CN103570842A - 一种普鲁兰多糖的提取方法 - Google Patents
一种普鲁兰多糖的提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103570842A CN103570842A CN201310545611.XA CN201310545611A CN103570842A CN 103570842 A CN103570842 A CN 103570842A CN 201310545611 A CN201310545611 A CN 201310545611A CN 103570842 A CN103570842 A CN 103570842A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- molecular weight
- polysaccharide
- decolouring
- centrifugal
- pulullan polysaccharide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 title abstract description 5
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 title abstract description 5
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 title abstract description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 104
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 104
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 104
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 51
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 33
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 26
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 claims abstract description 4
- ZBAFFZBKCMWUHM-UHFFFAOYSA-N propiram Chemical compound C=1C=CC=NC=1N(C(=O)CC)C(C)CN1CCCCC1 ZBAFFZBKCMWUHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229950003779 propiram Drugs 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241000223678 Aureobasidium pullulans Species 0.000 claims description 10
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 10
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 claims description 6
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000011759 adducin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010076723 adducin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 5
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 abstract 2
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K aluminium trichloride Chemical group Cl[Al](Cl)Cl VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001599 direct drying Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 1,1,2-Trichlorotrifluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(Cl)Cl AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 1-O-galloyl-3,6-(R)-HHDP-beta-D-glucose Natural products OC1C(O2)COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC1C(O)C2OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical group [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000001263 FEMA 3042 Substances 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920002306 Glycocalyx Polymers 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N Penta-digallate-beta-D-glucose Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Chemical group 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical group [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Chemical group 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000003311 flocculating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 210000004517 glycocalyx Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009998 heat setting Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000002932 luster Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002892 organic cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000013021 overheating Methods 0.000 description 1
- 238000010525 oxidative degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- -1 small molecule salt Chemical class 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229920002258 tannic acid Polymers 0.000 description 1
- LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N tannic acid Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N 0.000 description 1
- 229940033123 tannic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000015523 tannic acid Nutrition 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
一种普鲁兰多糖的提取方法,包括发酵、热处理、絮凝除菌、絮凝离心、盐析除蛋白、盐析离心、超滤分离、大分子多糖脱色、小分子多糖用活性炭脱色、混合、分级沉淀、真空干燥、粉碎等步骤；大分子多糖采用过氧化氢处理脱色、小分子多糖用活性炭脱色，去除发酵液中的菌体、蛋白质、小分子盐等杂质，并通过超滤和酒精分级沉淀的方法去除普鲁兰多糖中的分子量过大的分子和分子量过小的分子，使产品分子量比较均匀，颜色洁白，性质稳定，从而有利于普鲁兰多糖的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种普鲁兰多糖的提取方法，属于微生物多糖加工技术领域。
背景技术
普鲁兰多糖，又名短梗霉多糖、茁霉多糖，是一种真菌多糖，是出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）合成的一种细胞外水溶性大分子中性多糖。它的化学结构是以α-1,6-糖苷键连接的聚麦芽三糖，即葡萄糖按α-1,4-糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以α-1,6-糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成的高分子多糖。干燥的普鲁兰多糖粉末为白色，无吸湿性，易溶解在冷水和热水中。普鲁兰多糖具有极佳的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性及易自然降解等独特的理化和生物学特性，它无毒无害，对人体无任何副作用，是一种有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品。
普鲁兰多糖具有许多独特的性能，它在2006年被卫生部批准为食品添加剂新品种。中国近几年来对其的需求量快速增长，特别是在医药辅料领域引起了人们的广泛注意和大量应用。然而，普鲁兰多糖产品目前主要由日本供应，国内普鲁兰多糖的生产还没有规模化，产品价格高昂，这主要是由于后提取工艺不成熟。因此，简便有效的分离提取方法具有重要的意义。
