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CN1032367A - 含有指导异源多肽分泌的克鲁维酵母α-因子前导顺序的DAN组建物 - Google Patents

含有指导异源多肽分泌的克鲁维酵母α-因子前导顺序的DAN组建物 Download PDF

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Abstract

用于在酵母中分泌表达异源多肽的DNA组建 物，包括通过酵母加工信号将克鲁维酵母α-因子前 导序列连接到异源多肽上去。组建物用乳酸克鲁维 酵母α-因子前导和加工信号序列，有或无间隔，将其 与前凝乳酶连接作为一个实例。

Description

本发明属重组DNA领域，更确切地说是有关用克鲁维酵母（Kluyveromyces）α-因子前导顺序指导在酵母中分泌异源多肽。
美国专利No.4，562，082叙述了酿酒酵母（Saccharomyces    cerevisiae）的α-因子前体基因，旨在说明用酿酒酵母前导顺序的DNA组建物和异源基因来分泌表达该异源基因。
欧洲专利0116201叙述了在酵母中用酿酒酵母的α-因子前导顺序得到了分泌表达的人表皮生长因子。1983年8月12日提交的美国共同未决专利申请No    522，909叙述了用无间隔（“Spacerless”）酿酒酵母α-因子前导顺序得到异源基因更有效的分泌表达。
“科学”1985年229∶1219-1244页报道了用酿酒酵母α-因子顺序指导前凝乳酶的分泌，报道了产生的大部分前凝乳酶是在细胞内以不溶形式存在而不是分泌到胞外的。虽然转化酶前导物可有效地使能激活的前凝乳酶分泌出去，但必须筛选出能分泌足够量前凝乳酶的突变株。
以前从未有人叙述过用乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces.lactis）细胞或其他种克鲁维酵母的菌株生产偶配外激素（α-因子和a-/因子）。主要是由于不能在k.lactis中鉴定这些肽，在一定程度上是由于在乳酸克鲁维酵母中偶配外激素是可诱导的，而在酿酒酵母中偶配外激素是不需诱导即可产生的。
由于越来越需要得到上述指到在酵母中分谜表达外源基因的前导顺序，还需要更多能方便而有效地生产特定多肽的其他顺序。据次，申请人力求证实一种乳酿酒酵母α-因子是否存在。如果存在，它是否可用以指导酵母中异源多肽，如前凝乳酶的分泌。
本发明提供指导在酵母中分泌外源多肽的基于克鲁维酵母α-因子前导顺序的DNA组建物。含有这些组建物的克鲁维酵母转化体有效地分泌诸如前凝乳酶等多肽。
因此，本发明的一个方面是为一种蛋白编码的DNA组建物，该蛋白的氨基酸序列包括指导分泌的克鲁维酵母α-因子前导顺序及通过酵母加工信号与其连接的一种异源多肽，该加工信号可使上述蛋白加工成所述异源多肽。
本发明的另一方面是一种表达载体，它包括在酵母宿主中有功能的复制或整合系统，为一种蛋白编码的DNA组建物，该蛋白的氨基酸序列包括指导分泌的克鲁维酵母α-因子前导顺序及通过酵母加工信号与其连接的一种异源多肽，该加工信号可使上述蛋白加工成所述异源多肽。
本发明另一方面是在酵母中生产异源多肽的方法，包括在培养基中培养含上述表达载体的酵母。该培养基及培养条件下该酵母能以前肽形式表达该异源多肽并分泌出来。而该前肽至少可部分加工成所述多肽。
图1表示设计用于鉴定乳酸克鲁维酵母α-因子DNA的寡核苷酸探针的方案。
图2是乳酸克鲁维酵母α-因子编码DNA片段的完整序列。
图3比较乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母α-因子蛋白序列。
图4图解乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母α-因子。
图5比较乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母α-因子编码DNA序列。
图6图解三种在实施例中详述的质粒的组建过程。
