CN103536667A

CN103536667A - 止痢中药组合物

Info

Publication number: CN103536667A
Application number: CN201310554536.3A
Authority: CN
Inventors: 孙振华
Original assignee: Sichuan Ba Er Agriculture And Animal Husbandry Group Co ltd
Current assignee: Sichuan Baal Animal Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2013-11-08
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2033-11-08
Also published as: CN103536667B

Abstract

本发明提供了一种止痢中药组合物，组合物包括：以重量份数计，金银花5-20份，赤芍1-10份，白头翁8-30份，连翘4-15份，苦参5-20份，黄芪6-30份，板蓝根9-35份，贯众2-15份，麻黄4-15份，甘草1-10份，石膏5-20份。本发明提供的止痢中药组合物，是由金银花、赤芍、白头翁、连翘、苦参、黄芪、板蓝根、贯众、麻黄、甘草、石膏11味中药组成的新型复方制剂，具有清热解毒，除湿止痢，扶正祛邪，活血化瘀等功能，具有抑制大肠杆菌、沙门氏菌、抗炎、增强免疫功能等作用，是治疗畜禽大肠杆菌病和白痢的有效组方。

Description

止痢中药组合物

技术领域

本发明涉及动物医药领域，具体而言，涉及止痢中药组合物。

背景技术

痢疾，古称肠辟、滞下。为急性肠道传染病之一。临床以发热、腹痛、里急后重、大便脓血为主要症状。若感染疫毒，发病急剧，伴突然高热，神昏、惊厥者，为疫毒痢。痢疾初起，先见腹痛，继而下痢，日夜数次至数十次不等。多发于夏秋季节，由湿热之邪，内伤脾胃，致脾失健运，胃失消导，更挟积滞，酝酿肠道而成。在禽畜养殖领域，禽畜因为感染痢疾，死亡率较高，对农户带来了极大的经济损失。

目前常用的治疗禽畜痢疾的药品主要为西药片剂，但是西药的副作用较大，而且长期服用禽畜会产生抗药性。

发明内容

本发明的目的在于提供止痢中药组合物，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供的止痢中药组合物，以重量份数计，由以下组分制成：

金银花5-20份，赤芍1-10份，白头翁8-30份，连翘4-15份，苦参5-20份，黄芪6-30份，板蓝根9-35份，贯众2-15份，麻黄4-15份，甘草1-10份，石膏5-20份。

本发明提供的止痢中药组合物，是由金银花、赤芍、白头翁、连翘、苦参、黄芪、板蓝根、贯众、麻黄、甘草、石膏11味中药组成的新型复方制剂，具有清热解毒，除湿止痢，扶正祛邪，活血化瘀等功能，具有抑制大肠杆菌、沙门氏菌、抗炎、增强免疫功能等作用，是治疗畜禽大肠杆菌病和白痢的有效组方。

金银花具有清热解毒、抗炎的功效；赤芍具有行瘀、止痛、凉血、消肿的功效；白头翁具有极好地抗菌抗病毒作用；连翘能够清热解毒，对金黄色葡萄球菌、贺氏痢疾杆菌有很强的抑制作用；苦参清热燥湿，杀虫，利尿，用于热痢，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，疥癣麻风；黄芪有益气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿之功效；板蓝根具有清热解毒、凉血消肿之功效；贯众既能清气分之实热，又能解血分之热毒，凡温热毒邪所致之症皆可用之；麻黄作为发散风寒药成分；甘草主治清热解毒；石膏清热泻火，除烦止渴，用于外感热病，高热烦渴，肺热喘咳，胃火亢盛等症状。

该止痢中药组合物通过对小鼠的最大耐受量实验、亚急性毒性实验、本体动物的毒性实验证实，无任何毒副作用，按临床用药剂量使用安全可靠。突显了高效低毒，绿色环保中兽药的特点，彰显了传统医疗资源的优势。提升了民族智慧的科技层面，拓宽了中兽医药的应用领域。

本发明是申请人联合西南大学荣昌校区动物医学系研发的用于预防和治疗畜禽白痢、大肠杆菌病、肠炎、腹泻等传染病的高效中药复方制剂。该制剂是科研人员运用中兽医扶正祛邪和异病同治的辨证论治理论，结合现代免疫学机理研制而成的中药复方制剂。可有效减少养殖业损失，保障动物源性食品安全，增加农民收入，促进养鸡业健康可持续发展。

