CN103134841A - 葡萄糖氧化酶电极及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖氧化酶电极及其制备方法和应用，该葡萄糖氧化酶电极包括导电电极基材；负载在所述导电电极基材上的导电聚合物纳米阵列层，所述导电聚合物纳米阵列层上负载有葡萄糖氧化酶。本发明提供的葡萄糖氧化酶电极的优点在于：(1)具有较大的比表面积，大大提高了葡萄糖氧化酶在电极单位体积导电聚合物上的负载量；(2)具有高度有序的纳米结构，可以降低溶液离子的传输路径，减小电极的内阻，有利于离子在电极材料中的扩散与传输，从而大大提高了传感器的灵敏度、抗干扰性以及响应时间；(3)电极材料利用廉价的导电聚合物基，整个制作过程只有简单的两步电化学反应，其制备工艺简单快捷，且成本低廉。

Description

葡萄糖氧化酶电极及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种葡萄糖氧化酶电极及其制备方法和应用，特别是，涉及一种在电极单位体积导电聚合物上的酶负载量大、灵敏度高、检测范围广、响应时间短、抗干扰性强，且工艺简单、成本低的，具有高度有序的导电聚合物纳米结构的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法和应用。

背景技术

近年来纳米材料领域的兴起与发展为电化学生物传感器的进步带来了新的机遇。由于材料达到纳米尺度而展现出的独特的物理化学性质，纳米材料已经被越来越广泛的应用于新型的高性能，快响应的生物传感器研究的研发当中。

众多纳米材料，例如碳纳米管，石墨烯，金属纳米颗粒以及导电聚合物等已经被用来制造新型的高性能葡萄糖氧化酶电极。其中，聚苯胺作为一种重要的本征导电聚合物，由于其独特的掺杂与脱掺杂性质，多变可控的结构与物理化学性质，良好的生物兼容性，低廉的成本，而受到了越来越多的关注。目前，多种不同形貌的聚苯胺纳米材料，例如纳米球，无序纳米纤维，纳米多孔膜已被应用于新型生物传感器的研究当中，由于这些纳米形貌提高了电极材料的比表面积，促进了离子扩散与电子传递，因此传感性能得到了显著提高。

但是这些生物传感器在电极单位体积导电聚合物上的酶负载量、灵敏度、检测范围、响应时间、抗干扰性等方面有待于进一步改进，为此需要进一步地提高导电聚合物纳米结构的比表面积和提高离子扩散与直接电子传递性能。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种在电极单位体积导电聚合物上的酶负载量高、灵敏度高、检测范围广、响应时间短、抗干扰性强，且工艺简单、成本低的，具有高度有序的导电聚合物纳米结构的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种葡萄糖氧化酶电极，该葡萄糖氧化酶电极包括导电电极基材；负载在所述导电电极基材上的导电聚合物纳米阵列层，所述导电聚合物纳米阵列层上负载有葡萄糖氧化酶。

本发明还提供上述的葡萄糖氧化酶电极的制备方法，该方法包括通过无模板电化学法在导电电极基材上负载导电聚合物纳米线阵列得到导电聚合物纳米阵列电极，然后通过静电吸附在所述导电聚合物纳米阵列电极的导电聚合物纳米线阵列层上固定葡萄糖氧化酶。

本发明还提供上述的葡萄糖氧化酶电极在生物传感器中的应用。

本发明提供的葡萄糖氧化酶电极的优点在于：(1)具有较大的比表面积，大大提高了葡萄糖氧化酶在电极单位体积导电聚合物上的酶负载量；(2)具有高度有序的纳米结构，可以降低溶液离子的传输路径，减小电极的内阻，有利于离子在电极材料中的扩散与传输，从而大大提高了传感器的灵敏度、抗干扰性以及响应时间；(3)电极材料利用廉价的导电聚合物基，整个制作过程只有简单的两步电化学反应，其制备工艺简单快捷，且成本低廉。

