CN103014142A - 用于诊、查染色体微缺失综合征的分子组合探针 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，具体涉及用于诊、查染色体微缺失综合征的分子组合探针。本发明选择Williams综合征、22q 11微缺失综合征、Prader-Willi综合征、Angelman综合征、15q13.3微缺失综合征和Rett综合症的关键基因或关键区域内的基因、或重复/缺失片段内两端的基因，根据所述的基因序列，选择满足相应条件的序列作为探针序列，在探针左半序列5’端和右半探针3’端加通用引物序列，并加磷酸化标记，制成可用于多重连续探针扩增技术的组合探针。本发明的组合探针能克服荧光定量PCR的缺点，一次分析多个序列，具有更高的分辨率、灵敏度和可重复性。可用于上述6种染色体微缺失综合征的临床分子诊断筛查。

Description

用于诊、查染色体微缺失综合征的分子组合探针

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及染色体微缺失综合征的分子探针，具体涉及用于诊、查染色体微缺失综合征的分子组合探针。该探针可用于诊断、筛查常见的6种染色体微缺失综合征。

背景技术

据医学研究报道，染色体微缺失综合征尤其是常见的6种染色体微缺失综合征分别为：Williams综合征(Williams Syndrome，WS)、22q11微缺失综合征(22q11 deletionsyndrome，22q11DS)、Prader-Willi综合征(PWS)、Angelman综合征(AS)、15q13.3微缺失综合征和Rett综合症(Rett syndrome，RTS)；目前，上述微缺失综合征的临床诊断主要依靠临床表现及相关的实验室和影像学检查，其中，遗传学诊断以FISH检查为金标准，可有效地检出大部分缺失；但是，所述微缺失综合征的诊断主要为出生后检查，产前诊断检出率很少。

所述的Williams综合征(Williams Syndrome，WS)通常的临床表现为：心血管疾病(弹性蛋白动脉病，周围肺动脉狭窄，主动脉瓣上狭窄，高血压)，特殊面容，结缔组织异常，智力低下，发育迟缓，代谢分泌异常(高血钙，高钙尿，甲状腺功能减退，早熟)等症状；有研究显示，99％以上WS患者有Williams综合征典型区域(Williams-Beuren syndrome critical region，WBSCR)包括ELN基因的连续缺失，临床上通过FISH或目的区域突变分析检测；所述的WBSCR的缺失和重复都可影响该区域基因组结构，缺失可导致非等位同源重组，研究还显示，WB有95％缺失1.55Mb，5％缺失1.84Mb。

GTF2I，GTF2IRD1和GTF2IRD2这3个基因位于WBSCR和邻近低拷贝区(low copyregion，LCR)调节区域；上述TFII-I基因家族的成员可结合启动子的不同区域和上游调节位点，在WB中起到重要作用；其中，ELN的缺失与结缔组织异常包括心血管疾病相关；LIMK1在脑中表达，缺失会影响视觉建设性认识；STX1A由神经递质释放和胰岛素分泌，异常与WS中糖尿病相关；但是，FKBP6、TBL2在WS发生中所起到的作用目前还未知。

所述的22q11微缺失综合征(22q11deletion syndrome，22q11DS)是指由人类染色体22q11.21-22q11.23区域杂合性缺失引起的一类临床症候群，包括DiGeorge综合征、腭心面综合征、椎干异常面容综合征，Cayler心面综合征和Opitz综合征等数个具有相同遗传学基础的临床综合征，是人类最常见的微缺失综合征，其发生率为1∶4000(活产婴儿)，男女发病率无明显差异，大部分病人(90-95％)可检测到22号染色体长臂近端染色体的微缺失。目前，有研究已在缺失区发现30多个基因，其中研究较多的基因有TBX1、CRKOL、Ufd1L、HIRA、CRKL、COMT、PRODH、ZDHHC8等；TBX1与心脏圆锥动脉干畸形、颅面畸形、胸腺、甲状旁腺发育不良等表型密切相关。目前，临床诊断主要依靠临床表现及相关的实验室和影像学检查，其中，遗传学诊断以FISH检查为金标准，可有效地检出大部分缺失。