出芽短梗霉在发酵时所产色素和蛋白质等不利于其在各方面的应用。目前国内外主要从两个方面解决这个问题：一是通过优化培养基或者诱变或者基因改造获得产糖高产色素低的出芽短梗霉菌株；一是通过优化后提取工艺来分离纯化普鲁兰多糖。
工业中应用的微生物胞外多糖的提取回收一般有沉淀法和直接干燥法。沉淀法中最成熟的是醇沉法和盐沉法，常用的醇沉剂有甲醇、乙醇、异丙醇等，常用的盐沉剂主要有季胺盐、氯化钙、氢氧化钙以及氯化铝等。盐沉淀法主要适用于多聚阴离子多糖，在碱性条件下，高价金属阳离子及有机阳离子(如季铵盐) 可与多聚阴离子多糖形成沉淀。盐沉法的优点是用醇量比醇沉法少2-3倍，但产品质量略差。直接干燥法是将发酵液蒸发水分而直接干燥成固体产品。在实验室中冷冻干燥是达到这一目的的最好方法，工业上常用转筒烘烤、鼓风干燥、喷雾干燥等方法得到的产品都是粗制品，其中含有大量菌体、无机盐、有机残余物等杂质，因此产品的水溶性差、色泽深、流变性也不好，应用范围受到限制。
微生物多糖的提取步骤主要有预处理、脱色、脱蛋白和脱盐等。多糖的脱色方法主要有活性炭吸附法、离子交换法、氧化脱色法和金属络合物法。活性炭脱色较彻底但由于多糖被活性炭吸附会造成多糖的损失。离子交换法是利用弱碱性树脂来吸附色素，此法对游离的负性离子色素有效，对与糖结合的色素则效果不佳。氧化脱色法主要是用氧化剂在适当条件下将色素氧化脱除。多糖脱蛋白的方法主要有Sevage法、三氯乙酸法、鞣酸法、三氟三氯乙烷法和蛋白酶法等。经过脱色脱蛋白的多糖溶液可以运用乙醇分级沉淀来分离多糖并运用膜技术来除去盐类和小分子。
普鲁兰多糖目前能够规模化生产的只有日本的林原公司，但由于技术封锁等原因，国内对普鲁兰多糖的后提取工艺鲜有报道。目前只有中科院的孙万儒在小规模的提取方面申请了专利以及苏理的一项专利，其余的提取方法仅限于实验室。在普鲁兰多糖的提取过程中，主要的难点是蛋白质的去除。苏理采用膜滤技术对除菌体的发酵液直接进行脱色脱蛋白和脱盐，摒弃传统的乙醇沉淀法，运用流化床干燥法对产品进行干燥，生产过程可以实现自动化和连续化。该专利中的膜滤技术主要采用中空纤维或平板膜进行超滤，贮罐中不停的加入去离子水，直到色度和盐度达到指标。孙万儒采用添加絮凝剂的方法来去除菌体，然后运用膜技术对多糖溶液进行分离和浓缩，经过不同分子量的膜将多糖分级，后经喷雾干燥达到去除水分的目的。以上两种方法中对蛋白质的去除都是运用膜分离技术，然而膜分离去除蛋白质也具有很大的缺陷，所得产品蛋白含量较高，膜的污染和堵塞也较为严重。由于普鲁兰多糖是一种水溶性的胞外多糖，其提取的方法和工艺可以参考其它类似的多糖，如黄原胶、结冷胶和热凝胶等。然而，由于出芽短梗霉发酵过程中所产生的普鲁兰多糖分子量范围相差很大，据测定大约在6000-1000000之间，而不同分子量的普鲁兰多糖在粘度、成膜性、溶解度等性质方面存在着很大的差别，使经过简单提取的普鲁兰多糖的质量难以达到应用的要求。一般来说分子量越大成膜性越好，但分子量越大粘度越大、多糖粉末的溶解度越差。如果得到的产品分子量相差大、均匀性差，则会导致产品质量不稳定。
本发明专利通过采用热处理、絮凝等工艺去除发酵液中的菌体和蛋白质等杂质后，采用超滤分离的方法将发酵液中的大分子多糖和小分子多糖分离开来并分别进行处理，使最终得到的普鲁兰多糖的分子量在10000-100000之间，使产品的均匀性得到很大的提升，产品质量明显改善。而且还可以根据实际应用的需要通过调整工艺参数而改变产品的分子量范围。根据普鲁兰多糖的分子量大小不同采用不同的脱色方法。首先是采用超滤分离发酵液中的大分子多糖和小分子多糖，然后分别采用过氧化氢脱色或活性炭脱色。第一次超滤采用孔径为0.005μm的超滤膜，得到分子量大于100000的普鲁兰多糖，余下的超滤液再用孔径为0.001μm的超滤膜进行第二次超滤，得到分子量为10000-100000之间的普鲁兰多糖，分子量小于10000的普鲁兰多糖溶液则废弃或用于提取小分子低聚糖。对于分子量大于100000的普鲁兰多糖，由于分子量太大，干燥后往往溶解性较差，影响其应用效果，因此，本发明专利采用过氧化氢进行脱色处理，在脱色的同时对普鲁兰多糖进行一定程度的降解。而对于分子量小于100000的普鲁兰多糖则直接用活性炭进行脱色。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种能够提取出分子量比较均匀、颜色洁白、性质稳定的高品质普鲁兰多糖的提取方法。
技术方案：一种普鲁兰多糖的提取方法,包括以下步骤：
（a）发酵：出芽短梗霉经过常规的种子培养（斜面培养、摇瓶培养）、然后上发酵罐发酵培养4天以上；
（b）热处理：将发酵液在60-80℃下加热20-30分钟，以钝化有关降解酶的活性，避免普鲁兰在后续的处理过程中被降解；
（c）絮凝除菌：在热处理过的发酵液中加入1%-2%的质量浓度为10%的无机絮凝剂，静置8-10h，所述无机絮凝剂为三氯化铝；
（d）絮凝离心：将絮凝过的发酵液置于离心机中在3000-4000 r/min下离心，在低速离心絮凝过程中，使菌体沉淀的同时，一部分蛋白质也可被沉降下来；
（e）盐析除蛋白：将离心后的清液调节pH至9.0-10.0，加热温度控制在85-90℃，加入饱和度为60%左右的氯化钠，加热时间1h以上，变性的蛋白质能够通过共沉聚集而沉淀下来；
（f）盐析离心：用离心机对盐析液进行离心，去除其中的沉淀；
（g）超滤分离：离心后的清液加入适量的蒸馏水，配制成含多糖质量浓度为5%的溶液，然后置于超滤设备中在0.5Mpa的压力下超滤。选用的超滤膜为0.001μm和0.005μm，截留分子量分别为：10000和100000；经过超滤后，得到三种不同分子量的多糖：分子量大于100000的普鲁兰多糖、分子量在10000-100000之间的普鲁兰多糖、分子量小于10000的多糖；分子量小于10000的普鲁兰多糖废弃或者用于生产低聚糖的原料；
