CN103436555B

CN103436555B - 携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝纤维化治疗制剂的应用

Info

Publication number: CN103436555B
Application number: CN201310390760.3A
Authority: CN
Inventors: 刘艳宁; 楼国华; 陈智
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2033-08-30
Also published as: CN103436555A

Abstract

本发明属于干细胞与生物技术领域，涉及间充质干细胞的新应用。携带miR-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，和携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞的构建方法。另外，本发明还提供了携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞用于制备治疗肝纤维化尤其是HBV病毒感染的肝纤维化治疗制剂应用。本发明较之未携带miR-122的普通间充质干细胞，可避免HBV对植入细胞的影响，更好地发挥干细胞疗效，进而更好地促进肝脏病理恢复，改善肝功能和全身状态，从而为临床治疗肝纤维化，特别是乙肝相关肝纤维化开辟细胞治疗的新途径。

Description

携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝纤维化治疗制剂的应用

技术领域

本发明属于干细胞与生物技术领域，涉及间充质干细胞的新应用，具体涉及携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝纤维化细胞移植治疗制剂中的应用。

背景技术

肝硬化(livercirrhosis)是多种慢性肝病进展的重要阶段，在我国病毒性肝炎(尤其是乙型和丙型)是引起肝硬化的主要原因，肝硬化患者的肝细胞HBsAg阳性率高达76.7％。肝硬化主要发病机制是肝脏进行性纤维化，它是机体对慢性肝损的一种修复反应，故如何有效控制纤维化的发生和发展是防治慢性肝炎进展成为肝硬化的重要环节。

目前临床上肝纤维化的治疗方法主要有：去除伤害性刺激；运用化学药物来阻止胶原的合成和促进其降解；运用中药抗纤维化的免疫调节疗法；肝移植等。但是上述方法都存在一定缺陷，尚缺乏特异有效的治疗方法，预后不良。近年来运用成体干细胞移植治疗受损组织和器官成为热点。间充质干细胞作为一类成体干细胞存在于多种组织中，其在体外具有很强的克隆形成和扩增能力以及炎症趋化特性。我们从脂肪组织中也分离培养得到间充质干细胞(AMSC)，且其性质与骨髓来源的间充质干细胞相似，且脂肪中MSC频率是骨髓中含量的近100倍。脂肪组织来源丰富，供者不适度低，不受伦理限制，并且在体外经诱导可分化为肝细胞，移植肝纤维化小鼠模型后可植入损伤部位，并缓解其纤维化症状，因此具有极大的肝脏损伤的细胞治疗潜力。

然而对于因病毒感染而引起的肝纤维化，即使MSC移植能够缓解或治疗肝纤维化，但是移入的供体细胞依然面临被HBV病毒再次感染的可能，并引起类似肝细胞空泡化损伤和凋亡的现象，从而影响干细胞治疗的远期疗效。因此对于肝纤维化治疗，尤其是因病毒引起的肝纤维化治疗需要介入新的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)的构建方法。

携带miR-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，包括如下步骤：

(1)小鼠脂肪来源的间充质干细胞的制备：小鼠脂肪用DPBS清洗后，用Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5％胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80％融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用；

(2)携带miR-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞的制备:mmu-miR-122表达质粒通过Lipofectamine^TM2000介导转染mAMSC，以EGFP指示转染效率(转染效率约70％)，以转染无关miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选，筛选4-6周后可获得稳定表达miR-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞。

携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，包括如下步骤：

1)成人脂肪来源的间充质干细胞的制备：成人脂肪组织取出并经DPBS清洗后，用Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5％胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80％融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用；

2)携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞的制备：has-miR-122表达质粒通过电转法导入hAMSC，以EGFP指示转染效率(转染效率约70％)，以转染无关has-miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选，筛选4-6周后可获得稳定表达miR-122的携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞。

另外，本发明还提供了携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞用于制备治疗肝纤维化尤其是HBV病毒感染的肝纤维化治疗制剂应用，所述携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞具有间充质干细胞的基本特性和分化潜能；所述携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞可抵御HBV对间充质干细胞的感染。

携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝纤维化治疗制剂的应用。

进一步的，携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备乙肝合并肝纤维化细胞移植治疗药物中的应用。

