CN103088433A

CN103088433A - 全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN103088433A
Application number: CN2011103423517A
Authority: CN
Inventors: 高飞; 王君文; 夏渝东; 王俊
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Tianjin Huada Medical Laboratory Co Ltd
Priority date: 2011-11-02
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-11-02
Also published as: WO2013064066A1; CN103088433B

Abstract

提供了全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用。构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法包括：用Msp I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切；将DNA片段进行末端修复；在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A；将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连；将具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，以便获得目的片段；将目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；将经过转换的目的片段进行PCR扩增；分离纯化扩增产物，该扩增产物构成全基因组甲基化高通量测序文库。采用本发明的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法及其应用，能够方便有效地构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库。

Description

全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地，涉及全基因组甲基化检测技术，特别是微量DNA全基因组甲基化检测技术领域。更具体地，本发明提供了一种构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法、一种确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法、一种用于确定基因组DNA样品的甲基化位点的装置、一组分离的限制性内切酶以及一种用于构建全基因组甲基化高通量测序文库的试剂盒。

背景技术

DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，DNA甲基化在维持正常细胞功能、抑制寄生DNA成分对基因组完整性的损害、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。

然而，目前对全基因组DNA甲基化的研究仍有待改进。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现完成的：

减少的代表性重亚硫酸盐测序(RRBS)(参见Smith ZD等人，2009.在哺乳动物基因组中高通量重亚硫酸盐测序(High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes)Methods.48：226-232.，通过参照将其全文并入本文)，是目前常用的全基因组甲基化检测方法，其可以检测人类和鼠基因组中大部分的CpG岛和启动子区域。然而，越来越多的研究显示差异甲基化区域(DMRs)如组织特异性差异甲基化区域(T-DMR)和癌症中的差异甲基化区域(C-DMR)并非仅仅位于CpG岛内，更多的甲基化差异区域位于CpG岛外，如CpG岛外(CGIshores)来调控基因的表达，而这些区域是现有RRBS技术不足以检测到的。另一方面，现有RRBS技术对岛内CG数量的覆盖度低。

本发明旨在解决现有技术问题的至少之一。由此，为了检测基因组中更多具有代表性区域的甲基化状态并更真实的反应这些区域的甲基化水平，本发明提供了全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：用Msp I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，以便获得DNA片段，其中，所述第二限制性内切酶为选自BstN I、HpyCH4V、Alu I、Hae III、HpyCH4 II、Apek I、Ban II、TaqαI、Sph I、Bgl II、BssS I、BamH I和Kpn I的至少一种；将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，以便获得具有甲基化接头的连接产物；将所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，以便获得目的片段；将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，获得经过转换的目的片段；将所述经过转换的目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；以及分离纯化所述扩增产物，所述扩增产物构成全基因组甲基化高通量测序文库。

利用根据本发明实施例的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，能够有效地构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，特别是能够有效地构建微量样本的全基因组甲基化高通量测序文库，从而能够有效、充分地应用于高通量测序技术，通过对文库的测序，然后基于对测序结果的数据分析，就能够有效地获得全基因组甲基化位点信息，实现对基因组DNA样品的全基因组甲基化检测。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤：根据前面所述构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库；对该全基因组甲基化高通量测序文库进行测序，以便得到测序结果；以及对测序结果进行数据分析，以便确定基因组DNA样品的甲基化位点。利用根据本发明实施例的确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法，能够准确地确定基因组DNA样品的甲基化位点，从而实现对基因组DNA样品的全基因组甲基化检测，相对于目前的RRBS技术，本发明的确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法，对全基因组的调控区域的覆盖广度得到显著提高，对调控区域内CpG位点的覆盖量显著增加。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于确定基因组DNA样品的甲基化位点的装置。根据本发明的实施例，该装置包括：文库制备单元，所述文库制备单元用于制备基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，所述文库制备单元内设置有Msp I酶以及第二限制性内切酶，其中，所述第二限制性内切酶为选自BstN I、HpyCH4 V、Alu I、Hae III、HpyCH4 II、Apek I、Ban II、TaqαI、Sph I、Bgl II、BssS I、BamH I和Kpn I的至少一种；测序单元，所述测序单元与所述文库制备单元相连，并且从所述文库制备单元接收所述基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，以便用于对所述基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库进行测序，获得测序结果；以及数据分析单元，所述数据分析单元与所述测序单元相连，并且从所述测序单元接收所述测序结果，以便对所述测序结果进行数据分析，确定所述基因组DNA样品的甲基化位点。利用根据本发明实施例的用于确定基因组DNA样品的甲基化位点的装置，能够方便准确地确定基因组DNA样品的甲基化位点，可以应用于多种针对全基因组甲基化的研究，例如可以用于对人的肿瘤基因抑制基因的甲基化异常的检测，以便为人类疾病的早期诊断提供有效的途径。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一组分离的限制性内切酶。根据本发明的实施例，其由Msp I酶以及第二限制性内切酶构成，其中，所述第二限制性内切酶为选自BstN I、HpyCH4 V、Alu I、Hae III、HpyCH4 II、Apek I、Ban II、TaqαI、Sph I、Bgl II、BssS I、BamHI和Kpn I的至少一种。根据本发明实施例的Msp I酶和第二限制性内切酶构成的组合，能够有效地对基因组DNA进行酶切，且酶切获得的DNA片段非常适用于本发明的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于构建全基因组甲基化高通量测序文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：Msp I酶，以及第二限制性内切酶，其中，所述第二限制性内切酶为选自BstN I、HpyCH4 V、Alu I、Hae III、HpyCH4 II、Apek I、BanII、TaqαI、Sph I、Bgl II、BssS I、BamH I和Kpn I的至少一种。利用根据本发明实施例的用于构建全基因组甲基化高通量测序文库的试剂盒，能够方便有效地构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1：显示了根据本发明一个实施例的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法的流程示意图；