附图说明

图1是根据本发明实施例1制备得到的葡萄糖氧化酶电极(电极基材上附着聚苯胺纳米线阵列)的电子显微镜照片(放大4万倍)。

图2是根据本发明实施例1制备得到的葡萄糖氧化酶电极(电极基材上附着聚苯胺纳米线阵列)的电子显微镜照片。(放大6万倍)

图3是根据对比例1制备得到的葡萄糖氧化酶电极(电极基材上附着聚苯胺纳米薄膜)的扫描电子显微镜照片。(放大3万倍)

图4是根据对比例2制备得到的葡萄糖氧化酶电极(电极基材上附着无序聚苯胺纳米线)的扫描电子显微镜照片。(放大5万倍)

图5是根据本发明实施例1制备得到的聚苯胺纳米线阵列葡萄糖氧化酶电极对葡萄糖浓度-电流密度回归曲线。

图6是根据本发明实施例1制备得到的聚苯胺纳米线阵列葡萄糖氧化酶电极和对比例2制备得到的葡萄糖氧化酶电极对不同浓度葡萄糖溶液的时间-电流密度响应曲线。

具体实施方式

根据本发明的葡萄糖氧化酶电极，所述导电聚合物纳米线阵列层的纳米线的直径为40-110nm，纳米线的长度为100-2000nm；优选，由于在传感领域的应用中导电聚合物纳米线直径是越小越好，因此，所述导电聚合物纳米线阵列层的纳米线的直径为40-70nm，纳米线的长度为100-300nm。

根据本发明的葡萄糖氧化酶电极，以每平方厘米的所述导电电极基材为准，所述导电聚合物在导电电极基材上的负载量为0.01-0.05mg；优选，以每平方厘米的所述导电电极基材为准，所述导电聚合物在导电电极基材上的负载量为0.01-0.03mg。

根据本发明的葡萄糖氧化酶电极，所述导电聚合物是指主链上含有交替的单键和双键，从而形成了大的共轭π体系，通过掺杂等手段，能使得电导率在半导体和导体范围内的聚合物，通常指本征导电聚合物。本发明对于所述导电聚合物没有特别的限制，可以是本领域常用的各种导电聚合物，优选，所述导电聚合物选自聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩和聚乙撑二氧噻吩中的一种或多种；更优选，聚苯胺和/或聚吡咯。

根据本发明的葡萄糖氧化酶电极，对于所述导电电极基材没有特别的限制，可以是本领域常用的各种导电电极基材，例如可以为碳基电极基材、导电金属电极基材或半导体电极基材。优选，所述碳基电极基材选自导电碳纤维基材和石墨电极基材中的一种；所述导电金属电极基材选自铂电极基材、镍电极基材、铜电极基材、银电极基材和铅电极基材中的一种；所述半导体电极基材选自镀铂和/或镀金的硅电极基材中的一种。更优选，所述导电电极基材选自石墨电极基材、铂电极基材和镀铂硅电极基材中的一种。

根据本发明的葡萄糖氧化酶电极，负载的葡萄糖氧化酶的量可以在较大范围内变化，优选情况下，为了保证电极的稳定性差以及电极能够具有更好的传感效果，以单位体积的导电聚合物纳米阵列为准，所述葡萄糖氧化酶在所述导电聚合物纳米阵列层上的负载量为10-20μg·cm^-3；更优选为13-20μg·cm^-3。本发明中所说的导电聚合物纳米阵列的单位体积是指导电聚合物纳米阵列层的单位面积乘以纳米阵列层的平均厚度(相当于形成纳米阵列层的纳米线的平均长度)来计算的宏观体积。

根据本发明的葡萄糖氧化酶电极的制备方法，所述无模板电化学法包括：在电流密度为0.01-1mA·cm^-2，通电时间为20分钟-2小时，电解液的温度为20-40℃的条件下，以导电电极基材为工作电极，以铂片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，将含有导电聚合物单体和掺杂剂的电解液进行电解；优选，所述电流密度为0.01-0.5mA·cm^-2，所述通电时间为30分钟-1小时，所述电解液的温度为25-35℃。

