CN103536917B

CN103536917B - 干扰素在治疗肿瘤中的用途及相关的产品和方法

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Publication number: CN103536917B
Application number: CN201310525752.5A
Authority: CN
Inventors: 杨选明; 傅阳心
Original assignee: Suzhou Ding Fu Target Spot Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Shihuida Pharmaceuticals Group (JILIN) Ltd
Priority date: 2013-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2033-10-30
Also published as: CN103536917A

Abstract

本发明涉及干扰素在治疗肿瘤中的用途及相关的产品和方法。特别地，本发明涉及肿瘤治疗领域，尤其是克服肿瘤对抗体疗法的抗性。具体而言，本发明涉及通过干扰素、特别是I型干扰素以及其与阻断PD-1/PDL通路的化合物的联合使用而抑制肿瘤的生长与复发，并引起肿瘤消退的应用、相关的产品及方法。

Description

干扰素在治疗肿瘤中的用途及相关的产品和方法

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域，特别是克服肿瘤对抗体疗法的抗性。具体而言，本发明涉及通过干扰素、例如I型干扰素以及其与阻断PD-1（程序性死亡因子，Programmed death-1）/PDL（程序性死亡因子配体，PD-1Ligand）通路的化合物的联合使用而抑制肿瘤的生长与复发，并引起肿瘤消退。

背景技术

目前公认的观点是，靶向致癌性受体的抗体（例如西妥昔单抗和赫塞汀）具有抗肿瘤效果，因为它们能够阻断生长信号诱导、使细胞周期停止和/或通过凋亡或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）来诱导细胞死亡。然而，关于抗体介导的抗肿瘤机制的大多数研究是基于来自体外培养或体内异种移植模型的人肿瘤实验，它们没有包括获得性免疫应答的贡献。最近，使用免疫活性宿主进行的研究表明，通过抗-CD20，抗-Neu和抗-EGFR抗体疗法带来的持久抗肿瘤保护的确依赖于细胞免疫应答(Abes等人，2010;Park等人，2010;Yang等人，2013)。然而，仍未确定抗体治疗是否以及如何活化T细胞应答。

目前，用于改进抗体的治疗效果的大多数策略着重于增加对肿瘤细胞的细胞毒性。一种策略是将抗体与细胞毒性药物（包括化学治疗剂）相缀合而形成抗体-药物复合体(ADC)，与单独的抗体相比这实现了更好的抗肿瘤效果，并且与单独的细胞毒性化学治疗相比，这产生了更小的副作用(Fayad等人，2013;Hurvitz等人，2013;Krop等人，2012)。但是，ADC的长期保护效果仍然未知。也未能清楚地确定在这种治疗的过程中是否也会活化非特异性T细胞，从而增加产生有害的副作用的潜在可能。

与第一代抗体相似，在长期使用ADC之后能够产生宿主抗性。的确，虽然ADC的潜在细胞毒性效果起初引起消退，许多患者经历了复发或产生了转移。对于这种抗性，一种可能的解释是抗体抗性克隆在起初的抗体处理之前或之后产生，从而分别引起原发或获得性的抗性。

因此，亟需一种新型的抗肿瘤疗法，其能够有效地引起肿瘤的消退并且可以克服肿瘤细胞对于所述疗法的抗性而最终实现对肿瘤的治愈和/或防止肿瘤的复发。

发明内容

抗体免疫治疗通过靶向与肿瘤相关的表面标记物而用于治疗癌症已有将近16年(Scott等人，2012)。靶向致癌性受体已被显示是有效的，因为针对这些受体的抗体治疗能够在体外明显地抑制肿瘤细胞生长并且在免疫缺陷型小鼠内的人肿瘤异种移植模型中在体内部分地抑制肿瘤生长(Hynes和Lane，2005;Li等人，2005)。抗体疗法的主要治疗效果起初被归因于通过信号传导直接杀死肿瘤细胞。然而，最近，人们认识到免疫细胞上的Fc受体(FcR)信号传导也是很重要的，因为在小鼠模型中、在体内，当缺乏FcR信号传导时抗体介导的抗肿瘤效果大大降低(Clynes等人，2000)，并且FcR多态性与人乳腺癌患者中的临床结果相关(Musolino等人，2008)。这些数据提出了下述可能性：抗体疗法的抗肿瘤效果也取决于由先天性细胞产生的抗体依赖性细胞毒性，以及获得性免疫细胞依赖的免疫反应(ADCC)。

虽然有上面所示的抗体介导的抗肿瘤效果，对于实现有效的针对癌症的抗体疗法仍存在若干障碍。首先，许多患者在经历了长期和昂贵的治疗后仍对主要的抗体疗法会产生抗性。例如，80–90%的结肠癌患者对西妥昔单抗(抗EGFR)有抗性(Bardelli和Siena，2010)，66–88%的乳腺癌患者对赫塞汀(抗-HER2)有抗性(Cobleigh等人，1999)。第二，在长期的治疗之后，起初对抗体疗法有响应的患者中的肿瘤细胞很可能产生出天然的或获得性的抗体抗性克隆，这是癌症复发的主要原因。大多数的研究关注的是致癌性信号传导的内在抗性，例如被靶向的致癌基因中的突变或与促成抗体抗性的致癌通路相关的基因中的突变。在下列肿瘤细胞中能够发生对西妥昔单抗的原发性及获得性抗性：含有EGFR本身、或者下游的介导子KRAS和BRAF中的突变的肿瘤细胞，以及含有经扩增的Her2（EGFR的二聚化伴侣）的肿瘤细胞(Bardelli和Siena，2010;Misale等人，2012;Sharma等人，2007;Wheeler等人，2008;Yonesaka等人，2011)。为了增强通过抗体治疗杀伤肿瘤细胞的效力以及降低宿主的抗性，开发了第二代基于抗体的治疗，其是由与某些抗体缀合的细胞毒性药物或者放射性物质组成的，以增强直接的杀伤(Fayad等人，2013;Hurvitz等人，2013;Krop等人，2012)。另一种改进直接细胞毒性效应的策略涉及靶向不同的表位或甚至相关的受体(Bostrom等人，2009)。目前，克服宿主中对抗体的抗性的主要策略是开发靶向肿瘤细胞中经突变的致癌基因或经突变的与致癌通路相关的基因的药物。例如，BRAF抑制剂被用于靶向西妥昔单抗抗性肿瘤(Yoon等人，2011)。

综上所述，对抗体的抗性是对于基于抗体的癌症疗法的主要挑战。而目前克服所述对于抗体的抗性的策略着重于改进：1）通过抗体和细胞毒性药物缀合进行的对肿瘤细胞的直接杀伤，或者2）通过非特异性抗CD3活化进行的对肿瘤细胞的双特异性T细胞结合子增强靶向T细胞杀伤。由于肿瘤细胞的异质性以及它们所处的环境，这些直接杀伤的策略不能靶向所有的肿瘤细胞，并且最终仍会引起抗体抗性。

为了探求更有效的策略来改进抗体免疫疗法，需要鉴别关键性的分子，它们使抗体介导的抗肿瘤应答与所引起的获得性免疫抗肿瘤应答相联系。

干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，其可抑制病毒复制，同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。目前通用的分类方法将干扰素分为三型：Ⅰ型有IFN-α和IFN-β，其中IFN-α有二十余个亚型，IFN-β仅有一个亚型。I型干扰素具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等作用;Ⅱ型：只有IFN-γ，且只有一种亚型，除具有抗病毒、抗增殖活性外，其主要生物学活性为免疫调节作用;Ⅲ型：即IFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28a）和IFN-λ（IL-28b）。IFN-ω属于IFN-α家族，其结构和大小与其它IFN-α稍有差异，但抗原性有较大的不同。

最近，发现干扰素（IFN）（例如I型干扰素）的增加与抗癌的临床免疫应答有利地相关(Fuertes等人，2011)。此外，干扰素信号传导对于在自发性肿瘤排斥和各种抗肿瘤疗法的过程中引发抗肿瘤T细胞应答是至关重要的(Burnette等人，2011;Diamond等人，2011;Fuertes等人，2011;Stagg等人，2011)。这些数据表明干扰素对于引发针对肿瘤细胞的抗肿瘤特异性T细胞应答是关键的。也报道了干扰素在病毒感染的过程中活化记忆T细胞(Kohlmeier等人，2010)。然而，至今为止，干扰素被谨慎地用于临床中且效果有限(Trinchieri，2010)。的确，人们对这类细胞因子的作用理解得非常有限，因为其在不同的疾病模型中可能作为免疫活化剂或者免疫抑制剂起作用(Gonzalez-Navajas等人，2012)，并且潜在的严重副作用伴随短的半衰期限制了其在肿瘤治疗中的应用。

另一方面，在抗体响应性肿瘤模型中，在ADCC过程中或由应激的抗体结合肿瘤细胞释放的免疫活化性分子能够有效地活化抗原呈递细胞(APC)，增强其诱导细胞毒性T细胞应答的能力。然而，这种免疫应答是弱的和瞬时的，特别是当肿瘤已建立时。在抗体抗性肿瘤模型中，需要其它的策略来再活化被免疫抑制性肿瘤微环境抑制的APC或T细胞。当前的发明人最近观察到了将CpG与西妥昔单抗偶联极大地增强了其治疗效果，推测这是通过活化肿瘤微环境内的树突细胞和激发随后的获得性免疫应答(Yang等人，2013)。这些研究表明了设计用于推动获得性免疫的活化的方法对于基于抗体的癌症疗法的长期成功是重要的、甚至可以是关键的。