附图说明

图1为赤芍的纤维在显微镜下的图片A1；

图2为赤芍的淀粉粒在显微镜下的图片A2；

图3为赤芍的导管在显微镜下的图片A3；

图4为赤芍的草酸钙簇晶在显微镜下的图片A4；

图5为赤芍的草酸钙方晶在显微镜下的图片A5；

图6为苦参的表皮细胞在显微镜下的图片B1；

图7为苦参的草酸钙方晶在显微镜下的图片B2；

图8为苦参的导管在显微镜下的图片B3；

图9为苦参的木栓细胞在显微镜下的图片B4；

图10为苦参的纤维在显微镜下的图片B5；

图11为黄芪的导管在显微镜下的图片C1；

图12为黄芪的木栓细胞在显微镜下的图片C2；

图13为黄芪的石细胞在显微镜下的图片C3；

图14为黄芪的纤维束在显微镜下的图片C4；

图15为板蓝根的导管在显微镜下的图片D1；

图16为板蓝根的淀粉粒在显微镜下的图片D2；

图17为板蓝根的纤维束在显微镜下的图片D3；

图18为绵马贯众的淀粉粒在显微镜下的图片E1；

图19为绵马贯众的间隙腺毛在显微镜下的图片E2；

图20为绵马贯众的维管束在显微镜下的图片E3；

图21为绵马贯众的散在油滴在显微镜下的图片E4；

图22为甘草的草酸钙方晶在显微镜下的图片F1；

图23为甘草的导管在显微镜下的图片F2；

图24为甘草的晶纤维在显微镜下的图片F3；

图25为甘草的木栓细胞在显微镜下的图片F4；

图26为麻黄的导管在显微镜下的图片G1；

图27为麻黄的晶纤维在显微镜下的图片G2；

图28为麻黄的草酸钙砂晶在显微镜下的图片G3；

图29为麻黄的石细胞在显微镜下的图片G4；

图30为麻黄的薄壁细胞在显微镜下的图片G5；

图31为麻黄的纤维在显微镜下的图片G6；

图32为白头翁的导管在显微镜下的图片H1；

图33为白头翁的非腺毛在显微镜下的图片H2；

图34为白头翁的韧皮细胞在显微镜下的图片H3；

图35为连翘的薄壁细胞在显微镜下的图片I1；

图36为连翘的非腺毛在显微镜下的图片I2；

图37为连翘的石细胞在显微镜下的图片I3；

图38为连翘的维管束在显微镜下的图片I4；

图39为分别使用水煎法和水醇法提取的药物对大肠杆菌的抑菌效果图；

图40为分别使用水煎法和水醇法提取的药物对沙门氏菌的抑菌效果图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

实施例1：

止痢中药组合物，以重量份数计，由以下组分制成：

金银花具有清热解毒、抗炎的功效；赤芍具有行瘀、止痛、凉血、消肿的功效；白头翁具有极好地抗菌抗病毒作用；连翘能够清热解毒，对金黄色葡萄球菌、贺氏痢疾杆菌有很强的抑制作用；苦参清热燥湿，杀虫，利尿，用于热痢，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，疥癣麻风；黄芪有益气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿之功效；板蓝根具有清热解毒、凉血消肿之功效；贯众既能清气分之实热，有能解血分之热毒，凡温热毒邪所致之症皆可用之；麻黄作为发散风寒药成分；甘草主治清热解毒；石膏清热泻火，除烦止渴，用于外感热病，高热烦渴，肺热喘咳，胃火亢盛等症状。

该痢中药组合物通过对小鼠的最大耐受量实验、亚急性毒性实验、本体动物的毒性实验证实，无任何毒副作用，按临床用药剂量使用安全可靠。凸现了高效低毒，绿色环保中兽药的特点，彰显了传统医疗资源的优势。提升了民族智慧的科技层面，拓宽了中兽医药的应用领域。

本发明提供的止痢中药组合物的优势：

（1）高效低毒，绿色环保

较之单体人工药物，“金翁止痢颗粒”显示出纯天然、无污染的优势，显现出多靶点、广效能、低毒副、少残留的特色。不仅开创了我国研制新型抗感染中兽药复方制剂的先河，而且能有效保障食用动物不受有害残留的污染，确保动物源性食品安全。

