CN103404509A - 一种细胞保存液、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞保存液、其制备方法和应用，所述细胞保存液以100毫升氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液计，其中含有维生素0.01～1克、白蛋白0.1～10克、糖类0.1～1克、三磷酸腺苷和/或三磷酸腺苷二钠0.001～0.1克。本发明的细胞保存液在2-10℃的温度范围内保存细胞，在24小时内很好地维持了细胞活率和生物学特性，避免了细胞复苏和再次洗涤的风险，也避免了现有保存方法引起的细胞死亡和生物学特性改变，极大地扩大了中心实验室细胞应用的地域覆盖范围。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细胞保存液、其制备方法和应用。
背景技术
干细胞（Stem Cell，SC）是存在于生命个体中的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞群体。它们不仅存在于胚胎发育时期而且在成体内也广泛分布于各种组织器官的特定部位，故宏观上将其分为胚胎干细胞和成体干细胞。随着细胞替代治疗的发展，干细胞移植治疗已成为临床上治疗某些疾病的重要手段。
免疫细胞治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传统的手术、放疗和化疗副作用的弊端，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段，也是世界上目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。目前在临床中采用的免疫细胞包括：细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、树突状细胞（DC）、DC+CIK细胞、自然杀伤细胞（NK）和DC-T细胞等。
细胞治疗在临床上的应用前景已经得到了科学家的广泛认可，但是在实际应用中尚有诸多难题需要克服。目前，细胞治疗大多采用静脉滴注的方式进行。将体外培养好的细胞注射到不同规格的氯化钠注射液中，加入或不加入一定比例的人血白蛋白，将制备好的细胞悬液通过静脉滴注回输病患。所采用的细胞保存液为氯化钠注射液或者含有部分人血白蛋白。采用这种传统保存方法，细胞经过几个小时的保存后，细胞活率和生物学效力有很大程度的降低。常规保存方法不利于细胞较长时间的保存和远距离的运输。细胞在现实临床应用中，因为临床使用单位不具备相应的细胞培养技术和高标准专业化的细胞制备实验室，所以需要在区域性中心实验室进行细胞制备，制备好的细胞经过一定时间和距离的运输送到临床单位应用。细胞在回输前需要较长的运输保存时间，就要求在运输过程中采用合适的保存液来维持细胞的活率和生物学效力。而冻存的细胞可以采用-80℃干冰运输的方式进行远距离长时间运输。但是，冻存细胞的冻存液含有血清、培养基和DMSO。冻存的细胞再应用到临床之前需要进行复苏和洗涤，复苏会造成一定比例的细胞死亡，再次洗涤容易引起细胞污染。
在哺乳动物细胞的保存中，经常使用含有血清的保存液。血清一般来源于牛血清或者人AB血清。但在细胞治疗的临床应用中，制备细胞的方法要求是无血清培养，如果在保存液中使用血清，就会引入血清污染。同时血清中的成分不明，不仅含有细胞因子、生长因子、激素等成分，还可能含有未知病毒影响的问题。所以存在未知病毒污染和由于保存液成分不确定而引起的品质难以稳定等多种缺点。
因此，本领域亟需一种能够在较长时间内很好地维持细胞活率和生物学特性并且组分明确的细胞保存液。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞保存液，其在2-10℃的温度范围内保存细胞，在24小时内很好地维持了细胞活率和生物学特性，避免了细胞复苏和再次洗涤的风险，也避免了现有保存方法引起的细胞死亡和生物学特性改变，极大地扩大了中心实验室细胞应用的地域覆盖范围。
为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：
在第一方面，本发明提供一种细胞保存液，其以100毫升氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液计，其中含有维生素0.01～1克、白蛋白0.1～10克、糖类0.1～1克、三磷酸腺苷和/或三磷酸腺苷二钠0.001～0.1克。
本发明提供的细胞保存液中，所述白蛋白选自人白蛋白及哺乳动物白蛋白中的一种或多种，优选人及哺乳动物的血白蛋白、卵白蛋白和乳白蛋白中的一种或多种，更优选人、牛、马及羊的血白蛋白、卵白蛋白和乳白蛋白中的一种或多种，最优选人血白蛋白。