作为对这一想法的支持，最近的临床实验使用了抗体来阻断T细胞上的共抑制性信号，这包括CTLA-4，PD-1和PD-L1。B7-CD28家族有许多能削弱T细胞应答并促进T细胞耐受的抑制性信号通路,其中近年发现的PD-1/PD-L通路由于独特的抑制功能而引人瞩目,被认为是影响自身免疫和感染性疾病慢性化的重要因素,该通路包括PD-1与它的两个配体:PD-L1和PD-L2。PD-1（programmed cell death1）,也称CD279,属于免疫球蛋白超家族成员,含有两个酪氨酸信号基序的胞质区,其一组成免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-basedinhibition motif,ITIM）,另一为免疫受体酪氨酸交换基序（Immunoreceptor tyrosine-based switch motif,ITSM）。ITSM募集磷酸酶SHP-1和SHP-2,使TCR或BCR传递的效应信号发生去磷酸化,同时,PD-1信号降低CD28介导的信号,抑制Akt激酶磷酸化、糖代谢及Bcl-XL的表达。PD-1表达较为广泛,胸腺发育阶段PD-1主要表达于双阴性细胞上,活化后的外周CD4+、CD8+T细胞、B细胞和单核细胞可以诱导表达,NK-T细胞上表达水平较低。

PD-1有PD-L1和PD-L2两种配体,PD-L1较PD-L2的表达广泛,而PD-L2的亲和力是PD-L1的2～6倍。PD-L2（也称B7-DC或CD273）在树突状细胞（dendritic cells,DC）、巨噬细胞和培养的骨髓源肥大细胞上可诱导表达;而PD-L1（也称B7-H1或CD274）在鼠类T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、间充质干细胞和培养的骨髓源肥大细胞组成性表达,活化后表达增强,人PD-L1的组成性表达水平较鼠类低。PD-L1还表达于许多的非造血类型的细胞上,在免疫豁免部位,如眼和胎盘也有表达,PD-L1在这些组织中可能调节自身反应性T细胞或B细胞和炎性应答。

最近的研究显示出逆转T细胞抑制（例如，通过阻断PD-1/PDL）是改进治疗效果的有利方式，但是令人遗憾地，这也带来了严重的副作用(Brahmer等人，2012;Topalian等人，2012;Weber，2007)。并且，临床数据显示出，对于PD-1阻断的应答率在所选的患者库中仍然是相对低的(15-25%)，并且这种应答在很大程度上取决于PD-L1在肿瘤组织中的表达以及起初的淋巴细胞浸润(Topalian等人，2012)。因此，癌症免疫疗法的关键性问题是如何进一步逆转所述微环境中的免疫抑制以重新活化特异性的抗肿瘤T细胞应答，从而实现对基于抗体的免疫疗法的更高的应答率和长期的有效性。

所以，急需新一代的基于抗体的药物以更有效地靶向肿瘤组织和减少系统性的副作用。

本发明中表明了联合干扰素（例如I型干扰素）的抗体疗法（例如抗体-干扰素β）不直接靶向肿瘤细胞，因为干扰素受体-缺陷性小鼠中的干扰素受体-充分性肿瘤对抗体-干扰素β没有响应。此外，骨髓移植(BMT)实验显示出，需要在源自骨髓的细胞上表达干扰素受体，这表明其中不涉及干扰素的抗血管生成效果。为了确定ADCC与获得性免疫应答的相对贡献，发明人用抗体-干扰素β处理了免疫缺陷性Rag-1KO小鼠，并且观察到了在缺乏获得性免疫细胞的情况下，抗体-干扰素β完全不能抑制肿瘤生长。虽然T细胞和树突细胞均能够响应于干扰素β，发明人进一步确定了树突细胞是必需的表达干扰素受体的细胞，因为具有I型干扰素受体-缺陷性树突细胞的小鼠对于抗体-干扰素β完全没有响应，而具有I型干扰素受体-缺陷性T细胞的小鼠仅显示出略微降低的肿瘤抑制。此外，来自经抗体干扰素β处理的小鼠的树突细胞能够直接活化肿瘤特异性T细胞，这表明联合了干扰素（如I型干扰素）的抗体疗法（例如抗体-干扰素β）处理增加了树突细胞抗原呈递和T细胞活化。因此，树突细胞很有可能直接响应于联合了干扰素的抗体疗法（例如抗体-干扰素β）以增加抗原呈递和T细胞活化，而所述抗原呈递和T细胞活化重新激活T细胞。

在本发明中，发明人还显示了抗体处理本身能够诱导干扰素（例如I型干扰素）产生，其促成树突细胞活化以及随后产生抗肿瘤T细胞免疫性。这还表明了肿瘤微环境中的主要抑制性细胞类型是树突细胞而非T细胞，因为当I型干扰素受体在树突细胞中选择性缺失时，联合了I型干扰素的抗体疗法（例如抗体-干扰素β融合蛋白）的治疗效果就消失了。因此，除了靶向T细胞之外还靶向树突细胞能够进一步增加抗体疗法的效力。

为了平衡免疫介导的损伤与正在进行的免疫应答，在免疫活化之后宿主免疫性通常诱导抑制性的信号传导。在这之中，肿瘤组织中的PD-L1上调作为癌症免疫治疗过程中的一种保护性机制是最值得注意的，而发明人在用联合干扰素（如I型干扰素）的抗体疗法进行处理之后观察到了这个现象。的确，阻断PD-L1/PD-1通路进一步增强了抗肿瘤效果并清除了肿瘤。这对于PD-L1/PD-1是特异性的，因为当将联合I型干扰素的抗体疗法与阻断来自T细胞上两种其它的重要抑制性分子（CTLA-4或BTLA）的信号传导的抗体相组合时，没有观察到协同效果。这清楚地表明了靶向由主动免疫疗法特异性地诱导的抑制性通路能够指导未来的临床治疗。

从上文中的分析可以了解到，优先靶向致癌性受体的抗体(Ab)越来越多地被用于癌症治疗，但是在长期和昂贵的治疗之后，肿瘤常常发展出对这些抗体的抗性。当前的发明人用干扰素（例如I型干扰素，如干扰素β）来武装抗体，作为新一代的生物制剂，其远远优越于第一代的抗体疗法并独立于各种抵抗机制而被用于控制对抗体疗法有抗性的肿瘤。这种新的策略是通过重新活化和重新桥接被抑制的先天性和获得性免疫而控制对抗体的抗性。从机理上来讲，抗体与I型干扰素的联合应用主要靶向肿瘤内的树突细胞，其通过增加肿瘤相关微环境中的交叉诱导而重新活化细胞毒性T细胞。此外，在肿瘤内阻断由抗体与I型干扰素的联合应用而诱导的PD-1/PD-L1通路的信号传导进一步克服了阻碍治疗的抗性并且完全清除了更大的已建立的肿瘤。因此，本发明建立了新一代基于抗体的免疫疗法，其能够清除对抗体有抗性的肿瘤。

因此，本发明的新一代基于免疫的抗体治疗能够通过重新激活肿瘤内的先天性和获得性免疫细胞并产生靶向多个肿瘤突变抗原的特异性T细胞应答而克服上文提及的使用抗体疗法的问题。因此，这种新的策略可能能够清除抗体不能直接靶向的肿瘤细胞。

在另外的方面，PD-1/PD-L通路不仅在调节自身耐受中发挥重要作用,在抗微生物感染免疫中也有关键作用。许多引起慢性感染的微生物可能大多利用PD-1/PD-L通路削弱抗感染免疫,并促进持续感染。与急性感染或疫苗接种后产生强力的效应和记忆性CD8+T细胞不同,在慢性病毒感染时,病毒特异性CD8+T细胞的功能通常都会减弱。在慢性感染模型中,如小鼠LCMV感染或灵长类SIV感染,或HIV、HBV、HCV等病毒感染,通常可以观察到无功能的病毒特异性CD8+T细胞持续存在,这一现象称作耗竭（exhaustion）,T细胞耗竭代表一系列免疫缺陷。随病毒载量的升高,病毒特异性T细胞的功能受损更加严重,增殖和产生IL-2的能力在早期即消失,产生效应性细胞因子和溶细胞的功能在后期消失。

与此同时，干扰素(IFN)作为一种广谱抗病毒剂，也被显示能够抑制病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。因而，根据本发明还可以了解到，联合使用干扰素(例如I型干扰素，如干扰素β)，特别是与抗体相结合（例如融合，特别是以融合蛋白的形式存在）的干扰素以及阻断PD-1/PD-L通路的信号传导的试剂（例如抗PDL1抗体）也可被用于治疗微生物感染、病毒感染和/或其它的传染性疾病。

因此，本发明的一个方面涉及干扰素，如I型干扰素，例如IFNβ或IFNα5用于制备药物的用途，所述药物用于克服肿瘤对于抗体疗法的抗性。

在一个实施方案中，所述干扰素（如I型干扰素）与结合肿瘤相关抗原的靶向部分（例如抗体）相连（例如形成融合蛋白），其中所述靶向部分与所述干扰素直接相连或通过连接子相连。在一个具体的实施方案中，所述靶向部分位于所述干扰素的N端。在另一个具体的实施方案中，所述靶向部分位于所述干扰素的C端。在一个具体的实施方案中，所述干扰素可以与两个或两个以上的所述靶向部分相连，从而形成多特异性（例如双特异性）分子（如多特异性融合蛋白，如双特异性融合蛋白）。