图7图示了如何将乳酸克鲁维酵母α-因子前导DNA序列连接到前凝乳酶DNA序列。
图8表示PAB309    Bam    HⅠ/SalⅠ序列插入PUC18中。
图9图示质粒PGB901。
图10图示质粒PGBTe    G418。
图11表示用于使乳酸克鲁维酵母α-因子前导DNA突变的引物序列。
图12表示在乳酸克鲁维酵母中α-因子前导区/前凝乳酶DNA融合区附近的DNA序列。
根据本发明，酵母可用于生产成熟的外源多肽，而且这些多肽可直接从培养基中收集。所用DNA组建物是将克鲁维酵母α-因子前导区和加工信号序列连接到所需异源多肽编码序列得到的。所需异源多肽可以是单个异源多肽或被加工信号分开的多个异源多肽。所得组建物为一种前多肽原编码，它含该前多肽原分泌信号和加工信号，可在细胞内和细胞外将其加工成成熟多肽。
本发明组建物包括如下式表示的为一种前多肽编码的DNA序列：
（XY-（ZW）n-所需基因）Y
其中X是赖氨酸或精氨酸的编码;
Y是精氨酸的编码;
W是丙氨酸或脯氨酸的编码;
Z是某一氨基酸的编码，当W是脯氨酸码时，Z最好是丝氨酸，赖氨酸或天冬酰胺编码;而当W是丙氨酸码时，Z最好是谷氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸或丝氨酸编码。
Y为1-10，通常小于4，是指该序列为单体或多体。
所需基因是指非野生型克鲁维酵母α-因子基因，它是将该因子基因与非酵母来源的前导顺序连接的人工基因，通常该前导顺序来自植物或人基因。
n是0-8，通常为3-7，最好为0。
在上式中用X，Y，Z和W编码的氨基酸序列定义了α-因子加工信号，其中X和Y编码的氨基酸是二肽断裂点，Z和W编码区为一个寡肽间隔。从n可以是0这一事实说明有无间隔是任选的。如果有间隔，组建物将典型地包括可除去由间隔决定的N端残基的附加序列，从而得到所需基因编码的成熟蛋白。
大多数情况下，本发明组建物至少有下列分子式：
L-（XY-（ZW）n-所需基因）Y
它编码前多肽原，其中L是分泌前多肽原的克鲁维酵母前导序列，其他符号如上定义。可用有分泌功能的任何克鲁维酵母前导序列，它一般为20-120氨基酸，通常是30-100个氨基酸，具有疏水区，N端有一个蛋氨酸。
L可以是克鲁维酵母属任何种的全长α-因子前导序列，如乳酸克鲁维酵母和脆弱克鲁维酵母（K.fragilis），或是它们的一段功能片段（能指导分泌的），突变，保导或不保导的，即一般不多于5个，通常不多于3个不同的氨基酸，及它们的类似物。通过制备含不同长度野生型序列，再看其有无分泌机能来筛选，鉴定出各种功能片段。图2表示为野生型乳酸克鲁维酵母α-因子编码序列，包括为1-83氨基酸编码的DNA前导顺序。图2的DNA序列不是必需的，任何为有功能克鲁维酵母前导寡肽编码的序列都是可用的。不同序列多少都有效地被转译。理想的是至少有大部酵母优选编码可包括在顺序内。
下列式子通常用作描述作为表达暗盒的DNA序列：
Tr-L-（XY-（ZW）n-所需基因）d）Y
其中：Tr为转录调节信号，特别是启动子及其他诸如操作子，激活子，帽信号等其他调节信号，或涉及转录和转译控制的其他序列;
d是0或1，当Y大于1时d为1;
Tr序列一般至少为100bp-2000bp。特别有用的是所用Tr序列与前导序列L连在一起，从而可用一个包含与宿主内源信号序列相连的转录和转译信号的序列的DNA片段。这样彼此可利用转录和转译信号从而加强表达产物的产率。
其他符号如前定义。
所需基因的3′端可相当容易以一个组建物形式操作，该组建物可使所需基因插入到组建物的单一限制酶切点。这样的组建物可为所需基因从起始读码方向的插入提供限制点，这样的组建物用下式表示：
（Tr）a-L-XY-（ZW）n-（SC）b-Te
其中：上面原有符号与前定义相同。
a是0或1，即该组建物可以有或无转录和转译信号。
SC表示终止信号;
Te是转录终止序列，还可包括其他如多聚腺苷化等信号;
b是从0-4的整数，通常为0-3，即所需基因也可有其自己终止码。
可设计所需基因上游序列以提供方便的限制酶切点从而使得所需特定基因可被其他基因取代。需要时可用连锁子和连接物完成这种取代。
