CN103387999A - 水稻OsNDPK1基因在提高植物抗病性方面的应用 - Google Patents
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Abstract
病害的发生一直是制约作物高产的重要因素。发生病害的田块一般减产20%-30%，严重田块减产可达50%-60%，造成严重的经济损失。本发明通过构建了OsNDPK1基因（基因编号为Os07g0492000）的超表达载体，通过农杆菌转化获得了该基因的超表达突变体。实验表明：OsNDPK1基因可提高植物对细菌PstDC3000和真菌灰葡萄孢BC22的抗性，调节植物体内胼胝质的产生，诱导抗病基因NPR1和PR1的表达。OsNDPK1基因功能的分析和鉴定为获得抗病转基因植物新品种奠定了理论和生产实践基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一个水稻OsNDPK1基因在提高植物抗病性方面的应用。
背景技术
NDPK（nucleoside diphosphate kinase）广泛存在于动物、真菌、植物和原核生物中，NDPK是一种磷酸化蛋白，其主要功能是通过催化NDP和NTP之间磷酸基的转移反应来维持细胞内NTP浓度，为核酸的合成提供原料(Sonia D, et al., 2006)。植物中存在三种NDPKs，NDPK1是主要的形式，存在于细胞质中，占总NDPKs的70%左右，而且在分生组织中表达水平较高(Dorion S, et al., 2006 )。NDPK2主要参与一些信号途径，与光敏色素有关(Matsushita Y, et al., 2002)。NDPK3主要存在于线粒体膜间隙中，与腺苷核酸转运蛋白相互作用(Knorpp C, et al., 2003 )。
在植物中，NDPKs对伤害(Cipollini G, et al., 1997 )、热刺激(Engel M, et al., 1998 )、光敏色素B(Wagner P D, et al., 2000)、UV-B光照(Harris N, et al., 1994)、氧胁迫(Escobar M, et al., 2001)和激素(Choi G, et al. 1999)等的反应说明NDPKs在植物生长中也起一定的调节作用。迄今为止，已经克隆到NDPK基因的物种有菠菜（Spinacia oleracea）(Nomura T, et al., 1992)、豌豆（pisum sativum） (Finan P M, et al., 1994)、番茄（Lycopersicon esculentum）(Harris N, et al., 1994)、燕麦（avena sativa）(Sommer D, et al., 1994)、水稻（Oryza sativa）(Yano A, et al., 1993)等，但是NDPK在植物生长发育过程中的作用还不是很清楚。
关于水稻OsNDPK1基因的研究较少，已有研究表明OsNDPK1定位于细胞质中（Kihara A, et al., 2011）。水稻感染白叶枯病菌后OsNDPK1的表达量上升(Cho SM, et al., 2004)，暗示着OsNDPK1可能与抗病有关。本研究从病斑症状和Trypan Blue染色两个方面进行观察比较，结果发现过表达OsNDPK1的转基因植株对细菌性病原菌Pst DC3000和真菌性病原菌BC22均有抵抗作用，说明NDPK1在植物抗病过程中起一定作用。过表达OsNDPK1对转基因拟南芥抗病性增强的研究为研究BR抗病性提供了理论基础。
发明内容
1. 本发明的目的在于确定OsNDPK1在提高植物抗病性方面的功能，涉及OsNDPK1在植物抗病性方面的应用，以改良作物农艺性状、提高作物产量。
2. 为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了在拟南芥中过表达OsNDPK1基因，统计接种细菌性病原菌丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae pv tomato DC3000，Pst DC3000）和真菌病原菌灰葡萄孢（Botrytis Cinerea，BC22）后过表达OsNDPK1基因的拟南芥的发病情况，结果发现，过表达OsNDPK1基因后拟南芥植株的抗病性增强。
3. 所述OsNDPK1基因，基因序列号为Os07g0492000，蛋白序列号为GI:50096951，CDS全长为683bp，编码149个氨基酸。
4. 本发明的技术方案涉及OsNDPK1基因在提高植物抗病性方面的应用。
5. 将OsNDPK1基因超表达后获得了抗病性增强的转基因拟南芥。
6. 本发明利用RT-PCR技术检测4周龄的拟南芥（WT）和过表达OsNDPK1基因的拟南芥（OsNDPK1-OE）在接种病原菌48小时后，抗病相关基因PR1和NPR1基因的表达变化。研究结果表明OsNDPK1-OE中抗病关键基因表达量明显高于WT。
7. 本发明利用苯胺蓝染色法检测4周龄的拟南芥（WT）和过表达OsNDPK1基因的拟南芥（OsNDPK1-OE）在接种病原菌0，6，12小时后，胼胝质的积累情况。结果表明OsNDPK1-OE中胼胝质积累量明显高于WT，可以限制病原菌的进一步侵入。
8. 本发明利用染色法检测4周龄的拟南芥（WT）和过表达OsNDPK1基因的拟南芥（OsNDPK1-OE）在接种病原菌0，1，3，6，12，24小时后，几丁质酶基因的表达情况。结果表明OsNDPK1-OE中几丁质酶基因表达明显高于WT，这说明OsNDPK1-OE转基因植株对病原物的抵抗能力高于WT。
9. 本发明明确了OsNDPK1提高植物抗病性的功能，为提高植物抗病性及提高产量奠定了理论基础。
附图说明
图1为野生型拟南芥（WT）和过表达OsNDPK1基因的转基因拟南芥（OsNDPK1-OE）
图2为WT和OsNDPK1-OE中OsNDPK1的表达情况的RT-PCR分析，OsNDPK1-OE中OsNDPK1的表达量明显升高，确实为过表达OsNDPK1基因的转基因植株。
图3为接种Pst DC3000后48h后WT和OsNDPK1-OE叶片发病情况。OsNDPK1-OE叶片发病较轻。
