CN103235136B - 蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白质类药物的相关检测，具体涉及一种蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将选取的蛋白质药物的氨基酸序列被用来设计相应的多肽抗原；(2)多肽抗原通过联接一个半胱氨酸与蛋白质载体共价结合；(3)多肽抗原与蛋白质载体共价结合后通过动物产生多肽抗体；(4)将多肽抗体采用双抗夹心酶标记免疫吸附检测法测定蛋白质类药物的三维构像。本发明精确度能够达到分子水平，能对蛋白质三维构像能够进行快速系统的分析，为蛋白质药物的研发和生产提供重要的质量控制数据。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质类药物的相关检测，具体涉及一种蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列检测方法。
背景技术
蛋白质的三维构像与它的生物活性密切相关，对于蛋白质药物而言，它的三维构像在一定程度上决定了它在人体内的代谢速度和自身免疫性，而这是除去生物活性之外的重要的生物药物指标。由于蛋白质类药物三维构像的重要性，在生物制药的研发和生产过程中有多种技术被用来检测蛋白质类药物的三维构像。比较通用的技术包括：(1)分子筛层析(Molecular Seive or Gel Filtration)；(2)超速离心(Ultracentrifugation)；(3)荧光分析(Fluorescence)；(4)蛋白质CD光谱；(5)电泳分析(Electrophoresis)。但是以上所述的方法都有很大的局限性，主要表现在：(1)分析方法不够精确：所得到的数据只能反映蛋白质的总体差别，不能区分在不同蛋白质表面的差异。(2)分析方法不够快速：每一个样品需要几小时或者几十小时。(3)分析方法一次只能分析一个或几个样品，不能将多个样品同时并列分析。由于以上的限制，蛋白质三维构像的分析手段是药物研发中相对薄弱。鉴于蛋白质三维构像在药物研发和生产中的重要性，一种精确，快速，简便的分析技术将会为蛋白质药物的研发和生产提供重要的信息。
通过蛋白质的多肽片段制备抗体是一种成熟的技术，在生物化学研究领域，这种技术被用来进行抗原点测定(Epitope mapping)。一般情况下，5-8个氨基酸就可以形成一个抗原点，而6-8个氨基酸所组成的专一性顺序在人体蛋白质组(Proteome)中是具有专一性的。由于多肽在动物体内降解迅速，多肽本身不宜于用来直接生产抗体，而是先共价结合到一个稳定的蛋白质载体上面。通常情况下牛白蛋白(BSA)或血蓝蛋白(KLH)被广泛用来作载体蛋白。化学合成的多肽在与载体蛋白共价结合后，可以在动物体内有较长时间的存活期使动物产生相应的抗多肽的抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列检测方法，能够从分子水平系统定量检测蛋白质类药物三维构像及其变化，并且测定准确，精度高。
本发明所述的一种蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列检测方法，包括以下步骤：
(1)将选取的蛋白质药物的氨基酸序列被用来设计相应的多肽抗原，该多肽抗原的氨基酸数量为15～50个；
(2)多肽抗原通过联接一个半胱氨酸与蛋白质载体共价结合，结合的方式是N末端或C末端；
(3)多肽抗原与蛋白质载体共价结合后通过动物产生多肽抗体，其中，动物选自马、羊、牛、兔子、鸡或鼠中的一种；
(4)将多肽抗体采用双抗夹心酶标记免疫吸附检测法测定蛋白质类药物三维构像。
其中，步骤(1)中所设计的相邻的两个多肽抗原相邻有重叠的氨基酸序列，重叠数目为1个～10个，更优选为5个。用重叠设计的目的是保证生产出的序列抗体可以全面的对蛋白质药物的构像作出测定而不会有遗漏的区域。
步骤(2)中多肽抗原与蛋白质载体共价结合的化学反应选用的交联剂优选为二氯乙烷或甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯三元共聚物，最好为甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯三元共聚物；多肽抗原与蛋白质载体的当量比优选为10∶1～50∶1，更优选20∶1；蛋白质载体优选为血蓝蛋白或牛血清白蛋白，更优选血蓝蛋白。
步骤(3)中注射动物的抗原剂量优选为50微克/次/只～5毫克/次/只，更优选为1毫克/次/只。
步骤(3)中动物优选用新西兰白兔。
步骤(4)的具体步骤优选为：将双抗夹心酶标记免疫吸附检测法检测盒的平板分组用不同的多肽抗体包被，在经过牛血清白蛋白覆盖后，需要测定的蛋白质药物可以在不同浓度下与检测盒平板孔中的多肽抗体相混合，当蛋白质药物的表面有与孔中相应的多肽抗体所对应的抗原点，孔中的多肽抗体将与这部分蛋白质药物形成复合物，在下一步，一种抗人体免疫球蛋白的多克隆抗体将填加到检测盒的孔中，抗人体免疫球蛋白是经过生物素共价标记的，当孔中有多肽抗体与抗人体免疫球蛋白的复合体，抗人体免疫球蛋白将进一步与这个复合体形成更高一级的复合体，为多肽抗体-蛋白质药物-抗人体免疫球蛋白复合体，此复合体可以进一步与酶联亲和素形成复合体，而这个复合体的数量可以用过氧化酶的底物的转化反应出来，最后经分光光度计经光吸收测定蛋白质类药物三维构像。
