CN103159660B

CN103159660B - (2r)-1-(2-甲基-3-(甲氧基(甲基)氨基)-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸及其应用

Info

Publication number: CN103159660B
Application number: CN201110410165.2A
Authority: CN
Inventors: 饶子和; 陈悦; 郭宇; 周红刚; 白翠改; 李宁宁; 徐寅通; 夏强; 娄智勇; 杨诚
Original assignee: COLLEGE OF PHARMACY NANKAI UNIVERSITY; Tianjin International Joint Academy Of Biotechnology & Medicine
Current assignee: COLLEGE OF PHARMACY NANKAI UNIVERSITY; Tianjin International Joint Academy Of Biotechnology & Medicine
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2031-12-08
Also published as: CN103159660A

Abstract

本发明提供了式I化合物该化合物的化学名称为(2R)-1-(3-(甲氧基(甲基)氨基-2-甲基)-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸，是差向异构体混合物。式I化合物具有良好的抑制NDM-1活性的作用，其IC₅₀值为33.94±9.3μM。

Description

(2R)-1-(2-甲基-3-(甲氧基(甲基)氨基)-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸及其应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及(2R)-1-(2-甲基-3-(甲氧基(甲基)氨基)-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸及其制备方法和应用。

背景技术

在被称为抗生素“黄金时代”的20世纪五六十年代，全世界每年死于感染性疾病的人数约为700万，这一数字到1999年上升到了2000万。病死率升高的主要原因是耐药菌带来的用药困难。

目前，细菌耐药性问题已经非常严重。在发达国家，有5％～10％的住院病人发生过一次或更多的感染。美国每年发生医院感染的患者约为200万，死亡90000人，经济损失达45亿～57亿美元。在发展中国家，发生医院感染的危险要高出发达国家2倍～20倍。我国医院感染发生率为6％左右，但漏报率很高，可达50％以上，致死率尚不清楚。主要感染部位依次为下呼吸道、泌尿道及手术切口感染等。

2010年8月，著名医学杂志《柳叶刀》报道了一例对所有β-内酰胺类抗菌药物耐药、对环丙沙星也不敏感、仅对粘菌素敏感的病例，深入研究发现其携带肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)编码的一种新型金属β-内酰胺酶，并根据患者可能感染地点(印度新德里)将这种酶命名为新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1，NewDelhimetallo-β-lactamase-1)。

根据上述研究结果，英国、印度等国研究人员在印度、巴基斯坦、英国等开展了较大范围的流行病学调查，产NDM-1肠杆菌科细菌占所检测细菌的1.2％-13％，主要菌种为大肠埃希菌(Escherichiacoli)和肺炎克雷伯菌，其它细菌还有阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、变形杆菌(Proteusspecies)、弗劳地枸橼酸菌(Citrobacterfreundii)、产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)、摩根摩根菌(Morganellamorganii)、普罗威登菌(ProvidenciaEwing)等；这些细菌主要引起尿路、血流、伤口、肺部和导管相关感染等。不到一个月的时间内，在美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚、比利时以及我国大陆、香港、台湾地区等都已经有感染病例报道。

由于产NDM-1细菌的蔓延十分迅速，有关产NDM-1细菌感染治疗的临床和基础研究还较少。目前已经阐明NDM-1属于B类β-内酰胺酶超家族中的一员，在其活性部位结合有锌离子，因此又称为金属β-内酰胺酶。其水解底物包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类等，表现为产酶细菌对这些药物广泛耐药。与之前发现的其他B类β-内酰胺酶相比，NDM-1具有能够水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素，且耐受大多数β-内酰胺酶抑制剂等特点。NDM-1的存在是导致NDM-1超级细菌几乎对所有β-内酰胺抗菌药物耐药的分子基础，同时由于细菌具有其它耐药机制，对氨基糖苷类、喹诺酮类等也多耐药，目前只对多粘菌素和替加环素具有较高体外敏感性。

NDM-1能轻易地从一种细菌跳到另一种上面，科学家忧虑NDM-1跟危险性病毒结合，变成无法医治的人传人病毒，并且NDM-1是一种多重抗药性细菌，一旦在全球散播，抗生素作废的时期将拉开序幕，因此开发能够抑制产NDM-1耐药细菌的活性的药物迫在眉睫。

发明内容

为了寻找高效抑制NDM-1活性的药物，本发明提供了式I化合物

该化合物的化学名称为(2R)-1-(2-甲基-3-(甲氧基(甲基)氨基)-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸。

