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CN103074436A - 一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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CN103074436A CN2013100332619A CN201310033261A CN103074436A CN 103074436 A CN103074436 A CN 103074436A CN 2013100332619 A CN2013100332619 A CN 2013100332619A CN 201310033261 A CN201310033261 A CN 201310033261A CN 103074436 A CN103074436 A CN 103074436A
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Abstract

本发明公开了一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法，包括超纯水，X溶液，10×PCR缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，特点是PCR引物包括以下6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如SEQ ID NO.1～NO.32所示；其检测包括采集样本并提取核酸的步骤；以提取的核酸为模板进行PCR反应的步骤；最后GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品的步骤，优点是特异性强、准确度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。

Description

一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及多重基因检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
5-FU类药物属抗代谢类化疗药中的氟尿嘧啶类,这些药物在体内均转化为5-FU，抑制脱氧胸苷酸合成酶,从而影响DNA的合成，达到抑制肿瘤的生长的目的。因此该类药物的使用不可避免地损伤患者体内正常的细胞分裂，出现诸多的化疗副作用。5-FU类药物的抗癌谱很广，是使用最为广泛的抗肿瘤药物之一。但在5-FU类药物的临床应用中，却存在治疗有效率低和副作用大的问题，而且存在显著的个体差异，部分患者获益，部分患者耐药并出现严重毒副作用。研究表明，人群对5-FU的个体差异与单核苷酸多态性（SNP）密切相关。肿瘤患者在接受5-FU类药物化疗之前，进行5-FU类药物相关SNP基因位点的监测，根据监测结果制定化疗方案，提高肿瘤临床治疗的针对性，减少药物毒副作用的发生，节约宝贵的医治时间。
现有的指导5-氟尿嘧啶用药的单核苷酸多态性（SNP）诊断方法主要为基因芯片法、荧光定量PCR（qPCR）和Sanger测序法。
（1）qPCR检测方法：采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点变异设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强。其缺点是（1）通量低：不适宜多SNP位点的检测；难以设置内控基因。(2)成本较高：探针标记成本高；若需获得所有相关SNP信息，需进行多个检测试验，叠加成本更加昂贵。
(2)基因芯片法：基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。DNA芯片：由于高通量等优点在SNP检测中得到大量应用，依靠野生型与突变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测。其优点是：（1）高通量并行检测；（2）操作简便快速：整个检测只需4-8小时基本可以出结果。缺点：1）不同SNP位点之间的杂交动力学差异不同，在进行多位点同时检测时条件难以控制；2）技术成本昂贵、复杂：每个样品需要一个芯片，成本大于￥1000/样品，不利于大规模推广；探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤；3）重复性差，准确性低，易出现假阳性假阴性结果；4）灵敏度较低：芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度；5）由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。
（3）Sanger（双脱氧链终止法）测序法：Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。其优点是SNP分析金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP。缺点是每个样本的每个位点均需要经PCR扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序。步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，多个SNP位点检测累计价格相对昂贵。
GenomeLabTMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了96孔板的排列特性，降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法，通过Beckman Coulter染色标记，在同一个EP管中同时分析多个基因的表达，能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述方法存在的缺陷，具有以下优点：
1、高通量：本系统采用双（96孔）板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应（如192个患者样品，每个样品检测30种腹泻病毒，30个位点），一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。
2、准确性强：GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；
3、敏感性高，结果重复性好：GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度；
4、方法简便，使用经济：GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广；
5、精确定量、灵活性强：可精确定量病原体基因拷贝数，可随时根据需求调整检测的靶基因。
6、易于实现自动化：就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报告。
目前，国内外还没有关于基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒，包括超纯水（ddH2O），X溶液，10×PCR缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，所述的PCR引物包括以下6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其核酸序列如下表1所示：
表1
Figure BDA00002779637800031
Figure BDA00002779637800041