该组建物为插入载体提供一个方便的序列，它们提供所需的复制系统。如前述，有时需要用带有不同启动子取代与信号序列连接的野生型启动子。在酵母中，涉及糖酵解途径的一些酶的启动子可使其高效转录。这些启动子是与诸如磷酸葡萄糖异构酶，磷酸果糖激酶，磷酸丙糖异构酶，葡萄糖磷酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶和乙醇脱氢酶等有关的。这些启动子可插入信号顺序的上游。前导序列的5′-端侧区可保留或被选择的启动子3′端序列取代。可制备载体。该载体的启动子具有从其下游插入上述组建物的限制酶切点。
最终的表达载体包括表达暗盒和在酵母宿主中有功能并能稳定保持的复制和整合系统。该载体可随意包含复制系统，该系统使其能在原核生物中克隆。此外，要包括1个或多个选样标记，它们能在宿主中保持。进而，载体可有高或低拷贝数。一般为1-200。高拷贝数载体一般至少为10个，优选的为至少20个，但不超过150个，通常不超过100个。根据所需基因及载体在宿主中作用选择高或低拷贝载体。有时载体表达的产物可能影响宿主的活力，这时就需低拷贝载体。
可采用不同宿主，特别是具所需性质的突变性。根据组建体表达产物的产率及加工酶在该产率水平下是否足够等因素考虑。可通过载体使突变体增强加工酶生产能力（如：二肽基-氨基肽酶A和/或赖-精肽链内切酶）。通常该酶产率低于所需表达产物的产率。
此外，细胞内加工是不理想的，最好用一种突变体，其产品不经加工就已分泌出胞外，然后在体外加工成成熟产品。
最好用能控制调节表达的突变体。如，具有本发明的组建物的宿主，表达一种融合蛋白，但可能是由于融合蛋白的毒性使转化体生长缓慢。这时可在生长期间抑制其表达，使其高密度生长，再改变条件让其表达。
如上所述，所需基因可有随机排列的多个序列，或相同或有差异，并具有干予加工的信号。这种方式，产品可以整体或部分加工，其结果既可自身得到不同序列又可随后随机的加工。很多情况下是需要不同序列的产品，每种序列都是特定蛋白产品的亚单位。
所需基因可以编码任何类型的所需多肽。这些多肽小则只有8个氨基酸（或100，000道尔顿）或稍高。通常单链均低于300，000道尔顿，大部分低于150，000道尔顿。最令人感兴趣的是5，000-150，000道尔顿的多肽，特别是5000-100，000的。范围的多肽包括激素，生长因子，生长调节素，表皮生长因子;内分泌物如：促单体激素，甲状腺刺激激素，催产素，胰岛素，加压素，肾素，降钙素，促滤泡素，促乳素等;促红细胞生成素如：红细胞生成素，集落刺激因子等;淋巴因子;珠蛋白;球蛋白如：免疫球蛋白;清蛋白如：人血清白蛋白;干扰素如：α，β和δ;阻遏物;酶诸如：凝乳酶或其酶原，α和β-淀粉酶，葡萄糖淀粉酶，支链淀粉酶，木聚糖酶，葡糖异构酶，纤维素酶，脂酶，磷脂酶等;内啡呔如：β-内啡呔，脑啡呔，dynorphin等。
先制备含本发明组建物的载体，然后再将其引入酵母宿主。酵母的属和种不严格要求。作为酵母宿主的例子是克鲁维酵母和酿酒酵母。引入的方式是常规的，有一系列方法可选用。如Hiunen等人（见peoc.Acad.Natl.Sci.USA（1978）75∶1919-1933）或Das等人，J.Bacteriol（1983）58∶1165-1167或Stinchcomb等人.，EPA0045574。在合适培养基中培养转化体，使其保持充足的选择压力。当表达是可诱嫉模攘钇涓呙芏壬ぃ儆盏急泶铩Ｕ馐保返暮诵牟糠直Ａ粼谥芪О什糠郑赏ü钊纾航陀n酶（Zymolase）或溶菌酶处理酵母细胞使其释放产品。
用常规方法收获产品，包括用层析，电泳，透析，溶剂萃取等方法分离纯化。
为得到编码克鲁维酵母种的α-因子基因，下面举出实例。制备具有图1结构的放射标记寡核苷酸，用其探测其他菌株基因组DNA的酶解物。还可将酿酒酵母α-因子基因的切口转译片段用作探针。一种有用的技术是将基因组DNA核酸内切酶产物插入到质粒中，用这些质粒转化大肠杆菌或其他菌株，从而得到质粒库。从菌落得到的DNA用常规方法在硝酸纤维素滤低上与探针杂交。