在所述干扰素与所述靶向部分通过连接子相连而形成融合蛋白的情形中，所述连接子可以包含任意适当长度的氨基酸序列，例如，所述连接子可以包含1-10、1-20、1-30或更多个氨基酸（或由其组成），例如所述连接子可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或更多个氨基酸，或由所述氨基酸组成。

在具体的实施方案中，所述靶向部分为抗体，例如抗EGFR抗体或抗Neu抗体。

在其它的具体实施方案中，所述肿瘤为恶性肿瘤，例如恶性的固体肿瘤，其包括例如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，结肠癌，皮肤癌，头颈癌，淋巴瘤或黑色素瘤。

在另一个方面，本发明涉及干扰素（例如I型干扰素，如IFN-β或IFNα5）与阻断PD-1/PDL信号传导通路的化合物（例如抗体，如抗PD1或PD-L1的拮抗性抗体）共同用于制备药物（例如药物试剂盒）的用途，其中所述药物用于治疗肿瘤（例如恶性的固体肿瘤，特别是乳腺癌，肺癌，前列腺癌，结肠癌，皮肤癌，头颈癌，淋巴瘤或黑色素瘤），例如用于克服肿瘤对于抗体疗法的抗性。其中，所述干扰素与所述阻断PD-1/PDL信号传导通路的化合物在所述药物中可以不相互混合的形式彼此独立存在，或以不影响彼此效力的方式混合存在。

在一个具体的实施方案中，上述对于抗体疗法有抗性的肿瘤或携带所述肿瘤的宿主在下列一项或多项中有缺陷：1）干扰素（如I型干扰素），例如干扰素α5或干扰素β的表达和/或功能；2）干扰素受体（如I型干扰素受体）的表达和/或功能，特别是树突细胞上的干扰素受体的表达和/或功能；3）树突细胞的交叉呈递以及由此产生的抗肿瘤细胞毒性T细胞。

其中，在具体的实施方案中，所述干扰素（如I型干扰素）可以与结合肿瘤相关抗原的靶向部分（例如抗体）相连（例如形成融合蛋白），其中所述靶向部分与所述干扰素直接相连或通过连接子相连。在一个具体的实施方案中，所述靶向部分位于所述干扰素的N端。在另一个具体的实施方案中，所述靶向部分位于所述干扰素的C端。在一个具体的实施方案中，所述干扰素可以与两个或两个以上的所述靶向部分相连，从而形成多特异性（例如双特异性）分子（如多特异性融合蛋白，如双特异性融合蛋白）。

在另外的方面，本发明涉及一种试剂盒，其含有：

a)干扰素，例如I型干扰素，如IFNβ或IFNα5；和

b)阻断PD-1/PDL信号传导通路的化合物，例如抗体，如抗PDL1抗体。

其中在使用所述试剂盒时，所述干扰素（例如I型干扰素，如IFNβ或IFNα5）与所述阻断PD-1/PDL信号传导通路的化合物可被同时、顺次（以任何顺序）或分别向有需要的受试者施用。并且在所述试剂盒中，所述干扰素（例如I型干扰素，如IFNβ或IFNα5）与所述阻断PD-1/PDL信号传导通路的化合物可以彼此不互相混合的形式存在（例如各自在单独的空间中存在）；或者以不影响彼此的效力的形式混合存在。

其中，在具体的实施方案中，所述试剂盒中的所述干扰素（如I型干扰素）可以与结合肿瘤相关抗原的靶向部分（例如抗体）相连（例如形成融合蛋白），其中所述靶向部分与所述干扰素直接相连或通过连接子相连。在一个具体的实施方案中，所述靶向部分位于所述干扰素的N端。在另一个具体的实施方案中，所述靶向部分位于所述干扰素的C端。在一个具体的实施方案中，所述干扰素可以与两个或两个以上的所述靶向部分相连，从而形成多特异性（例如双特异性）分子（如多特异性融合蛋白，如双特异性融合蛋白）。

在另一个具体实施方案中，所述靶向部分为抗体，例如抗EGFR抗体或抗Neu抗体。

在另外的具体实施方案中，所述肿瘤为恶性肿瘤，例如恶性的固体肿瘤，其包括例如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，结肠癌，皮肤癌，头颈癌，淋巴瘤或黑色素瘤。特别地，所述肿瘤可以为乳腺肿瘤或黑色素瘤。

在一个具体实施方案中，所述肿瘤或携带所述肿瘤的宿主在下列一项或多项中有缺陷：1）干扰素（如I型干扰素），例如干扰素α5或干扰素β的表达和/或功能；2）干扰素受体（如I型干扰素受体）的表达和/或功能，特别是树突细胞上的所述干扰素受体的表达和/或功能；3）树突细胞的交叉呈递以及由此产生的抗肿瘤细胞毒性T细胞。

在另外的方面，本发明还涉及一种试剂盒，其含有：

a)如上文中所限定的干扰素；和

b)使用说明书，其中记载了所述试剂盒用于克服肿瘤对于抗体疗法的抗性。

在其它的方面，本发明涉及一种治疗肿瘤（例如，用于克服肿瘤对于抗体疗法的抗性）的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的如上文中所限定的干扰素或者如上文中所限定的本发明试剂盒。

在具体的实施方案中，所述患者对于抗体疗法有抗性。在其它的实施方案中，所述患者在下列一项或多项中有缺陷：干扰素，例如I型干扰素，如干扰素α5或干扰素β的表达和/或功能；2）干扰素受体的表达和/或功能，特别是树突细胞上的干扰素受体的表达和/或功能；3）树突细胞的交叉呈递以及由此产生的抗肿瘤细胞毒性T细胞。

在另外的实施方案中，所述预防和/或治疗方法还包括同时、顺次（以任何顺序）或分别向所述患者施用：1）如上文中所限定的干扰素；和2）阻断PD-1/PDL信号传导通路的化合物，例如抗体，如抗PDL1抗体。

在又一个方面，本发明涉及如上文所限定的干扰素、或者本发明的试剂盒，其用于克服肿瘤对于抗体疗法的抗性。

在其它的方面，本发明的I型干扰素、试剂盒或方法可被用于与抗肿瘤的抗体疗法或其它抗肿瘤疗法（例如化学疗法、放射性疗法等）联合施用（例如同时或者以任何顺序顺次施用）。

此外，任选地，本发明所述的试剂和/或试剂盒中可进一步包含药学上可接受的载体。

总之，本发明给癌症免疫治疗领域带来了若干重要的影响。首先，其建立了一种途径来产生新一代基于抗体的治疗（例如联合I型干扰素的抗体疗法，例如抗体-干扰素β融合蛋白），其使得获得性免疫应答能够更有效地应对抗体抗性和复发。然后，增强细胞毒性T细胞应答转而能够杀死更多的肿瘤细胞以产生下列正反馈循环：细胞毒性T细胞介导的肿瘤细胞死亡引发内源性危险/先天信号传导，其进一步产生针对肿瘤的先天性和获得性免疫，并最终引起更完全的肿瘤消退。第二，本发明提供了证据表明，干扰素（如I型干扰素）（其将先天性和获得性抗肿瘤免疫相联系）对于抗体介导的肿瘤消退而言是关键的因素，并因此提供了用于癌症免疫疗法的重要靶标。第三，本发明揭示了树突细胞是肿瘤中主要的耐受细胞类型，表明它们在确定免疫抑制性肿瘤微环境中起主要作用。因此，靶向树突细胞将是用于改进癌症免疫治疗的效力的另一个重要的策略。第四，本发明提出了拮抗由免疫治疗诱导的获得性抗性将使得免疫治疗的治疗效果最大化并最终治愈宿主的肿瘤。总之，本发明中所采用的策略对于优化靶向免疫治疗而言指出了若干新的方向，其可极大地影响抗肿瘤药物的发现和临床癌症治疗。

附图说明

图1.在抗体介导的肿瘤消退过程中诱导了干扰素产生并且其对于所述肿瘤消退过程是必须的。A)向WT BALB/c小鼠(n=4/组)皮下注射了5×10⁵TUBO细胞，在第14天时施用100μg的抗Neu(左栏)或对照IgG。向WT B6小鼠(n=4/组)皮下注射了7×10⁵B16-EGFR细胞，并在第14天时施用了100μg的抗EGFR(右栏)或对照IgG。四天之后，将肿瘤消化并分离出肿瘤组织中的CD45⁺和CD45^-群。进行了实时PCR以检测I型干扰素的mRNA水平的表达。B)向WT BALB/c小鼠(n=5/组)皮下注射了5×10⁵TUBO-EGFR细胞，在第14天和21天施用了100μg的抗Neu。在同一天肿瘤内施用了200μg的抗I型干扰素受体或对照Ig。每周两次测量肿瘤的生长并进行比较。C)向WT B6小鼠(n=5/组)皮下注射了5×10⁵B16-EGFR细胞，在第14天和21天肿瘤内施用了2×10⁹腺病毒-干扰素β或对照病毒。每周两次测量肿瘤生长并进行比较。*，与对照组相比P<0.05。显示了三组实验中的一组代表性实验结果。