本发明还提供了式Ia化合物

其化学名称为(2R)-1-((2S)-2-甲基-3-(甲氧基(甲基)氨基)-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸。

本发明还提供了式Ib化合物

其化学名称为(2R)-1-((2R)-2-甲基-3-(甲氧基(甲基)氨基)-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸。

上面所述式I化合物是式Ia化合物和式Ib化合物的差向异构体混合物。

“差向异构体”是指在含有两个或者多个四面体型手性中心的分子中，只有一个不对称原子的构型不同的一对非对映异构体。在本文中具体是指N取代基上连有甲基的C2位的构型不同，即式Ia化合物中该位置的碳为S构型，式Ib化合物中该位置的碳为R构型。

在一个方面，本发明还提供了一种制备所述式I化合物的方法，所述方法包括下列步骤：

a.由2-甲基-3-卤代丙酸发生酯化反应生成2-甲基-3-卤代丙酸酯；

b.由2-甲基-3-卤代丙酸酯与O，N-二甲基羟胺发生缩合反应生成3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸酯；

c.由3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸酯发生脱酯化反应生成3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸；

d.由(2R)-吡咯烷-2-羧酸发生酯化反应，生成(2R)-吡咯烷-2-羧酸酯；

e.由3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸和(2R)-吡咯烷-2-羧酸酯发生缩合反应生成(2R)-1-(3-(甲氧基(甲基)氨基)-2-甲基-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸酯；以及

f.然后发生脱酯化反应，生成式I化合物，其中各步骤中所述卤代是指氟代、氯代、溴代或碘代，优选溴代。

上面所述各步骤均可以采用本领域公知的方法进行反应。例如，在步骤a中，2-甲基-3-卤代丙酸在醇中与二氯亚砜发生酯化反应，其中所述醇选自甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇或2-丁醇等，优选甲醇；在步骤b中，2-甲基-3-卤代丙酸酯与O，N-二甲基羟胺在碱性条件下发生缩合反应，所述碱选自二乙胺、三乙胺、异丙胺或二异丙胺等，优选三乙胺；在步骤c中，由2-甲基-3-甲氧基(甲基)氨基-丙酸酯在醇和碱性催化剂的作用下发生去酯化反应，所述醇选自甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇或2-丁醇等，优选甲醇，所述碱性催化剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、和有机碱等；在步骤d中，发生酯化反应的条件与上面所述步骤a中的相同；在步骤e中，2-甲基-3-甲氧基(甲基)氨基-丙酸和(2R)-吡咯烷-2-羧酸甲酯在缩合剂、酰化催化剂和碱的存在下发生缩合反应，所述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、二环己基碳二亚胺(DCC)或者N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)，所述酰化催化剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、二甲氨基吡啶(DMAP)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或者N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，所述碱选自4-甲基吗啡啉、三乙胺(TEA)、二异丙基乙胺(DIEA)或者二甲基甲酰胺(DMF)；在步骤f中，脱酯化反应的反应条件与上述步骤c中所述的相同。

在一个具体实施例中，所述制备方法包括：

a.由2-甲基-3-溴丙酸在甲醇中与二氯亚砜发生酯化反应生成2-甲基-3-溴丙酸甲酯；

b.由2-甲基-3-溴丙酸酯在冰浴条件下与O，N-二甲基羟胺在Et3N的存在下发生缩合反应生成3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸甲酯；

c.由3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸甲酯在甲醇和氢氧化钠的作用下发生去酯化反应生成3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸；

d.由(2R)-吡咯烷-2-羧酸在甲醇中与二氯亚砜发生酯化反应，生成(2R)-吡咯烷-2-羧酸甲酯；

e.由3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸和(2R)-吡咯烷-2-羧酸甲酯在4-甲基吗啡啉、EDCI和HOBT的存在下发生缩合反应生成(2R)-1-(3-(甲氧基(甲基)氨基)-2-甲基-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸甲酯；以及

f.然后在甲醇和氢氧化钠的作用下发生去酯化反应，生成式I化合物。

在式I化合物的制备中所采用的起始原料是已知的、能够根据已知方法制备的或者可商购获得的。

中间体和终产物都可以根据常规方法进行后处理和/或纯化，所述常规方法包括调节pH、萃取、过滤、干燥、浓缩、色谱法、研磨、结晶等。

另外，式I化合物还可以通过本领域已知的各种方法或者变通方法进行制备。

式I化合物的差向异构体混合物可用本身已知的方法通过适当的分离方法分离为它们相应的异构体。差向异构体例如可通过分步结晶、色谱法、溶剂分配和相似的方法分离成它们的单独异构体。该分离可发生在起始化合物的水平上或者在式I化合物自身中。差向异构体可通过使用具有手性配体的色谱底物的色谱法(例如HPLC)来分离。