进一步的，所属制剂的剂型为注射剂。

本发明所述携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞为携带miR-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞或携带miR-122的人脂肪来源的间充质干细胞。为亚全能干细胞。

下面对本发明做进一步的说明。

本发明公开了一种构建携带miR-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞(mAMSC-miR-122)的方法，包括如下步骤：

(1)小鼠脂肪来源的间充质干细胞(mAMSC)的制备：小鼠脂肪(可以为利用无菌手术分离的小鼠腹股沟脂肪垫或者通过保存液保存的小鼠脂肪)取出并用DPBS清洗后，用Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5％胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80％融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。

(2)携带miR-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞(mAMSC-miR-122)的制备:mmu-miR-122表达质粒(pGCMV/EGFP/mmu-miR-122/Blasticidine，mmu-miR-122序列为：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG。)通过Lipofectamine^TM2000介导转染mAMSC，以EGFP指示转染效率，转染效率约70％。以转染无关miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选，筛选4-6周后可获得稳定表达miR-122的mAMSC-miR-122。

所述的携带mmu-miR-122的AMSC采用荧光定量PCR鉴定miR-122的表达：消化收集细胞后，采用Lifetechnology公司的AM1561试剂盒抽提miRNA，并采用广州锐博生物的miRQ0000421-1-2试剂盒进行逆转录，及荧光定量PCR的分析。PCR体系为：SYBR-10ul；miR-122上游引物-2ul；miR-122下游引物-2ul；ROX2-0.4ul；水-1.6ul；模板-4ul；PCR条件为：95℃预变性30s，然后95℃5s，60℃30s，40个循环。

本发明还公开了一种构建携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞(hAMSC-miR-122)的方法，包括如下步骤：

1)成人脂肪来源的间充质干细胞(hAMSC)的制备：人脂肪组织(为吸脂手术采集的成人脂肪组织或通过保存液保存的手术废弃的脂肪组织)取出并经DPBS清洗后，用Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5％胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80％融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。

2)所述的携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞(hAMSC-miR-122)是按以下方法制备的：has-miR-122表达质粒(pGCMV/EGFP/has-miR-122/Blasticidine，has-miR-122序列为：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG。)通过电转法导入hAMSC，以EGFP指示转染效率，转染效率约70％。以转染无关has-miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选。筛选4-6周后可获得稳定表达miR-122的hAMSC-miR-122。

所述的携带has-miR-122的AMSC采用荧光定量PCR鉴定miR-122的表达：消化收集细胞后，采用Lifetechnology公司的AM1561试剂盒抽提miRNA，并采用广州锐博生物的miRQ0000421-1-2试剂盒进行逆转录，及荧光定量PCR的分析。PCR体系为：SYBR-10ul；miR-122上游引物-2ul；miR-122下游引物-2ul；ROX2-0.4ul；水-1.6ul；模板-4ul；PCR条件为：95℃预变性30s，然后95℃5s，60℃30s，40个循环。

另外，本发明了还公开了携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝纤维化细胞移植治疗制剂中的应用，从而为治疗肝纤维化开辟细胞疗法的新途径。

本发明公开了一种携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(mAMSC-miR-122)在制备肝纤维化动物模型细胞移植治疗制剂中的应用。

所述的肝纤维化动物模型为四氯化碳(CCl₄)诱导的肝纤维化小鼠模型：C57BL/6雌性小鼠用橄榄油配制的50％的CCl₄灌胃，1ml/kg剂量，每周2次，灌胃6周后，通过HE病理检测，和Masson胶原染色来鉴定肝纤维化模型的造模；

所述的携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)由DPBS稀释为1×10⁷/mL的浓度，用于肝纤维化的小鼠模型进行尾静脉输注的有效剂量为5×10⁷/次/kg体重，输注时间为CCl₄第四次灌胃后24小时。细胞输注有效剂量及时间点是通过动物模型实验取得治疗效果而确定的。

