CN103505736A - 基于改性透明质酸的高分子脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于改性透明质酸的高分子脂质体及其制备方法，高分子脂质体粒径在80～150nm，Zeta电位为-36～-40mV。将硬脂酸改性透明质酸溶于二氯甲烷中，形成油相；将油相在100～250w功率范围下进行超声，加入去离子水，然后用超声波发生器进行超声分散，形成均匀的乳液分散体系；将上述乳液在25～50℃下于旋转蒸发仪上以20～100r/min的旋转速度进行旋蒸，当有机溶剂完全挥发后即得到高分子脂质体。制备的这种高分子脂质体粒径小于150nm，其粒径均匀，分散性好；可以在血液中自由运行，因而可降低正电性造成的细胞毒性。整个制备过程简单快捷，制备周期短，产率高，适合大批量生产。

Description

基于改性透明质酸的高分子脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于改性透明质酸的高分子脂质体及其制备方法；属于药物技术领域。

背景技术

脂质体是由磷脂分散在水中形成的具有双分子层的直径在几十纳米至数微米之间的球状粒子。1965年Bangham等发现脂质体，20世纪70年代首先将脂质体作为药物载体应用。其双分子层结构能有效地包裹亲水、亲脂及大分子药物，可作为难溶性药物的载体，增加其局部浓度；药物被包埋在脂质体中缓慢释放，在血循环中脂质体药物要比游离药物有更长的滞留时间，因而延长了药物的作用时间，起到长效作用；药物由于有脂质体包封将提高被包封药物的稳定性，还能保护定向至某些需治疗的靶器官或组织中释放，使这些靶器官或组织药物浓度提高，提高了药物的疗效；与此同时，另外一些器官或组织药物浓度分布很少，避免药物对这些器官或组织的影响，从而降低了药物的毒性。

特别是在经皮给药方面，通过20多年的实验和临床观察已证实了脂质体明显的促透作用。其经皮吸收的主要优点是避免肝脏首过效应和药物在胃肠道的降解和恒速给药、降低药物的不良反应等。其主要生物学作用包括：1.脂质体可包裹难以透皮的药物及易受胃肠道破坏的生化高分子药物，促进其透皮吸收，产生全身治疗作用；2.对局部应用的药物，脂质体不但有良好的促透作用，而且可降低药物的全身吸收，使药物集中于病灶局部，提高其生物利用度，降低副作用；3.脂质体的水化磷脂能够促进干燥皮肤的水化，使皮肤细腻光滑，对皮肤具有保护、美容作用；4.脂质体的成分一般为体内固有的成分，无毒，可被生物降解，对皮肤无刺激作用，等。由于脂质体具有独特的作用特点，而受到越来越多的关注。

然而传统脂质体通常由磷脂小分子组成，具有一些局限性，比如构成脂质体膜的天然卵磷脂易水解，理化稳定性差，难以长期储存，同时包封药物容易泄漏，易造成突释；另外，传统脂质体还有官能团少、不易进行表面修饰、功能单一等缺点。近期高分子脂质体的出现，有效解决了传统脂质体一些缺点，但是对目前存在的大多数高分子脂质体因材料自身问题往往具有更高的细胞毒性和较差的生物相容性。近年来，开发无毒新型材料高分子脂质体的研究受到广泛关注。

透明质酸(hyaluronic acid，HA)又称糖醛酸、玻尿酸，基本结构由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，是广泛分布在人体软结缔组织细胞外基质(ECM)中的主要蛋白多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性，无免疫原性，可食用以及静脉注射，对人体无毒害。

发明内容

鉴于目前传统脂质体以及一些高分子脂质体存在的缺陷，为了使脂质体更好的应用于药物载体，本发明提供一种既有小分子脂质体生物相容性好，细胞毒性小的优点，又具有作为高分子脂质体稳定性好、可长期储存，具有多种可表面修饰功能化基团的新型高分子脂质体及其制备方法。

硬脂酸，即十八烷酸，分子式C₁₈H₃₆O₂，工业上由油脂水解生产。硬脂酸是自然界广泛存在的一种脂肪酸，通常以甘油酯的形式存在于动物脂肪、油以及一些植物油中，这些油经水解即得硬脂酸。几乎所有油脂中都有含量不等的硬脂酸，在动物脂肪中的含量较高，是一种无毒的疏水性小分子。

本发明将硬脂酸和透明质酸以共价键连接成为双亲性高分子后，可制备一种高分子脂质体，这种高分子脂质体具有操作简便、适用性强、成本低的优点，并且粒径分布更为均匀，稳定性好，易于长期保存。由于透明质酸侧链含有大量的羧基和羟基，容易进行多功能修饰。这种高分子脂质体可同时或分别包载水溶性、油溶性和双亲性物质，包括药物、基因、磁性颗粒和量子点等，并且在高分子脂质体表面可连接多种功能基团。