图2：显示了根据本发明一个实施例的针对不同长度目的片段所构建全基因组甲基化高通量测序文库的安捷伦2100检测结果。

A：显示了根据本发明一个实施例的目的片段长度为160bp以上，且小于240bp的全基因组甲基化高通量测序文库的安捷伦2100检测结果。

B：显示了根据本发明一个实施例的目的片段长度为240bp以上，且小于340bp的全基因组甲基化高通量测序文库的安捷伦2100检测结果。

C：显示了根据本发明一个实施例的目的片段长度为340bp以上，且420bp以下的全基因组甲基化高通量测序文库的安捷伦2100检测结果。

D：显示了根据本发明一个实施例的目的片段长度为160bp-420bp的全基因组甲基化高通量测序文库的安捷伦2100检测结果。

图3：显示了根据本发明一个实施例的用于确定基因组DNA样品的甲基化位点的装置的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法。参考图1，根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：用Msp I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，以便获得DNA片段；将DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，以便获得具有甲基化接头的连接产物；将具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，以便获得目的片段；将目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，获得经过转换的目的片段；将经过转换的目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；以及分离纯化扩增产物，所得到的扩增产物构成全基因组甲基化高通量测序文库。

在本发明中所使用的术语“DNA”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA。本领域的技术人员可以理解，基因组DNA的来源不受特别限制，可以从任何可能的途径获得，可以是通过市售直接获得，也可以是从其他实验室直接获取，还可以是直接从样本中提取。根据本发明的实施例，可以从样本中提取获得基因组DNA。根据本发明的一个实施例，构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法可以进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤。根据本发明的一些具体示例，样本可以来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种。根据本发明的一些实施例，哺乳动物可以为人和小鼠的至少一种。根据本发明的一个实施例，基因组DNA可以为人类全血基因组DNA。发明人发现，当采用人类全血基因组DNA构建全基因组甲基化高通量测序文库时，从样本中提取基因组DNA的操作方便易行，且获得的DNA质量好、甲基化信息完整，由其构建的文库能够方便地应用于高通量测序技术，从而基于对测序结果的数据分析就能方便有效地获得样本的全基因组甲基化信息。根据本发明的实施例，基因组DNA的量不受特别限制，根据本发明的具体示例，优选基因组DNA的量为150-200ng，更优选为100ng。发明人惊奇地发现，当基因组DNA的量为100ng时，根据本发明实施例的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法构建的文库，能够非常方便地应用于高通量测序技术，如Solexa测序技术，且文库测序结果准确，可重复性好，包含甲基化信息完整、CpG位点覆盖多。

另外，需要说明的是，根据本发明实施例的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法中用Msp I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切的步骤，是本申请的发明人经过艰苦的研究和创造性劳动而意外获得的。在本文中所使用的术语“第二限制性内切酶”的含义是指与Msp I不同的限制性内切酶。根据本发明的实施例，可以采用的第二限制性内切酶的含义为选自BstN I、HpyCH4 V、Alu I、Hae III、HpyCH4 II、Apek I、Ban II、TaqαI、Sph I、Bgl II、BssS I、BamH I和Kpn I的至少一种。根据本发明的具体示例，优选采用ApeK I作为第二限制性内切酶。这些限制性内切酶均为已知的，并且其最佳酶切条件以及识别位点也都是已知的。例如，限制性内切酶Msp I和ApeK I的识别位点分别为CCGG和GCWGC(其中W表示碱基A或T)。发明人发现，当采用Msp I和上述第二限制性内切酶组合对基因组DNA进行酶切时，酶切所得的DNA片段对基因组调控区域的覆盖情况非常好，具体地，Msp I和ApeK I结合酶切与RRBS技术中的Msp I单酶切相比，理论上可检测到CpG岛内的CpG位点数由不足50％提高到近70％。发明人发现，通过Msp I和上述第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，然后进行全基因甲基化高通量测序文库构建以及后续的全基因组甲基化位点的确定，能够实现对甲基化区域的有效检测，尤其是现有RRBS技术无法检测到的区域例如大于70％的组织特异性差异的甲基化区域(T-DMR)和癌症中的差异甲基化区域(C-DMR)，由此检测范围得到显著扩大并且可覆盖更多的CpG位点，具有广阔的应用前景。

