CN103305499A - 一种直接扩增试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PCR扩增的试剂及其应用。本发明提供的直接扩增试剂，为如下1)或2)：1)所示的直接扩增试剂包括非离子型表面活性剂和醇类化合物；2)所示的直接扩增试剂包括非离子型表面活性剂；本发明的实验证明，本发明提供的直接扩增试剂，能够越过DNA提取与纯化步骤直接对FTA血卡、血液等常见生物样本进行PCR扩增或STR荧光复合扩增，获得理想结果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种直接扩增试剂及其应用。
背景技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain reaction)，简称PCR是一种重要的分子生物学技术。自20世纪80年代末，Mullis等人开发PCR技术以来，该技术基于其特有的技术优势，已被广泛应用于生物学、医学、法医学等各相关领域。
模板DNA的质与量通常直接决定着PCR反应的成败。因此，大量的基于PCR技术的检验方法与检测手段需要在扩增前进行生物样本的DNA提取与纯化。以法医DNA检验为例，其主要检验流程包括DNA提取、DNA定量、PCR扩增、产物检测等四个步骤。然而，常规的DNA提取方法如有机法(酚氯仿法)、硅珠法、Chelex法等通常涉及以下技术缺陷：1)操作步骤繁琐；2)耗时长；3)耗费大量人力、物力、财力；4)提取效率低；5)涉及有毒有害有机试剂的使用；6)无法实现提取自动化等。磁珠DNA提取法能够有效提高DNA提取效率，简化操作步骤，避免使用有毒溶剂，且能够实现高通DNA的自动化提取。但是，当面对超大规模生物样本高通量检验时，该方法仍然存在诸多不足之处，1)虽然可实现自动化，但需要依托于大型自动化操作工作站，硬件投入大；2)容易造成样本间的交叉污染；3)试剂大多已商业化，试剂成本投入大；4)配套耗材消耗大；5)该法虽然极大的减少的操作时间，但全操作仍然需要消耗1.5-3个小时；
为了攻克这些样本高通量检验的瓶颈，提高样本的检验效率，很多研究人员试图能够省去DNA提取步骤，直接针对适量生物样本进行PCR扩增操作，即所谓的直接扩增技术(Direct PCR)。
直接PCR(Direct PCR)又称直接扩增技术或免提取扩增技术，它能够将原始未经DNA提取与其它前处理步骤的样本直接加入PCR反应体系并获得扩增产物，减少检验步骤，降低检验成本，是PCR技术的一种，对于生物样本快速高效检验而言，这无疑将是一个巨大的革命性进步。然而，实际应用过程中发现，采用传统的直接扩增试剂并不能得到理想的实验结果。其主要的原因是生物样本通常伴随着大量的PCR抑制剂释放至PCR体系中，使DNA聚合酶活性降低或者失活，从而严重降低PCR效率甚至导致阴性结果的产生。
近年来随着该技术的快速发展，研究人员建立通过添加不同PCR增强剂或使用具有抗抑制能力的聚合酶多种不同直接扩增试剂体系。很多商业化直接扩增试剂也先后被推出并应用于实践。
血液、唾液等生物样本是直接扩增的常见样本类型，这些样本通常位于不同的载体上。常见的载体类型有棉纤维、滤纸、903卡，此外还有FTA卡、FTA口腔卡(指示型)等。FTA卡是一种针对各种生物样品进行收集、运输、存档和纯化其核酸并进行PCR、SNP，RT-PCR、RFLP以及限制酶解作用等分析而设计的常用载体，应用范围广泛。FTA卡经过专利的化学配方浸渍，能溶解细胞膜并改变蛋白质特性，核酸被固定下来并可保护其免于UV光线损害、以及微生物和真菌的侵蚀，利于DNA的保存。当前，FTA卡被众多法医DNA实验室作为保存样本的载体广泛使用于DNA检验领域。同时，值得注意的是FTA卡片保存样本(FTA血卡、口腔卡)在进行DNA检验的过程中，由于含有大量PCR抑制剂，需要进行提取或者水洗处理，否则极易导致不完全扩增现象或扩增失败。