根据本发明的葡萄糖氧化酶电极的制备方法，对所述含有导电聚合物单体和掺杂剂的电解液的制备方法没有特别的限制，可以通过本领域常用的方法制备，例如：在掺杂剂的水溶液与一定量的导电聚合物单体混匀；当所述导电聚合物单体为吡咯时，优选还可以将含有所述导电聚合物单体和掺杂剂水溶液的混合物与pH为5.5-7.4的磷酸盐缓冲液混匀，得到所述电解液。所述电解液中导电聚合物单体的浓度可以为0.01-1mol·L^-1；优选为0.1-0.8mol·L^-1。本发明对于电解液中所述掺杂剂的种类没有特别的限制，可以是本领域常用的各种掺杂剂，优选，所述掺杂剂选自硫酸、高氯酸、盐酸、对甲苯磺酸和樟脑磺酸中的一种或多种。所述电解液中掺杂剂的浓度可以为0.02-2mol·L^-1；优选为，0.5-1.5mol·L^-1。

根据本发明的葡萄糖氧化酶电极的制备方法，将葡萄糖氧化酶静电吸附到所述导电聚合物纳米线阵列上的方法包括：将所述导电聚合物纳米阵列电极进行电化学还原，然后再将经过还原的导电聚合物纳米阵列电极在含有葡萄糖氧化酶的电解液中进行电化学氧化。其中，所述电化学还原的方法包括：在电化学还原条件下，在电解液中对所述导电聚合物纳米阵列电极进行还原；所述电化学还原的条件包括：缓冲液的pH值为5.5-7.4，反应温度为20-40℃，还原电位为-0.7V至0V，通电时间为5-20分钟。所述电化学氧化的方法包括：在电化学氧化条件下，在含有葡萄糖氧化酶的电解液中对所述导电聚合物纳米阵列电极进行氧化；所述电化学氧化的条件包括：缓冲液pH值为5.5-7.4，反应温度为20-40℃，氧化电位为0.1V至0.6V，通电时间为5-20分钟。

根据本发明的葡萄糖氧化酶电极的制备方法，对于所述缓冲液的组成没有特别的限制，所述缓冲液可以是本领域常用的缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐可以选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的一种或多种物质与水的混合物，所述水优选为去离子水。对于所述缓冲液中磷酸盐的浓度没有特别的限制，只要满足所述缓冲液的pH值达到5.5-7就可以。由于所述缓冲液及其制备方法是本领域公知的，因此本发明不再赘述。

根据本发明的葡萄糖氧化酶电极的制备方法，所述含有葡萄糖氧化酶的电解液是将上述缓冲液中与一定浓度的葡萄糖氧化酶混合而得到的，所述含有葡萄糖氧化酶的电解液中葡萄糖氧化酶的浓度可以为0.2-10mg/ml；优选为1-5mg/ml。

本发明提供的葡萄糖氧化酶电极可以在在生物传感器中得到应用，例如葡萄糖传感器传感器。

聚苯胺纳米线的直径和长度通过扫描电镜观察得到。

导电聚合物负载量通过计算出电化学恒电流的方法在给定通电时间内所输出的电量与每个聚合物单体分子氧化聚合所需的电子数计算得到导电聚合物的质量，并处以所用电极基材的面子可以得到单位电极基材上所负载的导电聚合物量。

葡萄糖氧化酶负载量的测定方法为负载葡萄糖氧化酶后葡萄糖氧化酶电极的质量减去负载前导电聚合物纳米电极的质量(电极质量的获得方法均为将电极清洗之后冷冻干燥秤量)。

以下结合实施例和对比例详细说明本发明。

实施例1

该实施例用于说明本发明的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法。

1)苯胺单体电解液的制备：向20mL的浓度为1mol·L^-1的HClO₄水溶液中加入苯胺单体(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，得到苯胺单体浓度为0.1mol·L^-1的苯胺单体电解液。