（h）大分子多糖脱色：对于分子量大于100000的普鲁兰多糖采用过氧化氢氧化法脱色；
（i）小分子多糖用活性炭脱色：对于分子量10000-100000之间的普鲁兰多糖采用吸附法脱色；
（j）混合：将步骤h和步骤i中两种脱色液混合；
（k）分级沉淀：在混合后的脱色液中加入95%的酒精，使总溶液中的酒精含量达到20%，在这种酒精浓度下，超高分子量的普鲁兰多糖会形成沉淀，用离心去除；上清液再加入酒精使溶液的酒精含量达到70%，离心收集分子量在10000-100000之间的普鲁兰沉淀，而分子量小于10000的普鲁兰低聚糖在这种酒精浓度下不会沉淀，采用酒精对普鲁兰多糖根据分子量进行分离；
（l）真空干燥：将上述得到的沉淀置于真空干燥箱中，在0.1MPa下干燥24h；
（m）粉碎：将干燥后的普鲁兰用粉碎机粉碎。
其中，所述步骤h大分子多糖脱色工序中氧化脱色法是在碱性条件下，利用食品级双氧水的强氧化作用氧化降解色素类物质而脱色，氧化脱色法不会造成多糖的损失，色素物质的无色氧化降解产物能够溶解于水，乙醇沉淀后能够留在乙醇/水体系内而除去；脱色时调节发酵液pH至7.0-9.0之间，过氧化氢添加量为2.0%-3.0%，加热温度为40-50℃，加热时间为40-50分钟；升高温度、增加过氧化氢浓度可加快脱色的进行；脱色后离心，然后将溶液加热至90℃，保持10分钟；在碱性条件下加热可将多余的过氧化氢而除去；采用过氧化氢氧化法脱色，使普鲁兰在脱色的同时有一定程度的降解，在上述的氧化强度下，其中大部分高分子量的普鲁兰可降解到分子量小于100000。
其中，所述步骤i小分子多糖脱色工序中在发酵液中加入颗粒状活性炭或者粉末状活性炭，在60-80℃保持30分钟，脱色后过滤；吸附法脱色不会引起普鲁兰降解。
有益效果：本发明经过热处理、无机盐絮凝沉淀菌体、过滤、盐析除蛋白、离心、超滤分离、脱色（大分子多糖采用过氧化氢处理脱色、小分子多糖用活性炭脱色）、离心、混合、酒精分级沉淀、离心或过滤、真空干燥、粉碎等工序，去除发酵液中的菌体、蛋白质、小分子盐等杂质。并通过超滤和酒精分级沉淀的方法去除普鲁兰多糖中的分子量过大的分子和分子量过小的分子，使产品分子量比较均匀，颜色洁白，性质稳定，从而有利于普鲁兰多糖的应用。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1：
出芽短梗霉经过常规的种子培养（斜面培养、摇瓶培养）、然后上发酵罐发酵培养4天以上。将发酵液在60℃下加热30分钟。然后加入1%的浓度为10%（w/v）的无机絮凝剂（三氯化铝），静置8-10h。在4000 r/分钟下离心。上清液调节pH至9.0，加热温度控制在90℃，加入饱和度为60%左右的氯化钠，加热时间1h以上。再次用离心机对盐析液进行离心，去除其中的沉淀。过滤后的清液加入适量的蒸馏水，配制成含多糖5%（w/v）的溶液，然后置于超滤设备中在0.5MPa的压力下超滤。选用的超滤膜为 0.001μm 和0.005μm ，截留分子量分别为：10000和100000。经过超滤后，得到三种不同分子量的多糖，即分子量大于100000的普鲁兰多糖、分子量在10000-100000的普鲁兰多糖、分子量小于10000的多糖。分子量小于10000的普鲁兰多糖废弃（也可用于生产低聚糖的原料进行综合利用）。对于分子量大于100000的超滤液，调节pH至9.0，过氧化氢添加量为2.0%，加热温度为50℃，加热时间为50分钟。脱色后离心去除可能产生的沉淀。而对于分子量小于100000的超滤液，加入10g/L的颗粒状活性炭或者粉末状活性炭，在80℃保持30分钟，脱色后过滤。然后将上述两种脱色液混合。加入95%的酒精，使总溶液中的酒精含量达到20%，离心去除分子量大于100000的高分子普鲁兰；然后再加入酒精使溶液的酒精含量达到70%，离心收集分子量在10000-100000之间的沉淀。置于真空干燥箱中，在0.1MPa下干燥24h。用粉碎机粉碎。
实施例2：
出芽短梗霉经过常规的种子培养（斜面培养、摇瓶培养）、然后上发酵罐发酵培养4天以上。将发酵液在80℃下加热20分钟。然后加入2%的浓度为10%（w/v）的无机絮凝剂（三氯化铝），静置8-10h。在3000r/分钟下离心。上清液调节pH至10.0，加热温度控制在85℃，加入饱和度为60%左右的氯化钠，加热时间1h以上。再次用离心机对盐析液进行离心，去除其中的沉淀。过滤后的清液加入适量的蒸馏水，配制成含多糖5%（w/v）的溶液，然后置于超滤设备中在0.5MPa的压力下超滤。选用的超滤膜为 0.001μm 和0.005μm ，截留分子量分别为：10000和100000。经过超滤后，得到三种不同分子量的多糖，即分子量大于100000的普鲁兰多糖；分子量在10000-100000的普鲁兰多糖，分子量小于10000的多糖。分子量小于10000的普鲁兰多糖废弃（也可用于生产低聚糖的原料进行综合利用）。对于分子量大于100000的超滤液，调节pH至7.0，过氧化氢添加量为3.0%，加热温度为40℃，加热时间为40分钟。脱色后离心去除可能产生的沉淀。而对于分子量小于100000的超滤液，加入10g/L的颗粒状活性炭或者粉末状活性炭，在60℃保持30分钟，脱色后过滤。然后将上述两种脱色液混合。加入95%的酒精，使总溶液中的酒精含量达到20%，离心去除分子量大于100000的高分子普鲁兰；然后再加入酒精使溶液的酒精含量达到70%，离心收集分子量在10000-100000之间的沉淀。置于真空干燥箱中，在0.1MPa下干燥24h。用粉碎机粉碎。
实施例3：