根据本发明的实施例，使用Msp I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切时，限制性内切酶对基因组DNA进行处理的先后顺序不受特别限制，可以依次进行，也可以同时进行。以Msp I和ApeK I的组合为例，根据本发明的具体示例，可以首先使用Msp I进行酶切处理，然后再使用ApeK I进行酶切处理。发明人惊奇地发现，当采用这种酶切顺序进行酶切处理时，能够有效地对基因组DNA进行酶切处理，并且在完成Msp I对基因组DNA的酶切处理后，不需要纯化酶切产物，只需要对限制性内切酶进行失活处理，即可以添加ApeKI，进行酶切。

根据本发明的一个实施例，在使用Msp I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切时，可以添加对照样品，以验证方法的有效性。根据本发明的实施例，对照样品可以为序列已知且与样品基因组DNA来源不同的任何DNA。具体地，优选采用λ-DNA，因为λ-DNA的序列信息已知，且其核苷酸序列中不存在甲基化位点。由此，能够更加精确地评估文库构建过程重亚硫酸盐的转换效率，以便提高检测样本的应用范围和检测可信度。具体地，根据以Msp I和Apek I的组合为例，本发明的一个实施例，发明人利用Msp I和Apek I酶切lambda基因组DNA(λ-DNA)，选取同样大小范围的片段(40-300bp)与人类基因组hg19比对，结果显示所有选取范围内的λ-DNA片段均不会比回到人类基因组上。进一步，发明人使用100ng的成熟树突状细胞(mDC)基因组，同时混入50pg完整的λ-DNA共同酶切建库，计算证明建库过程重亚硫酸盐转换率约为99％，确定了其作为参照评估重亚硫酸盐转换效率的精确性。目前已知干细胞等相关细胞中存在大量非CpG位点上的甲基化修饰，因此，不能按照基因组本身单个C碱基(非CG二核苷酸处的C碱基)的甲基化状态来计算重亚硫酸盐处理的转换率。根据本发明的实施例，发明人通过将未甲基化的λ-DNA引入建库和测序过程，可更加精确的评估不同实验样本的检测准确性，为实验数据可信性的判定提供了重要依据。此外，根据本发明的实施例，与基因组DNA混合的λ-DNA的量不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，可以添加极微量的λ-DNA与基因组DNA混合，本领域的技术人员可以理解，这里所使用的术语“极微量”是相对而言，是指与基因组DNA的量相比，混合的λ-DNA的量非常少，不会干扰基因组DNA的酶切及其后续的建库过程。基因组DNA和λ-DNA的添加量可以不是一个数量级，例如100ng基因组DNA中，可以混合30-100pg的λ-DNA。发明人发现，皮克级的未甲基化λ-DNA的混合，就能够实现其参照作用，即能够精确地评估文库构建过程中重亚硫酸盐的转换效率。根据本发明的具体示例，优选地，100ng基因组DNA中混合50pg的λ-DNA，由此既能精确评估重亚硫酸盐的转换效率，还能有效地构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，且该文库能有效地用于后续的全基因族甲基化检测中，检测到的甲基化区域广、CpG为点多。

根据本发明的一个实施例，在将DNA片段进行末端修复前，可以进一步包括纯化DNA片段的步骤，由此，使得后续的末端修复易于进行。根据本发明的实施例，将DNA片段进行末端修复可以利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行，其中，所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’聚合酶活性，但缺少5’→3’外切酶活性。由此，能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。

根据本发明的一个实施例，可以利用Klenow(3’-5’exo-)，即具有3’→5’外切酶活性的Klenow，在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A。由此，能够方便准确地将碱基A添加到经过末端修复的DNA片段的3’末端。

本发明中所使用的术语“甲基化接头”是指这样的一种接头，在其核苷酸序列中，所有C位点均被甲基化修饰。根据本发明的一个实施例，在将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连前，可以进一步包括对常规测序所使用的接头进行甲基化的步骤。由此，能够避免测序接头对后续重亚硫酸盐处理等操作的干扰。本领域的技术人员可以理解，对接头进行甲基化的方法不受特别限制，可以利用本领域已知的任何方法对测序接头进行甲基化。