将本发明所述的携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)的制剂用于治疗肝纤维化的效果评价：

(1)一般情况：精神状态和活动状态、体重情况。

(2)肝脏组织供体来源细胞检测：雄性SRY基因分析。

(3)肝功能与血清肝纤维化指数。

(4)肝脏病理检测。

(5)肝脏胶原和纤维化相关基因表达分析。

本发明还公开了一种分析hAMSC-miR-122对HBV感染(血清)抵御作用的方法。

所述的HBV感染血清，是采用乙肝患者的血清，该患者HBsAg、HBcAb(HBVcoreantibody)和HBeAg为阳性，血清HBVDNA拷贝数>10⁷copies/ml.外周血2000rpm离心20分钟后制备HBV感染血清。

所述的感染方法，是采用HBV感染血清来感染hAMSC-miR-122：hAMSC-miR-122用L-DMEM+5％HBV感染血清的培养基培养48小时后，弃去该培养液，以PBS浸洗细胞5次后，换用完全培养基(L-DMEM+5％FBS)培养2周，隔天收集细胞和培养上清，备做AMSC-miR-122对HBV的抵御作用的检测分析。

所述的检测分析方法，包括：采用HBVPCR检测试剂盒，检测AMSC中的HBVDNA的拷贝数；采用ECL结合Elecsys2010fully-automatedECLanalyzer(Roche)方法检测培养上清中的HBsAg；采用AnnexinV/PI染色法，用流式细胞分析仪分析AMSC的细胞凋亡水平。

另外，本发明公开了一种携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞(hAMSC-miR-122)在HBV合并肝纤维化动物模型中的细胞移植的应用。

所述的HBV合并肝纤维化动物模型是通过以下方法建立的：雌性裸鼠用橄榄油配制的50％的CCl₄灌胃(1ml/kg剂量，每周2次)，第五次灌胃24小时后尾静脉高动力法注射HBV质粒，HBV质粒注射24h、72h时，通过裸鼠血清中及肝脏中的HBsAg水平和HBVDNA拷贝数来鉴定HBV感染小鼠模型的造模。50％的CCl₄继续灌胃至6周时，收集血清和组织标本，通过HE病理检测和Masson胶原染色，以及肝脏HBsAg、HBcAg、HBeAg水平，和HBVDNA拷贝数鉴定HBV合并肝纤维化动物模型的建模；

所述的携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞(hAMSC-miR-122)由DPBS稀释为1×10⁷/mL的浓度，用于肝纤维化的小鼠模型进行尾静脉输注的有效剂量为5×10⁷/次/kg体重，输注时间为CCl₄第四次灌胃后24小时。

将本发明所述的携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)的制剂用于HBV合并肝纤维化的治疗效果评价：

(1)治疗肝纤维化的效果评价指标同前面携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)的制剂用于治疗肝纤维化的效果评价；

(2)肝脏组织供体携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)的制剂用于治疗肝纤维化的效果评价源细胞检测：人源基因分析；

(3)血清中及肝脏中的HBsAg水平和HBVDNA拷贝数检测，分析hAMSC-miR-122对抗HBV感染疗效。

间充质干细胞(MSC)在肝脏损伤性疾病，包括肝炎、肝纤维化等疾病中的治疗价值备受肯定。近年来，由于脂肪组织来源丰富，供者不适度低，不受伦理限制，MSC频率远高于骨髓等特点，因此具有更大的临床应用前景。基于MSC的肝损伤治疗，虽然其近期疗效较受肯定，但其远期疗效尚有待商榷。例如对于因病毒感染而引起的肝纤维化，即使MSC移植能够缓解或治疗肝纤维化，但是移入的供体细胞依然面临被HBV病毒再次感染的可能，并引起类似肝细胞空泡化损伤和凋亡的现象，从而影响干细胞治疗的远期疗效。因此经改造修饰的干细胞，将对肝纤维化的细胞治疗，尤其是因病毒因素引起的肝纤维化治疗发挥更好的疗效。

microRNA(miRNA)因其对生理和病理环节的重要调控作用而日益受到关注，其中miR-122作为肝脏特异性表达的主要miRNAs之一，参与了肝脏发育、分化和代谢，以及肝脏损伤的炎症反应等多个环节。研究发现，miR-122在慢性肝损伤早、中、晚期呈进行性下降，显示miR-122与肝损伤存在密切关系，而补充外源性的miR-122可部分缓解肝脏损伤。并且，还发现miR-122可抑制HBV的复制，体内、外研究显示pCMV-miR-122/5质粒可分别抑制HBV模型小鼠血清或HBV细胞模型培养上清中的HBsAg达95％和75％。因此在肝损伤的细胞治疗中，构建携带miR-122的AMSC，并用于肝纤维化，尤其是乙肝相关肝纤维化的细胞治疗具有重大前景。