上述XPD基因上rs1318片段的A型基因的反向扩增引物与C型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.3：AGGAACCGTTTATGGCCC；上述DPYD基因上rs1801265片段的C型基因的正向扩增引物与T型基因的正向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.4：CTTACAAAGCAGTTCTTATCAGGATTT；DPYD基因上rs3918290片段的C型基因的反向扩增引物与T型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.9：CTCATCAGTGAGAAAACGGCT；上述MTHFR基因上rs1801133片段的G型基因的正向扩增引物与A型基因的正向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.10：ACCCTCGCCTTGAACAGGTGG；上述OPRT基因上rs1801019片段的G型基因的反向扩增引物与C型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.15：AGCATCTGCTAGCTGCAACA；上述NOS3基因上rs1799983片段的G型基因的正向扩增引物与T型基因的正向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.16：TCTTGAGAGGCTCAGGGATG；上述GSTP1基因上rs1695片段的A型基因的反向扩增引物与G型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.21：CAAGCCACCTGAGGGGTA。
所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。
所述的阳性对照品为上述6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。
一种使用指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）采集样本并提取核酸
采集肿瘤患者口腔拭子或血液样品，从中提取核酸；
（2）以提取的核酸为模板进行PCR反应
取DNA样品2μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁3.4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶0.6μL，X溶液2μL，超纯水10μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95°C1分钟；94°C30秒钟，60°C30秒钟，70°C1分钟，循环35次；70°C1分钟；4°C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记；PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，所述的PCR引物包括以下6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1～NO.32所示；
（3）GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
取PCR产物0.1-1μL，Beckman GeXP系统配套的上样缓冲液38.75μL，DNA标准品0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，获得指导5-氟尿嘧啶用药相关基因的SNP位点的等位基因型。。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法，本试剂盒及检测方法基于多重PCR和毛细电泳技术，利用不同长度的PCR特异性扩增片段来鉴定区分不同的基因，创立了一种同步检测XPD、DPYD、MTHFR、OPRT、NOS3和GSTP1六个基因的7个SNP位点上的不同基因型的检测方案，以指导5-FU的临床用药，本方法优化多重PCR反应体系，对待测DNA样品进行特异性扩增，再用毛细电泳方法分离PCR扩增产物以鉴别不同的基因和基因型，其一天之内可完成192个患者样品的检测，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间；DNA内参基因的使用可用于监测整个反应系统以及评估DNA模板的质量，避免假阴性；反应内参的使用可用于监测整个反应系统、PCR反应的效率，避免假阴性。
综上所述，本发明基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法，同步对6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型进行检测，检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率，还能够有效解决常规PCR的易污染问题；具有非竞争性内对照体系，可靠性强，无假阴性结果，利用GeXP遗传分析系统灵敏、准确定量、快速、高通量的技术优势，为临床提供一种优越的低成本的分子诊断方法，有助于化疗药物安全有效地使用。
附图说明
图1为GeXP遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果标准图谱。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
本发明一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒，该试剂盒中包括以下试剂：
1)PCR引物（PCR Primer Mix）
2)25mM氯化镁（MgCl2）
3)DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase）
4)X溶液（Solution X）
5)PCR缓冲液（PCR Buffer）
6)阳性对照（Positive Control）
7)超纯水（ddH2O）
上述PCR引物包括以下6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如表1所示（也可参见序列表）：
表15-氟尿嘧啶用药指导多重基因检测寡核苷酸序列
Figure BDA00002779637800061
Figure BDA00002779637800071
上述XPD基因上rs1318片段的A型基因的反向扩增引物与C型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.3：AGGAACCGTTTATGGCCC；上述DPYD基因上rs1801265片段的C型基因的正向扩增引物与T型基因的正向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.4：CTTACAAAGCAGTTCTTATCAGGATTT；DPYD基因上rs3918290片段的C型基因的反向扩增引物与T型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.9：CTCATCAGTGAGAAAACGGCT；上述MTHFR基因上rs1801133片段的G型基因的正向扩增引物与A型基因的正向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.10：ACCCTCGCCTTGAACAGGTGG；上述OPRT基因上rs1801019片段的G型基因的反向扩增引物与C型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.15：AGCATCTGCTAGCTGCAACA；上述NOS3基因上rs1799983片段的G型基因的正向扩增引物与T型基因的正向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.16：TCTTGAGAGGCTCAGGGATG；上述GSTP1基因上rs1695片段的A型基因的反向扩增引物与G型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.21：CAAGCCACCTGAGGGGTA。