根据本发明的一些实施例，甲基化接头中还可以进一步包含标签，由此可以方便地同时构建多种基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，并能够有效地应用于高通量测序平台，从而在对测序结果进行数据分析后，基于标签的序列信息，就能够准确地区分多种基因组DNA样品的文库的序列信息以及全基因组甲基化位点的信息，由此，能够充分地利用高通量测序平台，且能够节省时间、降低成本。

根据本发明的一个实施例，将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连是利用T4 DNA连接酶进行的，由此可以方便地获得具有甲基化接头的连接产物。

根据本发明的实施例，将具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，是通过2％的琼脂糖凝胶电泳进行的。根据本发明的实施例，通过2％的琼脂糖凝胶电泳对具有甲基化接头的连接产物进行片段选择后，还可以对获得的目的片段进行纯化回收，以便使后续的实验易于进行。根据本发明的一些具体示例，将具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，获得的目的片段的长度为160-420bp。根据本发明的一个实施例，目的片段的长度可以为160以上，且小于240bp。根据本发明的另一个实施例，目的片段的长度可以为240以上，且小于340bp。根据本发明的又一个实施例，目的片段的长度可以为340以上，且420bp以下。发明人发现，当目的片段的长度为160-420bp时，构建的样品的全基因组甲基化高通量测序文库，能够方便有效地应用于高通量测序平台如Solexa测序平台，且可重复性好，测序结果真实可靠，包含基因组甲基化信息完整、CpG位点覆盖多。

根据本发明的一些具体示例，在将目的片段进行重亚硫酸盐处理之前，可以将目的片段与片段化的λ-DNA混合。发明人发现，通过添加外源DNA(λ-DNA)，即将目的片段与外源DNA混合，然后进行重亚硫酸盐高效共处理，对目标DNA片段能够起到保护作用，最大限度地降低重亚硫酸盐对微量DNA的破坏，可以进一步提高检测精度，使得纳克级，例如50-150ng基因组整体水平高精度的甲基化检测成为现实。根据本发明的实施例，片段化的λ-DNA的添加量不受特别限制，根据具体的示例，优选片段化的λ-DNA的量为100-500ng，更优选为200ng。本领域技术人员能够理解，可以通过本领域已知的任意方法制备这些片段化的λ-DNA，例如可以随同前面的DNA片段化处理一起进行制备。

此外，将目的片段进行重亚硫酸盐处理，可以通过本领域已知的任何方法进行，根据本发明的具体示例，可以采用商品化的试剂盒进行，优选地采用EZ DNA Methylation-GoldKitTM(ZYMO)进行。发明人惊奇地发现，采用EZ DNA Methylation-Gold KitTM(ZYMO)对目的片段进行重亚硫酸盐处理时，方便快捷，且处理效果好，目的片段中非甲基化的胞嘧啶能够高效准确地转换为尿嘧啶，并且利于后续处理。

根据本发明的实施例，可以使用热启动taq DNA聚合酶对经过转换的目的片段进行PCR扩增。根据本发明的实施例，热启动taq DNA聚合酶的种类不受特别限制，根据本发明的具体示例，热启动taq DNA聚合酶可以为r-taq聚合酶，由此PCR扩增效率高、用时少。根据本发明的实施例，可以基于目的片段的长度，确定PCR扩增的循环数。具体地，当目的片段的长度为160bp以上，且小于240bp时，PCR扩增的循环数可以为11；当目的片段的长度为240bp以上，且小于340bp时，PCR扩增的循环数可以为13；以及当目的片段的长度为340bp以上，且420bp以下时，PCR扩增的循环数可以为15。发明人惊奇地发现，当采用上述方法确定PCR扩增的循环数时，PCR扩增效率高、用时少，扩增效果都非常好。在为对目的片段长度进行细分的情况下，如果目的片段的长度在160-420bp的范围内，PCR扩增的循环数可以为13，发明人发现仍然可以实现较好的扩增效果。

根据本发明的实施例，分离纯化扩增产物的方法不受特别限制，根据本发明的具体示例，可以通过选自磁珠纯化、纯化柱纯化和2％的琼脂糖凝胶电泳的至少一种进行，优选通过2％的琼脂糖凝胶电泳进行。

确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法和装置

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤：根据本发明实施例的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库；对该全基因组甲基化高通量测序文库进行测序，以便得到测序结果；以及对测序结果进行数据分析，以便确定基因组DNA样品的甲基化位点。

根据本发明的一些实施例，测序是利用高通量测序技术进行的。本领域的技术人员可以理解，可以通过本领域已知的任何高通量测序技术进行测序，根据本发明的具体示例，优选地采用Solexa测序平台进行测序。发明人发现，采用Solexa测序平台对基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库进行测序，能够有效地获得测序结果，且测序用时少、效率高、测序结果准确，可重复性好。

