CN103330722A

CN103330722A - 一种长白山红蚂蚁提取物的制备方法

Info

Publication number: CN103330722A
Application number: CN2013102146573A
Authority: CN
Inventors: 朴春红; 胡耀辉; 孙常明; 王玉华; 于寒松; 刘俊梅; 代伟长; 赵璐; 汪研
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2013-05-25
Filing date: 2013-05-25
Publication date: 2013-10-02

Abstract

本发明公开了一种长白山红蚂蚁提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：采用真空冷冻干燥机干燥长白山红蚂蚁后将白山红蚂蚁粉碎；采用80％乙醇溶液震荡提取24小时；提取液离心15min，取上清液保存，沉淀部分的蚂蚁在相同条件下重复震荡提取2次，提取液经离心收集上清液，将3次提取的上清液混合；采用旋转蒸发器浓缩并收集浓缩液；浓缩液-80℃预冷后采用真空冷冻干燥机将浓缩液干燥至膏状；将浸提膏先用石油醚萃取以去除去脂类物质，水相萃取液经旋转蒸发浓缩和真空冷冻干燥至膏状，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相萃取液同样经过旋转蒸发浓缩和真空冷冻干燥至膏状；保存备用。本方法获得的长白山红蚂蚁提取物治疗风湿性关节炎效果显著。

Description

一种长白山红蚂蚁提取物的制备方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，尤其涉及一种长白山红蚂蚁提取物的制备方法。

背景技术

类风湿性关节炎(RA)是一种使人衰弱、慢性的、全身性的、复杂的自身免疫性疾病，影响世界各地总人口的0.5％至1％，并且每年每100万人将有20-50人发病，该发病人群主要集中在40多岁的妇女。由人类以及动物模型发现，RA的特征在于一系列的关节病理进程，如白细胞浸润，慢性炎症，血管翳形成，以及广泛的关节软骨和骨的破坏。

RA的发病因素有很多，有遗传因素、环境因素和一些其他因素。虽然RA的病因与发病机制目前尚未完全阐明，但随着细胞分子学和免疫学的深入研究和RA动物模型的建立，发现细胞因子、TH1/TH2细胞平衡、性激素等在RA的发病中起重要作用。

其中人们已证实TNF-a及IL-1在RA进展中起着决定性作用。TNF-a是机体炎症反应与免疫应答的重要调节因子，既能刺激IL-1，IL-6，IL-8的产生，又能刺激其自身的合成，在RA的细胞因子网络中起中心作用。IL-1分为IL-1a和IL-1β，主要由巨噬细胞分泌，内皮细胞和淋巴细胞也能产生，能诱导一系列全身的炎症反应，并能影响IL-6，IL-8的释放。TNF-a和IL-1通过诱导许多种类型的细胞合成和释放炎症性金属蛋白酶、前列腺素和一氧化氮并通过抑制基质组分的生产来介导关节发炎和破坏。也有研究表明：氧化应激反应在RA的发病机制中扮演着重要的角色。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤，如癌症，心血管疾病，动脉粥样硬化和类风湿性关节炎。ROS和RNS不仅能够诱导T细胞产生白细胞介素和TNF-α，而且刺激了内皮细胞，从而影响生长因子、炎性细胞因子和粘连分子在免疫细胞的产生，因此加重了组织的破坏和炎症。

尽管目前还没有一种特效药物能彻底根治风湿病，但根据其发病机制，通过阻滞不同发病的关键环节，能有效缓解疾病进程和提高生活质量。常用的抗风湿药按其功能或作用靶点不同可分为6类：非甾体抗炎药(NSAIDs)、疾病修饰抗风湿药物(DMARDs)、生物制剂、镇痛药、糖皮质激素、免疫调节剂。其中，生物制剂这类药以阻断免疫反应中某个环节而起效，在风湿病治疗中占得地位正在逐步提高。最近研究表明，抗TNF抗体或可溶性TNF受体在类风湿疾病治疗中显示了显著的治疗效果。依他西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)等是目前获得批准的抗TNF-α的治疗药物，在改善风湿疾病方面取得了有效的治疗效果，但同时面临着结核病、充血性心脏衰竭和淋巴瘤等多种副作用。因此，开发一种副作用小、安全可靠的炎症细胞因子拮抗药物是当务之急。