本发明提供的细胞保存液中，所述维生素选自维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B4、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素H、维生素P、维生素PP、维生素M、维生素T和维生素U中的一种或多种，优选维生素C。
本发明提供的细胞保存液中，所述糖类选自单糖、二糖、三糖和多糖中的一种或多种，优选葡萄糖、半乳糖、果糖、核糖和海藻糖中的一种或多种，更优选葡萄糖。
作为优选，本发明提供的细胞保存液中，以100毫升氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液计，其中含有维生素0.05～0.8克、优选0.1～0.6克、更优选0.2～0.5克、最优选0.3～0.4克，白蛋白0.5～8克、优选1～6克、更优选2～5克、最优选3～4克，糖类0.2～0.9克、优选0.3～0.8克、更优选0.4～0.7克、最优选0.5～0.6克，三磷酸腺苷和/或三磷酸腺苷二钠0.005～0.08克、优选0.01～0.06克、更优选0.02～0.05克、最优选0.03～0.04克。
本发明提供的细胞保存液中，以100毫升氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液计，其中可以含有维生素0.02克、0.03克、0.04克、0.06克、0.07克、0.08克、0.09克、0.11克、0.12克、0.15克、0.18克、0.22克、0.25克、0.28克、0.32克、0.4克、0.45克、0.55克、0.65克、0.7克、0.75克、0.85克、0.9克、0.95克或0.99克。
本发明提供的细胞保存液中，以100毫升氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液计，其中可以含有白蛋白0.2克、0.3克、0.4克、0.6克、0.7克、0.8克、0.9克、1.1克、1.2克、1.5克、1.8克、2.2克、2.5克、2.8克、3.2克、3.5克、3.8克、4.2克、4.5克、5.5克、6.5克、7克、7.5克、8.5克、9克或9.5克。
本发明提供的细胞保存液中，以100毫升氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液计，其中可以含有糖类0.1克、0.11克、0.12克、0.15克、0.18克、0.22克、0.25克、0.28克、0.3克、0.4克、0.5克、0.6克、0.7克、0.8克、0.9克、0.95克或0.99克。
本发明提供的细胞保存液中，以100毫升氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液计，其中可以含有三磷酸腺苷和/或三磷酸腺苷二钠0.002克、0.003克、0.004克、0.006克、0.007克、0.008克、0.009克、0.011克、0.015克、0.02克、0.03克、0.04克、0.06克、0.07克、0.08克或0.09克。
在第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的细胞保存液的制备方法，按相应含量将注射级别的所述维生素、白蛋白、糖类及三磷酸腺苷和/或三磷酸腺苷二钠加入所述氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液中，彻底溶解，充分混匀。
在本发明细胞保存液的制备方法中，所述维生素、白蛋白、糖类及三磷酸腺苷和/或三磷酸腺苷二钠以注射液和/或冻干粉的形式加入所述氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液中。
在第三方面，本发明提供一种保存细胞的方法，将细胞加入如第一方面所述的细胞保存液中，置于2～10℃、优选3～8℃、更优选3～6℃、最优选4℃条件下保存。
在提供的保存细胞的方法中，温度可以是2℃、2.5℃、2.8℃、3.2℃、3.8℃、4.2℃、5.5℃、6.5℃、7℃、7.2℃、7.8℃、8.2℃、8.8℃、9.5℃或9.9℃。
在提供的保存细胞的方法中，所述保存的时间为0～48小时、优选6～42小时、更优选12～36小时、特别优选18～30小时、最优选24小时，比如可以是1小时、2小时、5小时、8小时、10小时、14小时、15小时、20小时、22小时、24小时、28小时、32小时、38小时、40小时或46小时。