将与探针杂交鉴定的DNA片段用不同限制酶解，再将用Southern吸印法或用同样杂交探针的相似分析方法分析所得片段，以选择适合作DNA序列分析的大小适度的片段。纯化所选片段，用合适载体克隆该片段，以得到足够量作DNA序列分析的片段。
用上述技术可从其他菌株得到克鲁维酵母α-因子基因。
根据本发明的方法可生产很多种多肽，并分泌到细胞外，从而提高了收获率，简化了纯化手续，以最小的降解量生产所需产品，并简化工艺设备和工程要求。此外，用酵母可避免很多内毒素的产生，而先有技术中使用原核生物则不可避免内毒素，此外，使用酵母也可沿用前人发酵生产的很多经验如：工业分离和提纯工艺等。
下列例证进一步阐述了本发明。这些例子都不是对本发明范围的限制。
例子
乳酸克鲁维酵母α-因子的鉴定和分离：
培养物上清液的生物学检测试验按Julius等所述（Cell.1983，32∶829）执行，使用酿酒酵母Mat    a    sst    2-3菌株RC687作为实验株。乳酸克鲁维酵母菌株CBS141（α）生长于含0.5%葡萄糖，无硫酸铵氮源的0.17%酵母浸膏，0.002%硫酸铵的培养基中。离心弃除细胞后，向培养物上清液中加入醋酸，使终浓度为0.1M，然后将该上清液过Bio-Rex    70（Biorad公司出品）柱。用0.1M醋酸液洗，再以80%Et    OH/10mMHCl液洗脱α-因子。洗脱物蒸发干燥，然后再复溶于0.1%TFA/20%乙腈液中并加于反相HPLC保护柱之中。以含0.1%TFA和20%，40%，60%，和80%乙腈的溶液分段洗脱。其中具有α-因子活性的60%区段收集液再加入于分析性C-18HPLC柱之中，以含0.1%TFA和乙腈20%-80%的梯度液进行洗脱。分区段收集并检测α-因子活性。含α-因子区段液被干燥，使用470A型实用生物系统气相蛋白质定序器及其相联的120A型PTH分析仪对其进行氨基酸序列分析。
质粒库的杂交筛选：
用r[32P]-ATP和T4聚核苷酸激酶标记寡核苷酸池。这些寡核苷酸探针被用于探查42℃下在下列杂交溶液中的细菌菌落：
4XSSC，50mMKH2PO4PH7，1%肌酸盐，10%葡聚糖硫酸盐，200μg/ml超声变性的鲑精子DNA。滤液在42℃下以2XSSC和0.1%SDS冲洗。
在含有来自于K.lactis菌株SD11的基因组DNA的限制酶Sau3AⅠ降解片段的插入序列的克隆载体PJS109（其他标准化的克隆载体如PUC18，和PBR322也可代替PJS109使用）中建质粒库。将分级得到的分子大小为＞5000bp的片段，用上述探针进行筛选，筛选通过大肠杆菌菌株HB101的平板转化法进行，在含100μg/ml氨苄青霉素的80mm    L-琼脂平板中密度为500-2000个菌落。DNA由菌落转移到硝基纤维素滤膜上，这些滤膜按上述方法杂交。原始平板上与杂交信号显示区相应的区域细菌被集中和再接种，然后经杂交法再检验以分离出带有含杂交序列的质粒的单个菌落。阳性菌落用由小培养纯化得到的DNA作Southern    blot分析来进一步检验。
将杂交后阳性菌落中纯化的质粒用各种限制酶降解，所得片段用同样的杂交探针经Southern吸印分析法做序列分析以便鉴定出大小适于DNA顺序分析的限制性片段。所得片段经琼脂糖凝胶电泳纯化，再克隆于适宜的MP18和MP19载体之中，再做DNA顺序分析。
培养物上清液的凝乳酶检验：
离心去除培养物中的细胞，向得到的上清液中加1M H2SO4使酸化到PH2，然后室温下温育2小时。再向溶液中加入2M Tris碱中和至PH6。取适度稀释液50μl加入含有12%脱脂干燥牛奶的10mM CaCl2混悬液200μl之中，37℃下温育直到凝块形成。1单位凝乳酶活性规定为在上述条件下10分钟内产生凝块所需要的活性凝乳酶量。
结果
乳酸克鲁维酵母α-因子最初的10个氨基酸表现出与酿酒酵母6个残基是明显同质的。这一顺序表示如下：
Trp-Ser-Trp-Ile-Thr-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln
用该蛋白顺序设计一套推断与图1所示结构基因互补的寡核苷酸链。包含了可能是α-因子肽链全部密码的寡核苷酸链分别按96和48个不同分子的两个文库合成。
这两个基因库用r[32P]-ATP和T4聚核苷酸激酶放射标记，并分别用Southern吸印法来探查乳酸克鲁维酵母DNA限制酶片段。发现基因库2对各种不同的酶解片段中一个单一片段表现强烈杂交倾向。从而选择基因库2作为筛选乳酸克鲁维酵母基因DNA的质粒文库。
使用这些探针筛选质粒库以分离大量杂交克隆。这些克隆其中之一，αfk18b的DNA序列分析表明它编码与酿酒酵母α-因子肽链前体极为相近的α-因子关联肽链。发现杂交片段位于大约1000bp的PstI-EcoRI降解段上。该片段的序列显示于图2。
该片段推断出的α-因子前体的比较示于图3和4。可以看出，它们具有相当的序列同源性的同一长度（氨基酸1-83图3）的前导序列。然而，乳酸克鲁维酵母前体仅包括两个位点来补加N端连接的碳水化合物链（图4）。此外，乳酸克鲁维酵母重复区的距离比酿酒酵母重复区更长，并表现出与酿酒酵母的X-Ala/pro图形而不是Glu/Asp-Ala顺序更加不一样的顺序。DNA序列的相似物（图5）也表现出全部编码区域的强烈的同源性。
图6所示的一系列质粒被组建，以便使乳酸克鲁维酵母α-因子前导物与强启动子的转录控制下表达的前凝乳酶融合。首先，来自dfk    18b的一个673bp    SSPⅠ-EcoRⅠ片段经过Klenow酶作用来充满EcoRⅠ伸出部分，再加上BgIⅡ连接体于平钝末端。将此片段插入于连接酿酒酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAp）的启动子和终止区的BglⅡ位点之中。这一暗盒作为PUC18中的BamHⅠ片段被克隆，造成PAB307。
编码α-前导物和牛前凝乳酶的序列完成融合。先将PAB307以NcoⅠ酶解，用mung豆核酸酶使粘性末端成平钝端。该产物再以SalⅠ处理并连接为含有编码前凝乳酶序列和酿酒酵母GAP转录终止区的一个2000bp    EcoRV-SalⅠ片段（序列显示于图7和8）。该片段衍生于质粒PJS111，在该质粒中，XbaⅠ-BamHⅠ连接物已被加于包括了融合在酿酒酵母GAP转录终止区的前凝乳酶cDNA的一个片段的5′末端。这一连接混液被用于转化大肠杆菌HB101株，带有质粒PAB309的转化体被分离。融合接合点周围序列示于图7，pAB309完整的BamHⅠ-SalⅠ插入段序列见图8。
为使乳酸克鲁维酵母菌株得以转化，包含了在已插入于乳酸克鲁维酵母LAC基因3′区域的酿酒酵母ADH1启动子转录控制下的大肠杆菌卡那霉素抗性基因的一个3560bp    HindⅢ片段被插入于PAB309之中得到质粒PAB312。对插入效果的筛选使用限制酶酶解物分析法，并检测正确的方向。
该3560bp    HindⅢ片段来源于质粒PGB901，其图解示于图9。质粒PGB901的组建是通过连接（1）含有乳糖酶启动子的3.6kbXbaⅠ-HaeⅡ片段于由PUCla56（下述）分离的乳糖酶ATG起始密码中大约第-90位，（2）具有下列核苷酸序列的HaeⅡ-SalⅠ片段：
5′TTAAC    ACTTGAAATT    TAGGAAAGAGCA    GAATTTGG    CAAAAAAAAT    AAAAAAAAAATA    AACACG    3′
3′CGCGAATTG    TGAACTTTAA    ATCCTTTCTC    GTCTTAAACC    GTTTTTTTTA    TTTTTTTTTT    ATTTGTGCAG    CT    5′
（3）编码前凝乳酶的5.1kb    SalⅠ-XbaⅠ片段和来自于PGB900（下述）提供抗生素抗性基因G418，以及（4）用XbaⅠ裂解的PUC19。
在组建该质粒时，来自HaeⅡ位点的CG序列粗心地被去除了，以至在这一位置上建立了HindⅢ位点。
