CN103197058A - 一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于酶联免疫检测技术领域的一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒。该试剂盒包括：呋喃西林代谢物特异性抗体、酶标板、呋喃西林代谢物辣根过氧化物酶标记物、呋喃西林代谢物标准品、酶标物稀释液、显色剂、清洗液、终止液和样品稀释液。本发明还公开了利用该试剂盒进行样品检测的方法。本试剂盒主要采用直接竞争酶联免疫法定性或定量检测样品中呋喃西林代谢物的含量，大大缩短了生产周期。本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存期长、自动化程度高、无放射性同位素污染等优点，可在动物源性食品及饲料产品检测中发挥重要作用。

Description

一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒

技术领域

本发明属于酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒。

背景技术

呋喃西林(Nitrofurazone)等硝基呋喃类抗生素因其广谱、高效、廉价等特点被广泛应用于家畜、家禽、水产、蜂等动物传染疾病的预防和治疗。氨基脲(SEM)是呋喃西林的代谢产物，它在此类药物中毒性最强，在动物源性食品中的残留可通过食物链传递给人类，长期摄入有致畸胎、致癌等副作用。美国、日本和欧盟目前已全面规定禁止使用呋喃类抗菌物质。我国农业部文件农牧发[2002]1号也规定动物源性食品中呋喃唑酮、呋喃它酮的检出限为不得检出。

呋喃西林在动物体内很快代谢，其中常以检测其代谢产物作为残留标示，目前欧盟对硝基呋喃类代谢物的检测方法灵敏度规定为1ug/kg。已报道用于检测硝基呋喃类抗生素代谢物残留的方法主要有HPLC、LC-MS、LC-MS/MS和酶联免疫法(ELISA)等。

HPLC、LC-MS、LC-MS/MS等方法灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确认方法，在我国LC-MS/MS技术更是被作为此类药物在动物源性食品中检测的国标法。然此类方法对仪器和操作人员要求都较高，一个样品检测要几百元，检测时间也很长，不能满足现场抽检的需求和推广应用。ELISA技术以其快速、灵敏、特异性高等特点已成为目前药品残留检测的有效方法之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高灵敏度、特异性、准确度、精确度且操作简单的酶联免疫吸附检测试剂盒，用于定量快速检测蜂蜜、各种水产畜禽组织生物样品中的呋喃西林代谢物，以及饲料中的原型药。

一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒，该试剂盒包括：呋喃西林代谢物特异性抗体、酶标板、呋喃西林代谢物辣根过氧化物酶标记物、呋喃西林代谢物标准品、酶标物稀释液、显色剂、清洗液、终止液和样品稀释液。

所述的清洗液为0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。

所述的显色剂为过氧化氢；或者过氧化脲、邻苯二胺与稳定剂K按5∶5∶1(体积比)混合而成；或者过氧化脲、四甲基联苯胺与稳定剂K按5∶5∶1(体积比)混合而成；在4℃下可以稳定保存两年不变色。

所述的酶标物稀释液为含酶稳定剂AH和酶保护剂KEN的磷酸盐缓冲液。

所述的稳定剂K、含酶稳定剂AH和酶保护剂均购自美国InternationalDiagostica System公司。

所述呋喃西林代谢物酶标记物为浓缩液，使用时用酶标物稀释液溶解为工作液即可直接使用。

所述的呋喃西林代谢物标准品用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)配置成浓度分别为0ng/mL、0.05ng/mL、0.15ng/mL、0.45ng/mL、1.35ng/mL、4.05ng/mL的溶液。

所述的终止液为2mol/L的盐酸溶液。

所述的浓缩样品稀释液为含1％BSA的5倍浓缩磷酸盐缓冲液。

所述呋喃西林代谢物特异性抗体包被在酶标板上。

所述呋喃西林代谢物特异性抗体为动物抗呋喃西林代谢物的多克隆抗体，用呋喃西林代谢物与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物制得。

所述动物为兔、鼠或羊。

一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的方法，按照如下步骤进行：

(1)样品前处理：对于肌肉、肝脏、鱼、虾的组织，供试样用均质器均质样本，取1.0±0.05g的均质物进行以下操作；对于蜂蜜样品直接称取1.0±0.05g的供试样进行以下操作；