图2.Ab-IFNβ极大地提高了抗体的抗肿瘤效果。A)向WT BALB/c小鼠(n=5/组)皮下注射了5×10⁵TUBO-EGFR并在第14，18和22天时用25μg的抗EGFR-干扰素β或对照抗体进行处理。每周两次测量肿瘤生长并进行比较。B)向WT B6小鼠(n=5/组)皮下注射了1×10⁶B16-EGFR并在第14，18和22天时用25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照抗体进行处理。每周两次测量了肿瘤生长并进行比较。C)向Rag1KO小鼠(n=5/组)皮下注射3×10⁶H460细胞，并在第13天时过继转移2×10⁶OTI LN细胞。在第14，18和22天时施用了25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照抗体。每周两次测量了肿瘤生长并进行了比较。D)向Neu^OTI/OTII-Tg雌性小鼠(n=5/组)皮下注射了1×10⁶NOP23并在第14，18和22天时用25μg的抗-Neu-干扰素β或对照抗体进行处理。每周两次测量了肿瘤生长并进行了比较。*，与对照组相比P<0.05。显示了三组实验中有代表性的一组。

图3.抗-EGFR-干扰素β能够诱导抗肿瘤特异性细胞毒性T细胞应答，其促成肿瘤消退。A)向WT和Rag1KO B6小鼠(n=5/组)皮下注射了5×10⁵B16-EGFR-SIY细胞，并且在第14，18和22天时用25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照抗体进行处理。每周两次监控肿瘤生长。B)在最后一次处理之后的第7天，收集了dLN细胞并进行了干扰素γELISPOT测定。C)向WT B6小鼠(n=5/组)皮下注射了5×10⁵B16-EGFR-SIY并在第14，18和22天时用25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照抗体进行处理。与抗-EGFR-干扰素β同一天施用了CD8-耗竭抗体(200μg/小鼠)。每周两次测量了肿瘤生长并进行了比较。D)在最后一次处理后的第7天，收集了dLN细胞并进行了干扰素γELISPOT测定。*，相比于对照组P<0.05。显示了三组实验中代表性的一组。

图4.抗-EGFR-干扰素β的抗肿瘤效果要求在宿主造血细胞上表达I型干扰素受体。A)向WT和I型干扰素受体1KO B6小鼠(n=5/组)皮下注射5×10⁵B16-EGFR-SIY细胞并且在第14，18和22天时用25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照抗体进行处理。每周两次监控肿瘤生长。B)在最后一次处理之后的第7天时，收集dLN，脾和经肿瘤浸润的细胞并通过CBA测定检测了上清液中的干扰素产生。C)在所示的骨髓嵌合体重构之后30天，向小鼠皮下注射了5×10⁵B16-EGFR-SIY并在第14，18和22天时用25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照Ig进行处理。每周两次测量了肿瘤生长并进行了比较。*，相比于对照组P<0.05。显示了两组代表性实验之一。

图5.抗-EGFR-干扰素β恢复了树突细胞的交叉呈递能力。A)向WTB6小鼠(n=5/组)皮下注射了5×10⁵B16-EGFR-SIY并且在第14和18天时用25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照抗体进行了处理。在最后一次处理之后的第7天，收集了dLN细胞并进行了干扰素γELISPOT测定。B)向WT B6小鼠(n=5/组)皮下注射了5×10⁵B16-EGFR-SIY并在第14和18天时用25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照抗体进行了处理。在第一次处理之后的第8天，通过CD11c⁺阳性选择纯化了来自dLN的树突细胞并用经纯化的幼稚2C T细胞进行了孵育。2天后测量了干扰素产生。C)通过流式细胞计数测量了树突细胞活化标记物。D)在所示的骨髓嵌合物重构之后30天，向小鼠皮下注射了5×10⁵B16-EGFR-SIY并在第14，18和22天时用25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照Ig进行了处理。与所述处理同一天施用了DT或PBS。每周两次测量了肿瘤生长并进行了比较。*，相较于对照组P<0.05。显示了两组实验中有代表性的一组。

图6.树突细胞是直接响应于抗-EGFR-干扰素β处理的主要细胞类型。A)向WT和CD11c-Cre I型干扰素受体1^flox/flox小鼠(n=5/组)皮下注射了5×10⁵B16-EGFR-SIY并在第14，18和22天时用25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照抗体进行了处理。每周两次测量肿瘤生长并进行了比较。B)向WT和CD4-Cre I型干扰素受体1^flox/flox小鼠（n=5/组)皮下注射了5×10⁵B16-EGFR-SIY并在第14，18和22天时用25μg的抗EGFR-干扰素β或对照抗体进行了处理。每周两次测量肿瘤生长并进行了比较。*，相较于对照组P<0.05。显示了两组实验中有代表性的一组。

图7.拮抗由抗-EGFR-干扰素β诱导的PD-L1表达实现了肿瘤完全消退的结果。A)向WT B6小鼠皮下注射了5×10⁵B16-EGFR-SIY细胞并在第14天时用25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照抗体进行处理。两天之后，收集肿瘤细胞并通过流式细胞计数来分析PD-L1表达。红线表示经对照Ig处理的组，而蓝线表示经抗-EGFR-干扰素β处理的组。B)B16-EGFR细胞，在体外细胞培养过程中用0.02μg/ml的抗-EGFR-干扰素β进行了处理。一天之后，收集了肿瘤细胞并通过流式细胞计数对PD-L1表达进行了分析。红线表示经对照Ig刺激的细胞，而蓝线表示经抗-EGFR-干扰素β刺激的细胞。C)向WT B6小鼠(n=5/组)皮下注射了5×10⁵B16-EGFR-SIY细胞，并在第14，18和22天时用25μg的抗-EGFR-干扰素β或对照抗体进行了处理。与抗-EGFR-干扰素β同一天施用了PD-L1阻断性抗体(400μg/小鼠)。每周两次测量肿瘤生长并进行了比较。D)在最后一次处理后的第14天，收集脾细胞并进行了干扰素γELISPOT测定。*，相比于对照组P<0.05。显示了三组实验中代表性的一组。

图8.提出的I型干扰素如何将先天性和获得性抗肿瘤免疫相联系的模型。在抗体疗法之后，从抗体响应性肿瘤而非抗体抗性肿瘤释放的DAMP将诱导I型干扰素产生。Ab-干扰素在抗体抗性肿瘤中原位模拟I型干扰素产生。I型干扰素同时增加树突细胞交叉呈递，以产生更好的细胞毒性T细胞应答，其直接激活T细胞并且还诱导PD-L1表达以削弱抗肿瘤免疫性。Ab-干扰素与PD-L1阻断相结合使得抗肿瘤免疫应答最大化。

图9.抗-EGFR-IFNβ能够将IFNβ递送至EGFR+细胞。A)抗-EGFR-IFNβ融合蛋白的结构。B)用hIg,抗-EGFR或抗-EGFR-IFNβ及抗-人IgG Fcγ-PE对A431细胞进行染色。C)用5x10⁵B16-EGFR细胞皮下注射WT B6小鼠(n=5/组)并在第14天用25μg的抗-EGFR-IFNβ进行处理。在不同的时间点，通过hIg ELISA测量不同组织中抗-EGFR-IFNβ的浓度。显示了三组代表性实验中的一组。

图10.抗-EGFR-IFNβ的副作用。用不同剂量的抗-EGFR-IFNβ静脉内注射B6小鼠。在所示的时间点,通过BD CBA试剂盒测量血清中所示细胞因子的浓度。

图11.对于抗-EGFR-IFNβ诱导的肿瘤消退，不需要CD20⁺,NK1.1⁺和Ly-6G⁺细胞。用5x10⁵B16-EGFR皮下注射WT B6小鼠(n=5/组)并在第14,18和22天时用25μg的抗-EGFR-IFNβ或对照Ab进行处理。与抗-EGFR-IFNβ同一天施用了所示的删除特定细胞群的Ab(200μg/小鼠)。每周两次测量了肿瘤生长并进行了比较。

图12.通过抗-EGFR-IFNβ在体外直接活化DC和T细胞。在体外培养了来自WT B6小鼠的脾细胞并用所示浓度的抗-EGFR-IFNβ进行了处理。一天之后，收集了细胞用于通过流式细胞计数分析T细胞上CD69和树突细胞上CD86的表达。

图13.抗-EGFR-IFNβ与抗-CTLA4和抗-BTLA之间没有协同性抗肿瘤效果。用5x10⁵B16-EGFR细胞皮下注射WT B6小鼠(n=5/组)并在第14、18和22天用25μg的抗-EGFR-IFNβ或对照抗体进行处理。与抗-EGFR-IFNβ同一天施用CTLA4或BTLA阻断性抗体(400μg/小鼠)。每周两次测量了肿瘤生长并进行了比较。

图14.本发明实施例中对联合干扰素的抗体疗法有响应的肿瘤模型的总结。

具体实施方案

术语及定义

除非特别说明，本申请中所使用的术语和定义均是本领域中惯常使用的含义并且为本领域技术人员所知晓。

如本申请中所使用的，术语“肿瘤位点”是指含有或被怀疑含有肿瘤细胞的体内或离体位置。所述肿瘤位点包括固体肿瘤以及接近或邻近肿瘤生长处的位置。

如本申请中所使用的，术语“施用”是指全身性和/或局部施用。术语“全身性施用”是指非局部地施用，从而所施用的物质可能影响整个身体中的若干器官或组织；或者从而所施用的物质可能穿越整个身体中的数个器官或组织而到达靶位点。例如，向受试者的循环系统施用可引起治疗性产物在多于一个组织或器官中从所施用的载体表达，或者可引起治疗性产物在特异性位点处由所施用的载体表达，例如，这是由于天然的趋向性或由于与组织特异性启动子元件的可操作连接。本领域技术人员将理解，所述全身性施用涵盖各种形式的施用，这包括但不限于：肠胃外施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经皮施用、口服等。