在第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的细胞保存液在保存细胞中的应用；优选地，所述细胞为干细胞或免疫细胞，优选胚胎干细胞、成体干细胞、淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞或肥大细胞，更优选脂肪干细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、树突状细胞（DC）、DC+CIK细胞、自然杀伤细胞（NK）或DC-T细胞，最优选脂肪干细胞或自然杀伤细胞。
本发明的有益效果为：
（1）本发明的细胞保存液在2-10℃的温度范围内保存细胞，在24小时内很好地维持了细胞活率和生物学特性，实验证实：保存24小时后，细胞活率均在90%以上，细胞标志物没有发生显著变化；
（2）本发明的细胞保存液成分明确、稳定性好、安全性高、无毒副作用，便于细胞的保存和运输，适应细胞治疗的临床大规模使用，应用前景广阔，为临床上细胞治疗的拓展提供了有力支持；
（3）本发明克服现有技术中保存时间短、细胞活性降低、保存液达不到临床使用级别、需要复苏和洗涤、操作复杂等问题，而提供一种能够在较长时间内有效维持细胞活性和生物学特性的细胞保存液，该保存液能够达到临床标准，无需其他处理可直接将细胞悬液输注到人体，并且该细胞保存液配方成分明确，配比简单，操作容易实现，极大地方便了细胞制剂的临床应用。
附图说明
图1为使用本发明实施例1的细胞保存液保存24h后的脂肪干细胞重新贴壁培养的显微镜观察图，左图为保存前的脂肪干细胞贴壁培养40倍显微镜观察图，右图为保存24h再培养48h后的脂肪干细胞重新贴壁培养40倍显微镜观察图。
图2为使用本发明实施例1的细胞保存液保存24h后的NK细胞重新培养的显微镜观察图，左图为保存前的NK细胞100倍显微镜观察图，右图为保存24h再培养24h后的NK细胞100倍显微镜观察图。
图3为保存前脂肪干细胞细胞表面标志（CD73、CD90、CD105、CD31和CD133）采用BD FACSAria检测的结果。
图4为使用本发明实施例1的细胞保存液保存24小时后的脂肪干细胞细胞表面标志（CD73、CD90、CD105、CD31和CD133）采用BD FACSAria检测的结果。
图5为保存前NK细胞细胞表面标志（CD3、CD56）采用BD FACSCalibur检测的结果。
图6为使用本发明实施例1的细胞保存液保存24小时后的NK细胞细胞表面标志（CD3、CD56）采用BD FACSCalibur检测的结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 细胞保存液的配制
在100ml氯化钠注射液中加入人血白蛋白1g，维生素C 200mg，葡萄糖1g，三磷酸腺苷二钠10mg，上述全部成分均为临床注射级别，彻底溶解，充分混匀。
实施例2 细胞保存液的配制
在100ml氯化钠注射液中加入人血白蛋白0.1g，维生素C 1000mg，葡萄糖0.1g，三磷酸腺苷二钠1mg，上述全部成分均为临床注射级别，彻底溶解，充分混匀。
实施例3 细胞保存液的配制
在100ml复方氯化钠注射液中加入人血白蛋白10g，维生素C 10mg，葡萄糖0.2g，三磷酸腺苷100mg，上述全部成分均为临床注射级别，彻底溶解，充分混匀。
实施例4 细胞保存液的配制
在100ml复方氯化钠注射液中加入人血白蛋白2g，维生素C 500mg，葡萄糖0.5g，三磷酸腺苷二钠50mg，上述全部成分均为临床注射级别，彻底溶解，充分混匀。
实施例5 细胞保存液的配制
在100ml氯化钠注射液中加入牛血白蛋白1g，维生素B1 200mg，半乳糖1g，三磷酸腺苷二钠10mg，上述全部成分均为临床注射级别，彻底溶解，充分混匀。
实施例6 细胞保存液的配制
在100ml氯化钠注射液中加入羊血白蛋白0.1g，维生素A 1000mg，果糖0.1g，三磷酸腺苷二钠1mg，上述全部成分均为临床注射级别，彻底溶解，充分混匀。
实施例7 细胞保存液的配制
在100ml复方氯化钠注射液中加入牛乳白蛋白10g，维生素D 10mg，核糖0.2g，三磷酸腺苷100mg，上述全部成分均为临床注射级别，彻底溶解，充分混匀。
实施例8 细胞保存液的配制
在100ml复方氯化钠注射液中加入人血白蛋白2g，维生素K 500mg，葡萄糖0.5g，三磷酸腺苷50mg，上述全部成分均为临床注射级别，彻底溶解，充分混匀。
实施例9 本发明实施例1细胞保存液在脂肪干细胞保存中的应用
