CN103543135A - 一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，首先对样品进行横向二维扫描，根据得到荧光寿命分布和荧光光斑进行横向对准，然后对单颗荧光颗粒进行轴向扫描成像，分析带有荧光强度与寿命分布的轴向二维图像，调节连续损耗光的发散度，完成光斑的轴向对准。本发明还公开了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置。本发明装置结构简洁，方便快速高精度调整，无需因采用纳米金颗粒而添加额外探测光路；调节精度高，光斑对准精度可达纳米量级。
Description
技术领域
本发明属于光学超分辨显微领域，特别涉及一种受激发射损耗显微术中基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置。
背景技术
共聚焦荧光显微术具有非侵入性、高特异性和高灵敏度等优点，一直是生命科学领域中的重要研究方法。但是由于光波的衍射效应，其成像分辨率被局限于半个波长左右，无法满足当前生命科学的研究需求。
为了打破光波衍射极限的限制，进一步探索生命的本质和疾病的机理，科学家们致力于超分辨光学显微术的研究，自20世纪90年代起，已提出了多种光学超分辨显微方法：受激发射损耗显微术(Stimulated emissiondepletion microscopy,STED)，光激活定位显微术(photoactivated localizationmicroscopy,PALM)，随机光学重建显微术(stochastic optical reconstructionmicroscopy,STORM)，饱和结构光照明显微术(saturated structuredillumination microscopy,SSIM)，等等。在这些方法之中，STED超分辨显微术目前具有最快的记录速度和最具前途的应用前景。
STED超分辨显微术首先是由S.W.Hell于1994年提出的。在一个标准的STED超分辨显微系统中，一束相位编码的红移损耗光被引入共焦系统，通过高数值孔径显微物镜的聚焦在焦平面产生一个环形中空光斑(donutspot)。损耗光通过受激辐射作用消耗掉激发光实心聚焦光斑外围的激发电子，抑制光斑外围的自发荧光效应进而获得更小的有效点扩散函数（PointSpread Function,PSF）。因此，最佳的STED成像效果需要激发光的实心聚焦光斑中心和损耗光的环形中空聚焦光斑中心精确重合。传统的方法中，两聚焦光斑中心对准是通过两束光分别扫描纳米金颗粒进行成像，然后通过对比两幅像调整两束光聚焦光斑的相对位置，多次重复直至光斑中心重合。这种对准方法存在以下几个缺点：①需要额外添加散射光成像光路：因为STED显微系统本身针对荧光波长，收集部分装有滤除激发光和损耗光的滤光片，而纳米金颗粒则是利用激发光和损耗光的散射光来成像，因此若要采用纳米金颗粒对准需要添加额外光路；②激发光和损耗光需要单独扫描成像，其间的样品漂移会产生误差需要校正：常见的采集系统多采用雪崩二极管（APD）来记录扫描强度，但是APD无法分辨收集信号的波长，因此激发光和损耗光需要单独扫描成像，对比两次扫描结果，势必会引入样品漂移误差。2013年，有国外课题组提出了采用荧光颗粒对STED中两束光的聚焦光斑中心进行对准（Auto-aligning stimulated emissiondepletion microscope using adaptive optics.Optics letters,2013），但是其方法并没有克服分时扫描引入样品漂移误差等问题，另外该方法是通过荧光强度分布来确定聚焦光斑中心的，荧光强度分布依赖于激发光和损耗光的强度比。
发明内容