术语“局部施用”是指在特异性位点处或其周围施用。本领域技术人员将理解，局部施用涵盖各种形式的施用，例如直接注射到特定位点处或注射到其周围（例如肿瘤内施用）。

如本文中所使用的，术语“治疗有效量”是指达到治疗目的疾病或病况（例如肿瘤/癌症，例如用于使肿瘤消退或减小肿瘤的大小）所需的本发明的干扰素，或者本发明试剂盒中组分的量。可以通过实践、按照常规的方式来关于特定的目的而确定所述有效量。特别地，所述治疗有效量可以是达到下述目的所需的量：减少癌细胞的数目;减少肿瘤大小;抑制(即减缓或停止)癌细胞浸润到外周器官中;抑制(即减缓或停止)肿瘤转移;抑制肿瘤生长;和/或缓解与癌症相关的一种或多种症状。

术语“抗体”涵盖例如，单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、抗体片段（其显示出所需的生物学或免疫学活性）。在本申请中，术语“免疫球蛋白”(Ig)与抗体可互换地使用。所述抗体可特异性地靶向肿瘤抗原，例如表面肿瘤抗原，例如EGFR，CD4，CD8、Neu等。

术语“干扰素”包括完整的干扰素分子（例如人干扰素、小鼠干扰素，例如人或小鼠I型干扰素，如干扰素α或β）、其功能性片段、衍生物、等同物或任何功能性变体，其能够实现所需的生物学功能，例如诱导肿瘤特异性T细胞的扩增、特别是树突细胞的交叉呈递以及由此产生抗肿瘤细胞毒性T细胞。在本发明的情境中，所述干扰素可选自Ⅰ型、II型和/或III型干扰素，例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28a）、IFN-λ（IL-28b）和IFN-ω等。

术语“功能性变体”是指，经过修饰（例如突变、插入、删除。融合、缀合、交联等）而与亲本分子（例如干扰素）不同，但是保留了所需的其生物学活性的变体。

可通过本领域已知的各种常规的方法来使干扰素、其片段或其功能性变体与所述靶向部分向连接。所述连接可以是直接或间接的（例如通过连接子），例如，可以通过形成融合蛋白、缀合或化学连接而实现。当所述连接形成融合蛋白时，其可通过例如重组技术或肽合成技术而实现。在某些实施方案中，所述融合蛋白也可包含连接子，所述连接子不破坏所形成的产物的目的特性（例如诱导抗肿瘤细胞毒性T细胞的产生）。例如，所述靶向部分可位于所述干扰素的N端或C端。在一个具体的实施方案中，所述干扰素可以与两个或两个以上的所述靶向部分相连，从而形成多特异性（例如双特异性）分子（如多特异性融合蛋白，如双特异性融合蛋白）。在所述干扰素与所述靶向部分通过连接子相连而形成融合蛋白的情形中，所述连接子可以包含任意适当长度的氨基酸序列，例如，所述连接子可以包含1-10、1-20、1-30或更多个氨基酸（或由其组成），例如所述连接子可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或更多个氨基酸，或由所述氨基酸组成

本领域技术人员能够根据具体的病况、疾病类型（例如肿瘤类型、肿瘤的发展阶段等）、严重程度、患者体质、可能联合施用的其它疗法、之前曾施用过的疗法等而选择适当的剂型和施用方式。

术语“癌症”是指通常被表征为不受调节的细胞生长的病况（例如在哺乳动物、例如人中）。所述癌症包括但不限于，例如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，结肠癌，皮肤癌，头颈癌，淋巴瘤或黑色素瘤等。

术语“抗体疗法”是指通过使用特异性靶向目的组织或位点的抗体来进行治疗的方法。在本发明的情境中，其特别是指用靶向肿瘤细胞的特异性抗体来治疗肿瘤（例如癌症）的方法。

在本发明的情境中，“对抗体疗法的抗性”是指，在使用特定的抗体制剂进行治疗后，肿瘤（例如癌症）或携带所述肿瘤的患者对于所述治疗没有响应（例如，肿瘤细胞没有被杀死、肿瘤没有消退），和/或所述疗法不能引起所述肿瘤的消退、减少或抑制肿瘤的转移或进一步生长。

在本申请中，术语“肿瘤相关抗原”包括例如肿瘤表面抗原，这包括但不限于例如表皮生长因子受体家族(EGFR)的成员，这包括EGFR，HER1，HER2，HER4和HER8等(Nam，N.H.，&Parang，K.(2003)，Current targets for anti cancer drμg discovery.Current Drμg Targets，4(2)，159-179)，STEAP(six-transmembrane epithelialantigen of the prostate;Hubert等人，STEAP:a prostate-specificcell-surface antigen highly expressed in human prostatetumors.，Proc Natl Acad Sci U S A.1999;96(25):14523-8.)，CD55(Hsu等人，Generation and characterization of monoclonalantibodies directed against the surface antigens of cervicalcancer cells.，Hybrid Hybridomics.2004;23(2):121-5)。

能用于本发明的其它合适的抗体包括利妥昔单抗(RituxanTM，嵌合的抗CD20抗体)，Campath-1H(抗CD52抗体)，和任何癌症特异性细胞表面抗原的抗体。下列示例性地列出了针对特定癌症类型的、适于与干扰素结合而用于本发明的目的的抗体:阿仑珠单抗(Campath^TM)用于慢性白血病;贝伐珠单抗(Avastin^TM)用于结肠癌和肺癌;西妥昔单抗(Erbitux^TM)用于结肠癌和头颈癌;吉妥珠单抗(Mylotarg^TM)用于急性髓性白血病;Ibritumomab(Zevalin^TM)用于非霍奇金淋巴瘤;帕木单抗(Vectibix^TM)用于结肠癌;利妥昔单抗(Rituxan^TM)用于非霍奇金淋巴瘤;托西莫单抗(Bexxar^TM)用于非霍奇金淋巴瘤;和曲妥珠单抗(赫塞汀^TM)用于乳腺癌。

在本发明中，“药学上可接受的载体”是指不会在所施用的细胞或受试者中引发过敏反应或其他不适影响，并且不会影响药物活性的载体。合适的可药用载体包括但不限于，例如，一种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物，以及上述物质的组合。药学上可接受的载体还可进一步包括能提高核酸、多肽、病毒颗粒或细胞的保存期限或效用的微量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。

在本申请中，在干扰素和/或其受体中“有缺陷”是指所述干扰素或干扰素受体的表达不能达到实现其生物学功能所需的水平，或者所表达的干扰素或干扰素受体不能发挥所需的生物学功能（例如以突变的形式存在），或者干扰素（或干扰素受体）不能够与其受体（配体）相互作用而引起下游的信号传导。

下面的实施例仅仅是为了更好地阐释本发明，而不意在以任何方式限制本发明。

实施例

材料和方法

小鼠

C57BL/6J和BALB/c小鼠购自Harlan。Rag1^-/-，2C CD8⁺TCR转基因小鼠，CD11c-DTR转基因小鼠，CD11c-Cre和CD4-Cre转基因小鼠购自JAX。IFN AR1^-/-小鼠是由芝加哥大学的Anita Chong博士提供的。IFNAR1^fl/fl小鼠是由德国汉诺威实验感染研究所的Ulrich Kalinke博士提供的(Kamphuis，Junt等人2006)。Neu^OT-I/OT-II转基因小鼠（B6背景）是由加拿大Trev & Joyce Deeley Research Centre，British Columbia的Brad H.Nelson博士提供的(Wall，Milne等人2007)。所有的小鼠都是在特定的无病原体条件下饲养的。动物护理和使用是根据研究所及NIH的方案和指导进行的，并且所有的研究都获得了芝加哥大学动物护理和使用委员会的批准。

细胞系和试剂

H460购自ATCC。TUBO是从BALB/c Neu-转基因小鼠中的自发乳腺肿瘤克隆的。TUBO-EGFR是在用pSEB-EGFR进行转染或用含有2μg/mL杀稻瘟菌素(InvivoGen)的质粒进行转染后选择的。用表达人EGFR或EGFR-SIY的慢病毒进行转导后，挑选B16-EGFR和B16-EGFR-SIY的单克隆。NOP23是从B6Neu^OT-I/OT-II转基因小鼠中的自发乳腺肿瘤克隆的，并且是由加拿大Trev & Joyce Deeley Research Centre的Brad H.Nelson博士提供的。在5%CO₂的条件下培养H460，TUBO，B16以及它们的衍生物，并将它们在体外维持在补充了10%热灭活的胎牛血清(Sigma)，2mmol/L L-谷氨酰胺，0.1mmol/L MEM非必需氨基酸，100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中。抗EGFR mAb西妥昔单抗购自Imclone。抗-CD8(YTS169.4.2)，抗-NK1.1(PK136)，抗-Neu(7.16.4)抗体是实验室内部制造的。抗-PD-L1(10F.9G2)和抗-Ly-6G(1A8)抗体购自BioXcell。抗-CD20(5D2)抗体是由Ouyang Wenjun(Genentech，San Franscisco)提供的。抗-I型干扰素受体(MAR-5A3)抗体是由Robert Schreiber博士(华盛顿大学，圣路易斯)提供的。表达鼠干扰素β的腺病毒是如之前所描述的制备的(Burnette等人，2011)。