随着我国DNA数据库建设步伐的进一步加快，急需提高样本检验速度，直接PCR技术是解决该问题的有效途径之一，当前所有商业化直扩试剂对FTA卡进行直接扩增均基于一定的体系范围(20-25uL)或者相应低减小FTA卡的打孔大小(0.5-0.75)。采用低体系(8ul-10ul)进行常规大小FTA血卡或口腔卡扩增时，表现出明显的抑制或者是完全失败，具有两个明显的应用瓶颈：1)不能有效节约检验成本；2)由于使用低体系而导致孔径的减小势必导致新的一系列问题的出现，如较小血卡(0.5mm)更受静电力的影响大，容易造成交叉污染，0.5mm的孔径只能采用人工打孔的方法，现存的BSD自动打孔器不能达到0.5mm的使用要求，不能有效简化操作流程，且不利于样本的高通量检验。
发明内容
本发明提供了一种直接扩增试剂。
本发明提供的直接扩增试剂，为如下1)或2)：
1)所示的直接扩增试剂包括非离子型表面活性剂和醇类化合物；
2)所示的直接扩增试剂包括非离子型表面活性剂；
所述非离子型表面活性剂为Tween 20、Tween60、Tween80、Tween65、Tween85、TritonX-100、乙基苯基聚乙二醇(NP40)、辛基苯基-聚乙烯二醇(
CA-630)、聚氧乙烯10油醚和N-辛酰基-N-甲基葡糖胺中的至少一种；
所述醇类化合物为PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG6000、PEG8000、乙二醇、丙三醇、丙二醇和己二醇中的至少一种。
上述直接扩增试剂中，1)所示的直接扩增试剂为如下1a)或1b)：
所述1a)中，所述非离子型表面活性剂为N-辛酰基-N-甲基葡糖胺和辛基苯基-聚乙烯二醇，所述醇类化合物为PEG6000；
所述1b)中，所述非离子型表面活性剂为Tween 20，所述醇类化合物为PEG6000；
所述2)中，所述非离子型表面活性剂为Tween 20和辛基苯基-聚乙烯二醇。
上述直接扩增试剂中，
所述1a)中，所述N-辛酰基-N-甲基葡糖胺、所述辛基苯基-聚乙烯二醇和所述PEG6000的配比为(0.12-0.3)ml∶(0.12-0.3)ml∶5g；所述N-辛酰基-N-甲基葡糖胺、所述辛基苯基-聚乙烯二醇和所述PEG6000的配比进一步具体为0.2ml∶0.2ml∶5g；
所述1b)中，所述Tween 20和所述PEG6000的配比为(0.8-1)ml∶5g；所述Tween20和所述PEG6000的配比进一步具体为0.9ml∶5g；
所述2)中，所述Tween 20和所述辛基苯基-聚乙烯二醇的体积比为(0.8-1)∶0.12；所述Tween 20和所述辛基苯基-聚乙烯二醇的体积比进一步具体为0.9∶0.12。
上述直接扩增试剂中，
所述1a)、1b)或2)中均还包括pH为8.3浓度为20mmol/L的Tris-HCl缓冲液、MgCl2、dNTPs、KCl、NH4Cl、BSA、DNA聚合酶和水；
所述1a)由所述pH为8.3浓度为20mmol/L Tris-HCl缓冲液、所述MgCl2、所述dNTPs、所述KCl、所述NH4Cl、所述BSA、所述N-辛酰基-N-甲基葡糖胺、所述辛基苯基-聚乙烯二醇、所述PEG6000、DNA聚合酶和所述水组成；
所述1b)由所述pH为8.3浓度为20mmol/L Tris-HCl缓冲液、所述MgCl2、所述dNTPs、所述KCl、所述NH4Cl、所述BSA、所述Tween 20、所述PEG6000、所述DNA聚合酶和所述水组成；
所述2)由所述pH为8.3浓度为20mmol/L Tris-HCl缓冲液、所述MgCl2、所述dNTPs、所述KCl、所述NH4Cl、所述BSA、所述Tween 20、所述辛基苯基-聚乙烯二醇、所述NA聚合酶和所述水组成。
上述直接扩增试剂中，所述1a)中，所述N-辛酰基-N-甲基葡糖胺在所述1a)中的浓度为0.12％-0.3％(体积百分含量)；所述N-辛酰基-N-甲基葡糖胺在所述1a)中的浓度进一步具体为0.2％(体积百分含量)；
所述辛基苯基-聚乙烯二醇在所述1a)中的浓度为0.12％-0.3％(体积百分含量)；所述辛基苯基-聚乙烯二醇在所述1a)中的浓度进一步具体为0.2％(体积百分含量)；
所述PEG6000在所述1a)中的浓度为4.5％-5.5％(质量百分含量)；所述PEG6000在所述1a)中的浓度进一步具体为5％(质量百分含量)；
所述1b)中，所述Tween 20在所述1b)中的浓度为0.8％-1％(体积百分含量)，所述Tween 20在所述1b)中的浓度进一步具体为0.9％(体积百分含量)；