（2）效果可靠、疗效确实

经临床试验证实，“金翁止痢颗粒”对自然发病的畜禽白痢的治疗，高、中剂量治疗组治愈率为80.0％，死亡率、总效率均分别为10％、90.0％。高、中、低剂量对白痢都有治疗作用，能缓解症状，降低死亡率，且高、中剂量在降低死亡率，提高治愈率等方面与氟苯尼考的效果相当。

（3）使用方便、成本低廉

“金翁止痢颗粒”该产品剂型简单，使用方便，可通过拌料饲喂或饮水达到治疗的目的，特别适用于规模化养殖场。本品疗效确切，用量少，同等情况下与使用西药进行预防相比，每羽可节约2元成本。

实施例2：止痢中药组合物，以重量份数计，由以下组分制成：

金银花6-18份，赤芍2-8份，白头翁9-28份，连翘5-13份，苦参6-18份，黄芪7-28份，板蓝根10-33份，贯众3-13份，麻黄6-13份，甘草2-8份，石膏6-18份。

实施例3：止痢中药组合物，以重量份数计，由以下组分制成：

金银花7-16份，赤芍3-6份，白头翁10-26份，连翘6-11份，苦参7-16份，黄芪8-26份，板蓝根11-31份，贯众4-11份，麻黄7-11份，甘草3-6份，石膏7-16份。

实施例4：止痢中药组合物，以重量份数计，由以下组分制成：

金银花8-14份，赤芍4-5份，白头翁11-24份，连翘7-9份，苦参8-14份，黄芪9-24份，板蓝根12-29份，贯众5-9份，麻黄8-10份，甘草4-5份，石膏8-14份。

实施例5：止痢中药组合物，以重量份数计，由以下组分制成：

金银花8份，赤芍3份，白头翁11份，连翘6份，苦参7份，黄芪9份，板蓝根12份，贯众5份，麻黄7份，甘草2份，石膏8份。

实施例6：止痢中药组合物，以重量份数计，由以下组分制成：

金银花9份，赤芍5份，白头翁12份，连翘8份，苦参9份，黄芪10份，板蓝根13份，贯众6份，麻黄9份，甘草5份，石膏9份。

实施例7：止痢中药组合物，以重量份数计，由以下组分制成：

金银花10份，赤芍6份，白头翁13份，连翘9份，苦参10份，黄芪11份，板蓝根15份，贯众7份，麻黄10份，甘草6份，石膏10份。

实施例8：止痢中药组合物，以重量份数计，由以下组分制成：

金银花12份，赤芍7份，白头翁16份，连翘10份，苦参12份，黄芪13份，板蓝根20份，贯众8份，麻黄12份，甘草7份，石膏12份。

实施例9：止痢中药组合物，以重量份数计，由以下组分制成：

金银花14份，赤芍8份，白头翁14份，连翘12份，苦参14份，黄芪15份，板蓝根22份，贯众10份，麻黄14份，甘草9份，石膏15份。

实施例10：止痢中药组合物，以重量份数计，由以下组分制成：

金银花18份，赤芍9份，白头翁20份，连翘14份，苦参18份，黄芪20份，板蓝根30份，贯众12份，麻黄15份，甘草10份，石膏18份。

对本发明提供的治理中药组合物的药材成分以及药效的鉴定：

（一）、中药的显微鉴定

1前言显微鉴定系指利用显微镜对药材及成方制剂组成药味的组织，细胞或细胞后含物等特征进行鉴别，以确定其真伪的一种方法，是中药鉴别的重要手段之一。通过本试验操作，对药材粉末的细胞形态结构进行观察，旨在初步鉴定药材真伪，为新药制备提供前期准备。

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1试验药品赤芍、白头翁、连翘、苦参、黄芪、板蓝根、贯众、麻黄、甘草、稀碘液、斯氏试液。

2.1.2试验仪器B203LEDR生物显微镜（中国.重庆）、显微摄影装置、HK-08摇摆式粉碎机（中国.广州）、载玻片、盖玻片、封装袋等。

2.2试验方法

2.2.1粉碎将购买回来的中药利用粉碎机加工粉碎制成1cm以下的粉粒，密封干燥保存。

2.2.2制片将药品分为含淀粉类和不含淀粉类两类，含淀粉类的赤芍、苦参、黄芪、板蓝根、贯众采用稀碘液制片；不含淀粉类的白头翁、甘草、麻黄、连翘采用斯氏试液制片。制片方法，将载玻片与盖玻片用无水乙醇浸泡后，用洁净纱布擦拭，至表面洁净无瑕，再将供显微观察的粉末样品置于载玻片上，然后加入对应的试液适量，用玻璃棒搅匀，用镊子将盖玻片沿一侧轻轻放下，使液体自然展匀即可。可用滤纸吸拭溢出的液体或从盖玻片边缘补充液体不足的空隙。