Ab-IFNβ融合蛋白的产生

从抗-EGFR(LA22)杂交瘤(ATCC)中克隆了抗EGFR的V区域。将重链和轻链的V区域分别克隆到Abvec-IgG1和Abvec-kappa中(Smith等人，2009)。然后，将小鼠干扰素β插入重链的C末端作为含有SGGGGSGGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:1)连接子的融合蛋白。将含有干扰素β的整个重链和轻链分别克隆到pEE6.4和pEE12.4(Lonza)中。然后用NotI和BamHI消化这两个载体。将来自经消化的pEE6.4质粒的完整的hCMV-MIE-重链/SV40转录单元与来自经消化的pEE12.4质粒的大的NotI-BamHI片段（含有轻链表达盒）相连接。将含有重链和轻链二者的质粒转染到CHO细胞中并且根据指导手册(Lonza)建立稳定的克隆。根据指导手册(Repligen Corporation)通过蛋白A柱纯化含有抗-EGFR-干扰素β的上清液。以相同的方式产生了抗-Neu-干扰素β，不同之处在于V区域的cDNA来自抗-Neu(7.16.4)杂交瘤。

肿瘤生长和处理

将大约6×10⁵TUBO，TUBO-EGFR，B16-EGFR，B16-EGFR-SIY或NOP23细胞在右侧腹处皮下注射到6至8周大的小鼠中。沿着三个正交轴(a，b和c)测量了肿瘤体积并计算了肿瘤体积为abc/2。在肿瘤接种之后的第14，18和22天，通过三次肿瘤内注射25μg的抗-EGFR-干扰素β抗体或对照抗体来处理小鼠。对于CD8耗竭实验，与所述抗-EGFR-干扰素β处理同时，腹腔内地注射200μg的抗-CD8抗体。将大约6×10⁶H460细胞在右侧腹处皮下注射到6至8周大的Rag1KO小鼠中。在肿瘤建立之后(约14天)，通过静脉内注射将来自OTI TCR转基因小鼠的2×10⁶LN细胞继受性地转移到小鼠中。一天后，通过三次肿瘤内注射25μg的抗-EGFR-干扰素β抗体或对照抗体来处理小鼠。

抗体处理后I型干扰素mRNA的表达

将大约6×10⁵TUBO，TUBO-EGFR或B16-EGFR细胞在右侧腹皮下注射到6至8周大的小鼠中。在肿瘤接种后的第14和16天，通过两次肿瘤内注射100μg的抗-Neu，抗-EGFR或对照抗体来处理小鼠。用1mg/ml的胶原酶VIII(Sigma)和200μg/ml的DNA酶I(Sigma)在37℃下消化肿瘤30分钟。通过FACS AriaII(BD Bioscience)分选活的CD45⁺和CD45^-细胞群。通过RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)分离总的RNA并通过Sensiscript RT试剂盒(Qiagen)将其反转录为cDNA。通过定量实时PCR分析I型干扰素mRNA的表达水平。用于所述测定的引物如下:

小鼠干扰素α5，5'-ATGAAGTCCATCAGCAGCTC（SEQ ID NO:2），5'-AGGGGCTGTGTTTCTTCTCT（SEQ ID NO:3）;

β-肌动蛋白，5'-ACACCCGCCACCAGTTCGC（SEQ ID NO:4），5'-ATGGGGTACTTCAGGGTCAGGATA（SEQ ID NO:5）。

通过ELISPOT测定来测量分泌干扰素γ的T细胞

通过ELISPOT测定测量SIY肽反应性T细胞。将脾或淋巴结细胞重悬在补充了10%FCS，2mmol/L L-谷氨酰胺，100单位/mL青霉素，和100μg/mL链霉素的RPMI1640中。一共将1-4×10⁵个脾或淋巴结细胞用于此测定。将SIY肽以5μg/mL的浓度加入。在48h的孵育后，根据指导手册通过干扰素γELISPOT试剂盒(BD Bioscience)或CBA测定(BD Bioscience)确定了干扰素γ的产生。用ImmunoSpot分析仪(细胞毒性T细胞)计数了所见到的细胞因子点。

离体树突细胞交叉呈递测定

在第14天和17天，用25μg的抗-EGFR、或抗-EGFR-干扰素β肿瘤内注射来处理携带B16-EGFR-SIY的小鼠。四天之后，用1mg/ml的胶原酶VIII(Sigma)和200μg/ml DNA酶I(Sigma)在37℃下将引流淋巴结消化15分钟。通过CD11c阳性选择试剂盒(Stemcell)纯化树突细胞。将大约1×10⁵树突细胞与经纯化的2×10⁵2C T细胞混合（含有或不含5μg/mL的SIY肽）以重新刺激T细胞。两天之后，收集了上清液，并且通过CBA测定(BD Bioscience)测量了干扰素γ。

离体T细胞活化测定

在第14和17天时，通过用25μg的抗-EGFR或抗-EGFR-干扰素β进行肿瘤内注射而处理携带有B16-EGFR-SIY的小鼠。四天之后，通过T细胞阴性选择试剂盒(Stemcell)纯化了dLN T细胞。将来自幼稚小鼠的大约1×10⁵经纯化的树突细胞与2×10⁵T细胞混合在一起（含有或不含5μg/mL的SIY肽）以再刺激T细胞。两天之后，收集上清液并通过CBA测定(BD Bioscience)来测量干扰素γ。

骨髓嵌合体的产生

用1000rads的单一剂量致死辐射WT小鼠。次日，将2-3x10⁶WT，IFN AR1^-/-或CD11c-DTR Tg供体骨髓细胞通过静脉内过继转移至所述经辐射的小鼠。重构后，将小鼠保持在复方磺胺甲恶唑(Bactrim)抗生素中（在饮用水中稀释的）4周。在重构之后的5-6周，用肿瘤细胞注射小鼠。

检测mAb和融合蛋白制备物中的内毒素

通过鲎变形细胞溶解物测定(Cambrex inc.MD)测量了内毒素。对于所有的mAb制备物，测定了内毒素的量为<0.2E.U./mg mAb。

流式细胞计数分析

用抗CD16/32(抗-FcγIII/II受体，克隆2.4G2)孵育单细胞悬浮液10分钟，然后用缀合的抗体进行染色。所有经荧光标记的单克隆抗体均购自Biolegend或eBioscience。在FACSC自动流式细胞计数仪(BDBiosciences)上对样品进行分析，并且用FlowJo软件(TreeStar，Inc.)分析了数据。

统计学分析

使用未配对Student双尾t测试比较了平均值。误差条表示SD。统计学上显著的差异p<0.05和p<0.01分别被标注以*和**。

实施例1

需要I型干扰素用于体内针对抗体疗法的有效肿瘤应答

已显现出I型干扰素作为潜在的关键性危险信号在自发性肿瘤排斥和各种抗肿瘤疗法中引发抗肿瘤的T细胞应答当前的发明人假设了抗致癌性受体抗体在肿瘤组织中诱导I型干扰素的产生，而桥接先天性和获得性免疫。为了测试在本文所述的模型中，肿瘤对抗致癌性受体抗体的敏感性是否与处理后I型干扰素的水平相关，发明人首先制备了两个不同的肿瘤细胞系，即抗体响应性细胞系和抗体抗性细胞系。TUBO乳腺肿瘤细胞源自Her2/neu Tg小鼠，其中Neu是细胞生长的主要信号，而TUBO细胞被用作抗-neu抗体响应性肿瘤细胞系。经EGFR转染的B16黑色素瘤细胞系（其中EGFR不能够递送生长信号）被用作完全抵抗抗EGFR处理的肿瘤细胞系。发明人用相应的抗体处理了携带这些肿瘤的小鼠并且评估了处理后肿瘤内I型干扰素的产生。发明人发现了干扰素α5和干扰素β的产生在抗体响应性肿瘤模型中增加了，但是在抗体抗性肿瘤模型中没有增加(图1A以及未显示的数据)，这表明增加的I型干扰素的产生是由抗体诱导的致癌性受体阻断和应激作用引起的。为了测试体内由抗体介导的抗肿瘤效果是否需要I型干扰素，发明人在抗体响应性TUBO肿瘤小鼠模型中、在抗Neu处理的过程中用抗-I型干扰素受体阻断抗体处理了小鼠。发明人发现了，阻断I型干扰素信号传导损害了抗Neu抗体的治疗效果(图1B)，这表明I型干扰素对于抗体介导的肿瘤消退而言的确是关键性的细胞因子。因此，这提出了下述可能性：受损的I型干扰素可能限制带有抗体抗性肿瘤的宿主中的免疫应答。为了进一步测试将其它的I型干扰素直接递送到肿瘤中是否足以控制肿瘤生长（甚至在抗体抗性肿瘤中），用编码干扰素β的腺病毒（腺病毒-干扰素β）处理了两组携带肿瘤的小鼠。如图1C中所示，Ad-干扰素β处理本身就足以控制抗体抗性肿瘤和抗体响应性肿瘤的生长(数据未显示)。综上所述，这些数据表明，将I型干扰素靶向到肿瘤中可能足以克服肿瘤免疫回避。