利用根据本发明实施例的确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法，能够有效地构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，并且能够通过高通量测序技术如Solexa测序技术实现对文库的准确测序，基于对测序结果的数据分析，就能够准确地确定基因组DNA样品的甲基化位点，从而实现对基因组DNA样品的全基因组甲基化检测，相对于目前的RRBS技术，根据本发明实施例的确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法，全基因组的调控区域的覆盖广度得到显著提高，使得调控区域内CpG位点的覆盖量显著增加。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于确定基因组DNA样品的甲基化位点的装置1000。参考图3，根据本发明的一个实施例，该装置包括：文库制备单元100、测序单元200以及数据分析单元300。

根据本发明的实施例，文库制备单元100用于制备基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，其中，文库制备单元100内设置有限制性内切酶Msp I和第二限制性内切酶。根据本发明的实施例第二限制性内切酶为选自BstN I、HpyCH4 V、Alu I、Hae III、HpyCH4II、Apek I、Ban II、TaqαI、Sph I、Bgl II、BssS I、BamH I和Kpn I的至少一种，优选所述第二限制性内切酶为Apek I。关于第二限制性内切酶，在前面已经进行了详细描述，不再赘述。由此，文库制备单元100可以适于实施前面所述的全基因组甲基化高通量测序文库构建方法。

测序单元200与文库制备单元100相连，可以从文库制备单元100接收所制备的全基因组甲基化高通量测序文库，并对所接收的全基因组甲基化高通量测序文库进行测序，从而可以获得测序结果。

数据分析单元300与测序单元200相连，可以从测序单元200接收所获得的测序结果，并且能够进一步对测序结果进行数据分析，从而基于分析结果确定基因组DNA样品的甲基化位点，最终实现对基因组DNA样品的全基因组甲基化检测。本领域技术人员能够理解的是，可以采用本领域中已知的任何适于进行上述操作的装置作为上述各个单元的组成部件。在本文中所使用的术语“相连”应作广义理解，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

利用根据本发明实施例的用于确定基因组DNA样品的甲基化位点的装置，能够方便准确地确定基因组DNA样品的甲基化位点，从而可以应用于多种针对全基因组甲基化的研究，例如可以用于对人的肿瘤基因抑制基因的甲基化异常的检测，以便为人类疾病的早期诊断提供有效的途径。

试剂盒

根据本发明的又一方面，本发明提供了一组分离的限制性内切酶。根据本发明的实施例，其由Msp I酶以及第二限制性内切酶构成。根据本发明的实施例，第二限制性内切酶为选自BstN I、HpyCH4 V、Alu I、Hae III、HpyCH4 II、Apek I、Ban II、TaqαI、Sph I、Bgl II、BssSI、BamH I和Kpn I的至少一种，优选所述第二限制性内切酶为Apek I。关于第二限制性内切酶，在前面已经进行了详细描述，不再赘述。根据本发明实施例的Msp I酶和第二限制性内切酶酶构成的酶切组合，能够有效地对基因组DNA进行酶切，且酶切获得的DNA片段非常适用于本发明的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法。该组分离的限制性内切酶的用途及效果，前面已经详细描述，在此不再赘述。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于构建全基因组甲基化高通量测序文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：Msp I酶，以及第二限制性内切酶。根据本发明的实施例，第二限制性内切酶为选自BstN I、HpyCH4 V、Alu I、Hae III、HpyCH4 II、Apek I、Ban II、TaqαI、Sph I、Bgl II、BssS I、BamH I和Kpn I的至少一种，优选所述第二限制性内切酶为Apek I。关于第二限制性内切酶，在前面已经进行了详细描述，不再赘述。本领域的技术人员可以理解，试剂盒中还可以进一步包括构建全基因组甲基化高通量测序文库所需的任何其他组分，在此不再赘述。利用根据本发明实施例的用于构建全基因组甲基化高通量测序文库的试剂盒，能够方便有效地构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库。

需要说明的是，根据本发明实施例的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法及其应用，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作完成的。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

一、实验流程

1.使用Msp I和ApeK I酶切基因组DNA：

1.1Msp I酶切：采用Msp I对100ng人源mDC细胞系全基因组DNA样品(mDC，成熟树突状细胞)进行酶切：

1)在1.5ml的离心管中配制Msp I酶切反应体系：

反应体系在37℃水浴中反应7h。反应完成后，将酶切反应体系置于80℃下20min，使限制性内切酶Msp I失活。

1.2ApeK I酶切：

1)在限制性内切酶失活的Msp I酶切反应体系中，直接加入5μL ApeK I(NEB)(4,000单位/ml)