式Ia和式Ib化合物可以采用上面所述用于制备式I化合物的方法来制备，除了将起始原料2-甲基-3-溴丙酸替换为其相应的R型和S型异构体。

在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含式I化合物，其中式I化合物是式Ia化合物和式Ib化合物的差向异构体混合物。本发明还提供了包含式Ia化合物或者式Ib化合物的药物组合物。

该药物组合物除包含上述式I、式Ia或式Ib化合物之外，还可以包含一种或多种药学上可接受的载体或者赋形剂。术语“药学上可接受的”是指当给药至动物例如哺乳动物(例如人类)时生理学上可耐受且通常不会产生过敏或类似的不良反应(例如头晕等)的添加剂或组合物。药物载体和赋形剂可以包括但不限于稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、甘露糖和/或甘油；润滑剂；聚乙二醇；粘合剂，例如硅酸铝镁、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；并且，如果需要的话，还包括崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠；和/或吸附剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂和甜味剂。

本发明化合物可以根据常规药物配制技术与药物载体或赋形剂(例如药学上可接受的载体和赋形剂)混合形成药物制剂。可以将活性成分式I、式Ia或式Ib化合物混合在任何常用的药物剂型中，所述药物剂型包括但不限于口服剂型、注射剂型和外用剂型。所述口服剂型包括片剂、胶囊剂和液体制剂(例如酏剂和混悬剂)，其中包含着色剂、矫味剂、稳定剂和掩盖味道的物质。对于混合口服剂型来说，活性成分化合物可以与各种普通片剂材料(例如淀粉、碳酸钙、乳糖、蔗糖和磷酸二钙)混合以助于压片和装入胶囊。所述注射剂型包括无菌溶液、纳米混悬剂等。活性成分可以在药学上可接受的无菌液体载体例如无菌水、无菌有机溶剂或者两者的混合物中溶解或混悬。液体载体可以是适合注射剂的载体，比如生理盐水、丙二醇或者聚乙二醇水溶液。液体药物制剂可以用于静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射或者皮下注射。所述外用剂型包括贴剂、软膏剂、泥敷剂、栓剂、乳剂、糊剂等。

在又一个方面，本发明提供了式I、式Ia或者式Ib化合物在制备抑制耐药细菌活性的药物中的应用。

本文中所用的“耐药细菌”是指对于几乎所有的β-内酰胺类抗生素具有耐药性，同时对于氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物也多具有耐药性的细菌。在一个具体实施例中，耐药细菌是指产NDM-1耐药细菌。产NDM-1耐药细菌选自大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌等中的一种或多种。

本发明的式I化合物具有良好的抑制NDM-1活性的作用，其IC₅₀值为33.94μM，可以减少甚至消除NDM-1对β-内酰胺类抗生素的水解，从而解决由于NDM-1引起的耐药性。应当理解该化合物可以与抗生素类药物联用，通过抑制NDM-1的活性，提高抗生素药物的疗效，从而能够治疗由NDM-1引起的耐药细菌感染，具有良好的药物应用前景。

附图说明

图1示出了药筛酶活体系底物亚安培南一水合物的化学结构式及其与NDM-1的作用位点。

图2示出了底物亚安培南一水合物反应前后全波长扫描的紫外吸收光谱图的比较结果。

图3示出了本发明所述的式I化合物的NDM-1剩余活性分数对化合物浓度对数的曲线图。

具体实施方式

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

木发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。本文所用的缩略语通常为本领域技术人员所熟知的，或者可以是根据基础知识易于理解的。