实施例2

干扰素β的靶向递送增强抗体介导的治疗效果

实施例1中的数据表明将I型干扰素靶向到肿瘤中具有潜在的免疫治疗效果，特别是可用于克服肿瘤对于抗体疗法的抗性。为了进一步验证此结论并进一步提高治疗效果，当前的发明人制备了抗-EGFR-干扰素β(Ab-IFNβ)融合蛋白以靶向地将干扰素β直接递送到表达EGFR的肿瘤组织中(图9A)。当前的发明人首先检查了此融合蛋白中抗-EGFR和干扰素β的抗肿瘤功能是否仍保持完好。发明人发现，所述融合蛋白能够结合EGFR⁺细胞（图9B）并且能够激活I型干扰素受体信号通路(数据未显示)，因此可知，融合蛋白中抗-EGFR和干扰素β的抗肿瘤功能都得到了很好的保持。发明人然后检测了抗-EGFR-干扰素β是否能够在体内特异性地将干扰素β递送到EGFR⁺肿瘤位点。结果证实了，在起初注射之后，抗-EGFR-干扰素β的浓度在几乎整整一周中在肿瘤组织中都保持较高水平（图9C)，而其在起初注射后不到一周的时间中就在其它组织中显著地降低。此外，发明人通过测量血清细胞因子、ALT和AST水平而检测了抗-EGFR-干扰素β的副作用。在发明人所检测的细胞因子中包括TNF，IL-12，干扰素γ，MCP-1，IL-6和IL-10，在注射后6小时和一天时干扰素γ和MCP-1的表达水平略有增加(图10)。发明人还观察到了在经过上面所述的处理之后，ALT和AST的水平没有增加(数据未显示)。

为了比较新一代抗-EGFR-干扰素β融合蛋白与第一代抗-EGFR抗体(西妥昔单抗)之间的抗肿瘤治疗效果，发明人用每一种试剂治疗了携带已建立的EFGR⁺肿瘤的宿主。令人惊讶地，发明人观察到在有部分抗性的肿瘤模型中，与单独使用抗-EGFR抗体相比，抗-EGFR-干扰素β在更低的剂量和更短的持续时间中有有效得多的治疗效果(图2A)。在乳腺内脂肪部分肿瘤注射模型中类似地观察到了提高的抗肿瘤效果(数据未显示)。为了进一步测试Ab-IFNβ是否能够在具有完全抗性的肿瘤模型中控制肿瘤生长，发明人测试了抗-EGFR-干扰素β在B16-EGFR模型中的效力。如所预测的，单独的抗-EGFR处理不能够在体内抑制B16-EGFR肿瘤生长，而抗-EGFR-干扰素β处理再次能够有力地控制肿瘤生长(图2B)。已报道了KRAS突变是促成临床中抗-EGFR抗性的关键因子为了测试抗-EGFR-干扰素β在KRAS突变诱导的抗体抗性肿瘤模型中是否是有效的，发明人在之前构建的获得性免疫重构Rag-1KO小鼠中用抗-EGFR-干扰素β处理了KRAS突变的H460人肿瘤。即使在这个模型中，相比于单独使用抗-EGFR，抗-EGFR-干扰素β也显示出了优越的治疗效果(图2C)。为了测试抗-EGFR-干扰素β是否能够控制肿瘤转移，当前的发明人向WT小鼠静脉内注射了B16-EGFR以模拟肿瘤转移。发明人发现了与单独使用抗-EGFR相比，抗-EGFR-干扰素β能够更好地控制转移性的肿瘤并且还能够延长小鼠的存活(数据未显示)。

由抗-Neu抗体导的抗肿瘤免疫性在neu Tg小鼠中大大降低，这是因为由于转基因表达的性质而使得在早期生命阶段，所有的乳腺中的高neu表达(作为自我以及肿瘤相关抗原)耐受宿主免疫细胞。为了测试Ab-IFNβ是否能够打破这种耐受性并在neu Tg小鼠中诱导neu⁺肿瘤的消退，在neu Tg宿主中建立了neu⁺肿瘤系NOP23（最初是从neu Tg小鼠产生的）令人惊讶地，与单独使用抗-Neu抗体相比，抗-Neu-干扰素β更显著地抑制了肿瘤生长（图2D)。总之，这些数据表明，对于控制肿瘤（甚至是在抗体抗性肿瘤模型和耐受的宿主中）而言，与第一代抗体疗法相比，Ab-IFNβ融合蛋白疗法能够以低剂量、在短时间内达到优越得多的效果(图14)。

实施例3

抗-EGFR-干扰素β融合蛋白的治疗效果取决于获得性免疫

I型干扰素对于肿瘤的生长具有多种潜在的效果，这包括抑制增殖、抑制血管生成、激活天然免疫细胞、桥接先天和获得性免疫以及直接激活获得性免疫应答。为了评估在众多其他的抗-EGFR-干扰素β抗肿瘤效果中，获得性免疫的相对贡献，用抗-EGFR-干扰素β处理了携带B16-EGFR的B6 Rag1 KO小鼠。与在WT小鼠中观察到的治疗效果相反，相似剂量的抗-EGFR-干扰素β不能抑制这些免疫受损的Rag1 KO小鼠中的肿瘤(图3A)。因此，这些数据支持了下述结论：抗-EGFR-干扰素β介导的治疗效果在很大程度上需要获得性免疫。

CD8⁺T淋巴细胞是参与控制许多肿瘤的生长的主要细胞群。为了确定它们是否也参与抗-EGFR-干扰素β介导的抗肿瘤效果，发明人在引发阶段中追踪了抗肿瘤T细胞应答。发明人首先建立了B16-EGFR-SIY肿瘤细胞系，其中SIY肽(SIYRYYGL)被异位表达在人EGFR分子中;这一SIY肽是作为替代标志，其可被内源性或2C Tg CD8⁺T细胞特异性地识别。在用抗-EGFR-干扰素β处理之后，从携带肿瘤的小鼠中分离了引流淋巴结(dLN)淋巴细胞，并用SIY肽进行了刺激，且测量了干扰素γ的产生，作为被激活的T细胞的效应子-功能指标。如图3B中所示，与单独的抗-EGFR处理相比，抗-EGFR-干扰素β处理增加了来自肿瘤抗原特异性T细胞的干扰素γ产生。为了了解CD8⁺细胞对于抗EGFR-干扰素β的治疗效果是否是关键的，发明人在携带B16-EGFR的WT B6小鼠中、在抗-EGFR-干扰素β处理的过程中施用了CD8耗竭抗体，并测量了肿瘤生长。CD8⁺细胞耗竭大大地降低了抗-EGFR-干扰素β的治疗效果(图3C)，这表明需要获得性的免疫应答来控制肿瘤生长。与这一发现相一致，发明人发现了在用抗-CD8进行耗竭后体外的T细胞应答大大降低(图3D)。其它细胞的耗竭（包括NK和B细胞）没有影响抗-EGFR-干扰素β的抗肿瘤效果(图11)。发明人因此推测，抗-EGFR-干扰素β诱导了对肿瘤特异性细胞毒性T细胞的更有效的引发，引起对肿瘤生长的抑制。总之，这些数据表明抗-EGFR-干扰素β处理能够增加T细胞引发，而这促成了抗-EGFR-干扰素β的抗肿瘤效果。

实施例4

抗-EGFR-干扰素β的治疗效果需要在宿主造血细胞上表达I型干扰素受体

I型干扰素受体在几乎所有的细胞类型中都广泛表达，因此正常的细胞和肿瘤细胞都是潜在的抗-EGFR-干扰素β靶标。已报道了抗-CD20-干扰素α融合蛋白的效力需要在肿瘤细胞上表达I型干扰素受体因此，发明人推断对于抗-EGFR-干扰素β的治疗效果而言，可能也需要由肿瘤细胞表达的I型干扰素受体。为此，发明人比较了携带肿瘤的I型干扰素受体敲除（KO）小鼠中的抗肿瘤效果，所述小鼠在宿主细胞上缺乏I型干扰素受体的表达，但是在肿瘤细胞上表达I型干扰素受体。令人惊讶地，在I型干扰素受体KO小鼠中，抗-EGFR-干扰素β的治疗效果被完全破坏了(图4A)，并且没有观察到增加的细胞毒性T细胞应答（图4B)。这些结果表明，抗-EGFR-干扰素β的治疗效果在宿主细胞中需要由I型干扰素受体介导的活化，但在肿瘤细胞中不需要。由于所有的宿主组织都表达I型干扰素受体，发明人构建了I型干扰素受体骨髓嵌合(BMC)小鼠，以进一步分析是否需要表达I型干扰素受体的造血细胞或宿主基质细胞来实现抗肿瘤效果。发明人发现了，需要在造血细胞上表达I型干扰素受体，因为在I型干扰素受体KO BM重构的小鼠中抗-EGFR-干扰素β的抗肿瘤效果严重受损(图4C)。这些数据表明抗-EGFR-干扰素β不是通过直接抑制肿瘤细胞生长、而是通过激活宿主造血细胞（其然后改变肿瘤微环境）而介导其抗肿瘤效应。