山蚂蚁(Formica aquilonia)也叫北方蚁，是蚂蚁的一种，主要分布于欧洲及亚洲森林一带。长白山红蚂蚁为山蚂蚁的一种，一直以来为周边的居民用于治疗风湿性关节炎的民间疗法。长白山红蚂蚁的理化分析显示其体内的蛋白质含量为40％-60％，并含有人体必须的8种必需氨基酸；富含醛类化合物、多种酶、生物碱等生物活性物质和新纳素、前列腺素E1、精氨酸加压素、胰岛素、睾酮等微量生物活性物质；此外还富含多种维生素和微量元素，其中锌含量极其丰富(120-130mg/g)。对红蚂蚁的药理实验研究结果表明红蚂蚁提取物具有抗癌、抗氧化、抗炎症、抗痴呆和抑制儿茶酚胺的作用。近期有研究发现，长白山红蚂蚁乙酸乙酯提取物具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种长白山红蚂蚁提取物的制备方法，旨在解决目前副作用小、安全可靠的治疗类风湿性关节炎的药物缺乏的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种长白山红蚂蚁提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：

采用真空冷冻干燥机干燥长白山红蚂蚁后将白山红蚂蚁粉碎；

采用80％乙醇溶液震荡提取24小时；

提取液离心15min，取上清液保存，沉淀部分的蚂蚁在相同条件下重复震荡提取2次，提取液经离心收集上清液，将3次提取的上清液混合；

采用旋转蒸发器浓缩并收集浓缩液；

浓缩液-80℃预冷后采用真空冷冻干燥机将浓缩液干燥至膏状；

将浸提膏先用石油醚萃取以去除去脂类物质，水相萃取液经旋转蒸发浓缩和真空冷冻干燥至膏状，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相萃取液同样经过旋转蒸发浓缩和真空冷冻干燥至膏状；

保存备用。

进一步、采用80％乙醇溶液震荡提取中料液比为1∶20，转速为160rpm，温度为30℃。

进一步、将提取液离心采用的转速为3000rpm，保存上清液的温度为4℃。

进一步、旋转蒸发器浓缩上清液的转速为50rpm，温度为40℃。

进一步、浓缩液-80℃预冷时间为2小时。

进一步、保存备用长白山红蚂蚁提取物的温度为4℃。

本发明提供的长白山红蚂蚁提取物的制备方法获得的长白山红蚂蚁提取物副作用小、安全可靠，治疗风湿性关节炎效果显著，具有良好的发展前景。

附图说明

图1是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物的制备方法流程图；

图2是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对AIA大鼠体重增加的影响示意图；

图3是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对AIA大鼠关节炎严重度评分的影响示意图；

图4是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对AIA大鼠足爪体积的影响示意图；

图是5本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对AIA大鼠胸腺指数的影响示意图；

图6是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对AIA大鼠脾指数的影响示意图；

图7是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对AIA模型TNF-α水平的影响示意图；

图8是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对AIA模型大鼠IL-1β水平的影响示意图；

图9是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对AIA模型大鼠IL-6水平的影响示意图；

图10是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对AIA模型大鼠NO水平的影响示意图；

图11是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对AIA模型大鼠H₂O₂水平的影响示意图；

图12是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对AIA模型大鼠GSH水平的影响示意图；

图13是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对CIA大鼠体重增加的影响示意图；

图14是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对CIA大鼠关节炎严重度评分的影响示意图；

图15是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对CIA大鼠足爪体积的影响示意图；

图16是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对CIA大鼠胸腺指数的影响示意图；

图17是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对CIA大鼠脾指数的影响示意图；

图18是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对CIA模型大鼠TNF-α水平的影响示意图；

图19是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对CIA模型大鼠IL-1β水平的影响示意图；

图20是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对CIA模型大鼠IL-6水平的影响示意图；

图21是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对CIA模型大鼠NO水平的影响示意图；

图22是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对CIA模型大鼠H₂O₂水平的影响示意图；

图23是本发明实施例提供的长白山红蚂蚁提取物对CIA模型大鼠GSH水平的影响示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