贴壁培养的脂肪干细胞，用0.25%的胰酶消化3min，消化得到单细胞悬液，经过1000rpm、10min离心洗涤三次，将洗涤后的脂肪干细胞等分为三份，一份用氯化钠注射液进行保存，一份用含1%人血白蛋白的氯化钠注射液进行保存，一份用本发明实施例1的细胞保存液进行保存。在2～10℃保存6h、12h、18h、24h，取样进行台盼蓝（Trypan Blue）染色，计数活细胞和死细胞数，计算细胞活率，细胞活率=活细胞数目/（活细胞数目+死细胞数目），结果如表1所示。
表1 脂肪干细胞活率实验结果
实施例10 本发明实施例1细胞保存液在NK细胞保存中的应用
收集悬浮培养的NK细胞悬液到离心管，1000rpm、10min离心，用DPBS（杜氏磷酸缓冲液）洗涤三次，将洗涤后的NK细胞等分为三份，一份用氯化钠注射液进行保存，一份用含1%人血白蛋白的氯化钠注射液进行保存，一份用本发明实施例1的细胞保存液进行保存。在2～10℃保存6h、12h、18h、24h，取样进行台盼蓝（Trypan Blue）染色，计数活细胞和死细胞数，计算细胞活率，细胞活率=活细胞数目/（活细胞数目+死细胞数目），结果如表2所示。
表2 NK细胞活率实验结果
实施例11 本发明实施例3细胞保存液在脂肪干细胞保存中的应用
贴壁培养的脂肪干细胞，用0.25%的胰酶消化3min，消化得到单细胞悬液，经过1000rpm、10min离心洗涤三次，将洗涤后的脂肪干细胞等分为三份，一份用氯化钠注射液进行保存，一份用含1%人血白蛋白的氯化钠注射液进行保存，一份用本发明实施例3的细胞保存液进行保存。在2～10℃保存6h、12h、18h、24h，取样进行台盼蓝（Trypan Blue）染色，计数活细胞和死细胞数，计算细胞活率，细胞活率=活细胞数目/（活细胞数目+死细胞数目），结果如表3所示。
表3 脂肪干细胞活率实验结果
实施例12 本发明实施例4细胞保存液在CIK细胞保存中的应用
收集悬浮培养的CIK细胞悬液到离心管，1000rpm、10min离心，用DPBS（杜氏磷酸缓冲液）洗涤三次，将洗涤后的CIK细胞等分为三份，一份用氯化钠注射液进行保存，一份用含1%人血白蛋白的氯化钠注射液进行保存，一份用本发明实施例4的细胞保存液进行保存。在2～10℃保存6h、12h、18h、24h，取样进行台盼蓝（Trypan Blue）染色，计数活细胞和死细胞数，计算细胞活率，细胞活率=活细胞数目/（活细胞数目+死细胞数目），结果如表4所示。
表4 CIK细胞活率实验结果
由实施例9～12可以看出，使用本发明细胞保存液保存细胞24h后细胞活率大于90%，满足临床对细胞活率的要求，大大增加了中心实验室的业务覆盖范围，方便临床医生根据病人时间灵活安排回输治疗。分析其原因，本发明的细胞保存液在细胞保存的过程中，减少了超氧阴离子对细胞壁的氧化损伤，又为细胞提供一些基本的营养物质和能量物质，在低温中维持低水平的代谢率，同时又为细胞提供了适合存活的渗透压。
实施例13 保存24h后脂肪干细胞重新贴壁培养
贴壁培养的脂肪干细胞，用0.25%的胰酶消化3min，消化得到单细胞悬液，经过1000rpm、10min离心洗涤三次，将洗涤后的脂肪干细胞用本发明实施例1的细胞保存液保存24小时后，将细胞1000rpm、10min离心收集，按照5×105/ml的浓度接种到T75培养瓶，培养基为GIBCO 1640培养基加10%FBS（胎牛血清）。在37℃、5%二氧化碳浓度的Heraeus HERAcell 240i二氧化碳培养箱中进行培养48小时。用Nikon Ti-s显微镜，在40倍放大倍数下进行拍照（图1）。
结果显示，保存后再培养的细胞状态良好，死细胞较少，保存前后细胞形态无变化。
实施例14 保存24小时后NK细胞重新培养
收集悬浮培养的NK细胞悬液到离心管，1000rpm、10min离心，用DPBS（杜氏磷酸缓冲液）洗涤三次，将洗涤后的NK细胞用本发明实施例1的细胞保存液保存24小时后，将细胞1000rpm、10min离心收集，按照1×106/ml的浓度接种到T75培养瓶，培养液为Takara GT-T551培养基，加入500IU/ml IL-2（白细胞介素-2）；在37℃、5%二氧化碳浓度的Heraeus HERAcell240i二氧化碳培养箱进行培养24小时。用Nikon Ti-s显微镜，在100倍放大倍数下进行拍照（图2）。
结果显示，保存后再培养的细胞状态良好，死细胞较少，保存前后细胞形态无变化。
实施例15 保存前后脂肪干细胞细胞表面标志的变化情况
CD73PE、CD90FITC、CD105APC、CD31FITC和CD133APC均购自美国BD公司。
保存前的脂肪干细胞采用BD FACSAria按照该仪器常规检测步骤进行检测；使用本发明实施例1的细胞保存液保存24小时后的脂肪干细胞同样采用BD FACSAria按照该仪器常规检测步骤进行检测，结果如图3、4所示，结果显示脂肪干细胞使用本发明细胞保存液保存24小时后的阳性指标CD73、CD90、CD105和阴性指标CD31、CD133均无有意义的变化，说明该细胞保存液在保存脂肪干细胞的过程中很好地维持了脂肪干细胞的生物学特性。