2.2.3镜检将制备好的待检片置于10×40的显微镜下观察，观察显微镜下该药材的粉末结构特征，利用显微摄影装置对其进行拍照记录。

3试验结果

如附图1-图38。

4分析与讨论

4.1操作过程中的注意事项选样要具有代表性，粉末的颗粒大小要控制在1cm以下，不易粉碎的药材经粉碎后过6号筛，减少制片过程中容易出现气泡、形态结构过于复杂、不便于观察的问题；涂片过程中加样不宜过多或过少，过多容易出现堆叠，不利于观察和图片的美观，过少则容易出现细胞结构过少，不易找全所有粉末结构；制片按使用试剂分类，将含有淀粉的药材选用稀碘液制片，无淀粉粒的选用斯氏试液制片，需要观察特殊结构的选用相应的染色方法；熟练显微操作技术，力求所拍摄照片清晰、结构完整，具有代表性。

4.2粉末结构的描述

本次试验所选9种药材除连翘为果皮类中药外其余均为根茎类中药，因此粉末结构主要有；淀粉粒，观察时，应注意淀粉粒的多少、形状、类型、大小、脐点形状及位置，层纹等特征。结晶，大多为草酸钙结晶（方晶、簇晶、针晶、砂晶），偶含硅质块。纤维，常分为韧皮纤维和木纤维两大类，其中木纤维又分为韧型纤维和纤维管胞。石细胞，多成群或单个存在，有的与木栓细胞或薄壁细胞相连接，观察时应注意石细胞的形状、大小、细胞壁增厚形态和程度、孔纹形状及大小、孔沟密度及特征。导管，导管多为网纹、梯纹或具缘纹孔，少为螺纹和环纹。木栓组织，双子叶植物根和根茎类中常见，单子叶植物根茎中少有存在。薄壁细胞，包括皮层、韧皮部、木质部、射线及髓部的薄壁细胞，薄壁细胞中的后含物或特殊物质是重要鉴别特征。

5结论

将所拍摄的粉末成分与《中药材显微鉴别彩色图鉴》以及《中国兽药典》进行对比，初步确定此9种中药材为真药。显微镜下的附图如图1至图38。

（二）、处方筛选（大肠杆菌抗菌试验）

1细菌大肠埃希氏菌：国家兽医微生物菌种保存中心，编号：CVCC210，血清型O9：K103

2方法

2.1棋盘法筛选复方中药

2.1.1中药提取按照均方设计，将药物分成12组，1-10药物分别为：金银花、赤芍、白头翁、连翘、苦参、黄芪、板蓝根、贯众、麻黄、甘草，每组份药量详见表1，分别提取中药复方，提取药液体后，准确称取石膏9份，溶解混匀。

表1均方设计表

编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	总
												1	1	2	3	4	5	6	8	9	10	12	60
2	2	4	6	8	10	12	3	5	7	11	68
												3	3	6	9	12	2	5	11	1	4	10	63
4	4	8	12	3	7	11	6	10	1	9	71
												5	5	10	2	7	12	4	1	6	11	8	66
6	6	12	5	11	4	10	9	2	8	7	74

7	7	1	8	2	9	3	4	11	5	6	56
												8	8	3	11	6	1	9	12	7	2	5	64
9	9	5	1	10	6	2	7	3	12	4	59
												10	10	7	4	1	11	8	2	12	9	3	67
11	11	9	7	5	3	1	10	8	6	2	62
												12	12	11	10	9	8	7	5	4	3	1	70