质粒PUCla    56按下述组建。由乳酸克鲁维酵母CBS2360株分离染色体DNA，用XhoⅠ裂解，按蔗糖梯度上的大小来分离。含乳糖酶基因的部分在置DNA于硝基纤维素滤膜上之后用LAC4探针来检测。含LAC基因的DNA被克隆于质粒pPA153-215的XhoⅠ位点（见P.M.Andredi，Mol.Gen.Genet.（1985）199∶372-380）制备出质粒pPA31。含乳糖酶基因的pPA31的XbaⅠ片段被亚克隆于产质粒PUCLa56的PUC19的XbaⅠ位点（见Yanisch-peron等，Gene（1985）33∶103-119）。
质粒PGB900的组建过程为连接（1）来自于含G418抗药基因的质粒PGBTe    G418（见图10及后述）的一个3.6kb    HindⅢ-XbaⅠ片段和（2）来自含前凝乳酶基因于被SalⅠ和XbaⅠ裂解后的PUC19之中的质粒PGB123的一个SalⅠ-HindⅢ片段。质粒PGB123在欧洲专利申请EPA0096430中介绍。
质粒PGBTe    G418（图10）包含有如Andreoli所述（见Mol.Gen.Genet.1985，199∶372-380）的质粒p    PA215和具有3.7kb    BamHⅠ乳酸克鲁维酵母乳糖酶终止片段的一个5.6kb片段（见Breunig等Nucleic    Acids    Res.（1984）12∶2327-2341）以及在酵母乙醇脱氢酶Ⅰ（ADHI）启动子指导下（同样见于Bennetzen和Hall，J.Biol.Chem.（1982）257∶3018-3025）的授于抗药G418的Tn5基因（见Reiss等，EMBO    J.（1984）3∶3317-3322）。质粒PGBTe    G418已于1987年2月26日贮存于编号CBS184.87下。
质粒PAB312用EcoRV降解（目标是对乳酸克鲁维酵母基因LAC区域的结合）然后用以转化乳酸克鲁维酵母2UV21株（a    ura    3    trpllac4[kil°]）对G418有抗性，它使用了Licl技术（见Das等，J.Bacteriol.（1984）158∶1165-1167）。
大量的转化体，与未转化的对照菌株一样，在由1%酵母浸膏，2%胨，2%葡萄糖，0.17%酵母氮源，50μg/ml色氨酸和50%μg/ml尿嘧啶组成的培基1ml中培养36小时。培养物上清液在经酸性活化后检验凝乳酶活性。发现所有的转化体均分泌100-200单位/毫升的活性凝乳酶。
经体外突变移除间隔密码
从PAB309中分离出一个1900bp的SacⅠ-HindⅢ片段，并克隆于MP19（详见yanisch-perron等，Gene（1985）33∶103）。分离单股噬菌体DNA并作为体外具有寡核苷酸引物的突变所需的模板使用，见图11。M13噬菌体MP19αk1.5和MP19/αkl2.2用引物＃1和引物＃2分别制备。
从这些噬菌体中制备双股RF    DNA，并从每个中分离出7700bp和SacⅠ-StuⅠ片段。这些片段连接于PAB312的一个7100bp    SacⅠ-StuⅠ片段上。所得质粒PAB313和PAB314由于其序列改变被分离，见图12。
质粒PAB313和PAB314被用于转化对G418有抗性的2UV21。转化体2UV21∶∶PAB312，2UV21∶∶PAB313，和2UV21∶∶PAB314被培养，培养物上清液按上述步骤检验凝乳酶活性。检验结果报告于表1，如下
表1
菌株    宿主    质粒    凝乳菌活性
（单位/毫升培养物）
2UV21    2UV21    -    ＜2
KRN303-1    2UV21    PAB312    256
KRN304-4    2UV21    PAB313    175
KRN305-2    2UV21    PAB314    206
使用三氯醋酸沉淀培养物上清液的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳判定发现每一转化体平均分泌单一前凝乳酶有关产品。经电泳转移率确定由PAB312转化体分泌的前凝乳酶有关蛋白表现出比PAB313和PAB314转化体所分泌者明显高的分子量。