下列实施例仅用于举例说明本发明，对本发明没有任何限制。所用起始原料均为可商购获得的已知化合物。

实施例1(2R)-1-(3-(甲氧基(甲基)氨基)-2-甲基丙酰基)吡咯烷-2-羧酸(式I化合物)的制备

步骤a：2-甲基-3-溴-丙酸甲酯的制备

在室温下，将2-甲基-3-溴丙酸(100mg，0.60mmol)溶解到甲醇(10ml)中，在搅拌下向上述溶液中滴入二氯亚砜(142.48mg，1.20mmol)，反应2小时。然后加入饱和碳酸氢钠(50ml)淬灭，浓缩旋出甲醇，用二氯甲烷(3*20ml)萃取，收集并合并有机相，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩除去溶剂，得到97.5mg预期产物，为白色油状物，收率为90％。该化合物的氢谱数据如下所示：¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)：δppm3.701(s，3H)，3.561(q，1H)，3.515(t，1H)，2.887(m，1H)，1.277(d，3H)。

步骤b：3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸甲酯的制备

在冰浴条件下，将步骤a中所得的2-甲基-3-溴-丙酸甲酯(100mg，0.55mmol)溶解在二氯甲烷(20ml)中，向上述溶液中，依次加入O，N-二甲基羟胺(53.64mg，0.55mmol)、三乙胺(55.66mg，0.55mmol)，加料完毕后，将体系升至室温，搅拌反应10个小时，然后加入水(50ml)和甲基叔丁基醚(50ml)，分层。将有机层用饱和食盐水(3*20ml)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，将残留物经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化，得到46.1mg预期产物，为黄色油状物，收率为51.8％。该化合物的氢谱数据如下所示：¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)：δppm3.739(s，3H)，3.641(s，3H)，3.075(m，2H)，2.227(s，3H)，2.307(m，1H)，1.207(d，3H)。

步骤c：3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸的制备

在室温条件下，将步骤b中得到的3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸甲酯(100mg，0.62mmol)溶解在甲醇(20ml)中，向上述溶液中加入氢氧化钠(27.29mg，0.68mmol)，反应4小时。然后抽滤反应混合液，向滤液中加入水(10ml)，浓缩，将甲醇旋干，用5％硫酸氢钾水溶液调节pH至6，然后用乙酸乙酯(4*20ml)萃取，收集并合并有机相，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，将残留物经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1)纯化，得到52.8mg预期产物，为黄色固体，收率为57.8％。该化合物的氢谱数据如下所示：¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)：δppm3.539(s，3H)，3.641(s，3H)，2.263(s，3H)，2.907(m，2H)，1.137(d，3H)。

步骤d：(2R)-吡咯烷-2-羧酸甲酯的制备

在室温下，将(2R)-吡咯烷-2-羧酸(100mg，0.87mmol)溶解到甲醇(10ml)中，在搅拌下向上述溶液中滴入二氯亚砜(113.67mg，0.96mmol)，反应2小时。然后向反应混合液中加入饱和碳酸氢钠溶液(50ml)淬灭反应，浓缩旋出甲醇，用二氯甲烷(3*20ml)萃取，收集并合并有机相，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩除去溶剂，得到101mg预期产物，为白色固体，收率为90％。该化合物的氢谱数据如下所示：¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)：δppm2.095(m，2H)，2.193(m，1H)，2.464(m，1H)，2.908(s，1H)，3.556(m，2H)，3867(s，1H)，4.513(s，1H)。

步骤e：(2R)-1-(3-(甲氧基(甲基)氨基)-2-甲基-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸甲酯的制备

在冰浴条件下，将步骤c中得到的化合物3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸(100mg，0.68mmol)溶解在二氯甲烷(20ml)中，向上述溶液中，依次加入步骤d中得到的化合物(2R)-吡咯烷-2-羧酸甲酯(87.76mg，0.68mmol)、EDCI(260.77mg，1.36mmol)、HOBt(110.32mg，0.82mmol)和N-甲基吗啡啉(82.54mg，0.82mmol)，加料完毕后，将体系升至室温，搅拌7个小时。然后加入二氯甲烷(50ml)稀释，分离出有机相，将有机相先用饱和食盐水(3*20ml)洗涤，再用5％硫酸氢钾水溶液(3*20ml)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，将残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1)纯化，得到98.7mg预期产物，为白色固体，收率为56.2％。该化合物的氢谱数据如下所示：¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)：δppm4.563(t，1H)，3.749(s，3H)，3.731(s，3H)，3.163(m，2H)，2.907(m，3H)，2.467(m，5H)，2.075(m，2H)，1.137(d，3H)。

步骤f：(2R)-1-(3-(甲氧基(甲基)氨基)-2-甲基-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸的制备