所述PEG6000在所述1b)中的浓度为4.5％-5.5％(质量百分含量)；所述PEG6000在所述1b)中的浓度进一步具体为5％(质量百分含量)；
所述2)中，所述Tween 20在所述2)中的浓度为0.8％-1％(体积百分含量)；所述Tween 20在所述2)中的浓度具体为0.9％(体积百分含量)；
所述辛基苯基-聚乙烯二醇在所述2)中的浓度为0.1％-0.2％(体积百分含量)；所述辛基苯基-聚乙烯二醇在所述2)中的浓度进一步具体为0.12％(体积百分含量)。
在所述1a)、1b)和2)中，所述MgCl2在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度均为1.6mmol/L；每一种所述dNTP在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度均为200uM；所述KCl在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度均为50mmol/L；所述NH4Cl在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度均为25mmol/L；所述BSA在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度为700ug/ml-1200ug/ml；所述BSA在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度具体进一步为980ug/ml或1200ug/ml；所述DNA聚合酶在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度为0.1U/ul-0.4U/ul，所述DNA聚合酶在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度进一步具体为0.3U/ul或0.4U/ul。
本发明的另一个目的是提供一种直接扩增试剂盒。
本发明提供的直接扩增试剂盒，包括上述的直接扩增试剂。
上述的直接扩增试剂或上述的试剂盒在制备用于待测样本直接扩增的产品中的应用也是本发明保护的范围。
在上述应用中，所述待测样本为孔径为1.2mm的FTA血卡、孔径为1.2mm的FTA口腔卡或孔径为1.2mm普通滤纸血卡；
所述直接扩增的扩增体系体积为8ul-10ul，所述直接扩增的扩增体系体积进一步具体为8ul或10ul；
所述直接扩增试剂为STR荧光复合扩增。
本发明的第三个目的是提供一种用于待测样本直接扩增试剂的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的直接扩增试剂或上述的试剂盒与引物对待测样本进行直接扩增试剂，得到扩增产物。
上述方法中，所述待测样本为孔径为1.2mm的FTA血卡、孔径为1.2mm的FTA口腔卡或孔径为1.2mm普通滤纸血卡；
所述直接扩增的扩增体系体积为8ul-10ul，所述直接扩增的扩增体系体积进一步具体为8ul或10ul；
所述直接扩增为STR荧光复合扩增。
上述方法中的引物为DNATyper15试剂盒(购自公安部物证鉴定中心)中的引物。
本发明的实验证明，本发明提供的直接扩增试剂，能够越过DNA提取与纯化步骤直接对FTA血卡、血液等常见生物样本进行PCR扩增或STR荧光复合扩增，获得理想结果，能够在极低扩增试剂体系(8-10μl)下，实现对1.2mm FTA血卡和口腔卡的直接扩增，获得高质量的STR分型图谱，单次检测成功率达93％以上(所有被检验样本中能够获得完整的STR信息的样本数为X，样本总数为Y，上述检验成功率为X/Y)，因此本发明提供的试剂能够满足降低成本的要求又能够有效突破上述诸多技术瓶颈，实现高效率、高成功率扩增。
附图说明
图1为标准STR分型图谱
图2为1.2mm FTA血卡在8μl试剂体系的直接扩增结果
图3为1.2mm FTA血卡在10μl试剂体系的直接扩增结果
图4为1.2mm FTA口腔卡在10μl试剂体系的直接扩增结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的浓度如无特殊说明，均为体系终浓度。
下述实施例中所用的材料举例如下：