图1示出了本发明提供的长白山红蚂蚁提取物的制备方法的流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。

如图1所示，本发明的实施例提供长白山红蚂蚁提取物的制备方法包括以下步骤：

采用80％乙醇溶液震荡提取24小时；

采用旋转蒸发器浓缩并收集浓缩液；

保存备用。

作为本发明实施例的一优化方案，采用80％乙醇溶液震荡提取中料液比为1∶20，转速为160rpm，温度为30℃。

作为本发明实施例的一优化方案，将提取液离心采用的转速为3000rpm，保存上清液的温度为4℃。

作为本发明实施例的一优化方案，旋转蒸发器浓缩上清液的转速为50rpm，温度为40℃。

作为本发明实施例的一优化方案，浓缩液-80℃预冷时间为2小时。

作为本发明实施例的一优化方案，保存备用长白山红蚂蚁提取物的温度为4℃。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

一、长白山红蚂蚁提取物对AIA模型大鼠的治疗作用

1.1实验材料

长白山红蚂蚁购于吉林省健龙实业有限公司；雷公藤多甙片(上海复旦复华科技有限公司，国药准字Z31020415，产品编号：P20080118083050136)；大鼠TNF-α检测试剂盒、大鼠IL-1β检测试剂盒、大鼠IL-6检测试剂盒均购自美国R.D.公司；过氧化氢(H₂O₂)测试盒、一氧化氮(NO)测试盒、还原型谷胱甘肽(GSH)测试盒均购自上海劲马实验设备有限公司；牛II型胶原、完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)均购自美国chondrex公司。

1.2实验动物

150g-180g SPF级雄性Wister大鼠60只，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司(许可证号：SCXK-(吉)2011-0004)。依据中国医学科学吉林省研究院动物管理和使用委员会的标准和政策进行实验研究。动物饲养条件：将大鼠养在聚丙烯的大鼠笼中，保持实验室室温23±2℃，相对湿度63.5±0.9％，给予12h昼夜光照交替，并给予等量的鼠粮和饮用水，并定期更换垫料，保持室内卫生清洁。

1.3实验方法

1.3.1长白山红蚂蚁提取物的制备

长白山红蚂蚁先用真空冷冻干燥机干燥，后立即粉碎，准确称取4kg蚂蚁粉，以80％乙醇溶液震荡提取24小时：料液比1∶20，转速160rpm，30℃。提取液离心(3000rpm)15min，取上清液4℃保存，沉淀部分的蚂蚁在相同条件下重复震荡提取2次，提取液经离心收集上清液，将3次提取的上清液混合，用旋转蒸发器浓缩(50rpm，40℃)并收集浓缩液。浓缩液-80℃预冷2小时，用真空冷冻干燥机干燥至膏状。将浸提膏先用石油醚萃取以去除去脂类物质，水相萃取液经旋转蒸发浓缩和真空冷冻干燥至膏状，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相萃取液同样经过旋转蒸发浓缩和真空冷冻干燥至膏状，得长白山红蚂蚁提取物768g，提取得率为19.2％。4℃保存备用。

1.3.2AIA模型的制备

完全弗氏佐剂(CFA)(热致死分支杆菌含量：10mg/mL)购自美国Chondrex公司。雄性Wister大鼠60只，随机选出10只作为正常组，其余50只制作类风湿模型。正常组大鼠不做任何处理，建模大鼠的右后足足垫用酒精棉擦拭消毒，皮下注射含有10mg/mL热致死分支杆菌的CFA0.10mL致炎，注射针的针尖插入挨近踝关节的足垫皮肤下面。大鼠左后足足垫的同一部位注射0.10mL的生理盐水。注射佐剂的当天定义为第0天。