2.1.2微量棋盘稀释法

①每种抗菌药物从1g生药/ml浓度开始用灭菌肉汤培养基倍比稀释，取6～8个稀释度，各取100μl分别排列在96孔无菌微孔板的行与列上。

②在无菌微孔板中加入10μl菌液，同时设不用药的细菌。

③过夜培养。

④观察各组细菌生情况，在对照组没有长菌的前提下判断细菌的生长情况，从而选择最佳抑菌药物。具体操作见下表2：

表2药物两倍稀释法方法

2.2牛津杯法试验

在营养琼脂平板上，用无菌接种环蘸取目标菌液在琼脂表面均匀涂布，以无菌操作将灭菌的不锈钢牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管)放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。平板上放4支小管。待1min后，分别向各小管中滴加1g/mL生药的提取液200μL的各种药液，勿使其外溢。培养18h，测量抑菌圈直径，求出4个抑菌直径的平均值，观察其抑菌情况。

3结果

3.1不同组的止痢中药组合物提取液对大肠杆菌的抑菌试验结果（棋盘法试验结果）

经试验，止痢中药组合物提取液在不同的配比下，抑制大肠杆菌生长情况不一，其中第8组，第4组，第12组均有一定抑菌效果，其中第8组抑菌效果良好，详见表4。

表4不同组药物对大肠杆菌的抑菌试验结果

组别

0

1

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

第1组

-

+

第2组

-

+

第3组

-

+

第4组

-

+

第5组

-

+

第6组

-

+

第7组

-

+

第8组

-

+

第9组

-

+

第10组

-

+

第11组

-

+

第12组

-

+

注：-表示细菌未生长，+表示细菌已经生长。

3.2不同组的止痢中药组合物提取液对大肠杆菌的抑菌试验结果（牛津杯法试验结果）

经试验检测，不同配比的止痢中药组合物提取液对大肠杆菌的均有一定的抑菌效果，其中第8组（金银花8份，赤芍3份，白头翁11份，连翘6份，苦参7份，黄芪9份，板蓝根12份，贯众5份，麻黄7份，甘草2份）效果较为明显，可能是其中含有大量的板蓝根、白头翁、金银花、麻黄等主要抗大肠杆菌中药，详见表5。

表5牛津杯法检测不同组药物对大肠杆菌的抑菌试验结果

（三）、止痢中药组合物提取工艺的筛选与药效初探

1试验动物和中药

大肠埃希氏菌：国家兽医微生物菌种保存中心，编号：CVCC210，血清型O9：K1032

鸡白痢沙门氏菌：国家兽医微生物菌种保存中心，编号：CVCC533，C79-13

家兔：新西兰白兔，体重2±0.2kg，健康无病，雌雄各半，购于西南大学荣昌校区动物科。

小鼠：昆明种小鼠，体重20±2g，健康无病，雌雄均有，购于西南大学荣昌校区动物科。

中药：所有中药巴尔公司提供。

2试验方法

2.1挥发油提取

旋转蒸发仪(挥发油蒸发回流)：按配方配金银花、白术、连翘、板蓝根、麻黄适量，加入旋转蒸发仪旋转瓶中，加入相当于原料重量5-10倍水，加热回流，回收蒸馏液，对蒸馏液进行二次旋转蒸发回流，收蒸馏液约为原料重的十分之一到十分之二的体积即停止蒸馏，备用。

2.2其他有效活性成分提取工艺筛选

2.2.1水煎提取法

赤芍、白头翁、苦参、黄芪、贯众、甘草与金银花、连翘、板蓝根、麻黄提取挥发油后药渣。加水煎煮提取三次，第一次加入相当于原料重量的5-10倍水，浸泡2-4小时后煎煮1-3小时，过滤，收集滤液；第二次和第三次各加入相当于原料重量2-3倍的水，煎煮0.5-1.5小时，过滤，收集滤液；合并三次滤液，按处方量加入生石膏，溶解，浓缩，即制得提取液。（重复三次）

2.2.2水醇提取法

赤芍、白头翁、苦参、黄芪、贯众、甘草与金银花、连翘、板蓝根、麻黄提取挥发油后药渣。加水醇（水和乙醇各50%）煎煮提取三次，第一次加入相当于原料重量的5-10倍水醇（水和乙醇各50%），浸泡12-4小时后煎煮1-3小时，过滤，收集滤液；第二次和第三次各加入相当于原料重量2-3倍的水醇（水和乙醇各50%），煎煮0.5-1.5小时，过滤，收集滤液；合并三次滤液，回收乙醇，按处方量加入生石膏，溶解，浓缩，即得提取液。（重复三次）