非离子型表面活性剂为Tween 20、Tween60、Tween80、Tween65、Tween85、TritonX-100、NP40、辛基苯基-聚乙烯二醇、聚氧乙烯10油醚或N-辛酰基-N-甲基葡糖胺；
醇类化合物为PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG6000、PEG8000、乙二醇、丙三醇、丙二醇或己二醇；
FTA血卡样本，均由公安部物证鉴定中心提供的血样，血卡的出售公司Whatman公司，产品目录号WB129237；由不同的需要剪成不同大小的血卡。
DNAtyper15试剂盒的引物组合为购自公安部物证鉴定中心的DNAtyper15试剂盒中的引物。
pH值为8.3(室温条件下)20mmol Tris-HCl缓冲液为购自美国Amresco公司，产品目录号目录号：0780C171；Tris碱溶于水后终浓度为20mmol，用浓盐酸调节pH值至8.0-8.3)；
BSA(美国Amresco公司，产品目录号E588)；
辛基苯基-聚乙烯二醇(IPEGAL CA630，美国Sigma公司，产品目录号I8896)；
TritonX-100(美国Sigma公司，产品目录号T8787)；
Taq DNA聚合酶(Roche公司，产品目录号12032945001)；
Tween20(Amresco公司，产品目录号0630C404)；
NP40(罗氏，产品目录号11332473001)；
PEG200(美国sigma，产品目录号p3015)；
GoldTaq DNA聚合酶(Roche公司，货号：12032945001)；
PEG6000(德国Merck公司，货号807491)；
实施例1、标准STR分型图谱的获得
取3.0mm FTA血卡样本(公安部物证鉴定中心提供的血样，血卡的出售公司Whatman公司，产品目录号WB129237)，采用Chelex-100法按照标准操作流程进行DNA提取操作，采用DNATyper15试剂盒(购自公安部物证鉴定中心)按照操作说明进行STR荧光复合扩增，在ABI3130xl上进行电泳分离荧光检测，经软件分析获得的结果如图1。
实施例2、直接扩增试剂的制备及其应用
一、1.2mm FTA血卡在8μl试剂体系中的直接扩增(用直接扩增试剂1a)
本部分实验主要为了进一步证明本发明试剂的高抗抑制能力。
方法一：
1、直接扩增试剂1a的制备
直接扩增试剂1a由20mmol Tris-HCl，1.6mM MgCl 2，200uM each dNTP，50mM KCl，25mM NH4Cl，1200ug/ml BSA，0.2％(体积百分含量)辛基苯基-聚乙烯二醇，0.2％(体积百分含量)N-辛酰基-N-甲基葡糖胺，5％(质量百分含量)PEG6000，0.3U/μl GoldTaqDNA聚合酶和水组成。
2、8μl直接扩增试剂1a在1.2mm FTA血卡直接扩增中的应用
将1.2mm的FTA血卡(公安部物证鉴定中心提供的血样，血卡的出售公司Whatman公司，产品目录号WB129237)加入8μl直接扩增试剂1a，引物采用DNAtyper15试剂盒的引物组合，进行STR荧光复合扩增，体系体积为8ul。
STR荧光复合扩增条件如下：75℃，15min孵育；95℃，11min变性及裂解；94℃，30s，59℃，2min，72℃，1min，28个循环；60℃，30min，25℃永久保温。
STR荧光复合扩增结果如图2a所示，与实施例1得到标准STR分型图谱比较，可以看出，直接扩增试剂1a所获得的STR分型图谱清晰完整，平衡性好，无非特异性人工产物出现，无条带丢失或明显的抑制现象出现。
采用相同的方法，用8ul商业试剂(ABI公司，目录号：4467831，产品推荐使用体系为25ul)进行对照试验，结果如图2b所示，可以看出，过大FTA血卡孔径已对试剂系统产生了强烈的抑制，大片段丢失现象严重，表现为常见的PCR抑制现象。
采用相同的方法，用25μl直接扩增试剂1a对1.2mm的FTA血卡进行STR荧光复合扩增，结果与8μl体系无显著差异。
以上实验说明，在低至8ul的试剂体系中，本发明的直接扩增试剂1a仍能够针对1.2mmFTA血卡进行直接扩增，可以获得完整的、高质量STR分型图谱，且节约检验成本。
方法二：