图4为WT和OsNDPK1-OE接种Pst DC3000叶片的Trypan Blue染色。
图5为WT和OsNDPK1-OE接种灰葡萄孢后叶片发病情况。OsNDPK1-OE叶片发病较轻。
图6为WT和OsNDPK1-OE接种灰葡萄孢后叶片胼胝质的积累情况， 胼胝质积累越多，抗病性越强。
图7为WT和OsNDPK1-OE接种灰葡萄孢不同时间后几丁质酶基因（Cha1）表达情况。
图8为WT和OsNDPK1-OE接种灰葡萄孢后抗病基因NPR1和PR1的表达情况。
具体实施方式
实施例一
过表达OsNDPK1转基因拟南芥的获得及抗病性分析
OsNDPK1基因的CDS区首先被克隆经pMD-19 simple载体上，然后利用KpnⅠ和BamHⅠ将OsNDPK1基因的CDS区切出，并应用KpnⅠ和BamHⅠ将OsNDPK1基因的CDS区连接连接至载体pCAMBIA1300的KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点之间。该载体含有CaMV 35S启动子，可驱动目的基因过量表达。含有OsNDPK1基因的CDS区的pCAMBIA1300载体利用农杆菌蘸花的方法转入拟南芥。经RT-PCR分析获得过量表达OsNDPK1的阳性植株（图1、2）。
将过量表达OsNDPK1的株系和野生型拟南芥在长日照下培养4周，用去针头的注射器接Pst DC3000菌株2天，观察其发病情况，结果如图3所示，野生型拟南芥接菌的叶片表现为明显的枯黄、萎蔫症状，而过表达OsNDPK1的株系只有轻微的黄化症状；利用Trypan Blue染色法，Trypan Blue染色液的配制：20 mL无水乙醇、10 mL苯酚、10 mL水、10 mL 83%乳酸、10 mg Trypan Blue。拟南芥叶片在染色液中煮沸2-5 min后，用饱和水合氯醛（2.5 g/mL）脱色，脱色完成后清水漂洗3次后加入50%甘油进行显微观察。发现接菌2天后野生型上出现大面积坏死的病斑，而过表达OsNDPK1的株系叶片的坏死面积明显少于野生型（图4）；
挑取野生型灰葡萄孢BC22的菌丝，接种到PDA平板上，约7 d后长出孢子，用无菌水冲洗孢子后纱布过滤，用血球计数板计算孢子量，当孢子悬浮液的浓度达到106个/mL时即可用于侵染拟南芥叶片。接种时取5 μL孢子悬浮液滴到叶片上即可。接种后覆膜黑暗保湿，保证BC22的菌丝能够侵染拟南芥。结果发现过表达OsNDPK1的转基因植株的叶片的发病情况比野生型要轻（图5）。利用DAB染色法，发现过表达OsNDPK1的株系的叶片上产生大量的胼胝质，且明显高于野生型（图6）。
这表明OsNDPK1基因确实可提高植物的抗病性。
实施例二
抗病相关基因的表达分析
将BC22接种野生型和过表达OsNDPK1的转基因拟南芥0、1、3、6、12 、24h后，利用RT-PCR技术分析发现，野生型拟南芥几丁质酶基因Cha1在接菌后3h表达量下降，而过表达OsNDPK1的转基因拟南芥的Cha1基因表达量能持续表达（图7），这说明过表达OsNDPK1的转基因拟南芥能持续抵抗病原菌的侵染；同时发明人分析了抗病相关基因NPR1和PR1的表达变化，结果发现过表达OsNDPK1的转基因拟南芥的NPR1和PR1的表达量都明显高于野生型拟南芥， NPR1基因尤为明显（图8）。NPR1基因在植物系统性获得抗性（SAR）中发挥关键作用，SAR是一种由局部感染引起的长效防卫反应，它能对一系列的真菌产生抵抗作用。 NPR1转基因拟南芥和水稻已分别被构建。对这些转基因植株的抗病性分析结果表明，NPR1无论在单子叶还是双子叶植株中的过量表达均使植株组成性表现对多种病原物的广谱持久抗性。
Claims (4)
1.水稻基因OsNDPK1在植物抗病性方面的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述农艺性状为植物抗病性。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述水稻基因OsNDPK1基因序列号为Os07g0492000。
4. 根据权利要求1 所述应用，其特征在于，将水稻OsNDPK1基因过表达获得抗病性增强的转基因拟南芥。
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| CN109852624A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-06-07 | 宁波大学 | 一种水稻根系伸长控制基因OsNDPK4及编码的蛋白质 |
| CN115385992A (zh) * | 2021-05-25 | 2022-11-25 | 中国科学院微生物研究所 | 石果衣真菌ndpk-2蛋白及其编码基因在调控植物高度和非生物胁迫抗性中的应用 |
Citations (5)
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| KR100775037B1 (ko) * | 2003-11-17 | 2007-11-08 | 한국생명공학연구원 | 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터 및이를 이용한 복합스트레스 내성 식물체의 제조방법 |
| KR20100053456A (ko) * | 2008-11-11 | 2010-05-20 | 동국대학교 산학협력단 | 선발마커가 제거된 형질전환 벼의 제조방법 |
| CN101815432A (zh) * | 2007-08-29 | 2010-08-25 | 纳幕尔杜邦公司 | 涉及编码核苷二磷酸激酶(ndk)多肽及其同源物的基因的用于修改植物根构造的方法 |
| CN102329818A (zh) * | 2011-07-22 | 2012-01-25 | 大连民族学院 | 一种将抗逆基因导入转基因741杨的方法 |
-
2012
- 2012-05-11 CN CN2012101438438A patent/CN103387999A/zh active Pending
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