2.3药效试验检测

2.3.1抗菌试验（大肠杆菌，鸡白痢沙门氏菌）

分别用两种提取工艺提取出来的中药提取液对大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌的抑菌试验，先测定药物的MIC值，再用牛津杯法检测抑菌效果。（重复三次）

2.3.2解热试验（发热模型-家兔）

取健康、体温正常的家兔50只，耳静脉注射脱脂牛奶，剂量为1-2ml/10kg，45min后测肛温，将升温0.8℃以上的家兔均分5组，每组10只。即：生理盐水组、药物高剂量组、中剂量组、低剂量组，安乃近注射液组，分别腹腔注射给药，按所示剂量连续给药3天，每隔4小时测药物对各组兔体温的影响。（重复三次）

2.3.3抗炎试验

分组：取昆明雄性小鼠100只，随机分为5组：分别为(1)空白对照组；(2)阿司匹林组：65mg/kg；(3)受试药低剂量组；(4)受试药中剂量组；(5)受试药高剂量组。

给药方式：灌胃法给药1次/天，7天。（重复三次）

造模：最后1次给药45min后除空白对照组外其他组小白鼠右耳的前后两面涂布二甲苯0.2ml/只致炎，左耳涂等量生理盐水作对照。

测定：涂药后30min后，用9mm打孔器分别在小鼠左右耳的同一部位打下圆耳片，用分析天平称其重量。

计算：每鼠（右耳片重-左耳片重）/左耳片重×100%即为肿胀度。

2.3.4增强免疫试验

2.3.4.1动物分组

将小鼠随机分为空白组（只灌胃生理盐水）、模型组（前5天腹腔注射环磷酰胺，灌胃生理盐水）、阳性药物组（前5天腹腔注射环磷酰胺，之后灌胃黄芪多糖）、高剂量组（前5天腹腔注射环磷酰胺，之后灌胃40mg/kg的止痢中药组合物提取液）、中剂量组（前5天腹腔注射环磷酰胺，20mg/kg的止痢中药组合物提取液）、低剂量组（前5天腹腔注射环磷酰胺，10mg/kg的止痢中药组合物提取液），每组小鼠10×4只。按0.2mL/10g灌胃给药，1次/天，连续给药14天。据本实验室研究，黄芪多糖灌胃量为30mg/kg。

2.3.4.2碳粒廓清指数测定

各组小鼠末次给药24h后，以0.1mL/10g体重的剂量，尾静脉注射处理后的印度墨汁，注射后2、10min分别用经肝素处理过的吸管，从小鼠眼眶后静脉取血20μL，立即吹入2mL质量分数为0.1%的Na₂CO₃溶液中摇匀，取血完毕后以质量分数为0.1%的Na₂CO₃溶液较零，于650nm测吸光度（OD），计算碳粒廓清指数（K）和校正廓清指数（α）。

K=（lgA1－lgA2）/（t2－t1）

α=K1/3·体重/（肝重+脾重）

其中，A1、A2分别代表先后2次所采血样测得的吸光度，t2－t1代表2次采血的时间间隔。

2.3.4.3免疫器官指数的测定

称小鼠体质量，取脾脏和胸腺，称其湿质量，按公式计算脾指数和胸腺指数。脾脏指数=脾脏/体重；胸腺指数=胸腺/体重。

2.3.4.4血清溶血素的测定

给药第7天各组小鼠腹腔注射5%CRBC悬液0.2mL进行免疫，免疫7天，末次给药24h后，各鼠股动脉取血于离心管中，室温放置1h，2000rpm离心10min。离心后取血清用生理盐水稀释100倍。取稀释后血清1mL与5%CRBC悬液0.5mL、10%补体0.5mL，混匀，在37℃恒温箱中保温30min后于0℃冰箱（或冰水浴中）终止反应。2000rpm离心10min后取上清液于紫外分光光度计540nm处测得吸光度值A，溶血素的值以半数溶血值HC₅O表示。

HC₅O=(样品吸光度值/CRBC半数溶血时吸光度值)稀释倍数。

2.3.4.5T、B淋巴细胞转化试验测定

在无菌条件下取脾，然后用PBS缓冲液冲洗两遍。用无菌的研磨器研磨后取浆液，离心(1000r/min)5min，弃上清液，加入pH为7.2的TrisNH₄Cl 5mL，轻轻吹打，使红细胞完全破裂。离心(1000r/min)5min，弃上清液，用PBS缓冲液冲洗1次，再以1000r/min离心5min，弃上清液。用含10%的新生牛血清及2%的庆大霉素的RPM I-1640全培养液重悬细胞，调整脾细胞浓度为3×106个/mL，备用。