(2)加入4mL蒸馏水，0.5mL1M盐酸和150μL50mM的4-硝基苯甲醛溶液，涡旋混匀30s，60℃水浴3h，每隔1h涡旋振荡一次；

(3)加入5mL0.1M磷酸氢二钾和0.4mL1M氢氧化钠溶液，混匀加入6mL乙酸乙酯，振荡1-40min，室温条件下，4000g离心10min，收集3mL上层液体至10mL玻璃试管，50～60℃水浴氮气吹干；

(4)加入1mL正己烷，涡旋混匀30s，然后加入1mL样品稀释液复溶，振荡混匀30s，室温条件下3000g离心5min弃去上层有机相，取下层水相50μL用于分析；对于饲料样品，称取1.0±0.05g粉碎的样本加入10mL乙腈，65℃超声波提取15min，室温下4000rpm离心10min，取上清液2mL，于50～60℃水浴环境中氮气吹干，加入1mL样品稀释工作液溶解干燥物，充分混匀后用样品稀释液再做10倍稀释，取50μL用于分析；

(5)预先进行编号，标记B₀、呋喃西林代谢物标准品和样品的位置，进行双孔检测；从包被有呋喃西林代谢物特异性抗体的酶标板上取下所需数量的微孔，将多余的重新密封并放回2～8℃保存；将酶标物稀释液、样品稀释液、清洗液配制成工作液；在B₀孔中加入50μL0.0ng/mL呋喃西林代谢物标准品溶液；在各标准孔中加入50μL的呋喃西林代谢物标准品溶液，在各样品孔中加入50μL样品溶液；立即在所有孔中加入100μL的呋喃西林代谢物辣根过氧化物酶标记物，晃动反应板1-10s；室温下温浴30min；倒掉微孔中的液体，在所有微孔中加满清洗液；在吸水纸上拍打；用微量移液器在每个微孔中加入100μL显色剂，晃动酶标板使之彻底混匀，室温下显色10min；每孔中加入100μL终止液，混匀在450nm下检测吸光度，分析检测结果。

本发明试剂盒的检测原理为：将呋喃西林代谢物抗体包被与固相载体上，加入呋喃西林代谢物标准品或样本并加入酶标记呋喃西林辣根过氧化物酶标记物工作液，待测样本中的呋喃西林代谢物与酶标记呋喃西林代谢物竞争固相化的呋喃西林代谢物抗体。通过清洗剂除去未结合的酶标记物，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中呋喃西林代谢物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出呋喃西林代谢物的浓度范围。

本发明的有益效果：本试剂盒主要采用直接竞争酶联免疫法定性或定量检测样品中呋喃西林代谢物的含量，大大缩短了生产周期。对于不同来源的样品采用相同的前处理方式，即只需进行一次前处理就可以同时检测四种不同的硝基呋喃类代谢。提高衍生化温度到60℃，将样品的处理时间缩短为3小时，无需再过夜处理。室温下即可进行检测，无需保温37℃。显色液为混合显色液，无需分次单独添加，减少了操作程序。此外，本试剂盒的显色过程无需避光，直接在室内显色15nin即可。另外主要试剂以工作液形式提供，可以减少检测的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差。本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存期长、自动化程度高、无放射性同位素污染等优点，可在动物源性食品及饲料产品检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为呋喃西林代谢物的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1呋喃西林代谢物免疫原和酶标抗原的合成

傅-克烷基化反应活化呋喃西林药物代谢物制备免疫原：采用4-NP衍生，利用烷基化剂与呋喃西林药物代谢物反应，在衍生物中引入具有6碳间隔臂的羧基；应用碳二亚胺法(EDC)与血蓝蛋白(KLH)偶联，合成免疫原，透析提纯，-20℃保存备用。

傅-克酰基化反应活化呋喃西林药物代谢物制备酶标记抗原：采用4-NP衍生，利用琥珀酸酐为酰化剂，活化呋喃西林药物代谢物，引入连有4碳原子的羧基；应用混合酸酐法与HRP反应制备酶标记抗原；透析提纯、-20℃保存备用。