1.3.3分组及治疗

在注射致炎剂的第14天仔细观察造模的大鼠的左后足是否发病，随机分为5组：模型组、阳性对照组、高剂量治疗组、中剂量治疗组和低剂量治疗组，每组10只。分组当天即给予药物灌胃治疗，各组灌胃剂量为模型组(2mL生理盐水)、阳性对照组(10mg/kg的雷公藤多苷片)、高剂量治疗组(1000mg/kg)、中剂量治疗组(100mg/kg)、低剂量治疗组(10mg/kg)，每日定时灌胃一次，直至第42天。

1.3.4大鼠关节炎严重度评分

大鼠关节炎严重度评分标准为：0：无关节炎症状；1：爪子一个足趾红肿；2：两个关节发生肿胀；3：超过两个关节发生肿胀；4：整个爪子严重肿胀并且全部足趾肿胀^[63]。定期观察大鼠关节炎严重度情况，严格按照评级标准记录严重度，每只大鼠关节炎严重度由单个爪子严重度数相加计算而得。

1.3.5大鼠体重的测量

每隔3-4天用电子天平测一次体重，直至第42天。每次测量重复两次，按照平均值±标准差记录。

1.3.6足爪体积的测量

用YLS-7A足趾容积测量仪(购于济南益延科技发展有限公司)来测量足爪体积。在致炎前一天和致炎当天和致炎第二天每天测定爪体积，之后每隔3-4天测量一次，每次测量重复两次，按照平均值±标准差记录。

1.3.7胸腺指数和脾指数

在建模后第42天，将大鼠处死，取胸腺、脾脏并称重，其重量与其体重的比值作为胸腺指数和脾指数(mg·100g-1)。

1.3.8血清中风湿因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平的测定

分别应用大鼠TNF-α检测试剂盒、大鼠IL-1β检测试剂盒、大鼠IL-6检测试剂盒测定各组大鼠血清来定量测定各种细胞因子，试剂盒均购自美国R.D.公司。每组样品和标准样品各准备两份，测定两次后取其平均值，按照平均值±标准差记录。

1.3.9氧化应激状态的检测

杀鼠取血并提取血浆样品测定氧化应激生物指示水平，即：一氧化氮、过氧化氢和谷胱甘肽的活性。在实验第42天杀鼠，通过心脏穿刺取血并装在含有肝素的试管中。这种肝素化血液样品经离心收集血浆，分别用过氧化氢(H₂O₂)测试盒、一氧化氮(NO)测试盒(硝酸还原酶法)、还原型谷胱甘肽(GSH)测试盒测定氧化应激参数。

1.3.10数据分析

实验数据均用Means士SD表示，用SPSS12.0.1 for windows统计软件进行统计分析。单因素用One-wayANOVA分析，多重比较用LSD法。p＜0.05表示具有统计学意义。

1.4结果与分析

1.4.1长白山红蚂蚁提取物对AIA大鼠一般发病情况的影响

正常组大鼠在42天的实验中精神状态良好，活泼善动，皮毛光泽色白净，饮食正常，体重呈现正常增加。

模型组大鼠在注射诱导剂的30min内注射足即出现急性肿胀，注射部位出现结痂，严重者甚至出现溃烂。到实验第14天左右，对侧的后足和前足也出现明显肿胀，耳部出现红斑，尾部出现结节，体毛干而无光泽，饮食减少，精神萎靡，关节活动不利，行走困难，体形瘦弱，体重严重下降。

阳性对照组大鼠实验前期一般状况与模型组大鼠无异，随着灌胃治疗的进行，状况有所好转，但是皮毛枯糙发黄，倦怠懒动进食较少，体重增长缓慢，与正常组大鼠状况有明显差异。

长白山红蚂蚁提取物高剂量组大鼠前期一般状况与模型组大鼠无异，随着灌胃治疗的进行，状况明显好转，皮毛光泽，较活跃，进食况较好，排便正常，体形与正常鼠近似。

1.4.2长白山红蚂蚁提取物对大鼠AIA模型体重的影响

在实验开始时，实验动物的体重在各实验组之间不存在显著差异，到致炎第17天开始，正常组与模型组、各治疗组之间的体重增加值开始出现显著性差异，至第21天，正常组和模型组(p＜0.013)、阳性对照组(p＜0.030)、高剂量组(p＜0.001)、中剂量组(p＜0.000)、低剂量组(p＜0.000)之间均表现出差异显著性。其中正常组与模型组(p＜0.005)、低剂量治疗组(p＜0.012)之间差异显著性一直延续至实验结束；到第33天，正常组与阳性对照组、高剂量治疗组之间不表现差异显著性(见图2)。