T淋巴细胞转化试验取96孔细胞培养板，每孔加制备成脾细胞悬液200μL，刀豆蛋白A15μL（终浓度为6mg/L），8复孔，于37℃下在浓度为5%的CO2培养箱中培养72小时。于培养结束前4小时弃上清100μL，加人MTT液20μL继续培养4h，吸去上清液，每孔加入DMSO150μL终止反应，将96孔板移入平板震荡器，水平震荡10min，使MTT还原产物完全溶解，用酶联免疫检测仪于630nm波长处测定每孔吸光度（OD值）。

B淋巴细胞转化试验将刀豆蛋白A换成脂多糖20μL/孔（终浓度为50mg/L），同上操作检测B淋巴细胞增殖能力。

3试验结果

3.1抗菌试验结果经过2种不同方法提取的中药对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌试验，结果显示水醇提取法提取物对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果优于水煎提取法提取的中药，其中水煎提取法提取中药对大肠杆菌处于不敏或低敏，对沙门氏菌处于低敏或中敏；水醇提取法提取的中药对大肠杆菌有中敏或高敏效果，对沙门氏菌有中敏和高敏的效果，详见表6，图39，图40。

表6中提取法提取中药对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌试验结果

3.2解热试验结果（正在进行）

3.3抗炎试验结果

表6中提取法提取的中药抗炎试验结果

3.4免疫增强试验结果

3.4.1碳粒廓清指数测定结果

从表3可知，水煎法和水醇提法量中方法的空白组、模型组和阳性药物组碳粒廓清指数差异不显著（P＜0.05），且模型组明显降低，与空白组相比，差异极显著（P＜0.01）；在水煎法试验中高、中、低剂量组与空白组差异极显著（P＜0.01），并存在一定的量效关系。水醇提法，高、中剂量组效果较好，与阳性药物组相比差异不显著（P＜0.05）。详见表7。

表7药物组对免疫低下小鼠碳粒廓清指数（α）影响

3.4.2免疫器官指数测定结果

试验结果表明，水煎法和水醇提法2种方法的空白组、模型组和阳性药物组脾脏指数和胸腺指数差异不显著（P＜0.05），且模型组明显降低，与空白组相比，差异极显著（P＜0.01）；在水煎法试验中，药物对免疫低下小鼠脾脏指数和胸腺指数都有一定的提高，且呈一定的量效关系；而水醇提法提取的药物对免疫低下小鼠胸腺指数和脾脏指数均有一定的增加，呈量效关系，且高剂量组与空白组相比差异不显著（P＜0.05）。详见表8。

表8药物对免疫低下小鼠免疫器官指数（mg/g）影响

3.4.3血清溶血素测定结果

试验结果表明，水煎法和水醇提法的空白组、模型组和阳性药物组HC5O差异不显著（P＜0.05），且模型组明显降低，与空白组相比，差异极显著（P＜0.01）；在水煎法试验中高、中、低剂量组与空白组差异极显著（P＜0.01）；水醇提法的高、中剂量组效果较好，且与空白组相比差异不显著（P＜0.05）。详见表9。

表9药物对免疫低下小鼠血清溶血素影响

3.4.4T、B淋巴细胞转化试验结果

试验结果表明，水煎法和水醇提法的空白组、模型组和阳性药物组小鼠T、B淋巴细胞差异不显著（P＜0.05），且模型组明显降低，与空白组相比，差异极显著（P＜0.01）；水煎提取法药物对小鼠T、B淋巴细胞转化、增殖能力有所提高，模型组相比，差异家显著（P<0.01）；水醇提取物对小鼠T、B淋巴细胞转化、增殖能力效果较为明显，效果极显著优于空白对照组（P＜0.01），详见表10。

表10药物对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响（OD₆₃₀）

4结论

综合以上的抑菌试验、抗炎试验、解热试验、免疫增强试验，水醇提法提取出的中药效果均有于水煎提取发提取的中药，故此对此复方中药有效活性成分的提取采用水醇提取法，详见表11。

表11中提取方法提取的中药活性成分试验比较结果

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。