实例2呋喃西林代谢物多克隆抗体的制备

选取6只体重2～2.5kg健康雄性新西兰大白兔。将免疫原呋喃西林代谢物-KLH偶联物与等量弗氏完全佐剂通过注射器对抽法混合成油包水的乳浊液，按1mg/kg体重的量进行首次免疫，采取背部皮下多点注射。每隔两周加强免疫一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，计量及方法同首次免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后10天，耳缘静脉取血1m1，进行抗体效价检测，当抗体效价不再升高时，不加佐剂进行最后一次(第七次)免疫，大腿肌肉注射，7天后颈动脉放血，室温凝固2h后4℃过夜。8000r/min离心10分钟，除去血块，血清部分用50％饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33％饱和硫酸铵溶液沉淀两次，沉淀物用尽可能少的磷酸缓冲液溶解，经透析后即得呋喃西林代谢物多克隆抗体。

实例3呋喃西林代谢物抗血清效价的测定

采用直接ELISA法进行测定。酶标板包被抗呋喃西林代谢物抗血清、洗涤、封闭，并以同样的稀释度的阴性血清为对照，第1行1至12孔依次加入倍比稀释的呋喃西林代谢物辣根过氧化物酶标记物，均为100uL/孔，22-23℃温育10分钟；再加入辣根过氧化物酶(ARP)底物100uL/孔，经过10分钟孵育，终止反应后测定OD₄₅₀值。抗血清的OD₄₅₀值与相同稀释度的阴性血清OD₄₅₀值之比大于2的最大稀释度定为呋喃西林代谢物抗血清的效价。经测定呋喃西林代谢物抗血清的效价为1000。

实例4棋盘滴定法确定抗体包被浓度和酶标抗原工作浓度

通过棋盘滴定法对IC₅₀值、最大吸光度值和样品添加回收率的比较，确定抗体的包被浓度和酶标抗原的工作浓度。

表1最大吸光度值(OD值)比较

注：带“-”的表示OD值超出仪器读数范围(＞4.0)。

表2IC₅₀(ng/mL)比较

注：带“-”的是曲线变形，无法用于计算。

表3 0.5ng/mL样品添加回收率(％)比较

由表1-表3可见，随着包被抗呋喃西林抗血清浓度的降低，最大吸光值降低，IC₅₀值在一定范围内也随之降低。经测定包被抗血清按1.50×10²倍稀释，其IC₅₀浓度、回收率和吸光度值均较好。因此，选择1.5×10²倍稀释的包被抗血清进行包被。呋喃西林酶标物在2.5×10³倍稀释时，最大吸光度值、IC₅₀一直浓度和样品测定结果均处于最佳状态。3.0×10³倍稀释时，吸光度降低以及本底干扰增加。所以酶标抗原浓度选择以2500倍稀释相对较好。

实例5酶标板的制备

用包被缓冲液将呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体进行150倍稀释，每孔加入100ul，37℃包被2h，本实例所用包被液为含1％卵清蛋白的磷酸盐缓冲液。倾去包被液，用清洗液洗涤4次，每次1min，拍干。在每个孔中加入150ul封闭液，37℃封闭2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

实例6检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒的组建及检测方法

(1)实例3中所述的包被有呋喃西林代谢物特异性抗体的酶标板1块(12条×8孔，可拆分)；

(2)呋喃西林代谢物酶标物浓缩液；

(3)呋喃西林代谢物标准品溶液：6×1mL/管(0ng/mL，0.05ng/mL，0.15ng/mL，0.45ng/mL，1.35ng/mL，4.05ng/mL)；

(4)显色剂：过氧化氢或过氧化脲、邻苯二胺或四甲基联苯胺与稳定剂K按5：5∶1(体积比)混合而成；

(5)酶标物稀释液：为含酶稳定剂AH和酶保护剂KEN的磷酸盐缓冲液；

(6)样品稀释液：为含0.1％BSA的磷酸盐缓冲液；

(7)清洗液：为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液；

(8)终止液：为2mol/L的盐酸溶液；

(9)4-硝基苯甲醛：75.5mg。

实施例7一步法酶联免疫技术快速检测肌肉中呋喃西林

按照如下步骤进行：

(1)样品前处理：供试样虾肉10.0g，分成10份，每份用均质器均质样本，取均质物进行以下操作；

(2)加入4mL蒸馏水，0.5mL1M盐酸和150μL50mM的4-硝基苯甲醛溶液，涡旋混匀30s，60℃水浴3h，每隔1h涡旋振荡一次；

(3)加入5mL0.1M磷酸氢二钾和0.4mL1M氢氧化钠溶液，混匀加入6mL乙酸乙酯，振荡1-40min，室温条件下，4000g离心10min，收集3mL上层液体至10mL玻璃试管，50～60℃水浴氮气吹干；