本发明的技术方案如下：

本发明的基于改性透明质酸的高分子脂质体，是透明质酸与硬脂酸反应，形成硬脂酸改性透明质酸，结构式如下：

该双亲性高分子通过自组装制备成一种新型高分子脂质体，粒径在80～150nm，Zeta电位为-36～-40mV。

硬脂酸改性透明质酸制备步骤如下：

a.将原料质量份数配比为:透明质酸:硬脂酸=（1:5）～（5:1）加入到反应器，然后向反应器中加入水和二甲基亚砜质量份数为（1:3）～（2:1）的混合溶剂，透明质酸和硬脂酸质量之和与溶剂质量份数比，即原料:溶剂=（1:8）～（1:50）；同时加入催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，其中，硬脂酸:EDC:DMAP质量份数比=1:（0.2～1）:（0.05～0.5）；磁力搅拌，室温下反应3～12小时；

b.反应结束后，将产物放入8000-14000的透析袋中透析3～10天，冻干后即得硬脂酸改性透明质酸。

本发明的新型高分子脂质体制备方法，还采用反相蒸发法，制备步骤如下：

a.将硬脂酸改性透明质酸溶于二氯甲烷中，形成油相；

b.将油相在100～250w功率范围下进行超声，加入去离子水，然后用超声波发生器进行超声分散，形成均匀的乳液分散体系，其中原料、油相及水相的质量份数配比为原料:二氯甲烷:去离子水=1:（200～1000）:（400～2000）；

c.将上述乳液在25～50℃下于旋转蒸发仪上以20～100r/min的旋转速度进行旋蒸，当有机溶剂完全挥发后即得到高分子脂质体。

本发明的有益效果：

本发明首先利用透明质酸（重均分子量10000-50000）与硬脂酸反应制备了一种双亲性高分子硬脂酸改性透明质酸，然后利用上述双亲性高分子通过反相蒸发法制备了这种新型高分子脂质体。如图3粒度分析测试结果所示，制备的这种高分子脂质体粒径小于150nm，可以在血液中自由运行。如图2透射照片所示，其粒径均匀，分散性好。如图4的Zeta电位分析图，Zeta电位正电性较低，因而可降低正电性造成的细胞毒性。

本发明涉及的新型高分子脂质体的性能包括：有效粒径在80～150nm之间，粒径可控，可以根据制剂的组成成分，实验条件等进行调节；Zeta电位在-36～-40mV，正电性低，生物相容性好，细胞毒性小；稳定性高，可在水溶液中保存至少2个月；整个制备过程简单快捷，制备周期短，产率高，适合大批量生产。

附图说明

图1：硬脂酸改性透明质酸红外分析；

图2：新型高分子脂质体透射照片；

图3：新型高分子脂质体粒度分析图；

图4：新型高分子脂质体Zeta电位分析图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实施例1：

硬脂酸改性透明质酸的合成。取分子量为10000的透明质酸1g，硬脂酸5g加入到烧杯中，向烧瓶中加入12mL水和36ml二甲基亚砜，以及1g EDC和0.05g DMAP，磁力搅拌，反应3小时。反应结束后，将产物放入8000-14000分子量的透析袋中透析3天，冻干，即得硬脂酸改性透明质酸。如图1红外分析测试结果所示，其中3430cm^-1左右的宽峰是透明质酸结构中的—OH和—COOH伸缩振动重叠而成的多重吸收峰，2918、2848cm^-1为—CH₃，和—CH₂的伸缩振动吸收峰，1080.11cm^-1处峰为酯键中—C—O—C—的伸缩振动吸收峰，以及1410cm^-1左右处—CH₃和—CH₂新吸收峰的出现，均表明硬脂酸成功接枝到透明质酸主链上。

实施例2：

硬脂酸改性透明质酸的合成。取分子量为50000的透明质酸5g，硬脂酸1g加入到烧杯中，向烧瓶中加入200mL水和100ml二甲基亚砜，以及1g EDC和0.5g DMAP，磁力搅拌，反应12小时。反应结束后，将产物放入8000-14000分子量的透析袋中透析10天，冻干，即得硬脂酸改性透明质酸。

实施例3：

硬脂酸改性透明质酸的合成。取分子量为20000的透明质酸1g，硬脂酸1g加入到烧杯中，向烧瓶中加入10mL水和10ml二甲基亚砜，以及0.5g EDC和0.2g DMAP，磁力搅拌，反应6小时。反应结束后，将产物放入8000-14000分子量的透析袋中透析5天，冻干，即得硬脂酸改性透明质酸。