1.4.3长白山红蚂蚁提取物对关节炎严重度的影响

对于AIA模型，因为造模时右后足足垫皮下注射CFA制炎，作为预期现象，注射的那只足爪不能包含在关节炎严重度评分记录内，因为即使其他足爪未肿胀，注射足也经常会出现肿胀，所以，AIA模型鼠关节炎严重度最高得分为12分。各组大鼠关节炎严重度评分如图3所示，在实验第23天后模型组大鼠严重度达到峰值，之后维持这一水平；各治疗组大鼠严重度均表现一定的减轻趋势，尤其是高剂量治疗组和阳性对照组严重度减轻的趋势更加显著。

1.4.4长白山红蚂蚁提取物对AIA大鼠足爪体积的影响

严重的急性关节炎症在注射佐剂的30分钟内就会在注射足出现，在第3-4天到达炎症巅峰。由于未发病的大鼠的注射足往往也会严重肿胀，因此注射足不用做发病的表征。典型的关节炎肿胀在致炎后的第12-14天在未注射佐剂的足爪(左后足)出现，并且在3-4天后达到巅峰。在致炎后第16天，正常组的左后足体积与模型组(p＜0.048)、阳性对照组(p＜0.033)、高剂量组(p＜0.043)、中剂量组(p＜0.013)、低剂量组(p＜0.003)之间均表现出差异显著性(Fig.2)。至第31天，正常组与高剂量治疗组之间差异不显著，但是模型组与阳性对照组(p＜0.018)、高剂量治疗组(p＜0.007)表现差异显著，并且显著性一直延续到实验结束。至第39天，正常组与阳性对照组之间不表现差异显著性。中、低剂量治疗组与模型组之间在整个实验中均未表现差异显著性(见图4)。

1.4.5长白山红蚂蚁提取物对AIA大鼠胸腺指数和脾指数的影响

风湿性关节炎可以造成胸腺萎缩和脾肿胀。图5和图6给出了实验各组的胸腺指数和脾指数。与正常组相比，风湿关节炎模型组相比其胸腺指数(p＜0.001)和脾指数(p＜0.001)差异极显著。与风湿关节炎模型组相比，高剂量治疗组能显著增加胸腺指数(p＜0.009)和显著降低脾指数(p＜0.020)，但是中、低剂量治疗组相比不表现显著性。同样，与风湿关节炎模型组相比，阳性对照组也能显著增加胸腺指数(p＜0.011)和显著降低脾指数(p＜0.017)。

1.4.6长白山红蚂蚁提取物对AIA模型风湿因子水平的影响

风湿因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平能够很好的反应关节炎的发病情况。图7-图9给出了正常组、模型组和治疗组大鼠血清中风湿因子TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度水平。由图我们可以看出，与正常组相比，AIA模型组TNF-α(p＜0.000)、IL-1β(p＜0.000)和IL-6(p＜0.000)水平极显著增加。与风湿关节炎模型组相比，高剂量治疗组TNF-α(p＜0.000)、IL-1β(p＜0.000)和IL-6(p＜0.000)水平能够极显著的降低；中剂量治疗组的TNF-α(p＜0.008)水平显著降低，但是IL-1β和IL-6水平的降低不表现显著性；低剂量治疗组的TNF-α、IL-1β和IL-6水平的降低均不表现显著性。雷公藤多苷治疗组与风湿关节炎模型组相比TNF-α(p＜0.000)、IL-1β(p＜0.002)和IL-6(p＜0.034)水平极显著降低。