实施例16 保存前后NK细胞细胞表面标志的变化
CD3FITC和CD56PE均购自美国BD公司。
保存前的NK细胞采用BD FACSCalibur按照该仪器常规检测步骤进行检测；使用本发明实施例1的细胞保存液保存24小时后的NK细胞同样采用BDFACSCalibur按照该仪器常规检测步骤进行检测，结果如图5、6所示，结果显示，保存前NK细胞CD3-CD56+为77.77%，使用本发明实施例1的细胞保存液保存24小时后，CD3-CD56+为73.85%。保存前后有少许下降，下降较少，说明该细胞保存液在长时间的保存中很好地维持了NK细胞的生物学特性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种细胞保存液，其特征在于，以100毫升氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液计，其中含有维生素0.01～1克、白蛋白0.1～10克、糖类0.1～1克、三磷酸腺苷和/或三磷酸腺苷二钠0.001～0.1克。
2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述白蛋白选自人白蛋白及哺乳动物白蛋白中的一种或多种，优选人及哺乳动物的血白蛋白、卵白蛋白和乳白蛋白中的一种或多种，更优选人、牛、马及羊的血白蛋白、卵白蛋白和乳白蛋白中的一种或多种，最优选人血白蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的细胞保存液，其特征在于，所述维生素选自维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B4、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素H、维生素P、维生素PP、维生素M、维生素T和维生素U中的一种或多种，优选维生素C。
4.根据权利要求1至3任一项所述的细胞保存液，其特征在于，所述糖类选自单糖、二糖、三糖和多糖中的一种或多种，优选葡萄糖、半乳糖、果糖、核糖和海藻糖中的一种或多种，更优选葡萄糖。
5.根据权利要求1至4任一项所述的细胞保存液，其特征在于，以100毫升氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液计，其中含有维生素0.05～0.8克、优选0.1～0.6克、更优选0.2～0.5克、最优选0.3～0.4克，白蛋白0.5～8克、优选1～6克、更优选2～5克、最优选3～4克，糖类0.2～0.9克、优选0.3～0.8克、更优选0.4～0.7克、最优选0.5～0.6克，三磷酸腺苷和/或三磷酸腺苷二钠0.005～0.08克、优选0.01～0.06克、更优选0.02～0.05克、最优选0.03～0.04克。
6.如权利要求1至5任一项所述的细胞保存液的制备方法，其特征在于，按相应含量将注射级别的所述维生素、白蛋白、糖类及三磷酸腺苷和/或三磷酸腺苷二钠加入所述氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液中，彻底溶解，充分混匀。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述维生素、白蛋白、糖类及三磷酸腺苷和/或三磷酸腺苷二钠以注射液和/或冻干粉的形式加入所述氯化钠注射液和/或复方氯化钠注射液中。
8.一种保存细胞的方法，其特征在于，将细胞加入如权利要求1至5任一项所述的细胞保存液中，置于2～10℃、优选3～8℃、更优选3～6℃、最优选4℃条件下保存。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述保存的时间为0～48小时、优选6～42小时、更优选12～36小时、特别优选18～30小时、最优选24小时。
10.如权利要求1至5任一项所述的细胞保存液在保存细胞中的应用；优选地，所述细胞为干细胞或免疫细胞，优选胚胎干细胞、成体干细胞、淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞或肥大细胞，更优选脂肪干细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、树突状细胞、DC+CIK细胞、自然杀伤细胞或DC-T细胞，最优选脂肪干细胞或自然杀伤细胞。
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