出芽短梗霉经过常规的种子培养（斜面培养、摇瓶培养）、然后上发酵罐发酵培养4天以上。将发酵液在70℃下加热25分钟。然后加入1.5%的浓度为10%（w/v）的无机絮凝剂（三氯化铝），静置9h。在3500 r/分钟下离心。上清液调节pH至9.5，加热温度控制在87℃，加入饱和度为60%左右的氯化钠，加热时间1h以上。再次用离心机对盐析液进行离心，去除其中的沉淀。过滤后的清液加入适量的蒸馏水，配制成含多糖5%（w/v）的溶液，然后置于超滤设备中在0.5MPa的压力下超滤。选用的超滤膜为 0.001μm 和0.005μm ，截留分子量分别为：10000和100000。经过超滤后，得到三种不同分子量的多糖，即分子量大于100000的普鲁兰多糖；分子量在10000-100000的普鲁兰多糖，分子量小于10000的多糖。分子量小于10000的普鲁兰多糖废弃（也可用于生产低聚糖的原料进行综合利用）。对于分子量大于100000的超滤液，调节pH至8.0，过氧化氢添加量为2.5%，加热温度为45℃，加热时间为45分钟。脱色后离心去除可能产生的沉淀。而对于分子量小于100000的超滤液，加入10g/L的颗粒状活性炭或者粉末状活性炭，在70℃保持30分钟，脱色后过滤。然后将上述两种脱色液混合。加入95%的酒精，使总溶液中的酒精含量达到20%，离心去除分子量大于100000的高分子普鲁兰；然后再加入酒精使溶液的酒精含量达到70%，离心收集分子量在10000-100000之间的沉淀。置于真空干燥箱中，在0.1MPa下干燥24h。用粉碎机粉碎。
Claims (3)
1.一种普鲁兰多糖的提取方法, 其特征在于，包括以下步骤：
（a）发酵：出芽短梗霉经过种子培养，然后上发酵罐发酵培养4天以上；
（b）热处理：将发酵液在60-80℃下加热20-30分钟；
（c）絮凝除菌：在热处理过的发酵液中加入1%-2%的质量浓度为10%的无机絮凝剂，静置8-10h；
（d）絮凝离心：将絮凝除菌过的发酵液置于离心机中在3000-4000 r/min下离心；
（e）盐析除蛋白：将絮凝离心后的清液调节pH至9.0-10.0，加热温度控制在85-90℃，加入饱和度为60%左右的氯化钠，加热时间1h以上；
（f）盐析离心：用离心机对盐析液进行离心，去除其中的沉淀；
（g）超滤分离：离心后的清液加入蒸馏水，配制成含多糖质量浓度为5%的溶液，然后置于超滤设备中在0.5Mpa的压力下超滤；选用的超滤膜为0.001μm 和0.005μm，截留分子量分别为：10000和100000；经过超滤后，得到三种不同分子量的多糖：分子量大于100000的普鲁兰多糖、分子量在10000-100000之间的普鲁兰多糖、分子量小于10000的多糖；分子量小于10000的普鲁兰多糖废弃或者用于生产低聚糖的原料；
（h）大分子多糖脱色：对于分子量大于100000的普鲁兰多糖采用过氧化氢氧化法脱色，；
（i）小分子多糖脱色：对于分子量在10000-100000之间的普鲁兰多糖采用吸附法脱色；
（j）混合：将步骤h和步骤i中两种脱色液混合；
（k）分级沉淀：在混合后的脱色液中加入95%的酒精，使总溶液中的酒精含量达到20%，在这种酒精浓度下，超高分子量的普鲁兰多糖会形成沉淀，用离心去除；上清液再加入酒精使溶液的酒精含量达到70%，离心收集分子量在10000-100000之间的普鲁兰沉淀，而分子量小于10000的普鲁兰低聚糖在这种酒精浓度下不会沉淀，采用酒精对普鲁兰多糖根据分子量进行分离；
（l）真空干燥：将上述得到的沉淀置于真空干燥箱中，在0.1MPa下干燥24h；
（m）粉碎：将干燥后的普鲁兰用粉碎机粉碎。
2.根据权利要求1所述的普鲁兰多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤h大分子多糖脱色工序中脱色时调节发酵液pH至7.0-9.0之间，过氧化氢添加量为2.0%-3.0%，加热温度为40-50℃，加热时间为40-50分钟；升高温度、增加过氧化氢浓度可加快脱色的进行；脱色后离心，然后将溶液加热至90℃，保持10分钟；在上述的氧化强度下，其中大部分高分子量的普鲁兰可降解到分子量小于100000。
3.根据权利要求1或2所述的普鲁兰多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤i小分子多糖脱色工序中在发酵液中加入活性炭，在60-80℃保持30分钟，脱色后过滤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310545611.XA CN103570842A (zh) | 2013-11-07 | 2013-11-07 | 一种普鲁兰多糖的提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310545611.XA CN103570842A (zh) | 2013-11-07 | 2013-11-07 | 一种普鲁兰多糖的提取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103570842A true CN103570842A (zh) | 2014-02-12 |
Family