在室温条件下，将步骤e中得到的化合物(2R)-1-(3-(甲氧基(甲基)氨基)-2-甲基-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(100mg，0.39mmol)溶解在甲醇(10ml)中，向上述溶液中加入氢氧化钠(17.03mg，0.43mmol)，反应8小时。然后抽滤反应混合液，向滤液中加入水(10ml)，浓缩，将甲醇旋干，然后用5％硫酸氢钾水溶液调节pH至6，用乙酸乙酯(4*20ml)萃取，收集并合并有机相，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，将残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得到61.2mg的标题化合物，为黄色固体，收率为64.7％。该化合物的氢谱数据如下所示：¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)：δppm10.08(s，1H)，4.423(t，1H)，3.773(s，3H)，3.628(s，3H)，3.124(m，2H)，2.852(m，3H)，2.241(m，5H)，2，123(m，2H)，1.217(d，3H)。

药理活性测试方法

本发明的活性测试方法以亚胺培南一水合物作为NDM-1的底物进行活性检测，亚胺培南一水合物的结构式见图1，其中表示NDM-1裂解底物的反应部位。其酶活机制是：底物亚胺培南一水合物的母核部分具有O＝C-N-C＝C共轭结构，表明底物可产生紫外吸收。由于NDM-1可以水解β-内酰胺环酰胺键，因此NDM-1与底物反应时可以水解底物的酰胺键，导致共轭结构被破坏，从而使紫外吸收消失。通过对比NDM-1与底物反应前后的全波长扫描紫外吸收光谱图发现，底物在300nm处有最强紫外吸收，如图2所示。如果化合物对NDM-1具有抑制作用，则阻止了NDM-1对底物的水解，导致底物的紫外吸收值降低减慢，由此可以判断化合物对NDM-1是否具有抑制效果，从而进行NDM-1抑制剂药物的筛选。

药理活性测试方法包括以下6个步骤：

步骤1.NDM-1底物储备液的制备

将亚胺培南一水合物(Imipenemmonohydrate，购自Sigma公司)溶于50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，购自BioBasic公司)中，配制成10mM的底物储备液备用。

步骤2.化合物的处理

将化合物在95％DMSO+5％ddH₂O(双蒸水)中溶解，配制成100mM浓度的溶液，然后将配制好的化合物溶液放置在1.5mlep管中，于4℃下保存备用。

步骤3.NDM-1蛋白缓冲液的配制

将NDM-1(由本实验室MDC蛋白纯化组提供，制备方法参见YuGuo，JingWang等，AstructuralviewoftheantibioticdegradationenzymeNDM-1fromasuperbug.Protein&Cell，2011，2(5)：384-394)溶解在蛋白缓冲液(pH＝6.8)中，配制成50nM的NDM-1蛋白缓冲液，其中蛋白缓冲液含有50mMHEPES、5μMZnCl₂(购于BioBasic公司)、10μg/mlBSA(购于上海生工工程有限公司)。

步骤4.NDM-1药筛酶活体系的建立

NDM-1药筛酶活体系中包含的成分，其体积和浓度见表1。

表1NDM-1的药筛酶活体系

体系	体积	浓度
			NDM-1	100μl	50nM
底物	50μl	600μM
			化合物	2μl	100mM
总计	152μl

检测体系设置阴性对照，阴性对照体系中加入2μl95％DMSO双蒸水溶液取代化合物，用于检测NDM-1的活性。

步骤5.化合物的初步筛选

向96微孔板中的每孔中加入100μl的浓度为50nM的NDM-1蛋白缓冲液。然后向每孔中加入2μl的浓度为100mM的化合物溶液。振荡，室温孵育1分钟后，每孔加入50μl的600μM的底物进行反应。每隔8秒用光谱扫描多功能读数仪(VarioskanFlash，Thermoscientific)检测一次，共测20次。

绘制曲线，取阴性对照曲线斜率的最大处值为V₀，化合物曲线斜率的最大处值为Vi，则NDM-1的剩余活性分数＝Vi/V₀。剩余活性分数越低，表示化合物对NDM-1活性的抑制越强。当NDM-1的剩余活性分数在0.2以内时，将进一步测定该化合物的IC₅₀值。