其中，双抗夹心酶标记免疫吸附检测法检测盒优选采用24孔平板、96孔平板或384孔平板中的一种，更优选采用96孔平板。
双抗夹心酶标记免疫吸附检测法检测盒被多肽抗体包被的温度优选为4摄氏度或室温，更优选为4摄氏度。
本发明的优点在于：采用的多肽抗原设计方案优良，以此方案设计的多肽抗原可以有效地在动物体内产生高效价的专一性的抗体；多肽抗原与载体蛋白的共价结合方法，此方法可以使生产出的抗体更具有针对性，能够检测多种情况下的蛋白质构像变化。本发明精确度能够达到分子水平的快速，对蛋白质三维构像能够进行系统的分析，为蛋白质药物的研发和生产提供重要的质量控制数据。
附图说明
图1为多肽抗体效价的测定结果；
图2为多肽抗体专一性的测定结果；
图3为双抗夹心酶标记免疫吸附检测法灵敏度的测定结果；
图4为市场上9种不同单克隆抗体药物轻链部分的构像测定结果；
图5为同种抗体药物不同实验条件下的构像比较结果；
图6为市场上同种抗体药物不同生产批次间的构像分析结果(轻链)；
图7为市场上同种抗体药物不同生产批次间的构像分析结果(重链)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
以帕立珠(Synagis)生物药为例，提供多肽设计的具体信息，具体见下表。
表1：帕立珠多肽抗原设计的序列。
| 多肽名称 | 多肽序列 |
| Ab-1 | DIQ(nle)TQSPSTLSASVGDRVTITC |
| Ab-2 | CGGRVTITSKSQLSVGY(nle)HWYQQKPG |
| Ab-3 | CGGQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRF |
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| Ab-6 | CGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD |
| Ab-7 | CGGIFPPSDEQLKSGTASVVSLLNNFYP |
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设计出的多肽抗原通过一个半胱氨酸与血蓝蛋白载体共价结合，结合的方式是N末端，选用的交联剂为甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯三元共聚物，多肽抗原与蛋白质载体的当量比为20∶1。多肽抗原与蛋白质载体共价结合后通过动物产生多肽抗体，动物选用新西兰白兔，注射动物的抗原剂量为1毫克/次/只。
(1)多肽抗体效价的测定：
在实施过程中，不同的多肽用磷酸缓冲液(pH7.4)稀释到每毫升100微克，在96孔平板上每孔加100微升多肽溶液，在4度冰箱中过夜吸附。第二天对平板进行包被，然后将不同的多肽抗体从1∶500系列稀释到1∶32,000。将以上稀释的抗血清加到96孔平板中，室温吸附1-2小时。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将二抗(抗兔子免疫球蛋白抗体，过氧化物酶连接)按1∶2500稀释后加到9孔6平板中，室温吸附1-2小时，将平板用磷酸缓冲液洗过后，加过氧化物酶底物，四甲基联苯胺，室温反应20分钟，然后每孔加入100微升1当量的硫酸，用分光光度计450纳米(nm)进行光吸收测定。测定结果见图1。
(2)多肽抗体专一性的测定：
在实施过程中，9种不同的来源于单克隆抗体轻链的多肽分别稀释成每毫升10微克，取100微升加到96孔平板的孔中，4度冰箱过夜吸附。第二天对平板进行包被，然后将不同的多肽抗体按1∶2000稀释。将以上稀释的抗血清分别加到96孔平板中，室温吸附1-2小时。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将二抗(抗兔子免疫球蛋白抗体，过氧化物酶连接)按1∶2500稀释后加到96孔平板中，室温吸附1-2小时，将平板用磷酸缓冲液洗过后，加过氧化物酶底物，四甲基联苯胺，室温反应20分钟，然后每孔加入100微升1当量的硫酸，用分光光度计450纳米(nm)进行光吸收测定。测定结果见图2。
(3)双抗夹心酶标记免疫吸附检测法灵敏度的测定：
在此项实验实施过程中，9种不同的对应于人体免疫球蛋白轻链的多肽抗体血清分别按1∶2000稀释，取100微升加到96孔平板的孔中，4度冰箱过夜吸附。第二天对平板进行用含1％牛白蛋白的包被磷酸缓冲液(含0.1％Tween-20)包被，同时，将一部份单克隆抗体用8当量的尿素进行处理，室温下培养2小时。然后将同一种活性单克隆抗体蛋白按每毫升20微克和200微克稀释到包被磷酸缓冲液，将尿素变性的单克隆抗体蛋白按每毫升2微克稀释到包被磷酸缓冲液中。将以上溶液按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养90分钟。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将生物素标记的抗人体免疫球蛋白抗体按1∶2000稀释到包被磷酸缓冲液中，按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养60分钟。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将链酶亲和素-过氧化物酶连接复合体按每毫升0.02微克稀释到包被磷酸缓冲液中，按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养60分钟，将平板用磷酸缓冲液洗过后，加过氧化物酶底物，四甲基联苯胺，室温反应20分钟，然后每孔加入100微升1当量的硫酸，用分光光度计450纳米(nm)进行光吸收测定。测定结果见图3。