实施例4：

反相蒸发法。采用反相蒸发法制备高分子脂质体的过程如下：（1）精确称取10mg实施例1中的产物硬脂酸改性透明质酸加入到茄形瓶中，溶于2ml的二氯甲烷中。（2）向茄形瓶中加入4ml的去离子水，然后用探头式超声波发生器以100W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液。（3）将上述乳液25℃下于旋转蒸发仪上以20r/min的旋转速度进行旋蒸。（4）当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后即得高分子脂质体。所制备的高分子脂质体的粒度分析如图3，Zeta电位分析如图4，制备的高分子脂质体有效粒径为116.7nm，多分散性指数为0.121，Zeta电位为-37.94mV，与现有高分子脂质体相比明显降低了正电性，因而用作药物载体时具有较低的细胞毒性。

实施例5：

反相蒸发法。采用反相蒸发法制备高分子脂质体的过程如下：（1）精确称取2mg实施例1中的产物硬脂酸改性透明质酸加入到茄形瓶中，溶于2ml的二氯甲烷中。（2）向茄形瓶中加入4ml的去离子水，然后用探头式超声波发生器以250W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液。（3）将上述乳液50℃下于旋转蒸发仪上以100r/min的旋转速度进行旋蒸。（4）当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后即得高分子脂质体。所制备的高分子脂质体的性能包括：制备的高分子脂质体有效粒径为88.7nm，多分散性指数为0.152，Zeta电位为-36.29mV。实施例6：

反相蒸发法。采用反相蒸发法制备高分子脂质体的过程如下：（1）精确称取8mg实施例2中的产物硬脂酸改性透明质酸加入到茄形瓶中，溶于3ml的二氯甲烷中。（2）向茄形瓶中加入6ml的去离子水，然后用探头式超声波发生器以150W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液。（3）将上述乳液45℃下于旋转蒸发仪上以80r/min的旋转速度进行旋蒸。（4）当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后即得高分子脂质体。所制备的高分子脂质体的性能包括：制备的高分子脂质体有效粒径为93.2nm，多分散性指数为0.201，Zeta电位为-37.12mV。实施例7：

反相蒸发法。采用反相蒸发法制备高分子脂质体的过程如下：（1）精确称取6mg实施例3中的产物硬脂酸改性透明质酸加入到茄形瓶中，溶于2ml的二氯甲烷中。（2）向茄形瓶中加入2ml的去离子水，然后用探头式超声波发生器以125W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液。（3）将上述乳液35℃下于旋转蒸发仪上以50r/min的旋转速度进行旋蒸。（4）当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后即得高分子脂质体。所制备的高分子脂质体的性能包括：制备的高分子脂质体有效粒径为108.7nm，多分散性指数为0.154，Zeta电位为-36.87mV。实施例8：

反相蒸发法。采用反相蒸发法制备高分子脂质体的过程如下：（1）精确称取3mg实施例2中的产物硬脂酸改性透明质酸加入到茄形瓶中，溶于2ml的二氯甲烷中。（2）向茄形瓶中加入3ml的去离子水，然后用探头式超声波发生器以150W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液。（3）将上述乳液50℃下于旋转蒸发仪上以50r/min的旋转速度进行旋蒸。（4）当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后即得高分子脂质体。所制备的高分子脂质体的性能包括：制备的高分子脂质体有效粒径为95.4nm，多分散性指数为0.167，Zeta电位为-36.98mV。

Claims (3)

1.一种基于改性透明质酸的高分子脂质体，其特征是重均分子量为10000-50000透明质酸与硬脂酸反应，形成硬脂酸改性透明质酸，结构式如下：

该双亲性高分子组装成的高分子脂质体，粒径在80～150nm，Zeta电位为-36～-40mV。

2.如权利要求1所述的高分子脂质体，其特征是硬脂酸改性透明质酸制备步骤如下：

a.将原料质量份数配比为，透明质酸:硬脂酸=（1:5）～（5:1）加入到反应器，然后向反应器中加入水和二甲基亚砜质量份数比例为（1:3）～（2:1）的混合溶剂，透明质酸和硬脂酸质量之和与溶剂质量比，即原料:溶剂=（1:8）～（1:50）；同时加入催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，其中，硬脂酸:EDC:DMAP=1:（0.2～1）:（0.05～0.5）；磁力搅拌，室温下反应3～12小时；

b.反应结束后，将产物放入8000-14000的透析袋中透析3～10天，冻干后即得硬脂酸改性透明质酸。

3.权利要求1的高分子脂质体制备方法，采用反相蒸发法，其特征是制备步骤如下：

a.将硬脂酸改性透明质酸溶于二氯甲烷中，形成油相；

b.将油相在100～250w功率范围下进行超声，加入去离子水，然后用超声波发生器进行超声分散，形成均匀的乳液分散体系，其中原料、油相及水相的质量份数配比为原料:二氯甲烷:去离子水=1:（200～1000）:（400～2000）；

c.将上述乳液在25～50℃下于旋转蒸发仪上以20～100r/min的旋转速度进行旋蒸，当有机溶剂完全挥发后即得到高分子脂质体。

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