步骤6.化合物的IC₅₀值的测定

将原始浓度为100mM的化合物溶液用95％DMSO双蒸水溶液按1∶2(体积比)的比例进行等比稀释，共稀释11个浓度梯度。最终浓度依次为1316、658、329、164.5、82.2、41.1、20.6、10.3、5.1、2.6、1.3μM。接着进行化合物的IC₅₀值检测，向96微孔板中的每孔中加入100μl的浓度50nM的NDM-1蛋白缓冲液。然后向每孔中加入2μl的上面配置的11个浓度的化合物溶液。振荡，室温孵育1分钟后，每孔加入50μl的600μM的底物进行反应。每隔8秒用光谱扫描多功能读数仪检测一次，共测20次。然后绘制曲线，计算NDM-1的剩余活性分数。最后以化合物浓度对数(以10为底数)为横坐标，NDM-1的剩余活性分数为纵坐标绘制曲线。根据曲线，采用GraphPadPrismversion5.0软件(GraphPadsoftware公司)计算IC₅₀值。

将实施例1中制备得到的(2R)-1-(3-(甲氧基(甲基)氨基)-2-甲基-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸(4mg)在95％DMSO(244μl)中溶解，配制成100mM浓度的溶液。按照上面所述的药理活性测试方法进行测试，最后以化合物浓度对数(以10为底数)为横坐标，NDM-1的剩余活性分数为纵坐标绘制曲线，见图3。根据曲线，采用GraphPadPrismversion5.0软件计算其IC₅₀值为33.94±9.3μM。

由上所述，可知本发明的式I化合物具有良好的抑制NDM-1活性的作用，可以减少甚至消除NDM-1对β-内酰胺类抗生素的水解，从而解决由于NDM-1引起的耐药性。

虽然本发明实施例仅提供了式I化合物，但本领域技术人员应当理解采用相似的方法制备得到式Ia化合物和式Ib化合物是显而易见的。本领域技术人员还应当理解式Ia化合物和式Ib化合物与式I化合物具有相似的药理活性。将这些化合物之一与抗生素类药物联用，通过抑制NDM-1的活性，能够提高抗生素药物的疗效，从而能够治疗由NDM-1引起的耐药细菌感染，具有良好的药物应用前景。

为了清楚和易于理解的目的，通过举例说明和实施例详细地描述了上述发明。可以在附随的权利要求的范围内进行改变和修改，这对本领域的技术人员来说是很明显的。因此，可以理解，上面的说明书旨在用于说明而不是用于限制。因此，本发明的范围不应参考上述说明书来确定，而应当参照下面所附权利要求以及这些权利要求所享有的等同原则所确定的全部范围确定。

Claims

1.式I化合物，

所述化合物的化学名称为(2R)-1-(3-(甲氧基(甲基)氨基-2-甲基)-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸。

2.式Ia化合物，

其化学名称为(2R)-1-((2S)-3-(甲氧基(甲基)氨基)-2-甲基-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸。

3.式Ib化合物，

其化学名称为(2R)-1-((2R)-3-(甲氧基(甲基)氨基)-2-甲基-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸。

4.根据权利要求1所述的式I化合物，其特征在于式I化合物是权利要求2所述的式Ia化合物和权利要求3所述的式Ib化合物的差向异构体混合物。

5.一种制备权利要求1所述的式I化合物的方法，所述方法包括下列步骤：

b.由2-甲基-3-卤代丙酸酯与O,N-二甲基羟胺发生缩合反应生成3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸酯；

c.由3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸酯发生去酯化反应生成3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸；

f.然后发生去酯化反应，生成式I化合物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，包括下列步骤：

b.由2-甲基-3-溴丙酸酯在冰浴条件下与O,N-二甲基羟胺在Et₃N的存在下发生缩合反应生成3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸甲酯；

e.由3-甲氧基(甲基)氨基-2-甲基-丙酸和(2R)-吡咯烷-2-羧酸甲酯在4-甲基吗啡啉、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑的存在下发生缩合反应生成(2R)-1-(3-(甲氧基(甲基)氨基)-2-甲基-丙酰基)吡咯烷-2-羧酸甲酯；以及

7.一种药物组合物，包含权利要求1所述的式I化合物，其中式I化合物是权利要求2所述的式Ia化合物和权利要求3所述的式Ib化合物的差向异构体混合物。

8.一种药物组合物，包含权利要求2或3所述的化合物。

9.权利要求1至3任意一项所述的化合物在制备抑制耐药细菌活性的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，所述细菌是产新德里金属β-内酰胺酶耐药细菌。