2)导电聚合物纳米阵列电极的制备：在25℃下，以抛光过的铂片(Pt)为工作电极，以Pt片(15×20mm，0.2mm)作为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以上述苯胺单体电解液为电解液，采用恒电流的方法，电流密度为0.01mA·cm^-2，通电0.5小时，在工作电极的表面沉积一层绿色的聚苯胺纳米线阵列(见图1所示的电镜照片)。由电镜图片可以得到，聚苯胺纳米线的直径约40nm、长度约为100nm。聚苯胺的负载量为0.01mg·cm^-2。

3)葡萄糖氧化酶电极的制备：将制备好的聚苯胺纳米阵列电极作为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以pH为7.4的磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和去离子水配置，后面都简称PBS)为电解液，对聚苯胺纳米线阵列进行电化学还原，还原电位为-0.2V，通电时间为15分钟；

以上述所得的聚苯胺纳米线阵列为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以含有2mg/ml的葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)为电解液，对聚苯胺纳米线阵列进行电化学氧化，氧化电位为0.25V，通电时间为15分钟，然后将上述工作电极用去离子水多次冲洗，制得聚苯胺纳米线阵列葡萄糖氧化酶电极，以单位体积的聚苯胺纳米阵列为基准，葡萄糖氧化酶在电极上的负载量为20μg·cm^-3。

图1和图2是根据本发明的实施例1的葡萄糖氧化酶电极的制备方法制备得到的葡萄糖氧化酶电极的扫描电镜照片；从图1和图2中能够看出采用本发明的方法制备得到的葡萄糖氧化酶电极中聚苯胺纳米线在电极基材上整齐排列形成纳米阵列。

实施例2

该实施例用于说明本发明的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法。

1)苯胺单体电解液的制备：向20mL的浓度为0.5mol·L^-1的HClO₄水溶液中加入苯胺单体(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，得到苯胺单体浓度为0.5mol·L^-1的苯胺单体电解液。

2)导电聚合物纳米阵列电极的制备：在30℃下，以抛光过的铂片(Pt)为工作电极，以Pt片(15×20mm，0.2mm)作为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以上述苯胺单体电解液为电解液，采用恒电流的方法，电流密度为0.1mA·cm^-2，通电40分钟，在工作电极的表面沉积一层绿色的聚苯胺纳米线阵列。得到的聚苯胺纳米线阵列的聚苯胺纳米线的直径约50nm、长度约为200nm，聚苯胺的负载量为0.015mg·cm^-2。

3)葡萄糖氧化酶电极的制备：将制备好的聚苯胺纳米阵列电极作为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以pH为5.5的磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和去离子水配置，后面都简称PBS)为电解液，对聚苯胺纳米线阵列进行电化学还原，还原电位为-0.5V，通电时间为10分钟；

以上述所得的聚苯胺纳米线阵列为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以含有5mg/ml的葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH5.5)为电解液，对聚苯胺纳米线阵列进行电化学氧化，氧化电位为0.1V，通电时间为20分钟，然后将上述工作电极用去离子水多次冲洗，制得聚苯胺纳米线阵列葡萄糖氧化酶电极，以单位体积的聚苯胺纳米阵列为基准，葡萄糖氧化酶在电极上的负载量为16μg·cm^-3。

实施例3

该实施例用于说明本发明的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法。

1)苯胺单体电解液的制备：向20mL的浓度为1.5mol·L^-1的HClO₄水溶液中加入苯胺单体(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，得到苯胺单体浓度为0.8mol·L^-1的苯胺单体电解液。

2)导电聚合物纳米阵列电极的制备：在35℃下，以抛光过的铂片(Pt)为工作电极，以Pt片(15×20mm，0.2mm)作为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以上述苯胺单体电解液为电解液，采用恒电流的方法，电流密度为0.5mA·cm^-2，通电60分钟，在工作电极的表面沉积一层绿色的聚苯胺纳米线阵列。得到的聚苯胺纳米线阵列的聚苯胺纳米线的直径约70nm、长度约为300nm，聚苯胺的负载量为0.03mg·cm^-2。