本发明提供了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置，通过探测STED显微术中由于损耗光引起的荧光光斑横向和纵向荧光寿命分布变化，调整寿命点扩散函数中心与对应荧光聚焦光斑中心的相对位置，从而对两聚焦光斑的中心进行三维对准。本发明结构简单，无需采用纳米金颗粒，无需添加额外光路，无需分时扫描成像，对准精度在纳米量级，特别适用于激发光为脉冲光、损耗光为连续光的STED超分辨显微系统。
一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，包括以下几个步骤：
1）同时启用脉冲激发光和连续损耗光，所述的脉冲激发光和连续损耗光转换为圆偏光后经显微物镜聚焦到荧光样品表面，收集荧光颗粒发出的荧光，得到聚焦点的荧光强度和荧光寿命；
2）横向移动所述的荧光样品，重复步骤1），获得对应扫描区域内各扫描点的荧光强度信息和荧光寿命信息；
3）对步骤2）获得的荧光强度信息和荧光寿命信息进行分析，选择单颗荧光颗粒的荧光强度光斑、拟合光斑中心并记录光斑中心坐标，同时提取所述荧光强度光斑对应的寿命分布，拟合寿命的最长点并记录最长点坐标，计算得到光斑中心与寿命最长点的距离；
4）根据步骤3）算得的距离，改变所述连续损耗光入射显微物镜的角度，使光斑中心与寿命最长点完全重合，完成光斑的横向对准；
5）对步骤3）中选择的单颗荧光颗粒，重复步骤1）中的操作，选取穿过颗粒中心的轴向切面进行扫描，并移动所述的荧光样品完成轴向二维扫描，获得对应各点的荧光强度信息和荧光寿命信息；
6）根据步骤5）中单颗荧光颗粒的椭圆荧光光斑及所述荧光光斑对应的寿命分布，调节所述连续损耗光的发散度，使得长寿命区域贯穿荧光光斑的中间区域且沿椭圆荧光光斑长轴和短轴呈轴对称分布，完成光斑的轴向对准。
以荧光样品的颗粒稀疏区域作为所述步骤2）中的扫描区域，所述颗粒稀疏区域确定方法为：单独使用脉冲激发光，并将脉冲激发光调制为圆偏光，然后由显微物镜聚焦到样品表面，对样品表面进行二维扫描，收集荧光颗粒发出的荧光，得到相应的扫描图像，根据所述扫描图像上荧光颗粒的分布，选取所述的颗粒稀疏区域。
其中，脉冲激发光在经过脉冲激发光快门之前已调制为平行光；连续损耗光在经过连续损耗光快门之前已调制为平行光，且已经过了相位调制，相位调制的作用是为了在之后在显微物镜的聚焦作用下聚焦光斑成中空面包圈形光斑。
其中，脉冲激发光经显微物镜的聚焦光斑与最终收集信号的多模光纤端面在系统中互为共轭点。
其中，所述的荧光样品为100纳米荧光颗粒，因为100纳米荧光颗粒有较好的抗漂白能力，也可以采用40纳米～80纳米尺寸的荧光颗粒。
在步骤2）中，还可以采用振镜扫描系统来实现样品的横向扫描。
本发明还提供了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，包括：
沿脉冲激发光光路依次布置的脉冲激发光生成装置和脉冲激发光快门；
沿连续损耗光光路依次布置的连续损耗光生成装置、连续损耗光快门和二色镜；
四分之一波片，用于将所述的脉冲激发光和连续损耗光调制为圆偏光；
显微物镜，用于将所述圆偏光聚焦至荧光样品并收集荧光；
信息采集装置，用于采集所述显微物镜收集荧光的强度信息和寿命信息；
以及与所述信息采集装置连接的计算机。
其中，所述的脉冲激发光生成装置包括沿光路依次布置的脉冲激光器、第一单模保偏光纤、第一准直透镜、第一起偏器、第一四分之一波片和第一二分之一波片。
其中，所述的连续损耗光生成装置包括沿光路依次布置的连续激光器、第二单模保偏光纤、第二准直透镜、第二起偏器、第二四分之一波片、第二二分之一波片和0～2π涡旋位相板。
其中，所述的信息采集装置包括沿收集荧光的光路依次布置的滤光片、透镜、多模光纤、雪崩二极管和时间相关单光子计数系统，且时间相关单光子计数系统分别与所述的计算机和脉冲激发光生成装置连接。
滤光片用于滤除除自发辐射荧光波长外其他任何波长的光，透镜用于将收集到的荧光聚焦于多模光纤端面，多模光纤与雪崩二极管（APD）相连，雪崩二极管（APD）时间相关单光子计数（TCSPC）系统相连，时间相关单光子技术系统与计算机相连，时间相关单光子计数系统负责将雪崩二极管记录的光子数和光子寿命信息提供给计算机。
本发明的工作原理如下：
经相位调制的脉冲激发光和连续损耗光在显微物镜的聚焦作用下在横向分别形成实心圆形聚焦光斑和环形中空聚焦光斑，在轴向分别形成实心椭圆形聚焦光斑（椭圆长轴沿光轴方向）和瓶颈形中空光斑。
荧光寿命是指荧光分子在激发态的分子数目衰减到原来的1/e所经历的时间，即荧光分子在上能级上的“平均停留时间”。若只开启激发光，则激发光聚焦光斑范围内荧光分子都将被激发至上能级并自发辐射跃迁发射荧光，则不考虑其他环境因素下整个激发光斑范围内任意一点荧光寿命的表达式可以写成
τ(r)=1/kf
其中，kf是荧光分子自发辐射跃迁发射荧光的速率，对于给定的荧光分子种类来说kf值是确定的，则若只开启激发光，则最后单颗荧光颗粒对应的荧光寿命是均一的，如图3所示。
若同时开启激发光和损耗光，则激发光聚焦光斑范围内荧光分子都将被激发至上能级，与只开启激发光不同，激发光斑范围内荧光寿命的表达式需要修订为
τ(r)=1/(kf+σISTED(r))
其中，kf是荧光分子自发辐射跃迁发射荧光的速率，对于给定的荧光分子种类来说kf值是确定的，σ是荧光分子受激辐射的吸收截面，ISTED(r)是聚焦光斑内r处的损耗光强度，即存在损耗光的区域荧光寿命缩短，且缩短程度与损耗光的强度有关，则若环形中空损耗光聚焦光斑与实心激发光聚焦圆斑重合时，重合光斑中心寿命最长，如图4所示。
根据100纳米荧光颗粒对应重合光斑荧光寿命分布进行纳米精度对准，如下表所示：
在横向，激发光的聚焦光斑为实心圆形聚焦光斑，损耗光的聚焦光斑为环形中空聚焦光斑，若只开启激发光时，对应的寿命分布为均一的圆斑；若两束光同时开启，则当两束光横向未对准时，则寿命最长点不在荧光颗粒光斑中心，当两束光聚焦光斑横向重合时，荧光颗粒光斑对应的荧光寿命分布圆心最高。
在轴向，激发光的聚焦光斑为实心椭圆形聚焦光斑（椭圆长轴沿光轴方向），损耗光聚焦光斑为瓶颈形中空光斑，若只开启激发光时，对应的寿命分布为均一的椭圆斑；若两束光同时开启，则当两束光轴向未对准时，长寿命未贯穿整个椭圆光斑且沿椭圆斑长轴和短轴的寿命分布并不呈轴对称分布；当两束光聚焦光斑轴向重合时，长寿命分布贯穿荧光颗粒轴向光斑中心且沿椭圆荧光光斑长轴和短轴呈轴对称分布。
若激发光的光路已调好（即保证脉冲激发光经显微物镜的聚焦光斑与最终收集信号的多模光纤端面在系统中互为共轭点），则两束光的横向重合可以通过调节第二二色镜的角度来实现损耗光的入射角度实现；两束光的轴向重合可以根据轴向光斑寿命分布调节损耗光的会聚发散程度实现。通过设定纳米平移台的扫描分辨率（纳米精度）可以达到纳米精度的对准。
本发明结构简单，对准精度在纳米量级，可以三维调节两光束的对准程度，特别适用于激发光为脉冲光、损耗光为连续光的STED超分辨显微系统。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
（1）系统误差小，无需因采用纳米金颗粒而引入分时扫描造成样品漂移误差；
（2）调节精度高，光斑对准精度可达纳米量级；
（3）装置结构简洁，方便快速高精度调整，无需因采用纳米金颗粒而添加额外探测光路。
附图说明
图1为基于寿命分布的纳米精度光斑对准方法的装置示意图；
图2为一组用于寿命分布纳米精度光斑对准方法的双光束的生成装置示意图；
图3为只开启激发光时横向激发光点扩散函数强度分布与对应荧光寿命分布剖面图；
图4为同时开启激发光和损耗光时横向损耗光点扩散函数强度分布与对应荧光寿命分布剖面图；
图5中的（a～j）图表示不同光束聚焦到样品表面形成的光斑图像。
具体实施方式
下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
如图1所示，一种基于寿命分布的纳米精度光斑对准方法的装置，包括：脉冲激发光快门1，第一二色镜2，第二二色镜3，四分之一波片4，显微物镜5，纳米平移台6，第一滤光片8，第一透镜9，多模光纤10，雪崩二极管（APD）11，时间相关单光子计数（TCSPC）系统12，连续损耗光快门13，计算机14。
其中，脉冲激发光模块A发射脉冲激发光，在脉冲激发光的光轴上依次设置脉冲激发光快门1和第一二色镜2，脉冲激发光快门1用于控制脉冲激发光的开关，第一二色镜2与脉冲激发光光轴的角度为负45°，第一二色镜2的作用用于反射脉冲激发光和透射荧光；脉冲激发光经第一二色镜2反射成为反射脉冲激发光，反射脉冲激发光光轴与脉冲激发光光轴成90°，在反射脉冲激发光的光轴上依次放置第二二色镜3、四分之一波片4、显微物镜5和纳米平移台6，第二二色镜3与反射脉冲激发光的角度为正45°，第二二色镜3的作用是透射反射脉冲激发光、荧光和反射连续损耗光，四分之一波片4的作用是保证入射到显微物镜5的光为圆偏光，显微物镜5用于聚焦激发光、损耗光和收集荧光，纳米平移台6用于完成对样品横向二维和轴向二维的扫描；在反射脉冲激发光的反向延长线上依次放置第一滤光片8、第一透镜9和多模光纤10，第一滤光片8的作用是只允许样品自发辐射跃迁的荧光通过，多模光纤10的端面放置在第一透镜9的焦面上；多模光纤10与雪崩二极管（APD）11相连，雪崩二极管（APD）11的作用是探测被显微物镜5收集的荧光光子；雪崩二极管（APD）11和脉冲激发光产生模块A与时间相关单光子计数（TCSPC）系统12相连，时间相关单光子计数（TCSPC）系统用于将从APD传导来的光子信号转化为强度信息和寿命信息；计算机14与时间相关单光子计数（TCSPC）系统12和纳米平移台6相连，计算机通过控制时间相关单光子计数（TCSPC）系统12和纳米平移台6完成对样品横向和纵向二维强度和寿命的成像；连续损耗光模块B发射连续损耗光，在连续损耗光的光轴上依次设置连续损耗光快门13和第一二色镜3，连续损耗光经第二二色镜3反射与反射脉冲激发光光轴重合，连续损耗光快门13用于控制连续损耗光的开关。
本实施例还给出了一组脉冲激发光和连续损耗光的生成装置，但生成方法并不仅限于此。
如图2A，一种用于寿命分布纳米精度光斑对准方法的脉冲激发光的生成装置，包括脉冲激光器15，第一单模保偏光纤16，第一准直透镜17，第一起偏器18，第一四分之一波片19和第一二分之一波片20。
其中，脉冲激光器15发射激光，经第一单模保偏光纤16耦合后出射，依次经过第一准直透镜17，第一起偏器18，第一四分之一波片19和第一二分之一波片20，第一单模保偏光纤16的出射端面在第一准直透镜17的前焦点处，第一准直透镜17的作用用于准直光束，第一起偏器18的作用用于保证准直光为线偏光，第一四分之一波片19和第一二分之一波片20用于补偿脉冲激发光光路的相位差进而保证最终聚焦光斑为圆偏光。
如图2B，一种用于寿命分布纳米精度光斑对准方法的连续损耗光的生成装置，包括连续激光器21，第二单模保偏光纤22，第二准直透镜23，第二起偏器24，第二四分之一波片25，第二二分之一波片26和0～2π涡旋位相板27。
其中，连续激光器21发射激光，经第二单模保偏光纤22耦合后出射，依次经过第二准直透镜23，第二起偏器24，第二四分之一波片25，第二二分之一波片26和0～2π涡旋位相板27。第二单模保偏光纤22的出射端面在第二准直透镜23的前焦点处，第二准直透镜23的作用用于准直光束，第二起偏器24的作用用于保证准直光为线偏光，第二四分之一波片25和第二二分之一波片26用于补偿连续损耗光光路的相位差进而保证最终聚焦光斑为圆偏光，0～2π涡旋位相板27用于形成横向为环形中空、轴向为瓶颈形中空光斑。
采用图1所示的一种基于寿命分布的纳米精度光斑对准方法，其过程如下：
（1）选取合适横向扫描区域；
脉冲激发光快门1打开，连续损耗光快门13关闭，脉冲激发光经第一二色镜2反射成为反射脉冲激发光，反射脉冲激发光光路与脉冲激发光光路正交；反射脉冲激发光经第二二色镜3透射后，经四分之一波片4调制为圆偏光，最终由显微物镜5聚焦到样品表面；100纳米荧光颗粒样品7被固定在纳米平移台6上，荧光颗粒基态电子被反射脉冲激发光激发至上能级，自发跃迁发射荧光；荧光经同一显微物镜5收集，先后依次通过四分之一波片4、第二二色镜3、第一二色镜2和第一滤光片8，由第一透镜9聚焦于多模光纤10端面，并被多模光纤10另一端连接的雪崩二极管（APD）11记录，雪崩二极管11和脉冲激发光产生模块A与时间相关单光子计数（TCSPC）系统12相连，时间相关单光子计数系统12负责将雪崩二极管11记录的光子数和光子寿命信息提供给计算机14，计算机14可以计算该扫描点的荧光强度和荧光寿命；完成该点记录后，进入下一点的扫描与记录，计算机通过控制纳米平移台6完成横向二维扫描，通过一次扫描获得各点的荧光强度信息和荧光寿命信息，即通过一次扫描同时获得组成带有寿命信息的横向二维强度图像，图像得到后关闭脉冲激发光快门1；在扫描图像上选取样品颗粒稀疏区域进行光斑校准。
（2）获取开启损耗光后的横向二维荧光强度图与寿命分布图像；
对步骤（1）选取的区域进行扫描成像，同时打开脉冲激发光快门1和连续损耗光快门13，连续损耗光经第二二色镜3反射成为反射连续损耗光，反射连续损耗光路与连续损耗光光路正交、与反射脉冲激发光光路基本重合；反射连续损耗光经四分之一波片4调制为圆偏光，最终经显微物镜5聚焦到样品表面，反射连续损耗光聚焦光斑与反射脉冲激发光聚焦光斑基本重合，其中反射脉冲激发光的聚焦光斑为实心圆斑，反射连续损耗光的聚焦光斑为环形中空圆斑；荧光颗粒基态电子被反射脉冲激发光激发至上能级，在无损耗光区域内，上能级电子自发跃迁发射荧光，在有损耗光区域，上能级电子受激辐射跃迁发射与损耗光波长相同的受激辐射光，产生的荧光和受激辐射光经同一显微物镜5收集，先后依次通过四分之一波片4、第二二色镜3、第一二色镜2，荧光经第一滤光片8由第一透镜9聚焦于多模光纤10端面，并被多模光纤10另一端连接的雪崩二极管（APD）11记录，受激辐射光被第二二色镜3反射和第一滤光片8滤除；雪崩二极管11和脉冲激发光产生模块A与时间相关单光子计数（TCSPC）系统12相连，时间相关单光子计数系统12负责将雪崩二极管记录的光子数和光子寿命信息提供给计算机14，计算机14可以计算该扫描点的荧光强度和荧光寿命；完成该点记录后，进入下一点的扫描与记录，计算机14通过控制纳米平移台6完成二维扫描，通过一次扫描获得各点的荧光强度信息和荧光寿命信息，即通过一次扫描获得组成带有寿命信息的横向二维强度图像，图像得到后关闭脉冲激发光快门1和连续损耗光快门13。
（3）根据荧光寿命分布和荧光光斑进行横向对准；
对步骤（2）获得的荧光强度图和荧光寿命分布图进行分析。选择单颗荧光颗粒的荧光强度光斑、拟合光斑中心并记录相应坐标，同时提取该荧光光斑对应的寿命分布，拟合寿命的最长点并记录相应坐标，计算光斑中心与寿命最长点距离，根据距离计算第二二色镜需要旋转的角度并转动第二二色镜3直至光斑中心与寿命最长点完全重合。
(4)获取开启损耗光后的荧光强度与寿命分布的轴向二维图像；
对步骤（3）选择的单颗荧光颗粒进行轴向扫描成像。同时打开脉冲激发光快门1和连续损耗光快门13，选取穿过颗粒中心的轴向切面进行扫描，计算机通过控制纳米平移台完成轴向二维扫描，获得的各点的荧光强度信息和荧光寿命信息组成带有寿命信息的轴向二维强度图像，图像得到后关闭脉冲激发光快门1和连续损耗光快门13。
（5）根据轴向荧光寿命分布和轴向荧光光斑进行轴向对准；
对步骤（4）获得的荧光强度分布和荧光寿命分布进行分析。选择单颗荧光颗粒的荧光强度光斑，同时提取该荧光光斑对应的寿命分布，调节损耗光的会聚发散度使得长寿命区域贯穿荧光光斑中间区域。
其中，第一二色镜2的作用是反射脉冲激发光并透射自发辐射跃迁产生的荧光；第二二色镜3的作用是透射脉冲激发光和自发辐射跃迁产生的荧光，同时反射连续损耗光；采用100纳米荧光颗粒的原因是因为100纳米荧光颗粒有较好的抗漂白能力，也可以采用40纳米～80纳米尺寸的荧光颗粒；第一滤光片8的作用是滤除脉冲激发光、连续损耗光和受激辐射光，仅允许自发荧光通过。
其中，脉冲激发光在经过脉冲激发光快门之前已调制为平行光；连续损耗光在经过连续损耗光快门之前已调制为平行光，且已经过了相位调制，相位调制的作用是为了在之后在显微物镜的聚焦作用下聚焦光斑成中空面包圈形光斑。
其中，脉冲激发光经显微物镜的聚焦光斑与最终收集信号的多模光纤端面在系统中互为共轭点。
Claims (8)
1.一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，其特征在于，包括以下几个步骤：
1）同时启用脉冲激发光和连续损耗光，所述的脉冲激发光和连续损耗光转换为圆偏光后经显微物镜聚焦到荧光样品表面，收集荧光颗粒发出的荧光，得到聚焦点的荧光强度和荧光寿命；
2）横向移动所述的荧光样品，重复步骤1），获得对应扫描区域内各扫描点的荧光强度信息和荧光寿命信息；
3）对步骤2）获得的荧光强度信息和荧光寿命信息进行分析，选择单颗荧光颗粒的荧光强度光斑、拟合光斑中心并记录光斑中心坐标，同时提取所述荧光强度光斑对应的寿命分布，拟合寿命的最长点并记录最长点坐标，计算得到光斑中心与寿命最长点的距离；
4）根据步骤3）算得的距离，改变所述连续损耗光入射显微物镜的角度，使光斑中心与寿命最长点完全重合，完成光斑的横向对准；
5）对步骤3）中选择的单颗荧光颗粒，重复步骤1）中的操作，选取穿过颗粒中心的轴向切面进行扫描，并移动所述的荧光样品完成轴向二维扫描，获得对应各点的荧光强度信息和荧光寿命信息；
6）根据步骤5）中单颗荧光颗粒的椭圆荧光光斑及荧光光斑对应的寿命分布，调节所述连续损耗光的发散度，使得长寿命区域贯穿荧光光斑的中间区域且沿椭圆荧光光斑长轴和短轴呈轴对称分布，完成光斑的轴向对准。
2.如权利要求1所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，其特征在于，以荧光样品的颗粒稀疏区域作为所述步骤2）中的扫描区域。
3.如权利要求2所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，其特征在于，所述颗粒稀疏区域确定方法为：
单独使用脉冲激发光，并将脉冲激发光调制为圆偏光，然后由显微物镜聚焦到样品表面，对样品表面进行二维扫描，收集荧光颗粒发出的荧光，得到相应的扫描图像，根据所述扫描图像上荧光颗粒的分布，选取所述的颗粒稀疏区域。
4.如权利要求1所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，其特征在于，所述的脉冲激发光和连续损耗光转换为经相位调制后的平行光。
5.一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，包括：
沿脉冲激发光光路依次布置的脉冲激发光生成装置和脉冲激发光快门；
沿连续损耗光光路依次布置的连续损耗光生成装置、连续损耗光快门和二色镜；
四分之一波片，用于将所述的脉冲激发光和连续损耗光调制为圆偏光；
显微物镜，用于将所述圆偏光聚焦至荧光样品并收集荧光；
信息采集装置，用于采集所述显微物镜收集荧光的强度信息和寿命信息；
以及与所述信息采集装置连接的计算机。
6.如权利要求5所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，所述的脉冲激发光生成装置包括沿光路依次布置的脉冲激光器、第一单模保偏光纤、第一准直透镜、第一起偏器、第一四分之一波片和第一二分之一波片。
7.如权利要求5所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，所述的连续损耗光生成装置包括沿光路依次布置的连续激光器、第二单模保偏光纤、第二准直透镜、第二起偏器、第二四分之一波片、第二二分之一波片和0～2π涡旋位相板。
8.如权利要求5所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，所述的信息采集装置包括沿收集荧光的光路依次布置的滤光片、透镜、多模光纤、雪崩二极管和时间相关单光子计数系统，且时间相关单光子计数系统分别与所述的计算机和脉冲激发光生成装置连接。
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