本发明在国际上首次公开了一种构建携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞的方法及其在肝纤维化细胞治疗中的应用。利用本发明所述的携带miR-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞(mAMSC-miR-122)尾静脉输注小鼠肝纤维化模型的实验证明，该细胞治疗能够阻滞肝纤维化的发展，改善全身状态和肝功能，促进肝脏病理恢复。本发明所述的携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞(hAMSC-miR-122)在体外培养中对HBV感染具有抵御作用；利用hAMSC-miR-122尾静脉输注HBV合并肝纤维化小鼠模型的实验证明，该细胞较之未携带miR-122的AMSC，能够抵御HBV对AMSC的影响，更好地植入损伤肝组织，促进肝脏病理恢复，阻滞肝纤维化的发展，改善全身状态和肝功能。

本发明所用方法如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为市场购得。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。所述百分比浓度若无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

本发明的优点：较之未携带miR-122的普通间充质干细胞(AMSC)，利用本发明所述的携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞(hAMSC-miR-122)静脉输注乙肝相关肝纤维化患者，可避免HBV对植入细胞的影响，更好地发挥干细胞疗效，进而更好地促进肝脏病理恢复，改善肝功能和全身状态，从而为临床治疗肝纤维化，特别是乙肝相关肝纤维化开辟细胞治疗的新途径。

附图说明

图1为mAMSC-miR-122和hAMSC-miR-122中的miR-122表达PCR分析图；

图2为雄性供体小鼠mAMSC-miR-122尾静脉输注雌性C57小鼠后，肝组织SRY基因的PCR检测图；

其中，1是CCl₄雌性，2是CCl₄雌性+mAMSC-miR-122，3是正常雌性，4是正常雌性+mAMSC-miR-122，5是CCl₄雌性+mAMSC-miR-NC，6是正常雄性。

图3为实验终点的Masson三色胶原染色图：正常对照组基本无蓝色胶原纤维染色；模型对照组蓝色胶原纤维沉积明显；mAMSC-miR-122治疗组和mAMSC-miR-NC治疗组蓝色胶原纤维染色均显著降低。显示，mAMSC-miR-122治疗组纤维化程度明显低于模型对照组。

图4为mAMSC-miR-122输注后的C57小鼠肝脏胶原和纤维化相关基因表达分析图；

其中，mAMSC-miR-122治疗组TGF-β1、α-SMA和CollagenⅠ基因表达水平明显低于模型组，以β-actin作为内参。

图5为hAMSC-miR-122和hAMSC-miR-NC培养上清中的HBsAg水平检测图；

其中，hAMSC-miR-122较之hAMSC-miR-NC，其培养上清中的HBsAg水平明显降低。

图6为hAMSC-miR-122和hAMSC-miR-NC培养上清中的HBVDNA拷贝数PCR分析图；

其中，hAMSC-miR-122较之hAMSC-miR-NC，其培养上清中的HBVDNA拷贝数明显降低。

图7为hAMSC-miR-122输注后的裸鼠肝脏胶原和纤维化相关基因表达分析图；

其中，hAMSC-miR-122治疗组TGF-β1、α-SMA和CollagenⅠ基因表达水平明显低于模型组和hAMSC-miR-NC治疗组，以GAPDH作为内参。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

下列实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为市场购得。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。

所述百分比浓度若无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例一：携带miR-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞(mAMSC-miR-122)在肝纤维化小鼠模型细胞移植治疗中的应用。

1、小鼠脂肪来源的间充质干细胞(mAMSC)的制备：

利用无菌手术分离的雄性C57BL/6小鼠腹股沟脂肪垫用DPBS清洗后，用0.075％的Ⅰ型胶原酶(Sigma)37℃消化1小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5％胎牛血清(MSC适宜胎牛血清)的低糖DMEM培养基(Gibco)的塑料培养瓶内，24小时后全量换液，除去血细胞，贴壁细胞视生长情况2～3天半量换液，增殖接近80％融合时，进行消化、传代，依此法传代数次，达到纯化和扩增AMSC的目的，收集细胞冻存、复苏备用。