1.4.7长白山红蚂蚁提取物对AIA大鼠氧化应激水平的影响

图10-12给出了正常组、模型组和治疗组大鼠血浆中的NO、H₂O₂、GSH含量的水平。由图可见，与正常组相比，关节炎模型组大鼠血浆中NO(p＜0.000)和H₂O₂(p＜0.000)水平显著增加，相反，GSH(p＜0.000)水平显著降低。与关节炎模型组相比，长白山红蚂蚁提取物治疗组在降低NO(p＜0.000，1000mg/kg；p＜0.002，100mg/kg；)和H₂O₂(p＜0.004，1000mg/kg)水平和增加GSH(p＜0.001，1000mg/kg；p＜0.037，100mg/kg)水平表现剂量高低关系。同样，与关节炎模型组相比，TGT阳性治疗组也能够显著降低NO(p＜0.000)和H₂O₂(p＜0.000)水平和增加GSH(p＜0.000)水平。

1.5讨论与结论

本研究应用SPF级成年雄性Wister大鼠成功建立了AIA模型，发病率能够达到90％以上。并通过定期用长白山红蚂蚁提取物对发病大鼠灌胃治疗，验证了长白山红蚂蚁提取物对类风湿性关节炎的治疗作用。通过在实验时对体重和足趾体积的测量和在实验结束时杀鼠取血并对血清促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和血浆氧化应激(NO、H₂O₂、GSH)的检测，分别从大鼠体外变化和体内变化对类风湿性关节炎的治疗作用进行了评价。

经过长白山红蚂蚁提取物的灌胃治疗后的实验结果可见，长白山红蚂蚁提取物能明显减轻关节炎发病大鼠的足趾肿胀程度，并且显著增加关节炎发病大鼠的体重和改善胸腺指数和脾指数的水平，表现出剂量依赖的关系。

在类风湿性关节炎发病机理的研究中发现，T细胞在类风湿性关节炎中扮演着重要的角色。激活的T细胞和巨噬细胞能够释放大量的TNF-α、IL-1等促炎性细胞因子，这些细胞因子参与并决定了类风湿性关节炎的发病开始和延续。因此，阻断这些促炎性细胞因子的过量释放，对于类风湿性关节炎来说是一种新型的治疗方法。由本研究的结果可见，长白山红蚂蚁提取物高剂量治疗组能够显著降低TNF-α(p＜0.000)、IL-1β(p＜0.000)和IL-6(p＜0.000)水平，并表现剂量依赖的关系。

除了炎症细胞因子之外，氧化应激在类风湿性关节炎的发病中也表现重要的作用。由于ROS和RNS可以作为组织损伤的介质，所以循环免疫细胞能够浸入发炎的组织并活化，在周围组织中释放促炎性细胞因子和进一步反应的物质。ROS对软骨的破坏能够被内源性抗氧化化合物GSH强烈的抑制。在很多前人的研究和我们的研究中发现，在关节炎大鼠中可以很明显观察到较高水平的一氧化氮和过氧化氢和较低水平的GSH，这与疾病的严重程度有关。活性氧清除活性的评价表明，我们研究的长白山红蚂蚁提取物能够明显的降低NO(p＜0.000，1000mg/kg；p＜0.002，100mg/kg；p＜0.104，10mg/kg)和H₂O₂(p＜0.004，1000mg/kg；p＜0.110，100mg/kg；p＜0.698，10mg/kg)水平和增加GSH(p＜0.001，1000mg/kg；p＜0.037，100mg/kg；p＜0.231，10mg/kg)水平，表现剂量依赖的关系。

因此，在本研究中，我们能够证明长白山红蚂蚁提取物在大鼠AIA模型中能显著抑制类风湿性关节炎的发生和发展，并表现出剂量依赖关系。我们还可以得出长白山红蚂蚁提取物不仅能够显著抑制促炎性细胞因子的释放，而且能够显著抑制一氧化氮和过氧化氢水平和增加GSH水平，另外也能显著改善胸腺指数和脾指数的水平。由此可见，长白山红蚂蚁提取物对类风湿性关节炎的治疗表现出多重作用，这对长白山红蚂蚁抗类风湿性关节炎食品和药品的开发提供了重要的借鉴。