2)将反应体系在75℃水浴进行酶切反应过夜(16-19h)。

3)向反应体系中加入1μL EDTA(1mM)，使限制性内切酶ApeK I失活。

4)用MiniElute PCR纯化试剂盒(Qiagen)回收反应体系中的DNA，用离心纯化柱进行纯化，溶于42μL EB中。

2.末端修复：

1)将上一步得到的DNA按下表在1.5ml的离心管中配制末端修复反应体系：

2)将上述反应体系置于20℃的Thermomixer(Eppendrf)上，进行反应30min。反应完后用MiniElute PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，最后将纯化的产物溶于34μl Elution缓冲液(EB)。

3.末端添加碱基A：

1)将上一步得到的DNA按下表在1.5ml的离心管中配制末端添加碱基A的反应体系：

2)将上述反应体系置于37℃的Thermomixer(Eppendrf)，进行反应30min。反应完后用MiniElute PCR纯化试剂盒Qiagen)进行纯化，最后将纯化的产物溶于12μL Elution缓冲液(EB)。

4.连接甲基化标签接头：

1)将上一步得到的DNA按下表配制连接甲基化标签接头的反应体系：

其中甲基化标签接头序列为：

接头1：5’Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

接头2：5’TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

接头1和接头2中的碱基C均经过甲基化修饰

2)将上述反应体系置于20℃的Thermomixer(Eppendrf)上反应15min。

5.片段选择

1)将上一步得到的样品进行2％琼脂糖电泳并进行且较回收，电泳条件为：100V，2h。

2)片段选择大小及范围：160bp以上，且小于240bp；240bp以上，且小于340bp；340bp以上，且420bp以下；或直接回收160-420bp的片段。

3)用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)分别回收纯化不同大小的片段，并溶于22μL EB。

6.重亚硫酸盐处理：

以200ng片段化的λ-DNA作为外源DNA分别与胶回收的目的片段经重亚硫酸盐共处理。重亚硫酸盐处理采用EZ DNA Methylation-Gold Kit^TM(ZYMO)，并按照制造商提供的说明书进行操作(通过参照将其说明书并入本文)，具体步骤如下：

1)制备CT转换试剂(CT Conversion Reagent)溶液：从试剂盒中取出CT转换试剂(固体混合物)，分别加入900μl水、50μlM-溶解缓冲液(Dissolving Buffer)和300μl M-稀释缓冲液，室温下溶解并且震荡10分钟或在摇床上摇动10分钟。

2)M-洗涤缓冲液的制备：向M-洗涤缓冲液中添加24ml 100％的乙醇，备用。

3)将待转换的目的片段DNA与λ-DNA的混合物，按照目的片段大小分别加入不同的PCR管中，若不足20μl的则用水补足。

4)在PCR管中分别加入130μl的CT转换试剂溶液，轻弹或移液器吹悬混合样品。

5)将上述PCR管置于PCR仪上按以下步骤操作：

98℃持续5分钟

64℃持续2.5小时

完成上述操作后，立刻进行下一步操作或者在4℃下存储(最多20小时)备用。

6)将Zymo-Spin ICTM Column放入收集管(Collection Tube)中，并加入600μl M-结合缓冲液(M-Binding Buffer)。

7)将重亚硫酸盐处理的样品分别加入到不同的含M-结合缓冲液的Zymo-Spin IC^TMColumn中，加盖颠倒混匀。

8)全速(＞10,000xg)离心30秒，弃收集管中的液体。

9)向柱中加入100μlM-洗涤缓冲液，全速(＞10,000xg)离心30秒，弃收集管中的液体。

10)向柱中添加200μl M-Desulphonation缓冲液，室温放置15min，全速(＞10,000xg)离心30s，弃收集管中的液体。

11)向柱中添加200μl的M-洗涤缓冲液，全速(＞10,000xg)离心30s，弃收集管中的液体，并再重复此步骤1次。

12)将Zymo-Spin IC^TM Column分别置于新的1.5ml EP管中，分别加入12μl的M-洗脱缓冲液到柱基质中，室温放置2min，全速(＞10,000xg)离心洗脱DNA。

7.PCR扩增及文库大小选择：

1)将上一步得到的DNA按以下体系配制PCR反应体系：

*其中，P1公用引物的序列为：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

**标签N的序列为：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，N为A、T、C、G四个碱基的任意组合

PCR反应条件：

*针对文库片段的长度，选择不同的循环数目，即如果长度为160bp以上，且小于240bp，则循环数为11；如果长度为240bp以上，且小于340bp，则循环数为13；如果长度为340bp以上，且420bp以下，则循环数为15。对于未在160-340bp范围内进一步细分的文库片段，循环数为13。

2)PCR产物经2％琼脂糖电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)分别回收纯化不同大小片段的文库。