(4)市场上9种不同单克隆抗体药物轻链部分的构像测定：
在此项实验实施过程中，9种不同的对应于人体免疫球蛋白轻链的多肽抗体血清分别按1∶2000稀释，取100微升加到96孔平板的孔中，4度冰箱过夜吸附。第二天对平板进行用含1％牛白蛋白的包被磷酸缓冲液(含0.1％Tween-20)包被，同时，将在市场上销售的9种不同的单克隆抗体(Remicade；Avastin；Synagis；Zenapex；Erbitux；Herceptin；Rituxin；Campath；Humira)按每毫升200微克稀释到包被磷酸缓冲液中。将以上溶液按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养90分钟。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将生物素标记的抗人体免疫球蛋白抗体按1∶2000稀释到包被磷酸缓冲液中，按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养60分钟。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将链酶亲和素-过氧化物酶连接复合体按每毫升0.02微克稀释到包被磷酸缓冲液中，按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养60分钟，将平板用磷酸缓冲液洗过后，加过氧化物酶底物，四甲基联苯胺，室温反应20分钟，然后每孔加入100微升1当量的硫酸，用分光光度计450纳米(nm)进行光吸收测定。测定结果见图4。
(5)同种抗体药物在不同实验条件下的构像比较：
在此项实验实施过程中，9种不同的对应于人体免疫球蛋白药物轻链的多肽抗体血清分别按1∶2000稀释，取100微升加到96孔平板的孔中，4度冰箱过夜吸附。第二天对平板进行用含1％牛白蛋白的包被磷酸缓冲液(含0.1％Tween-20)包被，同时，将一种单克隆抗体，三种不同条件处理(不同的酸碱度，24小时)按每毫升200微克稀释到包被磷酸缓冲液中。将以上溶液按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养90分钟。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将生物素标记的抗人体免疫球蛋白抗体按1∶2000稀释到包被磷酸缓冲液中，按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养60分钟。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将链酶亲和素-过氧化物酶连接复合体按每毫升0.02微克稀释到包被磷酸缓冲液中，按每孔100微升加到96平板中，室温培养60分钟，将平板用磷酸缓冲液洗过后，加过氧化物酶底物，四甲基联苯胺，室温反应20分钟，然后每孔加入100微升1当量的硫酸，用分光光度计450纳米(nm)进行光吸收测定。测定结果见图5。
(6)市场上同种抗体药物不同生产批次间的构像分析(轻链)：
在此项实验实施过程中，9种不同的对应于人体免疫球蛋白轻链的多肽抗体血清分别按1∶2000稀释，取100微升加到96孔平板的孔中，4度冰箱过夜吸附。第二天对平板进行用含1％牛白蛋白的包被磷酸缓冲液(含0.1％Tween-20)包被，同时，将同一种市场上销售的单克隆抗体，4批生产样品按每毫升200微克稀释到包被磷酸缓冲液中。将以上溶液按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养90分钟。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将生物素标记的抗人体免疫球蛋白抗体按1∶2000稀释到包被磷酸缓冲液中，按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养60分钟。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将链酶亲和素-过氧化物酶连接复合体按每毫升0.02微克稀释到包被磷酸缓冲液中，按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养60分钟，将平板用磷酸缓冲液洗过后，加过氧化物酶底物，四甲基联苯胺，室温反应20分钟，然后每孔加入100微升1当量的硫酸，用分光光度计450纳米(nm)进行光吸收测定。测定结果见图6。
(7)市场上同种抗体药物不同生产批次间的构像分析(重链)：