二、长白山红蚂蚁提取物对CIA模型大鼠的治疗作用

2.1实验材料

不完全弗氏佐剂(IFA)和牛II型胶原(2mg/mL)：均购自美国chondrex公司；其他试剂同1.1。

2.2实验动物

同1.2。

2.3实验方法

2.3.1长白山红蚂蚁提取物的制备

同1.2.1

2.3.2CIA模型的制备

雄性Wister大鼠60只，随机选出10只作为正常组，其余50只制作类风湿模型。正常组大鼠不做任何处理，建模大鼠的尾基部用酒精棉擦拭消毒，采用尾基部皮下注射稳定的牛II型胶原与完全弗氏佐剂的完全乳化剂共0.25mL，首次诱导7天后，尾基部皮下加强诱导注射0.1mL/只。注射诱导剂当天定义为第0天。

2.3.3分组及治疗

同1.3.3。

2.3.4大鼠关节炎严重度评分

同1.3.4。

2.3.5大鼠体重的测量

同1.3.5

2.3.6足爪体积的测量

同1.3.6。

2.3.7胸腺指数和脾指数

同1.3.7。

2.3.8风湿因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平的测定

同1.3.8。

2.3.9氧化应激水平的测定

同1.3.9。

2.3.10数据分析

同1.3.10。

2.3实验结果

2.3.1长白山红蚂蚁提取物对CIA大鼠一般发病情况的影响

长白山红蚂蚁提取物对CIA大鼠一般发病情况的影响与AIA大鼠的发病情况基本类似，模型组大鼠体毛干而无泽、饮食减少、神萎懒动，后期见关节活动不利，负重困难，纳食减少、体形瘦弱，尾部明显出现结节。正常组大鼠皮毛光泽色白，精神佳、活泼，饮食正常。阳性对照组大鼠皮毛枯糙发黄、倦怠懒动进食较少、体重增长缓慢。长白山红蚂蚁提取物高剂量组大鼠皮毛光泽、较活跃、进食况较好、排便正常、体形与正常鼠近似。

2.3.2长白山红蚂蚁提取物对大鼠CIA模型体重的影响

如图13所示，长白山红蚂蚁提取物对大鼠CIA模型足爪体积的影响与AIA模型基本相似。到致炎后第21天，正常组和模型组(p＜0.022)表现出差异显著性，且一直持续到实验结束(p＜0.002)。到致炎后第38天，模型组与雷公藤多苷阳性对照组(p＜0.025)、高剂量治疗组(p＜0.041)和中剂量治疗组(p＜0.047)之间均表现出显著性差异，但不与低剂量治疗组表现显著性差异。

2.3.3长白山红蚂蚁提取物对CIA大鼠关节炎严重度评分的影响

对于CIA模型，由于诱导剂是在尾基部注射的，因而四个足爪均可以作为评分，所以CIA模型鼠关节炎严重度最高得分为16分。各组大鼠关节炎严重度评分见图14。由图可见，长白山红蚂蚁提取物高剂量治疗组能够显著的降低CIA大鼠关节炎严重度。

2.3.4长白山红蚂蚁提取物对CIA大鼠右后足足爪体积的影响

如图15可见，长白山红蚂蚁提取物对大鼠CIA模型足爪体积的影响与AIA模型基本相似。典型的关节炎肿胀在致炎后第13天开始在后足足爪出现，并且在3-4天后达到巅峰。在致炎后第19天，正常组的左后足体积与模型组(p＜0.021)、阳性对照组(p＜0.000)、高剂量组(p＜0.009)、中剂量组(p＜0.013)、低剂量组(p＜0.020)之间均表现出差异显著性。至第35天，正常组与高剂量治疗组之间差异不显著；至第42天，正常组与阳性对照组之间差异不显著。

2.3.5长白山红蚂蚁提取物对CIA大鼠胸腺指数和脾指数的影响

图16-17给出了实验各组的胸腺指数和脾指数。正常组与CIA模型组相比其胸腺指数(p＜0.000)和脾指数(p＜0.002)差异极显著。与CIA模型组相比，高剂量治疗组能显著增加胸腺指数(p＜0.005)和显著降低脾指数(p＜0.004)，但是中、低剂量治疗组相比不表现显著性。同样，与风湿关节炎模型组相比，阳性对照组也能显著增加胸腺指数(p＜0.012)和显著降低脾指数(p＜0.000)。