2、mAMSC-miR-122的构建：

mmu-miR-122表达质粒(pGCMV/EGFP/mmu-miR-122/Blasticidine)(上海吉玛生物)通过Lipofectamine^TM2000介导转染mAMSC，以60-mm小培养皿为例：mAMSC接种至60-mm小培养皿，采用无青链霉素的AMSC培养液培养过夜，待细胞密度至80％左右，换为5ml的Opti-MEM；同时用0.5ml的Opti-MEM稀释8μg的mmu-miR-122表达质粒；并在另0.5ml的Opti-MEM中加入20μlLipofectamine^TM2000；室温静置5分钟后，把稀释后的质粒和Lipofectamine^TM2000进行混合，再室温静置20分钟后加入细胞培养皿中；培养4-6小时后换为无青链霉素的AMSC完全培养液(L-DMEM+5％FBS)。

根据mmu-miR-122表达质粒所带的EGFP基因指示转染效率，荧光显微镜下观察，转染效率可达70％左右。以转染无关miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选培养，筛选4-6周后可获得稳定表达miR-122的mAMSC-miR-122细胞。

采用荧光定量PCR法鉴定mAMSC中miR-122的表达：

消化收集细胞后，采用Lifetechnology公司的AM1561试剂盒抽提miRNA，并采用广州锐博生物的miRQ0000421-1-2试剂盒进行逆转录，及荧光定量PCR的分析。

PCR体系为：SYBR-10ul；miR-122上游引物(miRQ0000421-1-2试剂盒中提供该引物)-2ul；miR-122下游引物-2ul；ROX2-0.4ul；水-1.6ul；模板-4ul。PCR条件为：95℃预变性30s，然后95℃5s，60℃30s，40个循环。

PCR结果分析：转染miR-122的mAMSC，其miR-122的表达水平明显高于对照组(图1)

采用流式细胞术鉴定mAMSC-miR-122的间充质干细胞特性，其细胞表型为CD29(+),CD44(+),CD90.2(+),CD31(-),I-A/I-E(-)；细胞周期以G0/G1期为主(＞95％)，符合AMSC的干细胞特性标志，与未转染miR-122的普通mAMSC和mAMSC-miR-NC(转染无关miRNA的mAMSC)的细胞表型和周期均类似。

采用体外诱导分化鉴定mAMSC-miR-122的多系分化潜能：分别采用成脂、成骨、成软骨诱导培养基进行诱导培养，每3天半量更换诱导培养基，诱导培养3周后，分别进行油红O(成脂)，茜素红(成骨)，阿辛蓝(成软骨)的染色，证实携带miR-122的mAMSC仍具有多系分化潜能。

3、肝纤维化小鼠造模：

四氯化碳(CCl₄)诱导模型：雌性C57小鼠，19～21g，用浓度50％(体积百分比浓度，即CCl₄：橄榄油＝1:1)CCl₄(橄榄油溶解)，按1ml/kg给予小鼠腹腔注射，每周2次，共6周造模成功。

4、mAMSC-miR-122输注：

动物：雌性C57小鼠的四氯化碳(CCl₄)肝纤维化诱导模型；

剂量：2.5×10⁷/次/kg体重，单次注射；

途径：尾静脉；

治疗时机：CCl₄第四次注射后24小时，输注携带miR-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞(mAMSC-miR-122)；

模型对照组：输注同等体积的生理盐水；

细胞对照组：输注同等剂量的mAMSC-miR-NC(携带无关miRNA的mAMSC)。

5、效果评价：

1)一般情况：mAMSC-miR-122细胞治疗组精神状态较好，体重增加较模型对照组明显。与输注同等剂量mAMSC的治疗组相比(未携带miR-122的普通mAMSC)，无显著差异；

2)供体细胞(mAMSC-miR-122)植入肝脏证据：选择雄性小鼠作为供体，通过检测雄性Y染色体特异性基因的表达而指示供体细胞的植入。分别提取模型组和细胞治疗组肝组织基因组DNA，进行SRY基因的PCR检测，如图2所示，mAMSC-miR-122治疗组小鼠的肝组织可检测到SRY基因，显示供体细胞可植入受体肝脏。输注同等剂量mAMSC-miR-NC的治疗组亦可检测到SRY基因；