在此项实验实施过程中，21种不同的对应于人体免疫球蛋白重链的多肽抗体血清分别按1∶2000稀释，取100微升加到96孔平板的孔中，4度冰箱过夜吸附。第二天对平板进行用含1％牛白蛋白的包被磷酸缓冲液(含0.1％Tween-20)包被，同时，将同一种市场上销售的单克隆抗体，4批生产样品按每毫升200微克稀释到包被磷酸缓冲液中。将以上溶液按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养90分钟。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将生物素标记的抗人体免疫球蛋白抗体按1∶2000稀释到包被磷酸缓冲液中，按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养60分钟。将平板用磷酸缓冲液洗过后，将链酶亲和素-过氧化物酶连接复合体按每毫升0.02微克稀释到包被磷酸缓冲液中，按每孔100微升加到96孔平板中，室温培养60分钟，将平板用磷酸缓冲液洗过后，加过氧化物酶底物，四甲基联苯胺，室温反应20分钟，然后每孔加入100微升1当量的硫酸，用分光光度计450纳米(nm)进行光吸收测定。测定结果见图7。
Claims (13)
1.一种蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将选取的蛋白质药物的氨基酸序列被用来设计相应的多肽抗原，该多肽抗原的氨基酸数量为15～50个；
（2）多肽抗原通过联接一个半胱氨酸与蛋白质载体共价结合，结合的方式是N 末端或C末端；
（3）多肽抗原与蛋白质载体共价结合后通过动物产生多肽抗体，其中，动物选自马、羊、牛、兔子、鸡或鼠中的一种；
（4）将多肽抗体采用双抗夹心酶标记免疫吸附检测法测定蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列。
2.根据权利要求1所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于步骤（1）中所设计的多肽抗原相邻的两个有重叠的氨基酸序列，重叠数目为1个～10个。
3.根据权利要求2所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于步骤（1）中所设计的多肽抗原相邻的两个有重叠的氨基酸序列，重叠数目为5个。
4.根据权利要求1所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于步骤（2）中多肽抗原与蛋白质载体共价结合的化学反应选用的交联剂为二氯乙烷或甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯三元共聚物；多肽抗原与蛋白质载体的当量比为10：1～50：1；蛋白质载体为血蓝蛋白或牛血清白蛋白。
5.根据权利要求4所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于步骤（2）中多肽抗原与蛋白质载体共价结合的化学反应选用的交联剂为甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯三元共聚物；多肽抗原与蛋白质载体的当量比为20：1，蛋白质载体为血蓝蛋白。
6.根据权利要求1所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于步骤（3）中注射动物的抗原剂量为50微克/次/只～5毫克/次/只。
7.根据权利要求6所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于步骤（3）中注射动物的抗原剂量为1毫克/次/只。
8.根据权利要求1所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于步骤（3）中动物选用新西兰兔。
9.根据权利要求1所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于步骤（4）的具体步骤为：将双抗夹心酶标记免疫吸附检测法检测盒分组用不同的多肽抗体包被，在经过牛血清白蛋白覆盖后，需要测定的蛋白质药物可以在不同浓度下与检测盒孔中的多肽抗体相混合，当蛋白质药物的表面有与孔中相应的多肽抗体所对应的抗原点，孔中的多肽抗体将与这部分蛋白质药物形成复合物，在下一步，一种抗人体免疫球蛋白的多克隆抗体将填加到检测盒的孔中，抗人体免疫球蛋白是经过生物素共价标记的，当孔中有多肽抗体与抗人体免疫球蛋白的复合体，抗人体免疫球蛋白将进一步与这个复合体形成更高一级的复合体，为多肽抗体-蛋白质药物-抗人体免疫球蛋白复合体，此复合体可以进一步与酶联亲和素形成复合体，而这个复合体的数量可以用过氧化酶的底物的转化反应出来，最后经分光光度计经光吸收测定蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列。
10.根据权利要求9所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于双抗夹心酶标记免疫吸附检测法检测盒采用24平板、96平板或385平板中的一种。
11.根据权利要求10所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于双抗夹心酶标记免疫吸附检测法检测盒采用96 平板。
12.根据权利要求9所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于双抗夹心酶标记免疫吸附检测法检测盒被多肽抗体包被的温度为4摄氏度或室温。
13.根据权利要求12所述的蛋白质类药物三维构像的抗体阵序列的检测方法，其特征在于双抗夹心酶标记免疫吸附检测法检测盒被多肽抗体包被的温度为4摄氏度。
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