8.文库检测：

使用Bioanalyzer分析系统(Agilent，Santa Clara，USA)，检测文库插入片段的大小及含量；并利用Q-PCR精确定量文库的浓度。

9.测序及数据分析：

经检测，所构建的文库合格。

按照双末端90个碱基，在Hiseq2000测序仪上进行序列分析。通过与现有的Msp I单酶切RRBS方法测序数据比较，得出结论：使用Msp I和ApeK I双酶切，提高了对靶区域覆盖广度以及区域内CpG位点的覆盖深度，确定该技术显著优于现有Msp I单酶切RRBS技术。

二、实验结果：

1、利用表1中所列出的酶组合重复前述实验，获得人和小鼠基因组经单酶切和不同的双酶切组合对不同元件的覆盖度，结果示于表1中。

表1.不同甲基化不敏感酶组合对靶区域CpG位点检测情况统计

由上表1可以看出，人类基因组经Msp I和第二限制性内切酶的双酶切与仅经Msp I的单酶切相比，对各靶区域内CpG位点的覆盖均有较大程度的提高，特别是对最近研究发现的肿瘤和组织特异性差异甲基化区域(DMRs)比较集中的元件如：CpG岛外(CpGshore)由约24％提升到50％，启动子由约38％提升到55％，外显子由约29％提升到54％，内含子由约11％提升到30％，增强子由约8％提升到33％，基因下游2Kb区域由约20％提升到43％等。表1数据充分显示Msp I和第二限制性内切酶，尤其是ApeK I双酶切技术比目前Msp I单酶切RRBS技术有显著的进步。

2.安捷伦2100生物分析仪检测双酶切RRBS技术构建不同个数文库的可行性。

在一定测序数据量的基础上，为了获取尽可能多的甲基化信息，发明人选取长度为40-300bp的插入片段(加上测序接头后，长度显示为160-420bp)，并且将文库片段分为3个长度范围(即：160bp以上，且小于240bp；240bp以上，且小于340bp；340bp以上，且420bp以下)构建文库，以及直接构建一个长度范围160-240bp的文库。

图2显示了根据本发明一个实施例的构建的目的片段长度范围不同的全基因组甲基化高通量测序文库的安捷伦2100检测结果。图2A显示了根据本发明一个实施例的目的片段长度为160bp以上，且小于240bp的全基因组甲基化高通量测序文库的安捷伦2100检测结果。图2B显示了根据本发明一个实施例的目的片段长度为240bp以上，且小于340bp的全基因组甲基化高通量测序文库的安捷伦2100检测结果。图2C显示了根据本发明一个实施例的目的片段长度为340bp以上，且420bp以下的全基因组甲基化高通量测序文库的安捷伦2100检测结果。图2D显示了根据本发明一个实施例的目的片段长度为160bp-420bp的全基因组甲基化高通量测序文库的安捷伦2100检测结果。其中，安捷伦2100检测结果表示的是各个文库的文库片段分布范围。如图2所示，各个片段长度的文库，其分布范围均与理论值相符。此外，安捷伦2100结果证明160-420bp的跨度范围可以直接构建一个文库进行测序也可以分几个跨度范围构建几个文库进行测序。

3.以Msp I与ApeK I双酶切为例，mDC细胞系基因组单酶切与双酶切RRBS技术产出数据比较

用相同样品mDC细胞系基因组分别构建Msp I单酶切RRBS和Msp I与ApeK I双酶切的RRBS文库，测序读长分别为50PE和90PE(即双末端50个碱基和双末端90个碱基)，测序数据量分别约为7.7G和9.6G，下机数据经统计分析结果示于表2中。如表2所示，双酶切RRBS可检测到的CpG位点数约为10.5M，而单酶切RRBS检测到的CpG位点数仅为3.8M。

虽然单酶切对CpG位点的平均测序深度较双酶切对CpG位点的平均测序深度要高，但相对于检测到CpG甲基化信息的位点数来讲，双酶切RRBS成本并没有任何提高，即平均每一个位点的甲基化信息的成本并没有任何提高。但是，双酶切RRBS可检测到的位点数有数量级的增加，提供的甲基化信息将更加精确，而且增加的检测位点主要分布在差异甲基化区域，这表明双酶切RRBS比单酶切RRBS技术更有利于分析不同样本间的甲基化差异信息，对于探索甲基化在疾病发生发展过程中所承担的角色提供了一个更有利的工具。

表2.mDC样品Msp I单酶切RRBS与Msp I和ApeK I双酶切RRBS测序数据比较

*：重亚硫酸盐转换率是根据加入未甲基化的λ-DNA的转换率进行评估的

4.单酶切与双酶切RRBS检测不同元件上CpG位点

发明人借助生物信息学工具分析了全基因组分别经过Msp I酶切或经过Msp I和ApeK I酶切，选择不同片段跨度后，分析比较不同方法可覆盖到靶区域内的CpG位点百分比。