3)葡萄糖氧化酶电极的制备：将制备好的聚苯胺纳米阵列电极为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以pH为6的磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和去离子水配置，后面都简称PBS)为电解液，对聚苯胺纳米线阵列进行电化学还原，还原电位为0V，通电时间为20分钟；

以上述所得的聚苯胺纳米线阵列为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以含有1mg/ml的葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH6)为电解液，对聚苯胺纳米线阵列进行电化学氧化，氧化电位为0.6V，通电时间为10分钟，然后将上述工作电极用去离子水多次冲洗，制得聚苯胺纳米线阵列葡萄糖氧化酶电极，以单位体积的聚苯胺纳米阵列为基准，葡萄糖氧化酶在电极上的负载量为13μg·cm^-3。

实施例4

该实施例用于说明本发明的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法。

将吡咯单体(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)和对甲苯磺酸加入到20mL的pH为6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)中，得到吡咯浓度为0.1mol·L^-1、对甲苯磺酸浓度为0.1mol·L^-1的吡咯单体电解液，其他步骤和条件均与实施例1相同，得到聚吡咯纳米线阵列。得到的聚吡咯纳米线阵列的聚吡咯纳米线的直径约110nm、长度约为500nm，以单位体积的聚吡咯纳米阵列为基准，聚吡咯的负载量为0.05mg·cm^-2；葡萄糖氧化酶在电极上的负载量为10μg·cm^-3。

实施例5

该实施例用于说明本发明的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法。

1)吡咯单体电解液的制备：向20mL的pH为6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)中加入吡咯单体(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)和樟脑磺酸，得到吡咯单体浓度为1mol·L^-1、樟脑磺酸浓度为2mol·L^-1的吡咯单体电解液。

2)导电聚合物纳米阵列电极的制备：在40℃下，以抛光过的铂片(Pt)为工作电极，以Pt片(15×20mm，0.2mm)作为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以上述吡咯单体电解液为电解液，采用恒电流的方法，电流密度为1mA·cm^-2，通电20分钟，在工作电极的表面沉积一层绿色的聚吡咯纳米线阵列。由电镜图片可以得到，聚吡咯纳米线的直径约100nm、长度约为400nm，聚吡咯的负载量为0.035mg·cm^-2。

3)葡萄糖氧化酶电极的制备：将制备好的聚吡咯纳米阵列电极作为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以pH为6.5的磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和去离子水配置，后面都简称PBS)为电解液，对聚吡咯纳米线阵列进行电化学还原，还原电位为-0.4V，通电时间为5分钟；

以上述所得的聚吡咯纳米线阵列为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以含有10mg/ml的葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH6.5)为电解液，对聚吡咯纳米线阵列进行电化学氧化，氧化电位为0.3V，通电时间为5分钟，然后将上述工作电极用去离子水多次冲洗，制得聚吡咯纳米线阵列葡萄糖氧化酶电极，以单位体积的聚吡咯纳米阵列为基准，葡萄糖氧化酶在电极上的负载量为12μg·cm^-3。

实施例6

该实施例用于说明本发明的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法。

1)苯胺单体电解液的制备：向20mL的浓度为0.02molL^-1的HClO₄水溶液中加入苯胺单体(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，得到苯胺单体浓度为0.01mol·L^-1的苯胺单体电解液。

2)导电聚合物纳米阵列电极的制备：在20℃下，以抛光过的铂片(Pt)为工作电极，以Pt片(15×20mm，0.2mm)作为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以上述苯胺单体电解液为电解液，采用恒电流的方法，电流密度为0.8mA·cm^-2，通电2小时，在工作电极的表面沉积一层绿色的聚苯胺纳米线阵列。由电镜图片可以得到，聚苯胺纳米线的直径约110nm、长度约为1000nm，聚苯胺的负载量为0.02mg·cm^-2。