1、直接扩增试剂1a的制备：与方法一基本相同，不同的是0.12％(体积百分含量)辛基苯基-聚乙烯二醇，0.12％(体积百分含量)N-辛酰基-N-甲基葡糖胺，4.5％(质量百分含量)PEG6000。
2、8μl直接扩增试剂1a在1.2mm FTA血卡直接扩增中的应用：方法与方法一相同，结果与方法一无显著区别。
方法三：
1、直接扩增试剂1a的制备：与方法一基本相同，不同的是0.3％(体积百分含量)辛基苯基-聚乙烯二醇，0.3％(体积百分含量)N-辛酰基-N-甲基葡糖胺，5.5％(质量百分含量)PEG6000。
2、8μl直接扩增试剂1a在1.2mm FTA血卡直接扩增中的应用：方法与方法一相同，结果与方法一无显著区别。
二、1.2mm FTA血卡在10μl试剂体系中的直接扩增(用直接扩增试剂1b)
方法一：
1、直接扩增试剂1b的制备
直接扩增试剂1b由pH值为8.3(室温条件下)20mmol Tris-HCl，1.6mM MgCl2，200uM each dNTP，50mM KCl，25mM NH4Cl，1200ug/ml BSA，0.9％(体积百分含量)Tween20，5％(质量百分含量)PEG6000，0.4U/μl GoldTaq DNA聚合酶和水组成。
2、10μl直接扩增试剂1b在1.2mm FTA血卡直接扩增中的应用
将1.2mm的FTA血卡加入10ul直接扩增试剂1b，引物采用DNAtyper15试剂盒的引物组合，进行STR荧光复合扩增，体系体积为10ul。
STR荧光复合扩增条件如下：75℃，15min孵育；95℃，11min变性及裂解；94℃，30s，59℃，2min，72℃，1min，28个循环；60℃，30min，25℃永久保温。
STR荧光复合扩增结果如图3a所示，与实施例1得到标准STR分型图谱比较，可以看出，直接扩增试剂1b所获得的STR分型图谱清晰完整，平衡性好，无非特异性人工产物出现，无条带丢失或明显的抑制现象出现。
采用相同的方法，用10ul商业试剂(ABI公司，目录号：4467831，产品推荐使用体系为25ul)进行对照试验，结果如图3b所示，可以看出，过大FTA血卡孔径已对试剂系统形成了强烈的抑制，大片段丢失现象严重，表现为常见的PCR抑制现象。
采用相同的方法，用25μl直接扩增试剂1b对1.2mm的FTA血卡进行STR荧光复合扩增，结果与10μl体系无显著差异。
以上实验说明，在10ul的试剂体系中，本发明的试剂直接扩增试剂1b仍能够针对1.2mmFTA血卡进行直接扩增，可以获得完整的、高质量STR分型图谱，且节约检验成本。
方法二：
1、直接扩增试剂1b的制备：与方法一基本相同，不同的是0.8％(体积百分含量)Tween20，4.5％(质量百分含量)PEG6000。
2、10μl直接扩增试剂1b在1.2mm FTA血卡直接扩增中的应用：方法与方法一相同，结果与方法一无显著区别。
方法三：
1、直接扩增试剂1b的制备：与方法一基本相同，不同的是1％(体积百分含量)Tween20，5.5％(质量百分含量)PEG6000。
2、10μl直接扩增试剂1b在1.2mm FTA血卡直接扩增中的应用：方法与方法一相同，结果与方法一无显著区别。
三、1.2mm FTA口腔卡在10μl试剂体系中的直接扩增(用直接扩增试剂2)
FTA口腔卡也是一类常用样本载体，本部分实验主要为了进一步试剂的适应性及抗抑制能力。
方法一：
1、直接扩增试剂2的制备
直接扩增试剂2由pH值为8.3(室温条件下)20mmol Tris-HCl缓冲液、1.6mMMgCl2、200uM each dNTP、50mM KCl、25mM NH4Cl、980ug/ml BSA、0.9％(体积百分含量)Tween20、0.12％(体积百分含量)辛基苯基-聚乙烯二醇、0.4U/μl GoldTaq DNA聚合酶和水组成。
2、10μl直接扩增试剂2在1.2mm FTA口腔卡直接扩增中的应用
将1.2mm的FTA口腔卡(由公安部物证鉴定中心提供样本，口腔卡购自Whatman公司，产品目录号WB129236)加入在10μl直接扩增试剂2，引物采用DNAtyper15试剂盒的引物组合，进行STR荧光复合扩增，体系体积为10ul。
STR荧光复合扩增条件如下：75℃，20min孵育；95℃，11min变性及裂解；94℃，30s，59℃，2min，72℃，1min，28个循环；60℃，30min，25℃永久保温。