2.3.6长白山红蚂蚁提取物对CIA模型风湿因子水平的影响

由图18-20我们可以看出，与正常组相比，CIA模型组的TNF-α(p＜0.000)、IL-1β(p＜0.012)和IL-6(p＜0.000)水平极显著增加。与模型组相比，高剂量治疗组TNF-α(p＜0.000)、IL-1β(p＜0.000)和IL-6(p＜0.026)水平能够极显著的降低；中、低剂量治疗组的TNF-α、IL-1β和IL-6水平的降低均不表现显著性。雷公藤多苷治疗组与CIA模型组相比TNF-α(p＜0.000)、IL-1β(p＜0.000)和IL-6(p＜0.008)水平极显著降低。

2.3.7长白山红蚂蚁提取物对CIA大鼠氧化应激水平的影响

由图21-23可见，与正常组相比，关节炎模型组大鼠血浆中NO(p＜0.001)和H₂O₂(p＜0.001)水平显著增加，相反，GSH(p＜0.000)水平显著降低。与CIA模型组相比，长白山红蚂蚁提取物高剂量治疗组能显著降低NO(p＜0.000)和H₂O₂(p＜0.000)水平和增加GSH(p＜0.007)水平。同样，与关节炎模型组相比，TGT阳性治疗组也能够显著降低NO(p＜0.004)和H₂O₂(p＜0.002)水平和增加GSH(p＜0.001)水平。

3.3讨论与结论

本研究应用SPF级成年雄性Wister大鼠成功建立了CIA模型，并通过定期用长白山红蚂蚁提取物对发病大鼠灌胃治疗，验证了长白山红蚂蚁提取物对类风湿性关节炎的治疗作用。通过在实验时对体重和足趾体积的测量和在实验结束时杀鼠取血并对血清促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和血浆氧化应激(NO、H₂O₂、GSH)的检测，分别从大鼠体外变化和体内变化对类风湿性关节炎的治疗作用进行了评价。

大鼠体外观察结果显示，与模型组相比，长白山红蚂蚁提取物高剂量治疗组大鼠的发病严重度和足趾体积明显降低，体重明显恢复，这些结果表明长白山红蚂蚁提取物能够明显改善类风湿性关节炎发病大鼠的体质，进而表明红蚂蚁提取物能有效的抑制CIA大鼠的关节炎症。大鼠体内变化结果显示，长白山红蚂蚁提取物能够明显改善胸腺指数和脾指数，能够显著降低促炎性细胞因子TNF-α(p＜0.000)、IL-1β(p＜0.000)和IL-6(p＜0.026)的水平，还能有效降低NO(p＜0.000)和H₂O₂(p＜0.000)水平并增加GSH(p＜0.007)水平，并表现剂量依赖的关系，这些内部体质的变化表明长白山红蚂蚁具有较强的抗RA活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种长白山红蚂蚁提取物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

采用80％乙醇溶液震荡提取24小时；

采用旋转蒸发器浓缩并收集浓缩液；

保存备用。

2.如权利要求1所述的长白山红蚂蚁提取物的制备方法，其特征在于，采用80％乙醇溶液震荡提取中料液比为1∶20，转速为160rpm，温度为30℃。

3.如权利要求1所述的长白山红蚂蚁提取物的制备方法，其特征在于，将提取液离心采用的转速为3000rpm，保存上清液的温度为4℃。

4.如权利要求1所述的长白山红蚂蚁提取物的制备方法，其特征在于，旋转蒸发器浓缩上清液的转速为50rpm，温度为40℃。

5.如权利要求1所述的长白山红蚂蚁提取物的制备方法，其特征在于，浓缩液-80℃预冷时间为2小时。

6.如权利要求1所述的长白山红蚂蚁提取物的制备方法，其特征在于，保存备用长白山红蚂蚁提取物的温度为4℃。