所述的Prader-Willi综合征(PWS)，又称张力减退-智力减退-性腺功能减退与肥胖综合征，该综合征为父源性染色体片段15q11.2-q13缺失(70％)、母源性15号染色体单亲二体(uniparental disomy，UPD，＞25％)和基因印迹缺陷(imprinting defect，ID，约＜5％)，上述三种突变都伴随DNA异常甲基化。有研究发现有多个基因与PWS相关，如SNRPN是导致PWS的关键基因，该基因父系遗传，最初在大脑和心脏中表达；所述的SNURF是双功能蛋白控制DNA结合活性；NDN编码DNA结合蛋白，抑蛋白(necdin homolog(mouse)，NDN)缺失影响轴突分支生长，Ndn敲除小鼠的表型与PWS患者的缺陷非常相似。

所述的Angelman综合征(AS)，又称愉快木偶综合征，与PWS遗传机制相似，但15q11-q13缺失是由母源性15号染色体引起(70％)，父源性15号染色体单亲二体(uniparental disomy，UPD占5-7％)，基因印迹缺陷约占3-5％，UBE3A基因突变占11％；上述的前三种突变均伴有DNA异常甲基化。该综合征患儿出生时常正常，6个月以后很快出现严重的发育迟缓；其诊断依赖临床特征和分子遗传学/细胞遗传学检测。当前系统分析源自双亲的特异性甲基化可检测约78％的病例，其中包括了染色体15q11.2-q13片段的缺失、UPD和基因印迹缺陷。所述的UBE3A基因的序列分析可检测另外约11％的突变，还有约1％的病例有细胞遗传学可见的染色体异常，三者相加可涵盖90％的AS病例，还有10％的有典型临床表型特征的病例尚不能从基因医学上确认。上述AS病例分为以下五种类型：I型为母源性15q11-q13缺失，占70％；II型为父源性15号染色体UPD，占5％；III型为印迹缺陷，约占5％；IV型为UBE3A基因突变，占10％；V型为未知型，占10％。

所述的15q13.3微缺失综合征具有大范围高风险的临床表型，包括智力障碍，心脏异常，癫痫，自闭症，以及精神分裂。缺失与典型综合征没有直接相关性，普遍存在行为异常，集中力低，多动，情绪波动以及激进或强迫行为；半数的15q13.3缺失患者会智力低下。所述的15q13.3缺失综合征包括单一序列1.5Mb缺失和500kb或更大片段重复。

目前，有研究发现，15q邻近区域有一个高密度的低拷贝重复，2.OMb缺失导致6个基因丢失：MTMR15、TRPM1、MTMR10、KLF13、OTUD7A和CHRNA7；所述的15q13.3微缺失中CHRNA7单倍体不足可能是神经发育异常的致病因素；所述的CHRNA7编码突触离子通道蛋白，介导神经元信号转导，是癫痫、精神分裂和极端行为的候选基因；KLF13是心脏基因表达和心脏形成的调节因子。

所述的Rett综合症(Rett syndrome，RTS)为X连锁显性遗传病，是严重的神经系统发育障碍性疾病，常累及女孩，发病率为1/10,000-1/15,000。RTS患儿早期发育正常，常在大约6-24个月左右起病，首先表现为头围生长减速或停滞，肌张力减退并且精神发育迟滞。有研究发现，该综合症的病因是Xq28上甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG bindingprotein-2，MECP2)基因突变。目前已发现MECP2基因有多种突变类型，包括点突变、碱基插入和缺失、外显子重复或缺失等，不同类型的突变与症状严重性有关。国外有资料证明，所述的MECP2基因存在10个左右的突变热点，约占总突变的60％-70％；通过对MECP2的整个编码区进行双向测序和/或突变扫描，可检测80％的经典Rett综合征和40％的不典型Rett综合征患者。但是，通过MLPA方法可发现30％经测序分析未见突变的经典Rett综合征患者的MECP2基因外显子、多个外显子和整个基因缺失，以及7％未发现突变的不典型Rett综合征患者的MECP2基因显子、多个外显子和整个基因缺失。