3)血清肝功能指数与血清肝纤维化指数：mAMSC-miR-122输注2周和4周时进行血清检测，mAMSC-miR-122治疗组血清肝功能指标(ALT、AST)在细胞输注2周和4周时均明显低于模型对照组，血清肝纤维化指数(HA，P-Ⅲ-P)在2周和4周时也均明显低于模型对照组。与输注同等剂量mAMSC-miR-NC的治疗组相比，血清肝功能指数与肝纤维化指数略优于mAMSC-miR-NC治疗组，但mAMSC-miR-122治疗组较同周龄正常小鼠的肝功能和肝纤维化指数略高(表1mAMSC-miR-122和mAMSC-miR-NC细胞输注2周、4周时的血清肝功能指数与血清肝纤维化指数)；

表1

4)肝脏病理检测：mAMSC-miR-122治疗组肝脏病理结构显示肝细胞变性减轻，胶原纤维沉积减少，肝小叶结构趋于正常。模型对照组肝脏病理结构显示肝细胞严重变性坏死，肝小叶结构紊乱，纤维增生明显，Masson三色胶原染色结果显示，mAMSC-miR-122输注4周后较之模型组胶原面积明显减少(图3)。与输注同等剂量mAMSC-miR-NC的治疗组相比，mAMSC-miR-122治疗组的肝脏胶原面积略小于mAMSC-miR-NC治疗组；

5)肝脏胶原和纤维化相关基因表达分析：分别提取2组细胞治疗组、模型对照组、正常对照组小鼠的肝组织mRNA，逆转录为cDNA，进行TGF-β1、α-SMA和CollagenⅠ基因的real-timePCR分析，如图4所示，mAMSC-miR-122治疗组肝脏TGF-β1、α-SMA和CollagenⅠ基因表达水平要明显低于模型对照组，且略低于输注同等剂量mAMSC-miR-NC的细胞治疗组，与正常对照组小鼠的表达水平接近。

实施例二：携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞(hAMSC-miR-122)在HBV合并肝纤维化动物模型中的细胞移植的应用

1、成人脂肪间充质干细胞(hAMSC)的制备：

吸脂手术采集的成人脂肪组织经DPBS清洗后，用0.075％的Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5％胎牛血清(MSC适宜胎牛血清)的低糖DMEM培养基的塑料培养瓶内，24小时后全量换液，除去血细胞，贴壁细胞视生长情况2～3天半量换液，增殖接近80％融合时，进行消化、传代，依此法传代数次，达到纯化和扩增AMSC的目的，收集细胞冻存、复苏备用。

2、hAMSC-miR-122的构建：

hsa-miR-122表达质粒(pGCMV/EGFP/hsa-miR-122/Blasticidine)(上海吉玛生物)通过Lipofectamine^TM2000介导转染hAMSC，以60-mm小培养皿为例：hAMSC接种至60-mm小培养皿，采用无青链霉素的AMSC培养液培养过夜，待细胞密度至80％左右，换为5ml的Opti-MEM；同时用0.5ml的Opti-MEM稀释8μg的hsa-miR-122表达质粒；并在另0.5ml的Opti-MEM中加入20μlLipofectamine^TM2000；室温静置5分钟后，把稀释后的质粒和Lipofectamine^TM2000进行混合，再室温静置20分钟后加入细胞培养皿中；培养4-6小时后换为无青链霉素的AMSC完全培养液(L-DMEM+5％FBS)。

根据hsa-miR-122表达质粒所带的EGFP基因指示转染效率，荧光显微镜下观察，转染效率可达70％左右。以转染无关miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选培养，筛选4-6周后可获得稳定表达miR-122的hAMSC-miR-122细胞。

采用荧光定量PCR法鉴定hAMSC中miR-122的表达：

PCR体系为：SYBR-10ul；miR-122上游引物-2ul；miR-122下游引物-2ul；ROX2-0.4ul；水-1.6ul；模板-4ul。PCR条件为：95℃预变性30s，然后95℃5s，60℃30s，40个循环。