上述试剂盒可同步对6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型进行检测，利用不同长度的PCR特异性扩增片段来鉴定区分SNP位点的等位基因型，以指导5-氟尿嘧啶的临床用药，具体如表2所示：
表2.5-FU用药指导多重基因检测检测靶标位点
Figure BDA00002779637800072
上述X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。
上述阳性对照品为上述6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段（阳性对照品由本试剂盒各靶基因核苷酸引物克隆所得DNA片段）。
上述试剂盒设置了一个针对人DNA的内参，用于监测DNA样品的质量；同时设置了一个以质粒pcDNA3.1为模板的反应内参，用于监测PCR反应的正常进行（表1）。
具体实施例二
本发明一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测方法，采集患者肿瘤组织提取核酸，以肿瘤患者核酸为模板进PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：
1、生产基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒，试剂盒中包括的组分同上述实施例1；
2、采集样本并提取核酸
采集肿瘤患者口腔拭子或血液样品的分离培养物，从分离培养物中提取核酸；
3、以提取的患者核酸为模板进行PCR反应
1）按以下比例在96孔样品板/八连管上加入试剂和样品（PCR板见表3），并设置一个阳性对照反应：
表3PCR反应试剂和样品混合比例
Figure BDA00002779637800091
注：由本试剂盒各靶基因核苷酸引物克隆所得DNA片段，用量为1μL/反应；
X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向扩增引物带荧光标记。阳性对照品为实施例1中6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段
2）混匀后按以下温度进行热循环反应（见表4）：
表4PCR反应条件
步骤 温度 时间
1 95°C 1分钟
2 94°C 30秒钟
3 55°C 30秒钟
4 70°C 1分钟
5 N/A 重复2-4步骤34次（共35次）
6 70°C 1分钟
7 4°C 持续:直至收取PCR产物
4、GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
1）制备GeXP样品（见表5）：
表5GeXP样品混合比例
GeXP样品 量/孔
上样缓冲液（Beckman GeXP系统配套试剂） 38.75μL
DNA大小标准400 0.5μL
PCR产物 0.1-1μL
矿物油 1滴
2）毛细电泳分离样品
将GeXP样品加入96孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中；毛细管电泳分离是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具体程序为90℃变性120秒，进样电压2kv，30秒，分离电压6kv，35分钟。
5、结果分析（见GenomeLab GeXP遗传分析仪说明书）
根据GeXP遗传分析仪自有软件上默认的参数对结果进行片段大小分析，其横坐标表示片段大小，纵坐标为信号强弱。将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，获得6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点的等位基因型，以指导5-氟尿嘧啶的临床用药。标准图谱如图1所示，其结果能准确检测出6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的等位基因型，各目标片段大小间隔适中，且信号不至于过饱和，各靶标间信号相对持平，且没有宽峰、双峰等现象。
具体实施例三
检测试剂盒特异性分析：单重PCR扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Figure IDA00002779638600021
Figure IDA00002779638600041
Figure IDA00002779638600051
Figure IDA00002779638600061
Figure IDA00002779638600071
Figure IDA00002779638600081
Figure IDA00002779638600091

Claims (4)

1.一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒，包括超纯水，X溶液，10×PCR缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，其特征在于所述的PCR引物包括以下6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其核酸序列如下：
2.根据权利要求1所述的一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒，其特征在于：所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。
3.根据权利要求1所述的一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照品为上述6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。
4.一种利用权利要求1-3中任一项所述的指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）采集样本并提取核酸
采集肿瘤患者口腔拭子或血液样品，从中提取核酸；
（2）以提取的核酸为模板进行PCR反应
取DNA样品2μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁3.4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶0.6μL，X溶液2μL，超纯水10μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95°C1分钟；94°C30秒钟，60°C30秒钟，70°C1分钟，循环35次；70°C1分钟；4°C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记；PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，所述的PCR引物包括以下6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1～NO.32所示；
（3）GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
取PCR产物0.1-1μL，Beckman GeXP系统配套的上样缓冲液38.75μL，DNA标准品0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，获得指导5-氟尿嘧啶用药相关基因的SNP位点的等位基因型。
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