70年代，染色体G带技术发现了显微镜下可见的染色体异常如缺失、重复、易位和倒置，从而明确了多种相关的染色体非平衡异常，但是传统光学显微镜对于染色体结构异常的最大分辨率在5-10Mb，高分辨率显带技术也就在3-5Mb，而限制性片段长度多态性(RFLP)分析，磁场凝胶电泳(PFGE)和荧光原位杂交(FISH)对于基因组的分辨率达到了10⁴-10⁶水平。目前，以微阵列平台为基础的全基因组拷贝数变异分析技术的出现和迅速发展，使得定位和片断大小的精确性进一步提升，为染色体异常疾病的病因的解释做出了革命性的贡献。

2004年两个研究小组几乎同时在Nature和Science上报道了人体内拷贝数变异(Copynumber variations，CNVs)现象的存在，其在整个基因组中覆盖的核苷酸总数远远超过SNP的总数。所述的CNVs广泛的存在于人类基因组，拷贝数的变化将影响一个较宽区域的基因组序列和很多可能基因的变化，故CNVs在研究人类遗传性疾病方面的巨大潜力。大量研究表明，精神性疾病、神经性疾病、先天性疾病等都存在人类基因组CNV的异常，其中，所述的CNVs主要指介于1kb和3Mb的DNA片段多态性，其恰好处于显微镜和高分辨率观测范围之间，属于亚微观范畴，可通过如荧光定量PCR、FISH、MLPA及微阵列技术等进行检测。

目前，临床通常采用检测基因组拷贝数变异的方法检测上述染色体微缺失综合征，但该方法存在以下缺点：核型分析的分辨率有限，仅可以检测到大于5Mb的重复/缺失；定量PCR，通量低，不适于多位点的筛查检测；FISH：每个探针仅能检测一个位点，周期长，成本高；Array平台的芯片检测，成本高于MLPA，不适用于大样本的筛查。

发明内容

本发明的目的是提供涉及染色体微缺失综合征的分子探针，具体涉及用于诊、查染色体微缺失综合征的分子组合探针。该探针可用于诊断、筛查常见的6种染色体微缺失综合征。

本发明的分子组合探针为一种可用于MLPA实验方法的探针，可针对临床上单纯依赖表型明确诊断较为困难、与智力发育相关的染色体微缺失综合征(Williams综合征、22q11微缺失综合征、Prader-Willi综合征、Angelman综合征、15q13.3微缺失综合征和Rett综合症)进行经济、快速的筛查。

具体而言，本发明的用于诊、查染色体微缺失综合征的分子组合探针，其特征在于，包括Williams综合征、22q11微缺失综合征、Prader-Willi综合征、Angelman综合征、15q13.3微缺失综合征和Rett综合症的关键基因或关键区域内的基因，或重复/缺失片段内两端的基因，以及满足相应条件的探针序列和引物序列，和磷酸化标记。

本发明的组合探针可用于上述6种染色体微缺失患者的早期临床诊断及筛查。

本发明中，所选择的目的基因序列由http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat获得，并区别标记编码区、SNP及重复序列。

本发明中，所述的探针均由左半序列和右半序列组成，左半序列5’端至3’端依次为：左通用引物序列、左半探针序列；右半序列5’端至3’端依次为：磷酸标记、右半探针序列、右通用引物序列。左、右探针序列与靶序列相同，并可在连接酶的作用下直接相连；

本发明中，所述探针的左、右序列满足如下条件：(1)序列长度唯一性；(2)GC含量在50％左右；(3)Tm值≥70℃；(4)在连接位点不含SNP；(5)无二级结构；(6)在人类基因组内无相同重复序列；(7)序列加通用引物，磷酸标记。

本发明中，所述的序列在人类基因组内是否为特异性序列，可通过http://genome.uscs.edu/cgi-bin/hgBlat在线进行检测；GC含量检测、Tm值检测采用RawProbe软件；二级结构的检测http://mfold.rna.albany.edu在线进行。