ID=50043614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310545611.XA Pending CN103570842A (zh) | 2013-11-07 | 2013-11-07 | 一种普鲁兰多糖的提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103570842A (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104448019A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-03-25 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 高纯普鲁兰多糖提取工艺 |
| CN104479038A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-04-01 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 普鲁兰多糖提纯工艺 |
| CN112409506A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-02-26 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一种制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法 |
| CN114034595A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-02-11 | 江苏力凡胶囊有限公司 | 一种测定普鲁兰多糖含量的方法 |
| US11319566B2 (en) | 2017-04-14 | 2022-05-03 | Capsugel Belgium Nv | Process for making pullulan |
| CN115521959A (zh) * | 2022-10-12 | 2022-12-27 | 江苏力凡胶囊有限公司 | 一种普鲁兰多糖的提取方法 |
| US11576870B2 (en) | 2017-04-14 | 2023-02-14 | Capsugel Belgium Nv | Pullulan capsules |
| CN116813816A (zh) * | 2023-06-30 | 2023-09-29 | 山东泥秀生物科技有限公司 | 一种复合出芽短梗霉聚糖的制备方法 |
| CN118146896A (zh) * | 2024-03-04 | 2024-06-07 | 广东广味老土炮酒业有限公司 | 一种中药复合发酵保健酒及其制备方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0725903A (ja) * | 1993-07-13 | 1995-01-27 | Shin Etsu Chem Co Ltd | 高純度カチオン化プルランの製造方法 |
| CN1216780A (zh) * | 1997-11-05 | 1999-05-19 | 中国科学院微生物研究所 | 从发酵液中提取普鲁兰的技术和工艺 |
| CN1651467A (zh) * | 2005-01-11 | 2005-08-10 | 苏理 | 普鲁兰糖的溶剂提取生产工艺 |
| CN101560261A (zh) * | 2009-05-11 | 2009-10-21 | 江南大学 | 一种结冷胶的清洁生产方法 |
| CN103172759A (zh) * | 2013-03-18 | 2013-06-26 | 中国科学院过程工程研究所 | 利用枸杞多糖制备小分子量功能性多糖及寡糖的方法 |
-
2013
- 2013-11-07 CN CN201310545611.XA patent/CN103570842A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0725903A (ja) * | 1993-07-13 | 1995-01-27 | Shin Etsu Chem Co Ltd | 高純度カチオン化プルランの製造方法 |
| CN1216780A (zh) * | 1997-11-05 | 1999-05-19 | 中国科学院微生物研究所 | 从发酵液中提取普鲁兰的技术和工艺 |
| CN1651467A (zh) * | 2005-01-11 | 2005-08-10 | 苏理 | 普鲁兰糖的溶剂提取生产工艺 |
| CN101560261A (zh) * | 2009-05-11 | 2009-10-21 | 江南大学 | 一种结冷胶的清洁生产方法 |
| CN103172759A (zh) * | 2013-03-18 | 2013-06-26 | 中国科学院过程工程研究所 | 利用枸杞多糖制备小分子量功能性多糖及寡糖的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 崔玉海，童群义: "响应面法优化短梗霉多糖培养条件", 《食品与发酵工业》 * |
| 牛登飞: "发酵液中普鲁兰多糖提取工艺条件的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104448019A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-03-25 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 高纯普鲁兰多糖提取工艺 |