3)葡萄糖氧化酶电极的制备：将制备好的聚苯胺纳米阵列电极为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以pH为7的磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和去离子水配置，后面都简称PBS)为电解液，对聚苯胺纳米线阵列进行电化学还原，还原电位为-0.7V，通电时间为5分钟；

以上述所得的聚苯胺纳米线阵列为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以含有0.2mg/ml的葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7)为电解液，对聚苯胺纳米线阵列进行电化学氧化，氧化电位为0.5V，通电时间为5分钟，然后将上述工作电极用去离子水多次冲洗，制得聚苯胺纳米线阵列葡萄糖氧化酶电极，以单位体积的聚吡咯纳米阵列为基准，葡萄糖氧化酶在电极上的负载量为10μg·cm^-3。

对比例1

该对比例用于说明现有技术的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法。

1)苯胺单体电解液的制备：向20mL的浓度为lmol·L^-1的HClO₄水溶液中加入苯胺单体(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，得到苯胺单体浓度为0.02molL^-1的苯胺单体电解液。

2)导电聚合物纳米阵列电极的制备：在20℃下，以抛光过的铂片(Pt)为工作电极，以Pt片(15×20mm，0.2mm)作为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以上述苯胺单体溶液为电解液，采用脉冲恒电流的方法，电流密度为0.2mA·cm^-2，电流通断时间分别为2秒，总时间1小时，在工作电极的表面沉积一层绿色的聚苯胺纳米结构薄膜，聚苯胺纳米薄膜的厚度为900nm，聚苯胺的负载量为0.12mg·cm^-2。

葡萄糖氧化酶电极的制备：将制备好的聚苯胺电极作为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以pH为7的磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和去离子水配置，后面都简称PBS)为电解液，对聚苯胺进行电化学还原，还原电位为-0.5V，通电时间为5分钟；

以上述所得的聚苯胺为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以含有15mg/ml的葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7)为电解液，对聚苯胺进行电化学氧化，氧化电位为0.5V，通电时间为5分钟，然后将上述工作电极用去离子水多次冲洗，制得聚苯胺多孔膜葡萄糖氧化酶电极，葡萄糖氧化酶在电极上的负载量为0.5μg·cm^-3。

图3是根据对比例1的现有技术的方法制备得到的聚苯胺薄膜的葡萄糖氧化酶电极的电镜扫描照片。从图3中能够看出采用现有技术的方法只能够得到聚苯胺薄膜。

对比例2

该对比例用于说明现有技术的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法。

1)苯胺单体电解液的制备：向20mL的浓度为lmol·L^-1的HClO₄水溶液中加入苯胺单体(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，得到苯胺单体浓度为0.02mol·L^-1的苯胺电解液。

2)导电聚合物纳米阵列电极的制备：在20℃下，以抛光过的铂片(Pt)为工作电极，以Pt片(15×20mm，0.2mm)作为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以上述苯胺单体溶液为电解液，采用恒电位的方法，工作电位0.7V，通电时间1小时，在工作电极的表面沉积一层绿色的聚苯胺无序纳米线形成的薄膜，聚苯胺无序纳米线的直径约160nm、长度约为1.5μm；聚苯胺的负载量为0.18mg/cm²。

葡萄糖氧化酶电极的制备：将制备好的聚苯胺电极为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以pH为7的磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和去离子水配置，后面都简称PBS)为电解液，对聚苯胺进行电化学还原，还原电位为-0.5V，通电时间为5分钟；

将上述所得的聚苯胺为工作电极，以Pt片为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以含有15mg/ml的葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7)为电解液，对聚苯胺进行电化学氧化，氧化电位为0.5V，通电时间为5分钟，然后将上述工作电极用去离子水多次冲洗，制得聚苯胺无序纳米线葡萄糖氧化酶电极，葡萄糖氧化酶在电极上的负载量为2μg·cm^-3。

图4是根据对比例2的现有技术的方法制备得到的聚苯胺无序纳米线的葡萄糖氧化酶电极的扫描电镜照片。从图4中能够看出采用现有技术的方法只能够得到的纳米线排列杂乱、无序。