本发明中，所述的序列由Intrviogen公司化学合成。

本发明中，所述的探针针对的基因分别为：

(1)Williams Beuren综合征：FKBP6、TBL2、STX1A、LIMK1；

(2)22q11微缺失综合征：CLTCL1、HIRA、TBX1、SNAP29、ZNF74；

(3)Prader-Willi/Angelman综合征：NDN、UBE3A、GABRB3、OCA2；

(4)15q13.3缺失综合征：TRPM1、KLF13；

(5)Rett综合征：MECP2；

(6)以及两个性别标志基因chX(HNRPH2)、chY(SRY)。

本发明中，所述的探针采用化学方法合成。

本发明中，合成后的序列，单个分装，粉末试剂；按照每个序列所标记的nmol值，加TE稀释至100μM浓度储存，取出10μl储存液，加去离子灭菌水稀释至1μM作为工作液。将所有序列混合，加去离子灭菌水最终稀释至1fmol/μl，制得工作浓度的探针混合液；

所述的探针混合液，可用于多重连续探针扩增技术；

本发明中，所述的试剂采用MRC公司的P200探针空白试剂盒，其操作步骤为：

1)DNA变性：标记0.2ml Eppendorf管或8联管；加入5μl DNA，其中DNA总量在150-200ng；在PCR仪上启动MLPA程序：98℃5分钟，使DNA样本变性，冷却至25℃，取出；

2)杂交反应：制备杂交混合液，每个反应包括：1.5μl的MLPA缓冲液(黄色管)+1.5μl探针(黑色管)，充分混匀；在PCR仪到达25℃时，每管加3μl杂交混合液，混匀。继续MLPA程序：95℃1分钟，后60℃杂交16-20小时；

3)连接反应：制备连接混合液，每个反应包括：3μl连接酶-65缓冲液A(透明色管)+3μl连接酶-65缓冲液B(白色)+25μl去离子水，充分混匀；每个反应加1μl连接酶-65(绿色管)，轻柔混匀。继续MLPA程序，在54℃暂停；在PCR仪到达54℃时，每管加32μl连接混合液，混匀；继续MLPA程序：54℃15分钟(连接)，98℃5分钟使连接酶失活，后在15℃暂停；

4)PCR反应：标记新的PCR 8联管。制备PCR缓冲混合液，每个反应包括：4μl SALSAPCR缓冲液(红色管)+26μl去离子水，充分混匀；在新的8联管中，每管加入30μl PCR缓冲混合液；在室温下，将10μl连接产物加入相应的新8联管中；制备聚合酶混合液，每个反应包括：2μl SALSAPCR引物(棕色管)+2μl SALSA酶缓冲液(蓝色管)+5.5μl去离子水+0.5μl SALSA聚合酶(橘红色管)，轻柔混匀，使用前4℃保存；继续MLPA程序，在60℃暂停。在PCR仪到达60℃时，每管加10μl聚合酶混合液，混匀；立刻继续MLPA程序：35个循环：95℃30秒、60℃30秒、72℃60秒，后72℃20分钟，在15℃暂停；

5)毛细管电泳检测PCR产物。

上述技术方案中所有基本分子生物学操作均参照MRC公司的《Synthetic probedesign》和《Protocol MLPA-v29》。

本发明的优点是；

提供用多重连续探针扩增技术的组合探针，针对发病率相对较高、病因为染色体结构重复或缺失、临床常规检测方法难以确诊的Williams综合征、22q11微缺失综合征、Prader-Willi综合征、Angelman综合征、15q13.3微缺失综合征和Rett综合症等6种综合征进行临床分子诊断筛查，其中的多重连接依赖式探针扩增法(Multiplex ligation dependentprobe amplification，MLPA)能克服荧光定量PCR的缺点，一次能够分析多个序列，并具有更高的分辨率、灵敏度和可重复性的优点。同时，所述的MLPA较微阵列技术和FISH的检测方法经济、快捷，针对性更强，适合作为临床的常规检测方法。所述的探针可用于上述6种染色体微缺失综合征的。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的组合探针进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为本发明中探针序列模建图，其中，蓝色部分为通用引物序列，紫色部分为与靶序列结合部位。绿色为靶序列。