PCR结果分析：转染miR-122的hAMSC，其miR-122的表达水平明显高于对照组(图1)

采用流式细胞术鉴定hAMSC-miR-122的间充质干细胞特性，其细胞表型为CD29(+),CD31(-),CD44(+),CD45(-),CD73(+),CD90(+),CD105(+),HLA-DR(-)；细胞周期以G0/G1期为主(＞95％)，符合hAMSC的干细胞特性标志，与未转染miR-122的普通hAMSC和hAMSC-miR-NC(转染无关miRNA的hAMSC)的细胞表型和周期均类似。

采用体外诱导分化鉴定hAMSC-miR-122的多系分化潜能：分别采用成脂、成骨、成软骨诱导培养基进行诱导培养，每3天半量更换诱导培养基，诱导培养3周后，分别进行油红O(成脂)，茜素红(成骨)，阿辛蓝(成软骨)的染色，证实携带miR-122的hAMSC仍具有多系分化潜能。

3、分析hAMSC-miR-122对HBV感染(血清)的抵御：

采集乙肝患者的外周血，2000rpm离心20分钟后制备HBV感染血清。该乙肝患者血清HBsAg、HBcAb和HBeAg均为阳性，血清HBVDNA滴度为1.9×10⁷copies/ml。

hAMSC-miR-122或hAMSC分别用含5％HBV感染血清的L-DMEM培养液感染培养48小时后，弃去该培养液，以PBS浸洗细胞5次后，换用完全培养基(L-DMEM+5％FBS)培养2周，隔天收集培养上清和细胞，分别进行培养上清中的HBsAg检测，胞内的HBVDNA拷贝数检测，以及细胞的AnnexinV/PI流式凋亡检测。

显微镜下观察，经5％HBV感染血清感染培养48小时后的hAMSC-miR-122，其细胞形态优于hAMSC；流式凋亡检测结果显示，hAMSC-miR-122的凋亡率(AnnexinV+PI-&AnnexinV+PI+)显著低于hAMSC-miR-NC(5.5％±1.6v.s.13.2％±2.5)，以用完全培养基正常培养的hAMSC-miR-NC和hAMSC-miR-122作为对照。

ECL检测结果显示(图5)，hAMSC-miR-122较之hAMSC-miR-NC，其培养上清中的HBsAg水平明显降低；Real-timePCR结果显示，hAMSC-miR-122较之hAMSC-miR-NC，其培养上清(图6)及胞内HBVDNA拷贝数均明显降低。上述结果表明hAMSC-miR-122可抵御HBV对AMSC的感染。

4、HBV合并肝纤维化小鼠造模：

雌性BALB/c裸鼠用橄榄油配制的50％的CCl₄灌胃(1ml/kg剂量，每周2次)，第五次灌胃24小时后尾静脉高动力法注射HBV质粒pCH-9/3091，50％的CCl₄继续灌胃至6周时，造模成功。

HBV质粒注射24h，72h时，分别采集裸鼠血清及肝脏标本，检测HBsAg、HBcAg、HBeAg水平，和HBVDNA拷贝数。ECL检测结果显示，HBV质粒注射24h，72h时，裸鼠血清HBsAg、HBcAg、HBeAg呈阳性；Real-timePCR结果显示，血清和肝脏中均存在HBVDNA。造模终点(CCl₄灌胃6周)，对肝组织进行HE病理检测和Masson胶原染色，确定HBV合并肝纤维化动物模型的建立。

5、hAMSC-miR-122输注：

动物：雌性BALB/c裸鼠小鼠的四氯化碳(CCl₄)肝纤维化诱导模型；

剂量：2.5×10⁷/次/kg体重，单次注射；

途径：尾静脉；

治疗时机：CCl₄第四次注射后24小时，输注携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞(hAMSC-miR-122)；

模型对照组：输注同等体积的生理盐水；

细胞对照组：输注同等剂量的hAMSC-miR-NC(携带无关miRNA的hAMSC)。

6、效果评价：

1)一般情况：hAMSC-miR-122细胞治疗组精神状态较好，体重增加较模型对照组明显，进食量较大。与输注同等剂量hAMSC-miR-NC的治疗组相比，无显著差异；