用上述菌株的沉淀作凝乳酶活性分析，发现活性在上清液测定值的2%以下。因此，克鲁维酵母α-因子在指导乳酸克鲁维酵母分泌前凝乳酶方面有接近98%的效率。
由KRN303-1和KRN304-4分泌的主要产品用制备性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来纯化，并经气相氨基酸序列分析。该产品的N-端顺序如下：
KRN303-1
1    5    10
Glu-Ala-Asp-Ala-Ser-His-His-Met-Ala-Glu-
15
Ile-Thr-Arg-Ile-Pro
KRN304-4
1    5
Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile
上述结果表明由KRN303-1分泌的前凝乳酶的相关产品未经历氨基末端间隔顺序的处理过程，而KRN304-4分泌的产品有真正成熟的前凝乳酶氨基末端。
下列微生物已于1987年6月30日贮存于美国典型样品贮藏中心（ATCC）∶HB101    PAB307，ATCC登记号67454;HB101    PAB312，ATCC登记号67455。
虽然为便于理解，我们已通过说明和例证的方式对本发明予以详细介绍，但显然在附加权利要求的范围内可以实行某些改变或修正。

Claims (19)

1、为一种蛋白编码的DNA组建物，该蛋白的氨基酸序列包括连接到一种异源多肽序列的指导分泌的克鲁维酵母x-因子前导序列。
2、根据权利要求1的DNA组建物，其中的克鲁维酵母α-因子前导顺序是经过酵母加工信号序列与一种异源多肽序列连接的，该加工信号可使所述蛋白加工成所述异源多肽。
3、根据权利要求1的DNA组建物，它在5′端还进一步包括一个酵母启动子。
4、根据权利要求1的DNA序列，其中的前导序列是野生型克鲁维酵母α-因子的全长前导序列。
5、根据权利要求4的DNA序列，其中的前导序列是图2所述前导序列。
6、根据权利要求1的DNA序列，其中的前导序列是野生型克鲁维酵母α-因子全长前导序列中的一个功能片段。
7、根据权利要求6的DNA序列，其中的全长前导序列是表2所示的前导序列。
8、根据权利要求1的DNA序列，其中克鲁维酵母α-因子前导序列是乳酸克鲁维酵母α-因子前导序列。
9、根据权利要求2的DNA序列，其中酵母的加工信号包括一个碱性二肽裂解点和一个间隔。
10、根据权利要求2的DNA序列，其中的酵母加工信号包括一个直接融合到异源多肽N端的碱性二肽裂解点和缺失一个间隔。
11、根据权利要求9或10的DNA序列，其中的碱性二肽裂解点是赖-精或精-精。
12、根据权利要求3的组建物，其中酵母启动子是α-因子启动子或GAP启动子，克鲁维酵母α-因子前导序列是乳酸克鲁维酵母α-因子前导序列，该序列通过酵母加工信号连到异源多肽序列，该加工信号包括一个赖-精裂解点和一个间隔。
13、根据权利要求12的DNA组建物，其中的外源多肽为前凝乳酶。
14、根据权利要求3的DNA组建物，其中的酵母启动子是α-因子启动子或GAP启动子，克鲁维酵母α-因子前导序列是乳酸克鲁维酵母α-因子前导序列，该序列是通过酵母加工信号连接到异源多肽序列，该信号包括一个直接融合到异源多肽上的赖-精裂解点，并缺失间隔。
15、根据权利要求14的DNA组建物，其中的异源多肽是前凝乳酶。
16、表达载体，包含一个复制或整合系统，从而使其在酵母中稳定保持，还包括权利要求1-15中任一项提及的DNA组建物。
17、在酵母中生产异源多肽的方法，包括：在培养基中培养含权利要求6表达载体的酵母。该培养条件下该异源多肽是以前多肽形式表达和分泌出来，该前多肽至少可部分地被加工成所需异源多肽。
18、在酵母中生产异源多肽的方法，其中的异源多肽是在酵母α-因子前导序列指导下分泌出来的，其中的酵母α-因子前导序列是克鲁维酵母α-因子前导序列。
19、根据权利要求18的方法，其中的克鲁维酵母α-因子前导序列是乳酸克鲁维酵母α-因子前导序列。
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