图2为本发明中MLPA操作步骤PCR设定程序示意图。

图3为本发明中阴性病例检测结果原始图像，其中，浅色峰为每个位点正常人拷贝数水平，深色峰为病例拷贝数水平，检测病例各位点拷贝数与正常对照相同。

图4为本发明中阳性病例检测结果原始图像，其中，浅色峰为每个位点正常人拷贝数水平，深色峰为病例拷贝数水平，21号染色体涉及5个位点(箭头指示)，拷贝数均低于正常对照。

具体实施方式

实施例1

常见染色体疾病及其关键基因的选择

参考http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/GeneTests/Review？db＝GeneTests中对WS、22Q11、PWS、AS、15q13.3微缺失和Rett综合征6种综合征的描述，根据该描述及已发表的相关文献报道，选择关键基因或关键区域。若尚未明确关键基因或关键区域，

(1)探针序列的设计

选择的目的基因序列在http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat获得，并区别标记编码区、SNP及重复序列。

针对每个目的基因，探针均由左半序列和右半序列组成，左半序列5’端至3’端依次为：左通用引物序列、左半探针序列；右半序列5’端至3’端依次为：磷酸标记、右半探针序列、右通用引物序列。左、右探针序列与目的基因的目的序列相同，并可在连接酶的作用下直接相连，如图1所示。

左、右序列满足如下条件：1)序列长度唯一性；2)GC含量在50％左右；3)Tm值≥70℃；4)在连接位点不含SNP；5)无二级结构；6)在人类基因组内无相同重复序列。

序列GC含量检测、Tm值检测采用Raw Probe软件，如图3所示；二级结构的检测http://mfold.rna.albany.edu在线进行，如图4所示；在人类基因组内是否为特异性序列，http://genome.uscs.edu/cgi-bin/hgBlat在线进行检测，如图5所示。

(2)探针序列的合成

将设计好的序列，由Invitrogen公司合成。

实施例2

(1)阴性病例对照

选择正常人群，QIAgen试剂盒提取全基因组DNA后，进行MLPA实验，应用Genemarker Demo 1.80版本软件，进行数据分析。结果如图3所示。

(2)阳性病例对照

选择9例22q11综合征，经商业化MLPA试剂盒检测验证，明确为22q11综合征患者作为阳性对照，QIAgen试剂盒提取全基因组DNA后，进行MLPA实验，应用GenemarkerDemo 1.80版本软件，进行数据分析(如图4所示)。

Claims (4)

1.用于诊、查染色体微缺失综合征的分子组合探针，其特征在于，包括Williams综合征、22q11微缺失综合征、Prader-Willi综合征、Angelman综合征、15q13.3微缺失综合征和Rett综合症的关键基因或关键区域内的基因，或重复/缺失片段内两端的基因，以及满足相应条件的探针序列和引物序列，和磷酸化标记。

2.按权利要求1所述的用于诊、查染色体微缺失综合征的分子组合探针，其特征在于，所述的探针序列由左半序列和右半序列组成，左半序列5’端至3’端依次为：左通用引物序列、左半探针序列；右半序列5’端至3’端依次为：磷酸标记、右半探针序列、右通用引物序列；所述的左、右探针序列与靶序列相同，并可在连接酶的作用下直接相连；

所述探针的左、右序列满足如下条件：

(1)序列长度唯一性；

(2)GC含量在50％左右；

(3)Tm值≥70℃；

(4)在连接位点不含SNP；

(5)无二级结构；

(6)在人类基因组内无相同重复序列；

(7)序列加通用引物，磷酸标记。

3.按权利要求1所述的用于诊、查染色体微缺失综合征的分子组合探针，其特征在于，所述的探针序列针对的基因为：

(1)Williams Beuren综合征：FKBP6、TBL2、STX1A、LIMK1；

(2)22q11微缺失综合征：CLTCL1、HIRA、TBX1、SNAP29、ZNF74；

(3)Prader-Willi/Angelman综合征：NDN、UBE3A、GABRB3、OCA2；

(4)15q13.3缺失综合征：TRPM1、KLF13；

(5)Rett综合征：MECP2；

(6)以及两个性别标志基因chX(HNRPH2)、chY(SRY)。

4.按权利要求1所述的用于诊、查染色体微缺失综合征的分子组合探针，其特征在于，所述的探针采用化学方法合成。

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