2)供体细胞(hAMSC-miR-122)植入肝脏证据：实验终点(CCl₄灌胃6周)，分别提取模型组和细胞治疗组肝组织基因组DNA，进行人特异性的HLA-ABC基因检测，hAMSC-miR-122治疗组和hAMSC-miR-NC治疗组小鼠的肝组织均可检测到人源基因的表达，但前者的表达量要明显高于后者；

3)血清肝功能指数与血清肝纤维化指数：hAMSC-miR-122输注2周(造模4周)和4周(造模6周)时进行血清检测，hAMSC-miR-122治疗组血清肝功能指标(ALT、AST)在2周和4周时均明显低于模型对照组，血清肝纤维化指数(HA，P-Ⅲ-P)在2周和4周时也均明显低于模型对照组。与输注同等剂量hAMSC-miR-NC的治疗组相比，血清肝功能指数与肝纤维化指数显著优于hAMSC-miR-NC治疗组(表2hAMSC-miR-122和hAMSC-miR-NC细胞输注2周、4周时的血清肝功能指数与血清肝纤维化指数。)；

表2

4)肝脏病理检测：hAMSC-miR-122治疗组肝脏病理结构显示肝细胞变性减轻，胶原纤维沉积减少，肝小叶结构趋于正常。模型对照组肝脏病理结构显示肝细胞严重变性坏死，肝小叶结构紊乱，纤维增生明显，Masson三色胶原染色结果显示，hAMSC-miR-122输注4周后较之模型组胶原面积明显减少；与输注同等剂量hAMSC-miR-NC的治疗组相比，肝脏病理改善更为显著；

5)肝脏胶原和纤维化相关基因表达分析：分别提取细胞治疗组、模型对照组、正常对照组小鼠的肝组织mRNA，逆转录为cDNA，进行TGF-β1、α-SMA和CollagenⅠ基因的real-timePCR分析，如图7所示，hAMSC-miR-122治疗组肝脏TGF-β1、α-SMA和CollagenⅠ基因表达水平要明显低于模型对照组，也低于输注同等剂量hAMSC-miR-NC的细胞治疗组；

6)血清中HBsAg水平检测：HBV质粒注射72h，及造模4周(hAMSC-miR-122输注2周)，取外周血分离血清进行检测，ECL结果显示，hAMSC-miR-122治疗组血清中的HBsAg水平明显低于模型对照组；而输注同等剂量hAMSC-miR-NC的治疗组，其血清HBsAg水平与模型对照组相近；造模6周终点(hAMSC-miR-122输注4周)，各组血清HBsAg均低于检测限；

7)血清中的HBVDNA拷贝数检测：HBV质粒注射72h，及造模4周(hAMSC-miR-122输注2周)时，取外周血分离血清进行检测，采用之江生物的乙型肝炎(HBV)荧光定量试剂盒(货号：HD-0002-7900)进行real-timePCR分析，结果显示，hAMSC-miR-122治疗组血清中HBVDNA水平明显低于模型对照组；而输注同等剂量hAMSC-miR-NC的治疗组，其血清HBVDNA水平与模型对照组相近；

8)肝脏中的HBVDNA拷贝数检测：HBV质粒注射72h，及造模4周(hAMSC-miR-122输注2周)时，取肝组织。研磨后，采用QIGEN的QIAampDNAMini试剂盒(货号：51304)抽提肝组织基因组DNA，然后采用之江生物的乙型肝炎(HBV)荧光定量试剂盒(货号：HD-0002-7900)进行real-timePCR分析，结果显示，hAMSC-miR-122治疗组肝脏中HBVDNA水平明显低于模型对照组；而输注同等剂量hAMSC-miR-NC的治疗组，其肝脏HBVDNA水平与模型对照组相近。

<110>浙江大学

<120>携带miR-122脂肪间充质干细胞的构建方法及其应用

<160>2

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>Mouse

<400>1

UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>Homosapiens

<400>2

UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG

Claims

1.携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝纤维化治疗制剂的应用,所述携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞具有间充质干细胞的基本特性和分化潜能；所述携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞可抵御HBV对间充质干细胞的感染。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备乙肝合并肝纤维化细胞移植治疗制剂中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述制剂的剂型为注射剂。