(4)加入1mL正己烷，涡旋混匀30s，然后加入1mL样品稀释液复溶，振荡混匀30s，室温条件下3000g离心5min弃去上层有机相，取下层水相50μL用于分析；

(5)预先进行编号，标记B₀、呋喃西林代谢物标准品和样品的位置，进行双孔检测；从包被有呋喃西林代谢物特异性抗体的酶标板上取下所需数量的微孔，将多余的重新密封并放回2～8℃保存；将酶标物稀释液、样品稀释液、清洗液配制成工作液；在B₀孔中加入50μL0.0ng/mL呋喃西林代谢物标准品溶液；在各标准孔中加入50μL的呋喃西林代谢物标准品溶液，在各样品孔中加入50μL样品溶液；立即在所有孔中加入100μL的呋喃西林代谢物辣根过氧化物酶标记物，晃动反应板1-10s；室温下温浴30min；倒掉微孔中的液体，在所有微孔中加满清洗液；在吸水纸上拍打；用微量移液器在每个微孔中加入100μL显色剂，晃动酶标板使之彻底混匀，室温下显色10min；每孔中加入100μL终止液，混匀在450nm下检测吸光度，分析检测结果。

(6)结果计算

计算每个标准品和样品的平均吸光度。所有标准品和样品的平均吸光度除以零标准的平均吸光度，再乘以100，即得以％表示的结合率：

将每个标准的B/B₀值输入半对数系统中，对应于各自的呋喃西林代谢物标准的浓度可以获得一个标准曲线，用样品的B/B₀值在标准曲线中就可以找到对应的呋喃西林代谢物浓度，在标准曲线中得到的浓度结果还要最后乘上相应的稀释倍数，获得样品稀释前实际的呋喃西林代谢物含量，用ppb(μg/kg或μg/L)表示

说明：对于呋喃西林的原型药物，在标准曲线中得到的浓度结果在乘上相应的稀释倍数之后，尚需要考虑其交叉反应率值，通过换算后才能得到真实含量。

计算公式：样品实际含量＝样品检测浓度×稀释倍数×(1/0.136)(单位：μg/kg)

呋喃西林代谢物的标准曲线如图1所示，根据标准曲线和检测结果计算，本次试验检测到样品虾肉中平均含有3ug/kg的呋喃西林。

实施例8一步法酶联免疫技术快速检测蜂蜜中呋喃西林

(1)样品前处理：直接称取蜂蜜样品10.0g，分为10份，进行以下操作；

(2)加入4mL蒸馏水，0.5mL1M盐酸和150μL50mM的4-硝基苯甲醛溶液，涡旋混匀30s，60℃水浴3h，每隔1h涡旋振荡一次；

(3)加入5mL0.1M磷酸氢二钾和0.4mL1M氢氧化钠溶液，混匀加入6mL乙酸乙酯，振荡1-40min，室温条件下，4000g离心10min，收集3mL上层液体至10mL玻璃试管，50～60℃水浴氮气吹干；

(4)加入1mL正己烷，涡旋混匀30s，然后加入1mL样品稀释液复溶，振荡混匀30s，室温条件下3000g离心5min弃去上层有机相，取下层水相50μL用于分析；对于饲料样品，称取1.0±0.05g粉碎的样本加入10mL乙腈，65℃超声波提取15min，室温下4000rpm离心10min，取上清液2mL，于50～60℃水浴环境中氮气吹干，加入1mL样品稀释工作液溶解干燥物，充分混匀后用样品稀释液再做10倍稀释，取50μL用于分析；