试验实施例

灵敏度试验

本试验实施例用于说明实施例和对比例的葡萄糖氧化酶电极的灵敏度，在本文中术语“灵敏度”是指能够检测的最低葡萄糖浓度，又称为检测限。

将实施例1-6和对比例1-2所得葡萄糖氧化酶电极进行通过对低浓度的葡萄糖溶液的电化学时间电流法测定各自的检出限以比较各自对葡萄糖的灵敏度。具体测定方法是在由葡萄糖氧化酶电极，铂电极，饱和甘汞电极组成的三电极体系中，以pH5.5的PBS缓冲液为电解液，在相同的通电的条件下当电流趋于平稳时，向电解液体系中加入低浓度的葡萄糖溶液，当电流出现变化，且电流变化值大于电流基线的波动值3倍，即信噪比大于3时，可认为酶电极对该浓度的葡萄糖有响应，依次检测不同浓度的葡萄糖，可以得到有响应的最低葡萄糖浓度，便为最低检测限，结果在表1中示出。

回归试验

测定实施例1-6和对比例1-2所得葡萄糖氧化酶电极分别在浓度为0.1-10mmol/ml的葡萄糖溶液中响应的电流密度，在由葡萄糖氧化酶电极，铂电极，饱和甘汞电极组成的三电极体系中，以pH为5.5的PBS缓冲液为电解液，在通电的条件下，采用恒电位的电化学方法，观察各个电极对不同浓度葡萄糖溶液响应的电流变化，并利用OriginPro 7.0软件拟合其回归方程(纵坐标为相应电流密度μA·cm^-2；横坐标为葡萄糖浓度，mmol/L)及其线性相关系数和标准差，结果在表1中示出，图5是实施例1制备得到的聚苯胺纳米线阵列葡萄糖氧化酶电极对葡萄糖浓度-电流密度回归曲线。

响应时间测试

利用实施例1-6和对比例1-2所得葡萄糖氧化酶电极，在25℃，pH5.5的PBS缓冲液中，采用时间电流法，-0.35V的工作电位下通电，记录从葡萄糖溶液加入时间算起到电流变化达到峰值又逐渐落回稳态的时间间隔，即为响应时间结果如表1所示，图6是实施例1制备得到的聚苯胺纳米线阵列葡萄糖氧化酶电极和对比例2制备得到的葡萄糖氧化酶电极对不同浓度葡萄糖溶液的时间-电流密度响应曲线。

抗干扰性测试

人体血液中除了含有糖以外，还含有尿酸、血红蛋白、氯离子、维生素C(抗坏血酸)等成分，其中，尿酸和抗坏血酸对葡萄糖的测定影响最大，因此，本试验例中至针对尿酸和抗坏血酸来评价实施例1-6和对比例1-2所得葡萄糖氧化酶电极分别对测定结果的影响。

具体测定方法为：在由葡萄糖氧化酶电极，铂电极，饱和甘汞电极组成的三电极体系中，以pH5.5的PBS缓冲液为电解液，在-0.4V的工作电位下通电，当电流趋于平稳时，向电解液体系中加入略低于正常生理浓度的葡萄糖溶液(2mM)，然后等待电流响应，记录稳态电流值，当电流再次趋于平稳一段时间之后，再加入略正常生理水平的抗坏血酸(0.5mM)，然后等待电流响应，记录稳态电流值，以同样的方法，再加入尿酸，记录其稳态电流值。

抗干扰性通过将测定的不同葡萄糖氧化酶电极对生理水平的干扰物质的电流响应与对生理水平的葡萄糖浓度的电流响应的比值来量化表示，比值越小说明抗干扰性越好，结果在表1中示出。