STR荧光复合扩增结果如图4a所示，与实施例1得到标准STR分型图谱比较，可以看出，直接扩增试剂2所获得的STR分型图谱清晰完整，平衡性好，无非特异性人工产物出现，无条带丢失或明显的抑制现象出现。
采用相同的方法，用10ul商业试剂(ABI公司，目录号：4467831，产品推荐使用体系为25ul)进行对照试验，结果如图4b所示，可以看出，对于口腔卡，10ul本发明的试剂所获得的结果与10ul商业化试剂所获得的结果一致，图谱清晰完整，达到法医鉴定的使用要求。
采用相同的方法，用25μl直接扩增试剂2对1.2mm的FTA口腔卡进行STR荧光复合扩增，结果与10μl体系无显著差异。
方法二：
1、直接扩增试剂2的制备：与方法一基本相同，不同的是0.8％(体积百分含量)Tween20、0.1％(体积百分含量)辛基苯基-聚乙烯二醇。
2、10μl直接扩增试剂2在1.2mm FTA口腔卡直接扩增中的应用：方法与方法一相同，结果与方法一无显著区别。
方法三：
1、直接扩增试剂2的制备：与方法一基本相同，不同的是1％(体积百分含量)Tween20、0.2％(体积百分含量)辛基苯基-聚乙烯二醇。
2、10μl直接扩增试剂2在1.2mm FTA口腔卡直接扩增中的应用：方法与方法一相同，结果与方法一无显著区别。
Claims (10)
1.一种直接扩增试剂，为如下1)或2)：
1)所示的直接扩增试剂包括非离子型表面活性剂和醇类化合物；
2)所示的直接扩增试剂包括非离子型表面活性剂；
所述非离子型表面活性剂为Tween 20、Tween60、Tween80、Tween65、Tween85、TritonX-100、乙基苯基聚乙二醇、辛基苯基-聚乙烯二醇、聚氧乙烯10油醚和N-辛酰基-N-甲基葡糖胺中的至少一种；
所述醇类化合物为PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG6000、PEG8000、乙二醇、丙三醇、丙二醇和己二醇中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的直接扩增试剂，其特征在于：
1)所示的直接扩增试剂为如下1a)或1b)：
所述1a)中，所述非离子型表面活性剂为N-辛酰基-N-甲基葡糖胺和辛基苯基-聚乙烯二醇，所述醇类化合物为PEG6000；
所述1b)中，所述非离子型表面活性剂为Tween 20，所述醇类化合物为PEG6000；
所述2)中，所述非离子型表面活性剂为Tween 20和辛基苯基-聚乙烯二醇。
3.根据权利要求1或2所述的直接扩增试剂，其特征在于：
所述1a)中，所述N-辛酰基-N-甲基葡糖胺、所述辛基苯基-聚乙烯二醇和所述PEG6000的配比为(0.12-0.3)ml∶(0.12-0.3)ml∶5g；所述N-辛酰基-N-甲基葡糖胺、所述辛基苯基-聚乙烯二醇和所述PEG6000的配比进一步具体为0.2ml∶0.2ml∶5g；
所述1b)中，所述Tween 20和所述PEG6000的配比为(0.8-1)ml∶5g；所述Tween20和所述PEG6000的配比进一步具体为0.9ml∶5g；
所述2)中，所述Tween 20和所述辛基苯基-聚乙烯二醇的体积比为(0.8-1)∶0.12；所述Tween 20和所述辛基苯基-聚乙烯二醇的体积比进一步具体为0.9∶0.12。
4.根据权利要求1-3中任一所述的直接扩增试剂，其特征在于：
所述1a)、1b)或2)中均还包括pH为8.3浓度为20mmol/L的Tris-HCl缓冲液、MgCl2、dNTPs、KCl、NH4Cl、BSA、DNA聚合酶和水；
所述1a)由所述pH为8.3浓度为20mmol/L Tris-HCl缓冲液、所述MgCl2、所述dNTPs、所述KCl、所述NH4Cl、所述BSA、所述N-辛酰基-N-甲基葡糖胺、所述辛基苯基-聚乙烯二醇、所述PEG6000、DNA聚合酶和所述水组成；
所述1b)由所述pH为8.3浓度为20mmol/L Tris-HCl缓冲液、所述MgCl2、所述dNTPs、所述KCl、所述NH4Cl、所述BSA、所述Tween 20、所述PEG6000、所述DNA聚合酶和所述水组成；