(5)预先进行编号，标记B₀、呋喃西林代谢物标准品和样品的位置，进行双孔检测；从包被有呋喃西林代谢物特异性抗体的酶标板上取下所需数量的微孔，将多余的重新密封并放回2～8℃保存；将酶标物稀释液、样品稀释液、清洗液配制成工作液；在B₀孔中加入50μL0.0ng/mL呋喃西林代谢物标准品溶液；在各标准孔中加入50μL的呋喃西林代谢物标准品溶液，在各样品孔中加入50μL样品溶液；立即在所有孔中加入100μL的呋喃西林代谢物辣根过氧化物酶标记物，晃动反应板1-10s；室温下温浴30min；倒掉微孔中的液体，在所有微孔中加满清洗液；在吸水纸上拍打；用微量移液器在每个微孔中加入100μL显色剂，晃动酶标板使之彻底混匀，室温下显色10min；每孔中加入100μL终止液，混匀在450nm下检测吸光度，分析检测结果。

(6)结果计算

计算每个标准品和样品的平均吸光度。所有标准品和样品的平均吸光度除以零标准的平均吸光度，再乘以100，即得以％表示的结合率：

将每个标准的B/B₀值输入半对数系统中，对应于各自的呋喃西林代谢物标准的浓度可以获得一个标准曲线，用样品的B/B₀值在标准曲线中就可以找到对应的呋喃西林代谢物浓度，在标准曲线中得到的浓度结果还要最后乘上相应的稀释倍数，获得样品稀释前实际的呋喃西林代谢物含量，用ppb(μg/kg或μg/L)表示

说明：对于呋喃西林的原型药物，在标准曲线中得到的浓度结果在乘上相应的稀释倍数之后，尚需要考虑其交叉反应率值，通过换算后才能得到真实含量。

计算公式：样品实际含量＝样品检测浓度×稀释倍数×(1/0.136)(单位：μg/kg)

呋喃西林代谢物的标准曲线如图1所示，根据标准曲线和检测结果计算，本次试验检测到样品蜂蜜中平均含有3ug/kg的呋喃西林。

实例9试剂盒灵敏度实验

评价竞争性酶联免疫吸附实验反应灵敏度的方法，常用的有IC₅₀和检测限(下限)。分别测定20次标准曲线的IC₅₀，确定该值的浮动范围。一定条件下，试剂盒方法检测限符合正态分布的规律，取肌肉、肝脏、水产、蜂蜜20个空白样本通过试剂盒测定的光密度在标准曲线上对应的呋喃西林代谢物含量的平均值(x)和标准差(s)表示，检测限＝x+3s。

表4IC₅₀结果统计表

如表4所示，统计IC₅₀二十次测定结果，IC₅₀平均值为0.28ng/ml，浮动范围在0.10～0.40ng/ml之间。经试验确定样品中呋喃西林代谢物最低检出限为0.2μg/kg(组织样品)；样本中原型药最低检测限为50μg/kg(饲料)。该检测限能满足欧盟的1ug/kg的最低检测限量的要求。

实例10试剂盒重复性和再现性实验

重复性即实验室内的变异程度。以蜂蜜样品为例，将空白样品以定量限0.5μg/kg、两倍定量限1μg/kg进行添加，每个浓度各五个平行，并抽取3批试剂盒，每批试剂盒测定同一份样品3次。结果，样品的板内变异系数为1.7％～9.86％之间，批内、批间变异系数均小于15％，样品的平均回收率在75％～90％之间。再现性即实验室间的变异程度。对同一鱼肉样品，分别在不同地点的实验室对随机抽取的同一批次的三个试剂盒进行添加实验，计算得到的加标平均回收率分别为88％、76％和85％，板间、批内和批间变异系数均小于15％，说明此试剂盒再现性良好。

实例11试剂盒特异性实验

试剂盒的特异性可用药物的交叉反应率来表示。交叉反应率即引起50％抑制的标准物浓度与类似物引起50％抑制的浓度值之比。本实验分别测定了该试剂盒与呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等原型药及其代谢物的交叉反应率。

表5试剂盒特异性检验结果

本试剂盒检测结果显示，呋喃西林代谢物与其同类的呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因等及其代谢物的交叉反应率均小于0.01％。表明该试剂盒适用于食品中呋喃妥因类药物的残留检测，具有良好的特异性。