实施例5

提高的树突细胞交叉呈递促成抗-EGFR-干扰素β的抗肿瘤效果

鉴于CD8⁺细胞对于抗-EGFR-干扰素β治疗的抗肿瘤效果是关键性的，发明人进一步探索了抗-EGFR-干扰素β如何增强细胞毒性T细胞应答的根本机制。发明人观察到，即使没有外源性SIY肽的刺激，在抗-EGFR-干扰素β处理之后也有干扰素γ产生性CD8⁺细胞的显著增加，这表明APC的交叉呈递增加了(图5A)。因为交叉呈递是激活细胞毒性T细胞用于抗肿瘤免疫的主要引发性机制发明人推测所述交叉呈递的增加对于恢复树突细胞功能以重新活化肿瘤内和引流淋巴结内的细胞毒性T细胞可能是关键性的。为了开始研究抗-EGFR-干扰素β能够增加APC的交叉呈递的可能性，发明人使用了体内的抗原特异性系统以追踪肿瘤-抗原特异性T细胞的引发和活化。因此，评估了来自经抗-EGFR-干扰素β处理的携带B16-EGFR-SIY的小鼠的dLN的树突细胞，通过在离体测定中用SIY-反应性2C T细胞孵育它们而检测其增强特异性抗肿瘤细胞毒性T细胞应答的能力。的确，与抗-EGFR处理相比，来自经抗-EGFR-干扰素β处理的小鼠的树突细胞诱导了更多由2C T细胞产生的干扰素γ(约33倍)，甚至在没有外源性SIY肽的再刺激时也是如此(图5B)。综合而言，这些数据表明，经抗-EGFR-干扰素β活化的树突细胞通过增加交叉引发功能而增强了CD8⁺T细胞活化。此外，这些结果表明，是所述融合蛋白的干扰素β组分引起了树突细胞交叉呈递通路的活化，因为单独的抗-EGFR没有诱导强的树突细胞活化。为了测试抗-EGFR-干扰素β是否也增加了直接引发功能，将外源的抗原产生性肽(SIY)添加到培养基中，其进一步增加了SIY-特异性2C T细胞应答。在外源SIY-肽再刺激之后，与抗-EGFR处理相比，来自经抗-EGFR-干扰素β处理的小鼠的树突细胞诱导2C T细胞产生约2倍更多的干扰素γ(图5B)。这些结果表明，与来自单独经抗-EGFR处理的小鼠的树突细胞相比，来自经抗-EGFR-干扰素β处理的宿主的dLN的树突细胞很有可能在更大程度上被活化。的确，这些树突细胞具有活化标志物（包括CD86）的高表达，如通过流式细胞计数所评估的(图5C)。为了进一步解析由抗-EGFR-干扰素β诱导的树突细胞活化是否促成了增强的T细胞活化，在抗-EGFR-干扰素β处理的过程中，用DT处理携带肿瘤的CD11c-DTR BMC小鼠以耗竭树突细胞。发明人发现，当不存在树突细胞时，所述由抗-EGFR-干扰素β介导的治疗效果显著受损(图5D)。总之，这些数据表明增加的树突细胞交叉呈递引起改善的CD8⁺细胞毒性T细胞引发和功能，而这可能是抗EGFR-干扰素β的治疗效果的主要根本性机制。

实施例6

抗-EGFR-干扰素β直接靶向树突细胞以逆转耐受的肿瘤微环境用于改进的抗肿瘤效果

本申请的数据表明，增加的交叉诱导对于通过抗-EGFR-干扰素β处理带来改进的抗肿瘤效果是重要的。然而，如何通过抗-EGFR-干扰素β处理而活化树突细胞的机制仍不清楚。特别地，需要鉴别出直接促成抗-EGFR-干扰素β的治疗效果的表达I型干扰素受体的细胞。为了解决这个问题，将I型干扰素受体^fl/fl小鼠与各种Cre-Tg小鼠一同哺育。当I型干扰素受体在CD11c-Cre-I型干扰素受体^fl/fl小鼠中的CD11c⁺细胞中选择性缺失时，抗-EGFR-干扰素β的抗肿瘤效果显著减少（图6A)，这表明，通过抗-EGFR-干扰素β直接活化树突细胞可能是对其治疗效果做出主要贡献的因素。当I型干扰素受体在CD4-Cre-I型干扰素受体^fl/fl小鼠的T细胞中选择性缺失时，抗-EGFR-干扰素β的抗肿瘤效果略微受损但没有显著受损（图6B)，这表明使I型干扰素受体直接靶向T细胞可使已经被树突细胞激活的T细胞被进一步活化，从而产生改进的抗肿瘤效果。为了进一步测试这一想法，发明人在体外测定中评估了抗-EGFR-干扰素β刺激在树突细胞和T细胞活化中的效果；的确，抗-EGFR-干扰素β增加了经纯化的树突细胞和T细胞的活化(图12)。这些数据结合在一起表明了，I型干扰素受体表达性树突细胞的直接活化在抗-EGFR-干扰素β介导的治疗效果中起主要作用，而通过在T细胞上表达I型干扰素受体进一步增强了这种作用。

实施例7

拮抗抗-EGFR-干扰素β诱导的PD-L1表达实现了无肿瘤的效果

虽然与单独的抗-EGFR抗体相比，抗-EGFR-干扰素β融合实现了更有效的抗肿瘤效果，残留的肿瘤最终会复发。发明人因此想了解，抗-EGFR-干扰素β处理是否可能诱导抑制性分子的表达以防止组织损伤，而这将随着时间弱化抗肿瘤效果。发明人在抗-EGFR-干扰素β处理后评估了PD-L1的表达，并且在体内和体外都清楚地观察到了肿瘤细胞上增加的PD-L1表达(图7A和7B)。发明人然后测试了组合的抗-PD-L1和抗-EGFR-干扰素β处理是否能够进一步增强抗-EGFR-干扰素β的长期效果。令人惊讶地，当联合使用抗-PD-L1与抗-EGFR-干扰素β处理时，长期治疗效果得到了显著提高；在所述处理之后，小鼠保持无肿瘤至少60天并且对肿瘤刺激有抗性(图7C，以及未显示的数据)。此外，通过抗-PD-L1处理阻断PD-1与PD-L1的相互作用进一步提高了特异性的抗肿瘤T细胞应答(图7D)。相反，当将抗-EGFR-干扰素β与另外两个在T细胞上表达的主要抑制分子的抗体抗-CTLA-4、抗-BTLA组合施用时，没有观察到任何类似的协同效果(图13)。总之，发明人的数据表明拮抗肿瘤细胞上由抗-EGFR-干扰素β诱导的PD-L1表达能够使抗-EGFR-干扰素β的抗肿瘤效果最大化并获得令人印象深刻的无肿瘤结果，甚至对于抗体抗性肿瘤也是如此。这种基于组合的策略很可能增加抗体抗性宿主的整体应答和治愈率，甚至在不能响应抗-PD-1抗体（其直接阻断T细胞表达的PD-1）的宿主中也能实现。

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Claims

1.干扰素β与阻断PD-1/PDL信号传导通路的抗体共同用于制备药物或药物试剂盒的用途，其中所述药物或药物试剂盒用于治疗肿瘤，所述肿瘤选自：乳腺癌，肺癌和黑色素瘤。

2.根据权利要求1的用途，其中所述阻断PD-1/PDL信号传导通路的抗体为抗PDL1抗体。

3.干扰素β与阻断PD-1/PDL信号传导通路的抗体共同用于制备药物或药物试剂盒的用途，其中所述药物或药物试剂盒用于克服肿瘤对于抗体疗法的抗性，所述肿瘤选自：乳腺癌，肺癌和黑色素瘤。

4.根据权利要求3的用途，其中所述阻断PD-1/PDL信号传导通路的抗体为抗PDL1抗体。

5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中所述干扰素β与结合肿瘤相关抗原的靶向部分相连，其中所述靶向部分与所述干扰素β直接相连或通过连接子相连。

6.根据权利要求5的用途，其中所述结合肿瘤相关抗原的靶向部分为结合肿瘤相关抗原的抗体。

7.根据权利要求6的用途，其中所述结合肿瘤相关抗原的抗体为抗EGFR抗体或抗Neu抗体。

8.根据权利要求5的用途，其中所述干扰素β与结合肿瘤相关抗原的靶向部分形成融合蛋白。

9.根据权利要求6-7中任一项的用途，其中所述干扰素β与所述结合肿瘤相关抗原的靶向部分形成融合蛋白。

10.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中所述肿瘤或携带所述肿瘤的宿主在下列一项或多项中有缺陷：

1)I型干扰素的表达和/或功能；

2)I型干扰素受体的表达和/或功能；和

3)树突细胞的交叉呈递以及由此产生的抗肿瘤细胞毒性T细胞。

11.根据权利要求10的用途，其中1)中所述I型干扰素为干扰素α5和/或干扰素β。

12.根据权利要求10的用途，其中2)中所述I型干扰素受体是树突细胞上的I型干扰素受体。

13.试剂盒，其含有：

a)IFNβ；和

b)阻断PD-1/PDL信号传导通路的抗体。

14.权利要求13的试剂盒，其中所述阻断PD-1/PDL信号传导通路的抗体为抗PDL1抗体。

15.权利要求13或14的试剂盒，其中所述干扰素β与结合肿瘤相关抗原的靶向部分相连，其中所述靶向部分与所述干扰素β直接相连或通过连接子相连。

16.根据权利要求15的试剂盒，其中所述靶向部分为抗体。

17.根据权利要求15的试剂盒，其中所述靶向部分为抗EGFR抗体或抗Neu抗体。

18.根据权利要求15的试剂盒，其中所述干扰素β与所述靶向部分形成融合蛋白。

19.根据权利要求16或17的试剂盒，其中所述干扰素β与所述靶向部分形成融合蛋白。

20.根据权利要求13或14的试剂盒，其中所述试剂盒用于治疗肿瘤，所述肿瘤为乳腺癌，肺癌或黑色素瘤。

21.根据权利要求20的试剂盒，其中所述肿瘤或携带所述肿瘤的宿主在下列一项或多项中有缺陷：

1)I型干扰素的表达和/或功能；

2)I型干扰素受体的表达和/或功能；和

3)树突细胞的交叉呈递以及由此产生抗肿瘤细胞毒性T细胞。

22.根据权利要求21的试剂盒，其中1)中所述I型干扰素为干扰素α5和/或干扰素β。

23.根据权利要求21的试剂盒，其中2)中所述I型干扰素受体是树突细胞上的I型干扰素受体。