同时，发明人mDC细胞系基因组作为样本，重复前述实验，证明了实际数据与信息预测结果的一致性。并且实验证明，使用Msp I和ApeK I双酶切后，不论选择40-220bp还是选择40-300bp的跨度范围，在各靶区域内可检测到的CpG位点数均比单酶切可检测的位点数要多，尤其是在最近研究发现差异甲基化区域分布较多的区域如CpG岛外、内含子、基因下游调控区域等可检测的位点增加更为显著。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

用Msp I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，以便获得DNA片段，其中所述第二限制性内切酶为选自BstN I、HpyCH4 V、Alu I、Hae III、HpyCH4 II、Apek I、Ban II、TaqαI、Sph I、Bgl II、BssS I、BamH I和Kpn I的至少一种，优选所述第二限制性内切酶为ApekI；

将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；

在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；

将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，以便获得具有甲基化接头的连接产物；

将所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，以便获得目的片段；

将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，获得经过转换的目的片段；

将所述经过转换的目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；以及

分离纯化所述扩增产物，所述扩增产物构成全基因组甲基化高通量测序文库；

其中，

任选地，进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤，优选所述样本来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种，更优选所述哺乳动物为人和小鼠的至少一种；

任选地，所述基因组DNA为人类全血基因组DNA；

任选地，所述基因组DNA的量为150-200ng，优选100ng；

任选地，在将所述DNA片段进行末端修复前，进一步包括纯化DNA片段的步骤；

任选地，将所述DNA片段进行末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，其中，所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’聚合酶活性，但缺少5’→3’外切酶活性；

任选地，将所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A是利用Klenow(3’-5’exo-)进行的；

任选地，所述甲基化接头中包含标签；

任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连前，进一步包括对接头进行甲基化的步骤；

任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连是利用T4 DNA连接酶进行的；

任选地，将所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，是通过2％的琼脂糖凝胶电泳进行的；

任选地，所述目的片段的长度为160-420bp；

任选地，在将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理之前，将所述目的片段与片段化的λ-DNA混合，优选所述片段化的λ-DNA的量为200ng；

任选地，将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理是采用EZ DNA Methylation-Gold Kit^TM(ZYMO)进行的；

任选地，所述PCR扩增使用热启动taq DNA聚合酶；

任选地，所述热启动taq DNA聚合酶为r-taq聚合酶；

任选地，基于所述目的片段的长度，确定所述PCR扩增的循环数，

其中，

当所述目的片段的长度为160bp以上，且小于240bp时，所述PCR扩增的循环数为11；

当所述目的片段的长度为240bp以上，且小于340bp时，所述PCR扩增的循环数为13；以及

当所述目的片段的长度为340bp以上，且420bp以下时，所述PCR扩增的循环数为15；

任选地，分离纯化所述扩增产物是通过选自磁珠纯化、纯化柱纯化和2％的琼脂糖凝胶电泳的至少一种进行的，优选通过2％的琼脂糖凝胶电泳进行。

2.一种确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法，其特征在于，包括下列步骤：

根据权利要求1所述的方法构建所述基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库；

对所述全基因组甲基化高通量测序文库进行测序，以便得到测序结果；以及

对所述测序结果进行数据分析，以便确定所述基因组DNA样品的甲基化位点。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述测序是利用高通量测序技术进行的。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述测序是通过Solexa测序平台进行的。

5.一种用于确定基因组DNA样品的甲基化位点的装置，其特征在于，包括：

文库制备单元，所述文库制备单元用于制备基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，所述文库制备单元内设置有Msp I酶以及第二限制性内切酶，其中，所述第二限制性内切酶为选自BstN I、HpyCH4 V、Alu I、Hae III、HpyCH4 II、Apek I、Ban II、TaqαI、Sph I、Bgl II、BssS I、BamH I和Kpn I的至少一种，优选所述第二限制性内切酶为Apek I；

测序单元，所述测序单元与所述文库制备单元相连，并且从所述文库制备单元接收所述基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，以便用于对所述基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库进行测序，获得测序结果；以及

数据分析单元，所述数据分析单元与所述测序单元相连，并且从所述测序单元接收所述测序结果，以便对所述测序结果进行数据分析，确定所述基因组DNA样品的甲基化位点。

6.一组分离的限制性内切酶，其特征在于，由Msp I酶以及ApeK I酶构成。

7.一种用于构建全基因组甲基化高通量测序文库的试剂盒，其特征在于，包括：

Msp I酶，以及

第二限制性内切酶，

其中，

所述第二限制性内切酶为选自BstN I、HpyCH4 V、Alu I、Hae III、HpyCH4 II、Apek I、Ban II、TaqαI、Sph I、Bgl II、BssS I、BamH I和Kpn I的至少一种，优选所述第二限制性内切酶为Apek I。