实例12试剂盒稳定性实验

采用冷热性加速实验确定试剂盒的稳定性。将三批试剂盒置于37℃恒温箱中1天、3天、6天，随机取6盒试剂盒检测相关技术指标。从三批试剂盒中抽出6个试剂盒，每盒均做4℃6个时间段(第0、1、2、3、6、7月)的保存试验。每个时间点分别取出1个试剂盒，每个试剂盒做5条曲线、5个样品重复，测定其IC₅₀抑制浓度(灵敏度)、检测限、标准品板内变异系数和回收率等相关技术指标。

冷热稳定性实验结果显示：该试剂盒在37℃经6天的保存试验，OD值有所下降，但零标准吸光度值仍在1.0以上。IC₅₀均在0.10～0.28ng/ml之间，阳性回收率在70％～102.7％；标准品板内变异系数在15％以下。试剂盒保存条件为2～8℃，经过近7个月的测定，发现试剂盒从生产之起到第六个月，各项指标均符合《农业部文件》农医发「2005」17号附件2试剂盒备案参考评判标准的规定。到第7个月时检测结果发现0标准吸光度值在1.4左右，阳性样品回收率有下降趋势但幅度不是很大。

Claims (5)

1.一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：呋喃西林代谢物特异性抗体、酶标板、呋喃西林代谢物辣根过氧化物酶标记物、呋喃西林代谢物标准品、酶标物稀释液、显色剂、清洗液、终止液和样品稀释液。

2.根据权利要求1所述一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒，其特征在于，所述呋喃西林代谢物特异性抗体包被在酶标板上。

3.根据权利要求1所述一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒，其特征在于，所述呋喃西林代谢物特异性抗体为动物抗呋喃西林代谢物的多克隆抗体，用呋喃西林代谢物与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物制得。

4.根据权利要求3所述一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒，其特征在于，所述动物为兔、鼠或羊。

5.一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)样品前处理：对于肌肉、肝脏、鱼、虾的组织，供试样用均质器均质样本，取1.0±0.05g的均质物进行以下操作；对于蜂蜜样品直接称取1.0±0.05g的供试样进行以下操作；

(2)加入4mL蒸馏水，0.5mL1M盐酸和150μL50mM的4-硝基苯甲醛溶液，涡旋混匀30s，60℃水浴3h，每隔1h涡旋振荡一次；

(3)加入5mL0.1M磷酸氢二钾和0.4mL1M氢氧化钠溶液，混匀加入6mL乙酸乙酯，振荡1-40min，室温条件下，4000g离心10min，收集3mL上层液体至10mL玻璃试管，50～60℃水浴氮气吹干；

(4)加入1mL正己烷，涡旋混匀30s，然后加入1mL样品稀释液复溶，振荡混匀30s，室温条件下3000g离心5min弃去上层有机相，取下层水相50μL用于分析；对于饲料样品，称取1.0±0.05g粉碎的样本加入10mL乙腈，65℃超声波提取15min，室温下4000rpm离心10min，取上清液2mL，于50～60℃水浴环境中氮气吹干，加入1mL样品稀释工作液溶解干燥物，充分混匀后用样品稀释液再做10倍稀释，取50μL用于分析；

(5)预先进行编号，标记B₀、呋喃西林代谢物标准品和样品的位置，进行双孔检测；从包被有呋喃西林代谢物特异性抗体的酶标板上取下所需数量的微孔，将多余的重新密封并放回2～8℃保存；将酶标物稀释液、样品稀释液、清洗液配制成工作液；在B₀孔中加入50μL0.0ng/mL呋喃西林代谢物标准品溶液；在各标准孔中加入50μL的呋喃西林代谢物标准品溶液，在各样品孔中加入50μL样品溶液；立即在所有孔中加入100μL的呋喃西林代谢物辣根过氧化物酶标记物，晃动反应板1-10s；室温下温浴30min；倒掉微孔中的液体，在所有微孔中加满清洗液；在吸水纸上拍打；用微量移液器在每个微孔中加入100μL显色剂，晃动酶标板使之彻底混匀，室温下显色10min；每孔中加入100μL终止液，混匀在450nm下检测吸光度，分析检测结果。