表1

根据上表1的结果可以看出，本发明的葡萄糖氧化酶电极的葡萄糖溶液的检出限可以达到0.01-0.1mmol/mL，而对比例仅为0.2-1mmol/mL，由此说明，本发明的葡萄糖氧化酶电极具有更高的灵敏度；线性范围指的是本发明的葡萄糖氧化酶电极对葡萄糖溶液的浓度的有效测定范围，由表1可知，本发明的有效测定范围明显大于对比例，且标准差均小于11％，说明采用本发明的葡萄糖氧化酶电极进行测定的重复性更好，实施例的线性关系系数均大于对比例，说明本发明的葡萄糖氧化酶电极测定精密度高；本发明实施例对于抗坏血酸和尿酸的信号比均明显小于对比例的信号比，由此说明本发明的葡萄糖氧化酶电极对抗干扰物质的抗干扰性更强。

Claims (17)

1.一种葡萄糖氧化酶电极，其特征在于，该葡萄糖氧化酶电极包括导电电极基材；负载在所述导电电极基材上的导电聚合物纳米阵列层，所述导电聚合物纳米阵列层上负载有葡萄糖氧化酶。

2.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶电极，其中，所述导电聚合物纳米线阵列层的纳米线的直径为40-110nm，纳米线的长度为100-2000nm。

3.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶电极，其中，所述导电聚合物纳米线阵列层的纳米线的直径为40-70nm，纳米线的长度为100-300nm。

4.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶电极，其中，以每平方厘米的所述导电电极基材为准，所述导电聚合物在导电电极基材上的负载量为0.005-0.05mg。

5.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶电极，其中，所述导电聚合物选自聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩和聚乙撑二氧噻吩中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶电极，其中，所述导电电极基材选自碳基电极基材、导电金属电极基材或半导体电极基材。

7.根据权利要求6所述的葡萄糖氧化酶电极，其中，所述碳基电极基材选自导电碳纤维基材和石墨电极基材中的一种；所述导电金属电极基材选自铂电极基材、镍电极基材、铜电极基材、银电极基材和铅电极基材中的一种；所述半导体电极基材选自镀铂和/或镀金的硅电极基材中的一种。

8.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶电极，其中，以单位体积的导电聚合物纳米阵列为准，所述葡萄糖氧化酶在所述导电聚合物纳米阵列层上的负载量为10-20μg·cm^-3。

9.一种权利要求1-8中的任意一项所述的葡萄糖氧化酶电极的制备方法，其特征在于，该方法包括通过无模板电化学法在导电电极基材上负载导电聚合物纳米线阵列得到导电聚合物纳米阵列电极，然后通过静电吸附在所述导电聚合物纳米阵列电极的导电聚合物纳米线阵列层上固定葡萄糖氧化酶。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述无模板电化学法包括：在电流密度为0.01-1mA·cm^-2，通电时间为20分钟-2小时，电解液的温度为20-40℃的条件下，以导电电极基材为工作电极，以铂片为对电极，以甘汞电极为参比电极，将含有导电聚合物单体和掺杂剂的电解液进行电解。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述电解液中导电聚合物单体的浓度为0.01-1mol·L^-1。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述掺杂剂选自硫酸、高氯酸、盐酸、对甲苯磺酸和樟脑磺酸中的一种或多种。

13.根据权利要求10或12所述的方法，其中，所述电解液中所述掺杂剂的浓度为0.02-2mol·L^-1。

14.根据权利要求9所述的方法，其中，将葡萄糖氧化酶静电吸附到所述导电聚合物纳米线阵列上的方法包括：将所述导电聚合物纳米阵列电极进行电化学还原，然后再将经过还原的导电聚合物纳米阵列电极在含有葡萄糖氧化酶的电解液中进行电化学氧化。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述电化学还原的条件包括：缓冲液pH值为5.5-7.4，反应温度为20-40℃，还原电位为-0.7V至0V，通电时间为5-20分钟；所述电化学氧化的条件包括：缓冲液pH值为5.5-7.4，反应温度为20-40℃，氧化电位为0.1V至0.6V，通电时间为5-20分钟。

16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述含有葡萄糖氧化酶的电解液中，葡萄糖氧化酶的浓度为0.2-10mg/ml。

17.权利要求1-8中任意一项所述的葡萄糖氧化酶电极在生物传感器中的应用。

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