| CN104479038A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-04-01 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 普鲁兰多糖提纯工艺 |
| CN104479038B (zh) * | 2014-12-05 | 2016-09-28 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 普鲁兰多糖提纯工艺 |
| US11319566B2 (en) | 2017-04-14 | 2022-05-03 | Capsugel Belgium Nv | Process for making pullulan |
| US11576870B2 (en) | 2017-04-14 | 2023-02-14 | Capsugel Belgium Nv | Pullulan capsules |
| US11878079B2 (en) | 2017-04-14 | 2024-01-23 | Capsugel Belgium Nv | Pullulan capsules |
| CN112409506A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-02-26 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一种制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法 |
| CN114034595A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-02-11 | 江苏力凡胶囊有限公司 | 一种测定普鲁兰多糖含量的方法 |
| CN115521959A (zh) * | 2022-10-12 | 2022-12-27 | 江苏力凡胶囊有限公司 | 一种普鲁兰多糖的提取方法 |
| CN116813816A (zh) * | 2023-06-30 | 2023-09-29 | 山东泥秀生物科技有限公司 | 一种复合出芽短梗霉聚糖的制备方法 |
| CN118146896A (zh) * | 2024-03-04 | 2024-06-07 | 广东广味老土炮酒业有限公司 | 一种中药复合发酵保健酒及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103570842A (zh) | 一种普鲁兰多糖的提取方法 | |
| CN105942131B (zh) | 一种复合姜汁澄清剂及澄清姜汁提取液的制备方法 | |
| Kachhawa et al. | Studies on downstream processing of pullulan | |
| JP5770725B2 (ja) | 低次アシル基ジェランゴムのポスト抽出方法 | |
| CN102994395B (zh) | 一株出芽短梗霉及其应用 | |
| CN103665371A (zh) | 一种利用超滤纳滤技术精制生物发酵液中聚谷氨酸的方法 | |
| CN102492759B (zh) | 一种黑曲霉发酵玉米黄粉制备可溶性玉米肽的方法 | |
| JP5972165B2 (ja) | 高溶解性を有する低次アシル化ジェランゴムのポスト抽出方法 | |
| CN104087531A (zh) | 一株粪产碱杆菌突变株及用它制备可得然胶的方法 | |
| CN105237654A (zh) | 一种利用柑橘皮提取果胶的方法 | |
| CN104039893B (zh) | 藻青素的制备方法 | |
| CN101560261B (zh) | 一种结冷胶的清洁生产方法 | |
| CN103613753A (zh) | 一种无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法 | |
| CN106282266A (zh) | 一种利用柚苷酶制备浒苔寡糖的方法 | |
| CN113735991A (zh) | 一种从高粘度发酵液中提取普鲁兰多糖的工艺 | |
| CN104193841A (zh) | 一种低成本低酰基透明型结冷胶提取工艺 | |
| CN107383234A (zh) | 一种桃胶多糖的提取工艺 | |
| KR100895615B1 (ko) | 흑마늘 발효물의 제조방법 및 그 조성물 | |
| JP5112941B2 (ja) | 酵母からのグリコーゲン調製方法 | |
| EP3282867B1 (en) | Gellan gum products and methods of preparation thereof | |
| Wang et al. | A new and efficient method for purification of poly-γ-glutamic acid from high-viscosity fermentation broth | |
| KR101841099B1 (ko) | 저분자 후코이단이 함유된 마스크팩 화장료 조성물 및 그 제조방법 | |
| CN107011423A (zh) | 蛋白产品及其制备方法 | |
| CN106135542B (zh) | 一种绿茶茶汤的澄清方法 | |
| KR20200059089A (ko) | 효모 침강제 및 이의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140212 |