所述2)由所述pH为8.3浓度为20mmol/L Tris-HCl缓冲液、所述MgCl2、所述dNTPs、所述KCl、所述NH4Cl、所述BSA、所述Tween 20、所述辛基苯基-聚乙烯二醇、所述NA聚合酶和所述水组成。
5.根据权利要求4所述的直接扩增试剂，其特征在于：
所述1a)中，所述N-辛酰基-N-甲基葡糖胺在所述1a)中的浓度为0.12％-0.3％(体积百分含量)；所述N-辛酰基-N-甲基葡糖胺在所述1a)中的浓度进一步具体为0.2％(体积百分含量)；
所述辛基苯基-聚乙烯二醇在所述1a)中的浓度为0.12％-0.3％(体积百分含量)；所述辛基苯基-聚乙烯二醇在所述1a)中的浓度进一步具体为0.2％(体积百分含量)；
所述PEG6000在所述1a)中的浓度为4.5％-5.5％(质量百分含量)；所述PEG6000在所述1a)中的浓度进一步具体为5％(质量百分含量)；
所述1b)中，所述Tween 20在所述1b)中的浓度为0.8％-1％(体积百分含量)，所述Tween 20在所述1b)中的浓度进一步具体为0.9％(体积百分含量)；
所述PEG6000在所述1b)中的浓度为4.5％-5.5％(质量百分含量)；所述PEG6000在所述1b)中的浓度进一步具体为5％(质量百分含量)；
所述2)中，所述Tween 20在所述2)中的浓度为0.8％-1％(体积百分含量)；所述Tween 20在所述2)中的浓度具体为0.9％(体积百分含量)；
所述辛基苯基-聚乙烯二醇在所述2)中的浓度为0.1％-0.2％(体积百分含量)；所述辛基苯基-聚乙烯二醇在所述2)中的浓度进一步具体为0.12％(体积百分含量)。
6.根据权利要求4或5所述的直接扩增试剂，其特征在于：
在所述1a)、1b)和2)中，所述MgCl2在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度均为1.6mmol/L；每一种所述dNTP在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度均为200uM；所述KCl在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度均为50mmol/L；所述NH4Cl在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度均为25mmol/L；所述BSA在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度为700ug/ml-1200ug/ml；所述BSA在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度具体进一步为980ug/ml或1200ug/ml；所述DNA聚合酶在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度为0.1U/ul-0.4U/ul，所述DNA聚合酶在其对应的所述直接扩增试剂中的浓度进一步具体为0.3U/ul或0.4U/ul。
7.一种直接扩增试剂盒，包括权利要求1-6中任一所述的直接扩增试剂。
8.权利要求1-6中任一所述的直接扩增试剂或权利要求7所述的试剂盒在制备用于待测样本直接扩增的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述待测样本为孔径为1.2mm的FTA血卡、孔径为1.2mm的FTA口腔卡或孔径为1.2mm普通滤纸血卡；
所述直接扩增的扩增体系体积为8u1-10ul，所述直接扩增的扩增体系体积进一步具体为8ul或10ul；
所述直接扩增试剂为STR荧光复合扩增。
10.一种用于待测样本直接扩增的方法，包括如下步骤：用权利要求1-6中任一所述的直接扩增试剂或权利要求7所述的试剂盒与引物对待测样本进行直接扩增，得到直接扩增产物；
所述待测样本具体为孔径为1.2mm的FTA血卡、孔径为1.2mm的FTA口腔卡或孔径为1.2mm普通滤纸血卡；
所述直接扩增的扩增体系体积具体为8ul-10ul，所述直接扩增的扩增体系体积进一步具体为8ul或10ul；
所述直接扩增具体为STR荧光复合扩增。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant |