CN102943098A - 应用嗜糖假单胞菌g4-淀粉酶和其变体获得乙醇的无葡糖淀粉酶的方法 - Google Patents

Abstract

嗜糖假单胞菌G4-形成淀粉酶(PS4)和其变体可有利地用于酶催化的高温液化步骤，以从淀粉例如玉米淀粉产生乙醇。PS4产生显著量的麦芽三糖，其可在随后的发酵步骤中被酿酒酵母利用以产生乙醇。PS4的这一特性有利地允许在没有糖化步骤的情况下从液化的淀粉产生乙醇。提供了展示出改良的特性诸如热稳定性和/或改变的外切特异淀粉酶活性和内切特异淀粉酶活性的PS4变体。

Description

应用嗜糖假单胞菌G4-淀粉酶和其变体获得乙醇的无葡糖淀粉酶的方法

本申请是中国专利申请200880123830.6的分案申请，原申请的申请日是2008年12月30日，发明名称是“应用嗜糖假单胞菌G4-淀粉酶和其变体获得乙醇的无葡糖淀粉酶的方法”。

与相关申请的交叉引用

本申请要求2008年1月2日提交的美国临时申请61/006,240号的优先权权益，其在此引入作为参考。

序列表

附上包含SEQ ID NO：1-45的序列表，并且其在此引入作为参考。

发明领域

来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的α-淀粉酶、其热稳定突变和编码它们的核酸尤其在液化和糖化玉米浆以制备乙醇的方法中有用。

背景

将植物淀粉，尤其是玉米淀粉转化为乙醇是迅速发展的工业。当前的方法由两个顺次的酶催化步骤组成，其导致产生葡萄糖。然后应用酵母将葡萄糖发酵为乙醇。

第一个酶催化步骤是淀粉液化。一般地，通过快速加热至85℃或更高使淀粉悬液胶化。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)用于将该粘的液化物降解为麦芽糖糊精。α-淀粉酶是内切水解酶，其催化内部α-1，4-D-糖苷键的随机切割。随着α-淀粉酶降解淀粉，粘度下降。由于液化通常在高温下进行，热稳定α-淀粉酶诸如来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的α-淀粉酶对于这一步骤是优选的。

以这一方式产生的麦芽糖糊精一般不能被酵母发酵形成醇。因此需要第二个酶催化的糖化步骤以降解麦芽糖糊精。葡糖淀粉酶和/或生麦芽糖α-淀粉酶通常用于催化液化后形成的麦芽糖糊精非还原末端的水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。脱支酶诸如支链淀粉酶可用于帮助糖化。糖化通常在升高的温度下在酸性条件下进行，例如60℃，pH 4.3。

用于产生乙醇的酵母之一是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酿酒酵母含有α-葡糖苷酶，已显示其利用单糖、二糖和三糖作为底物。Yoon等，Carbohydrate Res.338：1127-32(2003)。酿酒酵母利用三糖的能力可通过补充Mg²⁺和过量表达AGT1透酶(Stambuck等，Lett.Appl.Microbiol.43：370-76(2006))、过量表达MTT1和MTT1alt以增加麦芽三糖摄入(Dietvorst等，Yeast 22：775-88(2005))、或在细胞表面表达麦芽糖酶MAL32(Dietvorst等，Yeast 24：27-38(2007))而得以改善。如果液化步骤产生充足水平的单糖、二糖或三糖并且使用酿酒酵母或其遗传修饰变体用于发酵步骤的话，则可完全省略糖化步骤。

嗜糖假单胞菌表达形成麦芽四糖的麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60；G4-形成淀粉酶；G4-淀粉酶；本文称为“Amy3A”或“PS4”)。已确定了编码PS4的嗜糖假单胞菌基因的核苷酸序列。Zhou等人，“Nucleotide sequenceof the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas saccharophila，”FEBSLett.255：37-41(1989)；GenBank登录号X16732。PS4作为具有N端21个残基信号肽的前体蛋白质表达。PS4的成熟形式如SEQ ID NO：1所示，其含有530个氨基酸残基，在N端具有催化结构域以及在C端具有淀粉结合结构域。PS4展示出内切和外切α-淀粉酶活性。内切α-淀粉酶活性可用于降低胶化淀粉的粘度，以及外切α-淀粉酶活性可用于将麦芽糖糊精降解为更小的糖。然而已认为PS4的外切α-淀粉酶活性仅产生麦芽四糖，其不是酿酒酵母α-葡糖苷酶的合适底物。由于这一原因，已认为PS4在液化玉米浆以产生乙醇的方法中是不适合的。

概述

与这一观念相反，以及从如本文所述的新的发现中，提供了新的条件，在这一条件下嗜糖假单胞菌G4-形成淀粉酶(PS4)可有利地用于酶催化的液化步骤，以从淀粉(例如，玉米淀粉、小麦淀粉或大麦淀粉)产生乙醇。在本发明的方法中，野生型PS4产生显著量的麦芽三糖，其可在随后的发酵步骤中被酿酒酵母利用以产生乙醇。PS4的这一特性有利地允许在没有糖化步骤的情况下从液化淀粉中产生乙醇。

一般地，在～85℃进行淀粉液化。然而，PS4的熔解温度(T_m)在pH 5.5是65℃。然而，在一个实施方案中，PS4可在以下方法中液化玉米淀粉：将淀粉预加热至70℃，然后与PS4混合并迅速加热至85℃，并且在这一温度下保持30分钟。这一液化产物的HPLC分析显示，除了麦芽四糖之外，PS4还产生了显著量的麦芽三糖。

在另一实施方案中，比野生型PS4更热稳定的PS4变体在液化中显示出改善的性能，如通过液化物的粘度所测量的那样。特定的变体包括其中移除了C端淀粉结合结构域的PS4的截短形式。其它热稳定变体包含对野生型PS4酶序列的一个或多个氨基酸修饰，或对C端截短的PS4变体序列的修饰。

与野生型PS4相比较，PS4变体可有利地产生比麦芽四糖更多的麦芽三糖。此外，PS4变体甚至比当前使用的淀粉酶，诸如SPEZYME^TM Xtra(Danisco US Inc.，Genencor Division)产生更多的葡萄糖和麦芽糖。这导致观察到的更高的来自发酵的乙醇产量，在应用发酵葡萄糖和麦芽糖的酵母的实施方案中其可超过2.5％v/v乙醇。预期可应用能代谢麦芽三糖的酵母株诸如酿酒酵母可进一步增加通过发酵由PS4变体产生的液化物的乙醇产量。

因此，本公开提供了加工淀粉的方法，其包括通过添加嗜糖假单胞菌淀粉酶(PS4)变体而液化淀粉和/或糖化淀粉液化物以形成糖浆，其中所述的变体包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1-429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，该PS4变体可具有经改变的热稳定性、经改变的内切淀粉酶活性、经改变的外切淀粉酶活性、和/或经改变的外切与内切淀粉酶活性的比。该PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的N33Y、D34N、G70D、K71R、V113I、G121A/D/F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、Y198F、G223A/E/F、S229P、H272Q、V290I、G303E、H307K/L、A309P、S334P、W339E和/或D343E。该PS4变体可包含SEQ ID NO：3、4、5或6的氨基酸序列。该PS4变体可在以下位置处包含一个或多个氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的7、8、32、38、49、62、63、64、67、72、73、74、75、76、104、106、107、110、112、116、119、122、123、124、125、126、128、130、137、138、140、142、143、144、148、149、150、151、154、156、163、164、168、169、182、183、192、195、196、200、202、208、213、220、222、225、226、227、232、233、234、236、237、239、253、255、257、260、264、267、269、271、276、282、285、295、297、300、302、305、308、312、323、324、325、341、358、367、379、390；一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、G9A、H13R、I46F、D68E、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70A/E/L/P/Q/S/V、K71M、G100A/S、G121I/P/R、A131T、G134C、A141S、N145S、Y146D/E、G153A/D、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/K/P/R/T/V、G166N、I170E/K/L/M/N、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、A179S、G184Q、G188A、A199P、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S229N、W238E/G/K/P/Q/R、G303L、H307D/E/F/G/K/M/P/Q/R/S/W/Y、A309E/I/M/T/V、S334A/H/K/L/M/Q/R/T和/或H335M；和/或在SEQ IDNO：1的420、422和/或424位置处的一个或多个氨基酸替换。本发明公开的PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、P7S、A8N、G9A、H13R、P32S、I38M、I46F、D49V、D62N、F63A/D/E/L/V、S64N/T、T67G/H/K/N/Q/R/V、D68E、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70A/E/L/P/Q/S/V、K71M、S72E/K/N/T、G73D/E/L/M/N/S/T、G74S、G75C/E/F/R/S/W/Y、E76V、G100A/S、G104N/R、G106K、V107M、L110F、D112E、N116D、N119E/G/S/Y、G121I/P/R、Y122A/E/Q/W、P123S、D124S、K125A/D/E/G/P/Q/W、E126D/N、N128E、P130S、A131T、G134C、R137C、N138D/E/S、C140A/R、A141S、D142E/G/N、P143T、G144E、N145S、Y146D/E、N148K/S、D149H/L/V、C150A、D151A/V/W、G153A/D、D154E/G/Y、F156Y、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/K/P/R/T/V、L163M、N164R、G166N、P168L、Q169D/E/G/K/N/R/V、I170E/K/L/M/N、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、R182D/G/H/M/S、S183G、G184Q、G188A、F192M/Y、V195D、R196A/G/K/P/Q/S/T/V/Y、A199P、P200A/G、R202K、S208T、S213N、L220A/T、K222M/Y、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S225E/G/V、E226C/D/G/W、Y227C/D/G/K/T、S229N、W232F/G/H/I/K/L/N/P/Q/R/S/T/Y、R233H、N234R、A236E、S237D/G、W238E/G/K/P/Q/R、Q239L、V253G、D255V、A257V、E260K/R、N264D、V267I、D269N/S/V、K271A/L/Q、G276R、W282S、V285A、T295C、Y297H、G300E、N302K、G303L、Q305E/L/T、H307D/E/F/G/K/M/P/Q/R/S/W/Y、W308A/C/G/K/N/Q/R/S/T、A309E/I/M/T/V、D312E、W323M、T324A/L/M、S325G、S334A/H/K/L/M/Q/R/T、H335M、Y341C/E、R358A/E/G/L/N/Q/T/V、S367Q/R、S379G和/或D390E；和/或SEQ ID NO：1的S420G、D422N/P/Q和/或G424D/S中的一个或多个替换。一方面，PS4变体可包含在以下位置处的一个或多个氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的7、32、49、62、63、64、72、73、74、75、76、107、110、112、116、119、122、123、125、128、130、137、138、140、142、143、144、148、149、150、151、154、156、163、164、168、169、182、183、192、195、196、202、220、222、226、227、232、233、234、236、237、239、253、255、257、260、264、269、271、276、282、285、297、300、302、305、308、312、323、324、325、341、358、367和/或379；一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、H13R、I38M、I46F、T67G/H/K/N/Q/R/V、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70E/L/P/Q/V、K71M、G100A/S、G104R、G106K、G121I/P/R、D124S、E126D/N、A131T、G134C、A141S、N145S、Y146D/E、G153A/D、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/K/P/R/T/V、G166N、I170E/K/L/M/N、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、G188A、A199P、P200A、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S225E/G/V、W238E/G/K/P/Q/R、T295C、G303L、H307D/G/M/P/S、A309E/I/M/T/V、S334A/H/K/L/M/Q/R/T、H335M和/或D390E；SEQ ID NO：1的S420G和/或D422/N/P/Q中的一个或多个氨基酸替换；和/或在SEQ IDNO：1的位置424处的氨基酸替换。另一方面，PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、P7S、H13R、P32S、I38M、I46F、D49V、D62N、F63A/D/E/L/V、S64N/T、T67G/H/K/N/Q/R/V、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70E/L/P/Q/V、K71M、S72E/K/N/T、G73D/E/L/M/N/S/T、G74S、G75C/E/F/R/S/W/Y、E76V、G100A/S、G104R、G106K、V107M、L110F、D112E、N116D、N119E/G/S/Y、G121I/P/R、Y122A/E/Q/W、P123S、D124S、K125A/D/E/G/P/Q/W、E126D/N、N128E、P130S、A131T、G134C、R137C、N138D/E/S、C140A/R、A141S、D142E/G/N、P143T、G144E、N145S、Y146D/E、N148K/S、D149H/L/V、C150A、D151A/V/W、G153A/D、D154E/G/Y、F156Y、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/K/P/R/T/V、L163M、N164R、G166N、P168L、Q169D/E/G/K/N/R/V、I170E/K/L/M/N、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、R182D/G/H/M/S、S183G、G188A、F192M/Y、V195D、R196A/G/K/P/Q/S/T/V/Y、A199P、P200A、R202K、L220A/T、K222M/Y、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S225E/G/V、E226C/D/G/W、Y227C/D/G/K/T、W232F/G/H/I/K/L/N/P/Q/R/S/T/Y、R233H、N234R、A236E、S237D/G、W238E/G/K/P/Q/R、Q239L、V253G、D255V、A257V、E260K/R、N264D、D269N/S/V、K271A/L/Q、G276R、W282S、V285A、T295C、Y297H、G300E、N302K、G303L、Q305E/L/T、H307D/G/M/P/S、W308A/C/G/K/N/Q/R/S/T、A309E/I/M/T/V、D312E、W323M、T324A/L/M、S325G、S334A/H/K/L/M/Q/R/T、H335M、Y341C/E、R358A/E/G/L/N/Q/T/V、S367Q/R、S379G和/或D390E；和/或一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1的S420G、D422N/P/Q和/或G424D/S。在其它方面，PS4变体可包含在以下位置处的一个或多个氨基酸替换：SEQID NO：1、2、3、4、5、或6的49、62、63、64、72、73、74、75、76、107、112、116、119、122、123、125、128、130、137、140、143、144、148、149、150、151、154、156、163、164、168、169、182、183、192、195、196、202、257、282、285、297、300、305、308、312、323和/或325；一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、P7S、H13R、I38M、I46F、T67G/H/K/N/Q/R/V、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70E/L/P/Q/V、K71M、G100A/S、G104R、G106K、L110F、G121I/P/R、D124S、E126D/N、A131T、G134C、N138D/E、D142/E/G/N、N145S、Y146D/E、G153A/D、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/K/P/R/T/V、G166N、I170E/K/L/M、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、G188A、A199P、P200A、L220T、KK222M/Y、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S225E/V、E226C/D/G/W、Y227C/D/G/K/T、W232F/G/H/I/K/N/P/Q/R/S/T/Y、R233H、N234R、A236E、S237D/G、W238E/G/K/P/Q/R、Q239L、V253G、D255V、E260K/R、N264D、D269N/S/V、K271A/L/Q、G276R、T295C、N302K、G303L、H307D/G/M/P/S、A309E/I/M/T/V、T324L/M、S334A/H/K/L/M/Q/R/T、H335M、Y341C/E、R358A/E/G/L/N/Q/T/V、S367Q/R、S379G和/或D390E；和一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1的S420G、D422/N/P/Q和/或G424S。在再另一方面，PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、P7S、H13R、I38M、I46F、D49V、D62N、F63A/D/E/L/V、S64N/T、T67G/H/K/N/Q/R/V、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70E/L/P/Q/V、K71M、S72E/K/N/T、G73D/E/L/M/N/S/T、G74S、G75C/E/F/R/S/W/Y、E76V、G100A/S、G104R、G106K、V107M、L110F、D112E、N116D、N119E/G/S/Y、G121I/P/R、Y122A/E/Q/W、P123S、D124S、K125A/D/E/G/P/Q/W、E126D/N、N128E、P130S、A131T、G134C、R137C、N138D/E、C140A/R、D142E/G/N、P143T、G144E、N145S、Y146D/E、N148K/S、D149H/L/V、C150A、D151A/V/W、G153A/D、D154E/G/Y、F156Y、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/K/P/R/T/V、L163M、N164R、G166N、P168L、Q169E/G/K/N/R/V、I170E/K/L/M、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、R182D/G/H/M/S、S183G、G188A、F192M/Y、V195D、R196A/G/K/P/Q/S/T/V/Y、A199P、P200A、R202K、L220T、K222M/Y、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S225E/V、E226C/D/G/W、Y227C/D/G/K/T、W232F/G/H/I/K/N/P/Q/R/S/T/Y、R233H、N234R、A236E、S237D/G、W238E/G/K/P/Q/R、Q239L、V253G、D255V、A257V、E260K/R、N264D、D269N/S/V、K271A/L/Q、G276R、W282S、V285A、T295C、Y297H、G300E、N302K、G303L、Q305E/L/T、H307D/G/M/P/S、W308A/C/G/K/N/Q/R/S/T、A309E/IM/T/V、D312E、W323M、T324L/M、S325G、S334A/H/K/L/M/Q/R/T、H335M、Y341C/E、R358A/E/G/L/N/Q/T/V、S367Q/R、S379G和/或D390E，和/或一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1的420G、D422N/P/Q和/或G424S。与SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的氨基酸序列相比较，该PS4变体可具有多达25、23、21、19、17、15、13或11个氨基酸的缺失、添加、插入或替换。

本发明考虑了在以下位置处包含额外的一个或多个氨基酸替换的PS4变体：SEQ ID NO：1或2的N33、D34、G70、G121、G134、A141、Y146、I157、S161、L178、A179、G223、S229、H307、A309和/或S334。一方面，PS4变体包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P和/或S334P。

本发明还考虑了与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比具有改变的热稳定性的PS4变体。该PS4变体可比SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列更热稳定。一方面，该更热稳定的PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的A3T、I38M、G70L、Q169K/R、R182G/H、P200G、G223N、S237D、D269V、K271A/Q、S367Q/R、S379G和/或S420G。另一方面，更热稳定的PS4变体可包含额外的在以下位置处的一个或多个氨基替换：SEQ ID NO：1或2的G134、A141、I157、G223、H307、S334和/或D343。在其它方面，更热稳定的PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P和/或D343E。在再另一方面，该PS4变体还可包含一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的N33、D34、K71、L178和/或A179。该PS4变体可包含一个或多个氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的N33Y、D34N、K71R、L178F和/或A179T。

本发明还考虑了与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比可具有改变的内切淀粉酶活性、改变的外切淀粉酶活性和/或改变的外切与内切淀粉酶活性比的PS4变体。该PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的A3T、G69K、G70E、K71M、G73D/E、G75C/E、Y122A、C140A、G144E、Y146D/E、N148K、C150A、D151A/V/W、G153A、G158I/P、S161G/H/K/P/R、Q169D/E/G/N/R、R196Q/S/T、R202K、S208T、S213N、K222M、G223C/F/H/M/Q/W/Y、E226D、Y227D/G/K/T、S229N、W232Q/S/T、T295C、Q305T、W308A/C/G/Q/R/S/T、A309I/V、W323M、T324L/M、S334A/H/M/Q和/或R358E/L/N/Q/T/V。该PS4变体可包含额外的一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的W66、I157、E160、S161、R196、W221、K222、E226、D254、Q305、H307和/或W308。该PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的W66S、E160F/G/L/P/R/S、S161A、R196H/P/V、W221A、K222T、Q305T/L、H307L和/或W308A/L/S。

在一个方面，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQID NO：2的氨基酸序列相比较，PS4变体可具有升高的内切淀粉酶活性或降低的外切与内切淀粉酶活性比。该PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的G69K、G73D/E、Y122A、C140A、C150A、G153A、G158I/P、S161G/H/K/P/R、Q169R、S208T、S229N、T295C、Q305T和/或R358E/L/Q/T/V。该PS4变体可包含额外的一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的W66S、R196H/P/V、W221A、K222T、H307L和/或W308。

另一方面，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQID NO：2的氨基酸序列相比较，PS4变体可具有升高的外切淀粉酶活性或升高的外切与内切淀粉酶活性比。该PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的A3T、G70E、K71M、G75C/E、G144E、Y146D/E、N148K、D151A/V/W、Q169D/E/G/N、R196Q/S/T、R202K、S213N、K222M、G223C/F/H/M/Q/W/Y、E226D、Y227D/G/K/T、W232Q/S/T、W308A/C/G/Q/R/S/T、A309I/V、W323M、T324L/M、S334A/H/M/Q和/或R358N。该PS4变体可包含额外的一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的E160F/G/L/P/R/S、S161A和/或Q305T/L。

在其它方面，该淀粉加工方法还可包括添加脱支酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶或所述酶的任一组合至淀粉液化物。该淀粉加工方法可适于来自玉米、玉米穗、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯的淀粉。

在再另一方面，公开的淀粉加工方法可包括发酵糖浆以产生乙醇。该公开的方法还可包括回收乙醇。可通过蒸馏该淀粉获得乙醇，其中发酵和蒸馏同时、分别或顺次进行。

附图简述

附图并入本文并且组成这一说明书的一部分，并且阐释各实施方案。在下图中，“PS4”由缩写“SAS”替换。该缩写指代同样的蛋白质并且可互换。

图1描述了液化性能，作为时间(分钟)的函数以粘度(μNm)测量，应用野生型Amy3A G4-淀粉酶(SEQ ID NO：1)或热稳定的PS4变体CF135(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：3)和CF143(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：4)。

图2描述了作为时间(小时)函数的乙醇产量(％v/v)，应用热稳定PS4变体CF149(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：5)和CF154(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：6)，与用SPEZYME^TM Xtra(Danisco US Inc.，Genencor Division)产生的液化物相比较。

图3描述了在与图2所使用的相同条件下的作为时间(小时)函数的葡萄糖利用(％w/v)。

图4描述了在与图2所使用的相同条件下的作为时间(小时)函数的二糖(DP-2)的％w/v的变化。

图5描述了在由CF149(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：5)、CF154(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：6)或Xtra催化的反应中乙醇的积累(％v/v)。

图6描述了在由CF149(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：5)、CF154(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：6)或Xtra催化的反应中葡萄糖的利用率(％w/v)。

图7描述了在由CF149(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：5)、CF154(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：6)或Xtra催化的反应中DP-2的利用率(％w/v)。

图8描述了具有阿卡波糖结合的PS4的晶体结构。

图9描述了PS4与结合至活性部位裂口的阿卡波糖之间的相互作用。显示了阿卡波糖的糖位置+3至-3。

发明详述

提供了PS4、其C端截短变体及其热稳定变体。PS4和其变体可用于加工淀粉，有利地产生显著量的麦芽三糖，所述麦芽三糖可在随后的发酵步骤中被酿酒酵母或其遗传工程改造的变体所利用以产生乙醇。该产生乙醇的方法有利地不需要在糖化步骤中应用葡糖淀粉酶和/或生麦芽糖α-淀粉酶以将麦芽糖糊精转化为单糖、二糖和三糖。在说明书和附图中，PS4可偶尔作为SAS提及。“PS4”和“SAS”是同义的。

1.定义和缩写

根据这一发明详述，以下缩写和定义适用。应当指出如本文中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地说明。因此，例如，对“一种酶”的提及包括多种此类酶，并且对“该制剂”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或多种制剂及其等价物的提及等。

除非另外定义，本文中所用的全部技术及科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同意义。下文提供了以下术语。

1.1.定义

“淀粉酶”尤其指能够催化淀粉降解的酶。内切作用淀粉酶活性以随机方式切割淀粉分子内部α-D-(1→4)O-糖苷键。相反，外切作用解淀粉酶从底物的非还原末端切割淀粉分子。当所述概念与PS4相关联时，“内切作用淀粉酶活性”、“内切活性”、“内切特异性活性”、“内切特异性”是同义的。对于外切活性的相应术语也是相同的。

“变体”指多肽或核酸。术语“变体”可与术语“突变体”互换使用。变体包括分别在氨基酸或核酸序列的一个或多个位置处的插入、替换、转换、截短和/或颠换。术语“变体多肽”和“变体酶”意思是这样的PS4蛋白，其具有已从野生型PS4的氨基酸序列进行修饰的氨基酸序列。变体多肽包括与亲本酶具有某些百分比序列同一性的多肽，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。如本文所使用的那样，“亲本酶”、“亲本序列”、“亲本多肽”、“野生型PS4”和“亲本多肽”的意思是变体多肽所基于的酶和多肽，例如SEQ IDNO：1的PS4。“亲本核酸”的意思是编码亲本多肽的核酸序列。“野生型”PS4天然存在并且包括SEQ ID NO：1的PS4的天然存在的等位基因变体。“变体”的信号序列可与野生型PS4的相同(SEQ ID NO：8)或不同。变体可表达为含有异源多肽的融合多肽。例如，该变体可包含另一蛋白质的信号肽或设计以帮助鉴定或纯化所表达的融合蛋白的序列，诸如His-标签序列。

为描述所考虑的被本发明包含的各种PS4变体，采用了以下命名法以易于指代。当替换包括数字和字母时，例如141P，则这表示{根据编号系统的位置/替换的氨基酸}。因此，例如将位置141位上的氨基酸替换为脯氨酸标记为141P。当替换包括字母、数字和字母时，例如A141P，则这表示{原始氨基酸/根据编号系统的位置/替换的氨基酸}。因此，例如，将141位上的丙氨酸替换为脯氨酸标记为A141P。

当在特定位置处两个和多个替换是可能时，这将通过连续的字母标记，其任选地通过斜杠“/”分开，例如，G303ED和G303E/D。

应用本领域已知的标准技术(例如，参见Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)；程序，诸如在Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTHT、FASTA和TFASTA(Genetics Computer Group，Madison，WI)和Devereux等，Nucleic Acid Res.，12：387-395(1984))确定序列同一性。

“核酸序列同一性百分比(％)”和“氨基酸序列同一性百分比(％)”是指候选序列中与初始序列(例如，PS4)的核苷酸残基或氨基酸残基相同的核苷酸残基或氨基酸残基的百分比。可在初始序列的全长上测量序列同一性。

“序列同一性”在本文中通过序列比对方法得以确定。为本发明的目的，比对的方法是由Altschul(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)和Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))等描述的BLAST。尤其有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见Altschul等，Meth.Enzymol.266：460-480(1996))。WU-BLAST-2应用若干个搜索参数，其大多数设置为缺省值。可设置的参数设置为以下值：重叠跨度＝1、重叠部分＝0.125、字阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值并且通过程序自身依据特定序列的组成和针对其对目的序列进行检测的特定数据库的组成建立。然而，可调节该值以增加敏感性。A％氨基酸序列同一性值通过将匹配的同一残基的数目除以在比对区域“更长”序列的总残基数得以确定。“更长”的序列是在比较区域具有最多真实残基的序列(忽略由WU-Blast-2为了最大化比对得分而引入的空位)。

“变体核酸”可包括这样的序列，所述序列与能够与本文所示的核苷酸序列杂交的序列互补。例如，变体序列与能够在严格条件下(例如50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0))和本文所示的核苷酸序列杂交的序列互补。更特别地，术语变体包含这样的序列，即其与在高严格条件下(例如65℃和0.1X SSC)和本文所示的核苷酸序列杂交的序列互补。变体核酸的解链温度(Tm)可比野生型核酸的Tm低约1、2或3℃。变体核酸包括与编码亲本酶的核酸具有特定百分比例如80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多核苷酸。

如本文所使用的术语“表达”是指通过其基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

“分离的”意思是该序列至少基本上没有至少一种与该序列天然相关联并且在自然中发现的其它成分，例如基因组序列。

“纯化的”意思是该物质处于相对纯的状态，例如至少约90％纯、至少约95％纯或至少约98％纯。

“热稳定”的意思是酶在暴露于升高的温度后仍然保持活性。通过其半寿期(t_1/2)测量酶的热稳定性，其中酶通过半寿期丧失了一半的酶活性。在确定的条件下通过测量剩余淀粉酶活性计算半寿期值。为确定酶的半寿期，将样本加热至测试温度1-10分钟，并且应用对于PS4活性的标准测定法，诸如测定法(Megazyme，Ireland)来测量活性。

如本文所使用的，“最佳pH”是指在pH范围内测量的这样的pH，即PS4或PS4变体在该pH处在PS4活性的标准测定法中展现出活性。

如本文所使用的那样，“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义，在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

如本文所用的那样，“核苷酸序列”或“核酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物、片段和衍生物。核苷酸序列可以是基因组、合成或重组来源的并且可以是双链或单链的，无论是表示有义或反义链。如本文所使用的那样，术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。

“同源物”的意思是与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定程度的同一性或“同源性”的实体。“同源序列”包括与另一序列具有一定百分比，例如80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多核苷酸或多肽。同一性百分比的意思是，当比对时，当比较两个序列时相同的碱基或氨基酸残基的百分比。当与主题序列相比较替换、缺失或添加了氨基酸时，氨基酸序列不是同一的。通常关于主题蛋白质的成熟序列测量序列同一性百分比，即例如在移除了信号序列之后。一般地，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性部位残基。同源物也保留了淀粉酶活性，尽管该同源物可能具有与野生型PS4不同的酶特性。

如本文所使用的，“杂交”包括这样的过程，即核酸链通过该过程与互补链通过碱基配对结合在一起，以及包括了如在聚合酶链反应(PCR)技术中进行扩增的过程。变体核酸可作为单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链体或RNA/DNA共聚物存在。如本文所使用的那样，“共聚物”是指包含核糖核酸和脱氧核糖核酸的单核酸链。可对变体核酸进行密码子优化以进一步增加表达。

如本文所使用的那样，“合成的”化合物是通过体外化学或酶合成产生的。其包括但不限于，用宿主生物的最优密码子使用制造的变体核酸，所述宿主生物诸如酵母细胞宿主或所选择的其它表达宿主。

如本文所使用的那样，“转化的细胞”包括已通过应用重组DNA技术进行转化的细胞，包括细菌和真菌细胞。通常通过将一个或多个核苷酸序列插入细胞进行转化。所插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列，即对待转化的细胞而言非天然的序列，诸如融合蛋白。

如本文所使用的那样，“有效连接的”的意思是所描述的元件处于允许它们以其预期的方式行使功能的关系当中。例如，与编码序列有效连接的调控序列以这样的方式连接，使得在与该控制序列相容的条件下实现该编码序列的表达。

如本文所使用的那样，“生物活性的”是指与天然存在的序列具有类似的结构、调控或生物化学功能的序列，尽管不必要具有相同的程度。如本文所使用的那样，术语“淀粉”是指包含植物(诸如玉米)的复杂多糖碳水化合物的任何材料，其包含具有式(C₆H₁₀O₅)_x的直连淀粉和支链淀粉，其中X可以是任意数字。术语“粒状淀粉”是指生的即未煮过的淀粉，例如，未进行胶化的淀粉。

术语“液化”是指淀粉转化过程中的转化阶段，其中水解胶化淀粉以得到低分子量可溶糊精。如本文所使用的那样，术语“糖化”是指淀粉至葡萄糖的酶转化。术语“聚合度”(DP)是指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单位的数量(n)。DP1的实例是单糖葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖麦芽糖和蔗糖。

如本文所使用的，术语“干固体含量”(ds)是指在干重百分比基础上的浆体的总固体。术语“浆体”是指含有不可溶固体的水性混合物。

术语“同时糖化和发酵(SSF)”是指在生物化学生产中的过程，其中微生物诸如产乙醇微生物和至少一种酶诸如PS4或其变体存在于同一个过程步骤期间。SSF是指同时水解粒状淀粉底物为糖以及发酵该糖为醇，例如，在同一个反应容器中。

如本文所使用的“产乙醇微生物”是指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。

1.2缩写

除非另外指出，否则使用以下缩写：

ADA          偶氮二酰胺

Amy3A        野生型嗜糖假单胞菌G4-形成淀粉酶

cDNA         互补DNA

CGTase       环糊精葡聚糖转移酶

DEAE         二乙氨乙醇

dH₂O         去离子水

DNA          脱氧核糖核酸

DP-n         具有n个亚单位的聚合度

ds           干固体

ds-DNA       双链DNA

EC           酶分类酶学委员会

FGSC         真菌遗传保存中心

G121F        SEQ ID NO：2的位置121的甘氨酸(G)残基被苯丙氨酸(F)残基替换，其中通过本领域公知的单字母缩写表示氨基酸。

HPLC        高效液相色谱法

LU          脂肪酶单位，每单位质量酶的磷脂酶活性测量

mRNA        信使核糖核酸

PCR         聚合酶链反应

PDB         蛋白质数据库

PEG         聚乙二醇

ppm         百万分之一

PS4         嗜糖假单胞菌G4-形成淀粉酶

RT-PCR      逆转录酶聚合酶链反应

SAS         嗜糖假单胞菌G4-形成淀粉酶

SDS-PAGE    十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1X SSC      0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0

SSF    同时糖化和发酵

t_1/2   半寿期

Tm     50％的主题蛋白质熔解的熔解温度(℃)

ΔTm   Tm的℃增加

w/v    重量/体积

w/w    重量/重量

2.嗜糖假单胞菌α-淀粉酶(PS4)和其变体

提供了分离的和/或纯化的包含PS4或其变体的多肽。在一个实施方案中，PS4是多肽的成熟形式(SEQ ID NO：1)，其中切割了21个氨基酸的前导序列，因此使得该多肽的N端在天冬氨酸(D)处开始。变体PS4包括其中C端淀粉结合结构域已被移除的PS4。其中已移除淀粉结合结构域的成熟PS4变体的代表性氨基酸序列是具有SEQ ID NO：1的残基1至429、或在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的序列。其它PS4变体包括其中相对于野生型PS4或具有SEQ IDNO：1的残基1-429的氨基酸序列的PS4，或在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：2添加或缺失了1至约25个氨基酸残基的变体。在一个方面，PS4变体具有SEQ ID NO：1的残基1-429的氨基酸序列，其中替换了1至约25之间任意数量的氨基酸。这些变体的代表性实施方案包括CF135(C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：3)、CF143(C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：4)、CF149(C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：5)和CF154(C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：6)。

在另一方面，PS4变体具有野生型PS4的序列，其中替换了1至约25之间任意数量的氨基酸。具有单氨基酸替换的PS4变体的代表性实例显示于表3。具有氨基酸替换组合的PS4变体的实例显示于表4和7。表4描述了已被修饰以形成核心变体序列的各种氨基酸，所述核心变体序列还如表7所列的PS4变体所示的那样额外地被修饰。表7还概述了各种突变体对内切和外切淀粉酶活性以及外切与内切淀粉酶活性比的影响。除了在表3-4中列出的氨基酸残基修饰，其它可进行修饰的特定PS4残基包括A3、S44、A93、G103、V109、G172、A211、G265、N302、G313和G342。PS4变体可具有本文所公开的氨基酸替换的各种组合。应用PS4变体的方法可包含单个PS4变体或PS4变体的组合或混合物的应用。

PS4变体可有利地产生比麦芽四糖更多的麦芽三糖。此外，PS4变体可比当前使用的淀粉酶诸如SPEZYME^TM Xtra(Danisco US Inc.，Genencor Division)产生更多的葡萄糖和麦芽糖。这导致观察到的更高的来自发酵的乙醇产量，在应用发酵葡萄糖和麦芽糖的酵母的实施方案中其可超过2.5％v/v乙醇。提供了与野生型PS4相比较具有相当高的内切淀粉酶活性和/或与野生型PS4相比较具有更低的外切与内切淀粉酶活性比的PS4变体。当单独使用或与其它PS4变体组合时，此类PS4变体在液化过程中尤其有用，其中复杂支链糖的内部切割使底物的粘度更低。

维持或增加热稳定性的氨基酸替换的代表性实例包括对变体CF135、CF143、CF149和CF154实施的替换。PS4变体CF135具有在C端融合有SEQ ID NO：1残基419-429的SEQ ID NO：3的氨基酸序列。这一变体含有氨基酸替换A141P。变体CF143具有在C端融合有SEQ ID NO：1残基419-429的SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其具有额外的替换G223A。变体CF149具有在C端融合有SEQ ID NO：1残基419-429的SEQ ID NO：5的氨基酸序列，其具有7个替换：G134R、A141P、G223A、I157L、H307L、S334P和D343E。变体CF154具有在C端融合有SEQ ID NO：1残基419-429的SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其具有与CF149相同的7个替换，以及还有替换N33Y、D34N、K71R、L178F和A179T。

其它特别有用的变体包括其中已替换了影响底物结合的残基的那些变体。参与底物结合的PS4残基包括在图9中描述的那些。特别的残基包括W66、I157、E160、S161、R196、W221、K222、H307和W308。替换影响底物结合的残基可影响PS4变体内切或外切活性的相对程度。增加外切活性的替换例如有利地促进DP3糖的形成，其中DP3糖可在玉米淀粉的发酵过程中被酿酒酵母代谢以制得乙醇。影响底物结合的突变的代表性实例包括E160G、E160P、E160F、E160R、E160S、E160L、W66S、R196V、R196H、R196P、H307L、W221A、W308A、W308S、W308L、W308S和K222T。还预期对残基D254、R196和E226(其参与和K222的离子对网络)的突变也是有用的，因为这些突变将间接地影响K222与底物的相互作用。提供了影响-4、-3、-2、+2和+3糖结合部位的特定PS4变体。变体包括影响这些位点子集的那些，尤其是影响-3、-2、+2或+3位置的那些。考虑了应用影响不同糖结合部位的突变的组合的方法。影响糖结合部位的具体突变公开于实施例中。

PS4变体可包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429、或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。与SEQID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1-429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，该PS4变体可能具有经改变的热稳定性、经改变的内切淀粉酶活性、经改变的外切淀粉酶活性、和/或经改变的外切与内切淀粉酶活性的比。该PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的N33Y、D34N、G70D、K71R、V113I、G121A/D/F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、Y198F、G223A/E/F、S229P、H272Q、V290I、G303E、H307K/L、A309P、S334P、W339E和/或D343E。PS4变体可包含SEQ ID NO：3、4、5或6的氨基酸序列。

在一些实施方案中，PS4变体可包含一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的7、8、32、38、49、62、63、64、67、72、73、74、75、76、104、106、107、110、112、116、119、122、123、124、125、126、128、130、137、138、140、142、143、144、148、149、150、151、154、156、163、164、168、169、182、183、192、195、196、200、202、208、213、220、222、225、226、227、232、233、234、236、237、239、253、255、257、260、264、267、269、271、276、282、285、295、297、300、302、305、308、312、323、324、325、341、358、367、379、390；一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、G9A、H13R、I46F、D68E、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70A/E/L/P/Q/S/V、K71M、G100A/S、G121/P/R、A131T、G134C、A141S、N145S、Y146D/E、G153A/D、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/K/P/R/T/V、G166N、I170E/K/L/M/N、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、A179S、G184Q、G188A、A199P、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S229N、W238E/G/K/P/Q/R、G303L、H307D/E/F/G/K/M/P/Q/R/S/W/Y  、A309E/I/M/T/V、S334A/H/K/L/M/Q/R/T和/或H335M；和/或在SEQ ID NO：1的位置420、422和/或424的一个或多个氨基酸替换。代表性的替换可包括：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、P7S、A8N、G9A、H13R、P32S、I38M、I46F、D49V、D62N、F63A/D/E/L/V、S64N/T、T67G/H/K/N/Q/R/V、D68E、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70A/E/L/P/Q/S/V、K71M、S72E/K/N/T、G73D/E/L/M/N/S/T、G74S、G75C/E/F/R/S/W/Y、E76V、G100A/S、G104N/R、G106K、V107M、L110F、D112E、N116D、N119E/G/S/Y、G121I/P/R、Y122A/E/Q/W、P123S、D124S、K125A/D/E/G/P/Q/W、E126D/N、N128E、P130S、A131T、G134C、R137C、N138D/E/S、C140A/R、A141S、D142E/G/N、P143T、G144E、N145S、Y146D/E、N148K/S、D149H/L/V、C150A、D151A/V/W、G153A/D、D154E/G/Y、F156Y、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/K/P/R/T/V、L163M、N164R、G166N、P168L、Q169D/E/G/K/N/R/V、I170E/K/L/M/N、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、R182D/G/H/M/S、S183G、G184Q、G188A、F192M/Y、V195D、R196A/G/K/P/Q/S/T/V/Y、A199P、P200A/G、R202K、S208T、S213N、L220A/T、K222M/Y、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S225E/G/V、E226C/D/G/W、Y227C/D/G/K/T、S229N、W232F/G/H/I/K/L/N/P/Q/R/S/T/Y、R233H、N234R、A236E、S237D/G、W238E/G/K/P/Q/R、Q239L、V253G、D255V、A257V、E260K/R、N264D、V267I、D269N/S/V、K271A/L/Q、G276R、W282S、V285A、T295C、Y297H、G300E、N302K、G303L、Q305E/L/T、H307D/E/F/G/K/M/P/Q/R/S/W/Y、W308A/C/G/K/N/Q/R/S/T、A309E/I/M/T/V、D312E、W323M、T324A/L/M、S325G、S334A/H/K/L/M/Q/R/T、H335M、Y341C/E、R358A/E/G/L/N/Q/T/V、S367Q/R、S379G和/或D390E，和/或SEQ ID NO：1的S420G、D422N/P/Q和/或G424D/S中的一个或多个替换。

在一些实施方案中，PS4变体可包含一个或多个在以下位置处的氨基替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的7、32、49、62、63、64、72、73、74、75、76、107、110、112、116、119、122、123、125、128、130、137、138、140、142、143、144、148、149、150、151、154、156、163、164、168、169、182、183、192、195、196、202、220、222、226、227、232、233、234、236、237、239、253、255、257、260、264、269、271、276、282、285、297、300、302、305、308、312、323、324、325、341、358、367和/或379；SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、H13R、I38M、I46F、T67G/H/K/N/Q/R/V、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70E/L/P/Q/V、K71M、G100A/S、G104R、G106K、G121I/P/R、D124S、E126D/N、A131T、G134C、A141S、N145S、Y146D/E、G153A/D、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/K/P/R/T/V、G166N、I170E/E/L/M/N、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、G188A、A199P、P200A、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S225E/G/V、W238E/G/K/P/Q/R、T295C、G303L、H307D/G/M/P/S、A309E/I/M/T/V、334A/H/K/L/M/Q/R/T、H335M和/或D390E；SEQ ID NO：1的一个或多个氨基酸替换S420G和/或D422/N/P/Q；和/或在SEQ ID NO：1的位置424处的氨基酸替换。代表性的替换可包括：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、P7S、H13R、P32S、I38M、I46F、D49V、D62N、F63A/D/E/L/V、S64N/T、T67G/H/K/N/Q/R/V、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70E/L/P/Q/V、K71M、S72E/K/N/T、G73D/E/L/M/N/S/T、G74S、G75C/E/F/R/S/W/Y、E76V、G100A/S、G104R、G106K、V107M、L110F、D112E、N116D、N119E/G/S/Y、G121I/P/R、Y122A/E/Q/W、P123S、D124S、K125A/D/E/G/P/Q/W、E126D/N、N128E、P130S、A131T、G134C、R137C、N138D/E/S、C140A/R、A141S、D142E/G/N、P143T、G144E、N145S、Y146D/E、N148K/S、D149H/L/V、C150A、D151A/V/W、G153A/D、D154E/G/Y、F156Y、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/K/P/R/T/V、L163M、N164R、G166N、P168L、Q169D/E/G/K/N/R/V、I170E/K/L/M/N、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、R182D/G/H/M/S、S183G、G188A、F192M/Y、V195D、R196A/G/K/P/Q/S/T/V/Y、A199P、P200A、R202K、L220A/T、K222M/Y、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S225E/G/V、E226C/D/G/W、Y227C/D/G/K/T、W232F/G/H/I/K/L/N/P/Q/R/S/T/Y、R233H、N234R、A236E、S237D/G、W238E/G/K/P/Q/R、Q239L、V253G、D255V、A257V、E260K/R、N264D、D269N/S/V、K271A/L/Q、G276R、W282S、V285A、T295C、Y297H、G300E、N302K、G303L、Q305E/L/T、H307D/G/M/P/S、W308A/C/G/K/N/Q/R/S/T、A309E/I/M/T/V、D312E、W323M、T324A/L/M、S325G、S334A/H/K/L/M/Q/R/T、H335M、Y341C/E、R358A/E/G/L/N/Q/T/V、S367Q/R、S379G和/或D390E；和/或一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1的S420G、D422N/P/Q和/或G424D/S。

在其它实施方案中，PS4变体可包含在以下位置处的一个或多个氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的49、62、63、64、72、73、74、75、76、107、112、116、119、122、123、125、128、130、137、140、143、144、148、149、150、151、154、156、163、164、168、169、182、183、192、195、196、202、257、282、285、297、300、305、308、312、323和/或325；一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、P7S、H13R、I38M、I46F、T67G/H/K/N/Q/R/V、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70E/L/P/Q/V、K71M、G100A/S、G104R、G106K、L110F、G121I/P/R、D124S、E126D/N、A131T、G134C、N138D/E、D142/E/G/N、N145S、Y146D/E、G153A/D、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/K/P/R/T/V、G166N、I170E/K/L/M、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、G188A、A199P、P200A、L220T、K222M/Y、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S225E/V、E226C/D/G/W、Y227C/D/G/K/T、W232F/G/H/I/K/N/P/Q/R/S/T/Y、R233H、N234R、A236E、S237D/G、W238E/G/K/P/Q/R、Q239L、V253G、D255V、E260K/R、N264D、D269N/S/V、K271A/L/Q、G276R、T295C、N302K、G303L、H307D/G/M/P/S、A309E/I/M/T/V、T324L/M、S334A/H/K/L/M/Q/R/T、H335M、Y341C/E、R358A/E/G/L/N/Q/T/V、S367Q/R、S379G和/或D390E；以及一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1的S420G、D422/N/P/Q和/或G424S。代表性替换可包括：SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的A3T、P7S、H13R、I38M、I46F、D49V、D62N、F63A/D/E/L/V、S64N/T、T67G/H/K/N/Q/R/V、G69A/E/H/I/K/M/R/T、G70E/L/P/Q/V、K71M、S72E/K/N/T、G73D/E/L/M/N/S/T、G74S、G75C/E/F/R/S/W/Y、E76V、G100A/S、G104R、G106K、V107M、L110F、D112E、N116D、N119E/G/S/Y、G121I/P/R、Y122A/E/Q/W、P123S、D124S、K125A/D/E/G/P/Q/W、E126D/N、N128E、P130S、A131T、G134C、R137C、N138D/E、C140A/R、D142E/G/N、P143T、G144E、N145S、Y146D/E、N148K/S、D149H/L/V、C150A、D151A/V/W、G153A/D、D154E/G/Y、F156Y、G158C/F/I/L/P/Q/V、S161G/H/KP/R/T/V、L163M、N164R、G166N、P168L、Q169E/G/K/N/R/V、I170E/K/L/M、L178N/Q/W、A179E/N/P/R/S、R182D/G/H/M/S、S183G、G188A、F192M/Y、V195D、R196A/G/K/P/Q/S/T/V/Y、A199P、P200A、R202K、L220T、K222M/Y、G223C/F/H/M/N/Q/W/Y、S225E/V、E226C/D/G/W、Y227C/D/G/K/T、W232F/G/H/I/K/N/P/Q/R/S/T/Y、R233H、N234R、A236E、S237D/G、W238E/G/K/P/Q/R、Q239L、V253G、D255V、A257V、E260K/R、N264D、D269N/S/V、K271A/L/Q、G276R、W282S、V285A、T295C、Y297H、G300E、N302K、G303L、Q305E/L/T、H307D/G/M/P/S、W308A/C/G/K/N/Q/R/S/T、A309E/I/M/T/V、D312E、W323M、T324L/M、S325G、S334A/H/K/L/M/Q/R/T、H335M、Y341C/E、R358A/E/G/L/N/Q/T/V、S367Q/R、S379G和/或D390E，和/或一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1的S420G、D422N/P/Q和/或G424S。

与SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的氨基酸序列相比较，PS4变体可具有达25、23、21、19、17、15、13或11个氨基酸缺失、添加、插入或替换。

PS4变体可包含额外的一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQID NO：1或2的N33、D34、G70、G121、G134、A141、Y146、I157、S161、L178、A179、G223、S229、H307、A309和/或S334。代表性的替换可包括：SEQ ID NO：1或2的N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P和/或S334P。

在其它实施方案中，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，PS4变体可具有经改变的热稳定性。与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，该经改变的热稳定性可以是升高的热稳定性。更热稳定的PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的A3T、I38M、G70L、Q169K/R、R182G/H、P200G、G223N、S237D、D269V、K271A/Q、S367Q/R、S379G和/或S420G。此外，该PS4变体可包含额外的一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的G134、A141、I157、G223、H307、S334和/或D343。代表性的替换可包括：SEQ ID NO：1或2的G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P和/或D343E。该PS4变体可还包含一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的N33、D34、K71、L178和/或A179。代表性的替换可包括：SEQ ID NO：1或2的N33Y、D34N、K71R、L178F和/或A179T。

在再另一实施方案中，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，PS4变体可具有经改变的内切淀粉酶活性、经改变的外切淀粉酶活性和/或经改变的外切与内切淀粉酶活性比。该PS4变体可包含一个或多个以下氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的A3T、G69K、G70E、K71M、G73D/E、G75C/E、Y122A、C140A、G144E、Y146D/E、N148K、C150A、D151A/V/W、G153A、G158I/P、S161G/H/K/P/R、Q169D/E/G/N/R、R196Q/S/T、R202K、S208T、S213N、K222M、G223C/F/H/M/Q/W/Y、E226D、Y227D/G/K/T、S229N、W232Q/S/T、T295C、Q305T、W308A/C/G/Q/R/S/T、A309I/V、W323M、T324L/M、S334A/H/M/Q和/或R358E/L/N/Q/T/V。此外，该PS4变体可包含额外的一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQ ID NO：1或2的W66、I157、E160、S161、R196、W221、K222、E226、D254、Q305、H307和/或W308。代表性的替换可包括：SEQ ID NO：1或2的W66S、E160F/G/L/P/R/S、S161A、R196H/P/V、W221A、K222T、Q305T/L、H307L和/或W308A/L/S。

本公开还涉及如表4所述的每一个和任一个核心变体序列或骨架，其包含如表7中为每一变体所示的替换模式。本公开还涉及精确叙述的如表4所示的具有如在表7中所述替换的变体，即仅含有如表7所示突变或替换模式的核心变体序列。本公开还涉及包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且包含如表7所示替换模式的PS4变体。此外，本公开还涉及包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且仅包含如表7所示替换模式的PS4变体。

还提供了编码上述多肽的核酸。在一个实施方案中，编码PS4变体的核酸是编码包含SEQ ID NO：1的残基1至429氨基酸序列的蛋白质的cDNA。例如，该cDNA可以具有SEQ ID NO：7所示天然mRNA的相应序列。参见GenBank登录号X16732。如本领域技术人员所理解的那样，遗传密码是简并性的，意味着在一些情况下多个密码子可能编码相同的氨基酸。核酸包括编码PS4变体的基因组DNA、mRNA和cDNA。

2.1.PS4变体表征

酶变体可通过它们的核酸和一级多肽序列、通过三维结构模建和/或通过它们的特定活性得以表征。PS4变体的其它特征例如包括稳定性、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。可应用本领域技术人员公知的标准测定法评估表达和酶活性水平。另一方面，变体展现出相对于野生型酶的经改良的表现特征，诸如在高温例如65-85℃的改良的稳定性。PS4变体对于在液化或其它需要升高温度的方法(诸如烘烤)中使用是有利的。例如，热稳定PS4变体可在约55℃至约85℃或更高的温度下降解淀粉。

表达特征的意思是当在特定宿主细胞中产生变体时，该变体的经改变的表达水平。表达一般地与在给定时间量中可用本领域公知的标准技术从发酵肉汤中移除的活性变体的量相关。表达还可与在宿主细胞中产生的或通过该宿主分泌的变体的量或速率相关。表达还可与编码该变体酶的mRNA的翻译速率相关。

提供了与编码本文所示的任意PS4变体的核酸互补的核酸。此外，还提供了能与该互补体杂交的核酸。在另一实施方案中，在本文描述的方法和组合物中使用的序列是合成的序列。其包括但不限于用在宿主生物(诸如酵母)用于表达的最佳密码子使用产生的序列。

3.PS4变体的产生

可根据本领域公知的方法合成地或通过在宿主细胞细胞中重组表达本文提供的PS4变体。表达的PS4变体任选地在使用之前分离。在另一实施方案中，在表达之后纯化PS4变体。遗传修饰和重组产生PS4变体的方法例如描述于美国专利号7,371,552、7,166,453；6,890,572和6,667,065；以及美国专利公开号2007/0141693；2007/0072270；2007/0020731；2007/0020727；2006/0073583；2006/0019347；2006/0018997；2006/0008890；2006/0008888和2005/0137111。这些公开的相关教导，包括编码PS4的多核苷酸序列、引物、载体、筛选方法、宿主细胞、纯化和重构所表达的PS4变体、以及PS4变体的表征，包括用于酶测试的有用的缓冲液、pH范围、Ca2+浓度、底物浓度和酶浓度，均在此引入作为参考。

在另一实施方案中，合适的宿主细胞包括选自以下的革兰氏阳性细菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽胞杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝固芽胞杆菌(B.coagulans)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、灿烂芽胞杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)；或革兰氏阴性细菌，其中所述的革兰氏阴性细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在一个实施方案中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌，并且所表达的蛋白质经改造以包含枯草芽孢杆菌信号序列，如以下进一步详述。

在一个实施方案中，遗传改造宿主细胞以表达与野生型PS4具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的PS4变体。在一些实施方案中，编码PS4变体的多核苷酸将具有编码SEQ ID NO：1或2的蛋白质的核酸序列，或与编码SEQ ID NO：1或2的蛋白质的核酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。在一个实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：7的核酸具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

3.1.载体

在一些实施方案中，将在表达载体中包含编码PS4变体的核酸的DNA构建体转移至宿主细胞中，所述表达载体包含与PS4编码序列有效连接的调控序列。载体可以是能整合至真菌宿主细胞基因组中并当导入至宿主细胞后复制的任何载体。密苏里大学的菌株FGSC目录列出了合适的载体。合适的表达和/或整合载体的其它实例在Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York(2001)；Bennett等，More GeneManipulations in Fungi，Academic Press，San Diego(1991)，pp.396-428；和美国专利号5,874,276中提供。示例性载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D、pDON^TM201、pDONR^TM221、pENTR^TM、

和

用于细菌细胞的示例包括pBR322和pUC19，其允许在大肠杆菌中复制；和例如pE194，其允许在芽胞杆菌属中复制。

在一些实施方案中，将编码PS4变体的核酸与合适的启动子有效地连接，其中所述的启动子允许在宿主细胞中转录。启动子可衍生自编码对于宿主细胞而言同源或异源的蛋白质的基因。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1和egl2启动子。在一个实施方案中，启动子是宿主细胞天然的启动子。例如，当嗜糖假单胞菌是宿主时，启动子是天然的嗜糖假单胞菌启动子。“可诱导启动子”是在环境或发育调控下有活性的启动子。在另一实施方案中，启动子是对于宿主细胞而言异源的启动子。

在一个实施方案中，将编码序列与编码信号序列的DNA序列有效连接。代表性的信号肽是SEQ ID NO：8，其是PS4前体的天然信号序列。在其它实施方案中，用编码来自非嗜糖假单胞菌物种的信号序列的核苷酸序列替换编码信号序列的DNA。在这一实施方案中，编码信号序列的多核苷酸紧接在上游并且符合编码多肽的多核苷酸的阅读框。信号序列可以选自与宿主相同的物种。在一个非限制性实施方案中，信号序列是来自芽胞杆菌属的环糊精葡聚糖转移酶(CGTase；EC 2.4.1.19)信号序列，并在枯草芽孢杆菌宿主细胞中表达PS4变体。可将甲硫氨酸残基添加到信号序列的N端。

在其它实施方案中，包含在待引入至真菌宿主细胞DNA构建体或载体中的信号序列和启动子衍生自相同的来源。在一些实施方案中，表达载体还包括终止序列。在一个实施方案中，终止序列和启动子序列衍生自相同的来源。在另一实施方案中，终止序列对宿主细胞是同源的。

在一些实施方案中，表达载体包括可选择标记。合适的可选择标记的实例包括赋予对抗微生物剂例如潮霉素或腐草霉素的抗性的那些。营养性选择标记也是合适的，并且包括amdS、argB和pyr4。在一个实施方案中，可选择标记是amdS基因，其编码酶乙酰胺酶，其允许经转化的细胞以乙酰胺作为氮源而生长。应用构巢曲霉(A.nidulans)amdS基因作为选择标记描述于Kelley等，EMBO J.4：475-479(1985)和Penttila等，Gene 61：155-164(1987)。

包含具有编码PS4变体的多核苷酸的DNA构建体的合适表达载体可以是能够在给定宿主生物中自主复制或整合至宿主DNA中的任意载体。在一些实施方案中，表达载体是质粒。在一些实施方案中，考虑了两类用于获得基因表达的表达载体。第一种载体包含这样的DNA序列，即其中启动子、PS4编码区和终止子全部源自待表达的基因。在一些实施方案中，通过缺失不需要的DNA序列(例如，编码C端淀粉结合结构域的DNA)获得基因截短，以留下在其自身转录和翻译调控序列的控制下表达的结构域。在第二类表达载体是预装配的并且含有高水平转录所需的序列和可选择标记。在一些实施方案中，将PS4基因的编码区或其部分插入这一通用表达载体中，使得其在表达构建体启动子和终止子序列的转录控制之下。在一些实施方案中，将基因或其部分插入强cbh1启动子下游。

3.2.转化、表达和宿主细胞培养

将DNA构建体和载体引入宿主细胞包括诸如转化、电穿孔、核酸微注射、转导、转染(例如，脂质介导和DEAE-葡聚糖介导的转染)、与磷酸钙DNA沉淀温育、用包被有DNA的微粒高速轰击、以及原生质体融合。一般的转化技术是本领域公知的。例如参见Ausubel等(1987)，同上，第9章；Sambrook等(2001)，同上；以及Campbell等，Curr.Genet.16：53-56(1989)。在木霉属(Trichoderma)中表达异源蛋白例如描述于美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；Harkki等，Enzyme Microb.Technol.13：227-233(1991)；Harkki等，BioTechnol.7：596-603(1989)；EP 244,234和EP 215,594。在一个实施方案中，用载体系统构建遗传稳定的转化体，由此将编码PS4的核酸稳定整合至宿主细胞染色体中。然后通过公知的技术纯化转化子。

在一个非限制性的实例中，包括amdS标记的稳定转化子通过它们在含有乙酰胺的固体培养基上较快的生长速率以及形成光滑的圆菌落而非粗糙的外形而与不稳定的转化子相区分。此外，在一些情况下，通过以下方法进行进一步的稳定性测试：在固体非选择培养基(例如，无乙酰胺的培养基)上培养转化子、从这一培养基收获孢子并且确定在含有乙酰胺的选择性培养基上随后萌芽并生长的孢子百分比。可使用其它本领域公知的方法选择转化子。

3.3.PS4活性鉴定

为评估PS4变体在宿主细胞中的表达，测定法可测量表达的蛋白质、相应的mRNA和α-淀粉酶活性。例如，合适的测定法包括DNA和RNA印迹、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)以及应用合适的经标记杂交探针的原位杂交。合适的测定法还包括在样本中测量PS4活性。PS4变体外切活性的合适测定法包括但不限于

测定法(Megazyme，Ireland)。PS4变体内切活性的合适测定法包括但不限于Phadebas blue测定法(Pharmacia and Upjohn Diagnostics AB)。测定法还包括HPLC分析PS4变体存在下制备的液化物。HPLC可通过将DP-3和DP-4糖从该测定法的其它组分中分离而用于测量淀粉酶活性。

3.4.纯化PS4的方法

一般地，在细胞培养物中产生的PS4将分泌至培养基中，并且可例如通过从细胞培养基中移除不想要的组分而纯化或分离。在这种情况下，应用本领域技术人员惯用的技术从产生酶的细胞中纯化该酶。实例包括但不限于：亲和层析；离子交换色谱法，包括高分辨离子交换；疏水相互作用色谱法；两相分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石或在阳离子交换树脂(诸如DEAE)上的色谱法；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；以及例如应用SeDhadex G-75的凝胶过滤。

4.PS4变体的组合物和用途

通过上述方法产生和纯化的PS4变体可用于各种工业应用。在一个实施方案中，PS4变体可用于淀粉转化过程中，尤其是淀粉的液化过程中，所述淀粉例如是玉米淀粉、小麦淀粉或大麦淀粉。期望的终产物可以是可通过淀粉底物的酶转化产生的任意产物。例如，期望的产物可以是富含可用于发酵的糖的糖浆，所述糖尤其是麦芽三糖、葡萄糖和/或麦芽糖。然后可在发酵过程中直接使用该终产物以产生用作燃料或饮料(例如，饮用醇)的醇。本领域技术人员了解可用于产生乙醇或其它发酵终产物的各种发酵条件。能发酵麦芽三糖和/或较不复杂的糖的微生物，诸如酿酒酵母或其遗传修饰变体是特别有用的。对发酵麦芽三糖尤其有用的合适的经遗传改变的酿酒酵母变体包括表达AGT1透酶(Stambuck等，Lett.Appl.Microbiol.43：370-76(2006))、MTT1和MTT1alt(Dietvorst等，Yeast 22：775-88(2005))或MAL32(Dietvorst等，Yeast 24：27-38(2007))的变体。PS4变体还可用于食物制备的组合物和方法中，其中需要在高温下表达淀粉酶活性的酶。

应用特定PS4变体的合意性将取决于该PS4变体相对于特定应用的需求所展示的总体性质。一般而言，对淀粉转化过程有用的PS4变体与野生型PS4相比具有相当高的内切淀粉酶活性，和/或与野生型PS4变体具有更低的外切与内切淀粉酶活性比。当单独使用或与其它PS4变体联合时，此类PS4变体特别可用于液化过程，其中复杂支链糖的内部切割降低了底物的粘度。然而，期望可用于液化的一些PS4变体具有与野生型PS4相当的或甚至比其更低的内切淀粉酶活性。取决于应用，有用的PS4变体包括比野生型PS4具有更高或更低外切淀粉酶活性的那些变体。组合物可包括一种PS4变体，或包括PS4变体的组合，其每一种可展示不同的特性集合。

4.1.淀粉底物的制备

本领域技术人员熟知可用于制备在本文公开的方法中使用的淀粉底物的可利用方法。例如，可从块茎、根、茎、荚果、谷物或整个作物中获得有用的淀粉底物。更特别的，粒状淀粉来自产生高量淀粉的植物。例如，粒状淀粉可获自：玉米、玉米穗、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。玉米含有约60-68％淀粉；大麦含有约55-65％淀粉；黍含有约75-80％淀粉；小麦含有约60-65％淀粉；以及白米含有约70-72％淀粉。特别考虑的淀粉底物是玉米淀粉、小麦淀粉和大麦淀粉。来自谷物的淀粉可以是磨过的或完整的，并且包括谷物固体，诸如粒子、麸和/或穗轴。淀粉可以是高度精制的生淀粉或来自淀粉精制过程的原料。许多淀粉还是可商购的。例如，玉米淀粉可获自Cerestar，Sigma和Katayama Chemical Industry Co.(日本)；小麦淀粉可获自Sigma；甜马铃薯淀粉可获自Wako Pure Chemical Industry Co.(日本)；以及马铃薯淀粉可获自Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.(日本)。

淀粉底物可以是来自经研磨的整谷物的粗淀粉，多数整谷物含有非淀粉部分，例如胚残余物和纤维。研磨可包含湿研磨或干研磨。在湿研磨中，将整谷物浸泡在水或稀释的酸中，以将该谷物分离为其组成部分，例如，淀粉、蛋白质、胚、油、核纤维。湿研磨有效地分离胚和粗粉(即，淀粉颗粒和蛋白质)并且特别适于产生糖浆。在干研磨中，将完整核研磨为精细粉末并且在不将谷物分为其组成部分的情况下加工。干研磨的谷物因此除了淀粉外还将包含显著量的非淀粉碳水化合物。多数乙醇来自干研磨。备选地，待加工的淀粉可以是高度精制的淀粉质量，例如，至少约90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯。

4.2.淀粉的胶化和液化

如本文所使用的那样，术语“液化”意指通过其将淀粉转化为更不粘以及更短链糊精的过程。这一过程涉及同时或随后添加PS4变体的淀粉胶化。优选将热稳定PS4变体用于这一应用。还可任选地添加其它诱导液化的酶。

在一些实施方案中，如上所述制备的淀粉底物是有水的浆体。淀粉浆可含有约10-55％、约20-45％、约30-45％、约30-40％、或约30-35％干固体重量百分比的淀粉。例如通常以约每kg淀粉干物质1500单位提供α-淀粉酶。为优化α-淀粉酶稳定性和活性，可将浆液的pH调节至PS4变体的最佳pH。可添加其它的α-淀粉酶并且可能需要不同的最佳条件。可通过在随后的反应步骤中降低pH或通过从浆液中移除钙从而失活液化后剩余在浆液中的细菌α-淀粉酶。

可通过喷射式煮浆锅连续泵送淀粉浆加PS4变体，其为在约85℃至105℃加热的蒸汽。在这些条件下胶化非常迅速地发生，并且酶活性与显著剪切力的结合开始了淀粉底物的水解。在喷射式煮浆锅中的停留时间很短。部分胶化的淀粉可进入一系列保持在85-105℃的收集管中，并且维持5分钟以完成胶化过程。这些罐可含有挡板以防止回混合。如本文所使用的，术语“次级液化”是指在当使得浆液冷却至室温后，初级液化之后的液化步骤。这一冷却步骤可以是约30分钟至约180分钟，例如约90分钟至120分钟。

4.3.发酵过程

将一般来自酵母属(Saccharomyces spp.)的酵母添加至浆状物中并且进行发酵24-96小时，诸如一般为35-60小时。温度为约26-34℃，一般为约32℃，以及pH为约pH 3-6，一般为约pH 4-5。

在一个实施方案中，在封闭的系统中应用分批发酵法，其中在发酵的开始设定培养基组合物，并且在发酵期间不改变。在发酵的开始，用需要的微生物接种培养基。在这一方法中，允许发酵在不添加任何成分至该系统的情况下进行。一般地，分批发酵就添加碳源而言取得“分批”的资格，并且通常意图控制诸如pH和氧含量的因素。分批系统的代谢和生物量组成持续改变，直到发酵停止的时间。在分批培养物中，细胞从静态延滞期发展至高生长对数期，并且最后为平台期，在平台期生长减少或停止。如果未处理，在平台期的细胞最终死亡。一般地，在对数期的细胞负责产生大多数的产物。

标准分批系统的合适的变形为“补料分批发酵系统”。在典型发酵系统的这一变形中，随发酵进展增量地添加底物。当分解代谢物阻遏可能会抑制细胞代谢时以及当需要获得培养基中有限量的底物时，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中测量真实底物浓度是困难的，因此其通常在可测量因素，诸如pH、溶解氧和废气(诸如CO₂)分压的改变的基础上进行估计。分批发酵和补料分批发酵是常用的并且是本领域公知的。

连续发酵是开放系统，其中将确定的发酵培养基连续添加至生物反应器中，并且同时移除等量的条件培养基用于加工。连续发酵通常使培养物维持在恒定高密度下，其中细胞主要为对数期生长。连续发酵允许调整一个或多个影响细胞生长和/或产物浓度的因素。例如，在一个实施方案中，以固定的速率维持限制性营养物，诸如碳源或氮源，并且允许调整所有其它参数。在其它系统中，可连续地改变影响生长的许多因素，而使通过培养基混浊度测得的细胞浓度维持稳定。连续系统努力维持稳态生长条件。因此，由于抽取培养基而造成的细胞丧失应当与发酵中的细胞生长率平衡。调整营养物和连续发酵方法中的生长因素的方法，以及最大化产物形成速率的技术是工业微生物领域所公知的。

发酵后，蒸馏醪液以提取乙醇。根据本发明方法获得的乙醇例如可用作燃料乙醇；饮用乙醇，即饮料中性酒精；或工业乙醇。从发酵中剩余的是谷物，其通常用于液态形式或干的动物饲料。如何进行液化、糖化、发酵、蒸馏和回收乙醇的其它细节是本领域技术人员公知的。根据本发明的方法，可同时或分开地进行糖化和发酵。

5.纺织品退浆组合物和用途

还考虑了使用PS4变体处理织物(例如，退浆纺织品)的组合物和方法。织物处理方法是本领域公知的(例如参见美国专利号6,077,316)。例如，在一个方面，通过包括使织物与溶液中的PS4变体接触的方法改善织物的触感和表观。在一个方面，在压力下用溶液处理织物。

在一个方面，在编织纺织品期间或之后、或在退浆阶段期间、或在一个或多个额外的纺织品加工步骤中应用PS4变体。在编织纺织品期间，将丝暴露于大量的机械应变中。在纺织机上编织之前，经纱通常涂布有上浆淀粉或淀粉衍生物以增加它们的抗张强度以及防止断裂。可在编织期间或之后应用PS4变体以移除这些上浆淀粉或淀粉衍生物。编织之后，可在进一步加工该织物之前应用PS4变体以移除上浆涂料，以确保匀质且耐洗的结果。

PS4变体可单独地，或与其它退浆化学试剂和/或退浆酶一起作为洗涤剂添加剂(例如，在水性组合物中)使用以退浆包括含棉织物在内的织物。PS4变体还可用于在靛蓝染色的劳动布织物和服装上产生砂洗外观的组合物和方法中。为生产服装，可将织物切割并缝合为衣服或服装，其是在后完成的。特别地，为生产劳动布牛仔裤，已开发了不同的酶精加工方法。劳动布服装的精加工通常以酶退浆步骤开始，期间使服装经受淀粉分解酶的作用，以给纺织品提供柔软度以及使得棉更易在随后的酶精制步骤使用。PS4变体可在精制劳动布服装(例如，“生物石磨(bio-stoning)方法)、酶退浆和对纺织品提供柔软度的方法和/或精制过程中使用。

实施例

实施例1

确定热熔点。应用差示扫描量热计表征野生型PS4和PS4变体：CF135(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：3)、CF143(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：4)、CF149(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：5)和CF154(在C端融合有SEQ ID NO：1的残基419-429的SEQ ID NO：6)的热解折叠中点(Tm)。将Tm用作各种酶热稳定性的指示。应用超灵敏扫描高通量微量热计VP-Cap DSC(MicroCal，Inc.，Northampton，MA)测量过量热容曲线。每一DSC运行需要约500μL 500ppm的蛋白质，并且在30-120℃温度范围应用200℃/hr的扫描速率扫描样本。然后重扫描相同的样本以检验该过程的可逆性。对于野生型和变体蛋白质，热解折叠过程是不可逆的。缓冲液是含有0.002％吐温20的10mM醋酸钠，pH 5.5。野生型PS4和PS4变体的Tm值，以及由于突变造成的Tm的升高(ΔTm)，如表1所示：

表1

所有的PS4变体均显示出相对于野生型PS4的热解折叠中点的升高。野生型PS4相对于突变的Tm是野生型PS4＜PS4CF 135＜PS4CF143＜PS4CF149＜PS4CF154。

测量热稳定性。备选地，通过在升高温度下测量给定PS4变体的半寿期评估其热稳定性，因为在一级反应之后热失活。为此，在(1)50mM柠檬酸钠、5mM氯化钙，pH 6.5；(2)50mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.5；或(3)50mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、2mM氯化钙，pH 5.0中在72℃、75℃、80℃或85℃中温育给定变体1-30分钟后测量其残余淀粉酶活性。应用

测定法(Megazyme，Ireland)确定残余淀粉酶活性。测定混合物含有50μL 50mM柠檬酸钠、5mM氯化钙，pH6.5，具有25μL酶样本和25μL Betamyl底物(对硝基酚(PNP)偶联的麦芽五糖(Glc5)和α-葡糖苷酶)。一个Betamyl单位定义为降解0.0351摩尔/分钟的PNP偶联的麦芽五糖的活性。该测定法含有50μL 50mM柠檬酸钠、5mM氯化钙，pH 6.5，和25μL Betamyl底物。在40℃温育该测定混合物30分钟，然后通过添加150μL 4％Tris终止。应用ELISA读数仪测量在420nm的吸光度，并且根据以下公式计算Betamyl活性：活性＝A420x d，以Betamyl单位/ml所测定的酶样本为单位，其中“d”是酶样本的稀释倍数。各种PS4变体的半寿期如表7所示。

实施例2

确定淀粉液化性能。通过淀粉液化物粘度的减少率测量野生型PS4和热稳定PS4变体的淀粉液化性能。应用热VT55O粘度计确定粘度。将包含淀粉底物和适量酶的浆液倒入粘度计导管中。在加热至85℃并连续温育额外的60至120分钟期间记录温度和粘度。作为时间的函数以μNm测量粘度。

野生型PS4在高温例如70-85℃液化淀粉。考虑到野生型PS4的66.5℃的熔解温度，这一结果是显著的。然而，用野生型PS4获得的相对高的终粘度暗示野生型PS4在这些温度下具有有限的性能。

在全长、野生型PS4(“Amy3A”)和PS4变体CF135和CF143之间比较了液化性能。如图1所示，PS4变体以与Amy3A相当的速率液化玉米淀粉。此外，应用CF135和CF143的液化物的终粘度更低，表明这些PS4变体在这一测定法中展示出较Amy3A更好的性能。

用CF149和CF154与SPEZYME^TM Xtra相比较的淀粉液化。为测试酵母从应用PS4作为α-淀粉酶产生的玉米液化物中产生乙醇的能力，在对粘度计中产生的液化物运行的常规乙醇发酵过程中将热稳定PS4变体CF135、CF143、CF149和CF154与SPEZYME^TM Xtra(Danisco US Inc.，Genencor Division)进行比较。将4.86mg/mL的Xtra溶液加入到2.0μg/g干固体中。将PS4变体CF149(纯化的，32.7mg/mL)加入到46.7μg/g干固体中，和将PS4变体CF154(纯化的，15.9mg/mL)加入到46.7μg/g干固体中。淀粉溶液是30％干固体玉米粉(15g总干固体)，pH 5.8，其中用H₂SO₄或NH₄OH根据需要调节pH。在加入酶之前，将淀粉溶液在70℃预温育10分钟。将保持反应的粘度计在70℃，100rpm转动下维持1分钟。在12分钟中将温度升高至85℃，以75rpm旋转。然后在85℃在75rpm旋转下进行反应20分钟。

使用CF149、CF154或SPEZYME^TM Xtra液化物的发酵。对每一酶进行两个粘度计运行，以产生足够的液化物用于一个50g发酵。在每一粘度计运行之后，收集液化物；汇集来自每一对粘度计运行的液化物。在125mL锥形瓶中一式两份地进行发酵。由于记时约束，在分开的日子开始重复的发酵。

对于每一单个的50g发酵，将pH调节至pH 4.3。不调整％干固体。以400ppm的终浓度加入尿素。以0.33％(w/w)的比例添加Red StarEthanol Red酵母；在等分500μL至烧瓶之前作为33％(w/v)浆液预水解酵母。

在32℃温育烧瓶，并以400rpm搅拌，发酵48小时。PS4液化物发酵减缓了缓慢的搅拌，而Xtra液化物发酵完全没有搅拌。在t＝0、14h、23h、39h和48h取出样本，并通过HPLC分析。

结果。来自应用PS4液化物的发酵的终乙醇产量平均为3.2％和3.3％(v/v)，而来自应用Xtra液化物的发酵的终乙醇产量平均为2.2％(v/v)。参见图2，表2。在发酵中PS4液化物的乙醇水平比Xtra液化物的乙醇水平更高。PS4液化物的发酵显示出以更多的葡萄糖和麦芽糖开始，这两者都在14小时随着乙醇水平的升高而减少，如从图2和图3的比较所显示的那样。

表2

样本	终乙醇(v/v)％
		Xtra液化物	2.20
PS4CF149液化物	3.26
		PS4CF154液化物	3.19

应用液化反应的HPLC分析确定高DP糖的水平。图4描述了DP-2糖浓度随时间的减少。图5-7显示了从反应的开始随时间(小时)产生的DP-n糖的全部范围。PS4变体液化物以比Xtra液化物显著更低量的DP-4糖、以及相对更高量的DP-2、DP-3和DP-4糖开始。DP-3水平在发酵中对于PS4液化物保持相当的恒定，而对于Xtra液化物则显示出稍微地降低。对于所有三个液化物DP-4峰值也保持相当的恒定。由PS4变体产生的主要碳水化合物是麦芽三糖(DP-3)。

实施例3

天然PS4的结晶和结构确定。应用Hampton PEG6000屏获得野生型PS4催化核心的结晶。在10-30％PEG6000，在6-8的pH范围获得大的单结晶。还通过在4℃无沉淀地储存蛋白质储存溶液获得具有类似形态的结晶。

用R-AXIS IV应用来自RU200发生器的CuKα辐射在室温下收集数据，并且应用d＊TREK(MSC，The Woodland，Texas)处理。单元外形与施氏假单胞菌G4-淀粉酶的晶体形式II的那些几乎相同。参见Yoshioka等，J.Mol.Biol.271：619-28(1997)；Hasegawa等，Protein Eng.12：819-24(1999)。因此不必要分子替换计算，并且应用刚体精修开始结构精修。来自RCSB蛋白质数据库(PDB)登录号1JDC的G4-淀粉酶结构与配体缺失一起使用。每一同源物之间的氨基酸差异在2Fo-Fc差异图谱中是显而易见的，并且应用COOT手工构建正确的嗜糖假单胞菌结构。然后应用包括在Collaborative Computational Project，第4号(CCP4)程序组中的REFMAC5进行精修。参见CCP4，“The CCP4Suite：Programs for ProteinCrystallography，”Acta Cryst.D50：760-63(1994)。应用COOT确定水分子，并且应用REFMAC5完成精修。应用可在Dundee PRODRG2服务器上获得的PRODRG产生REFMAC5的配体原子标记和几何学文件。

实施例4

PS4的总体结构。PS4催化核心的天然结构由418个氨基酸、2个钙原子和115个水分子组成。具有阿卡波糖(假四糖)的天然PS4的结构由418个氨基酸、2个钙原子、76个水分子和阿卡波糖衍生的具有7个糖残基的抑制剂组成。PS4的催化核心具有GH13酶共有的保守的3个结构域结构。结构域A由(β/α)8片层桶组成，结构域B是在β-片层3和α-螺旋3之间插入这一片层桶的插入物，其在这一酶中相对无特定结构，并且其含有保守的钙离子。结构域C是在Greek关键基序(Greek key motif)中的5-链反向平行β-片层。结构域C包被了结构域A的C端。与施氏假单胞菌(P.stutzeri)MO-19G4-淀粉酶一样，在N端区域结合有第二个钙离子。

实施例5

抑制剂结合的PS4的制备。将阿卡波糖添加到在储存缓冲液中生长的结晶母液当中，然后使该母液在4℃温育24小时。如上述那样在室温收集数据并加工。手工地将配体拟合至所观察到的差异密度中，并且应用REFMAC5精修蛋白质配体复合物。参见图8。

实施例6

酶抑制剂相互作用的分析。应用Chemical Computing Group(Montreal，Canada)Molecular Operating Environment(MOE)程序根据该程序提供的参数和说明书分析和表征酶-抑制剂相互作用。与PS4结合的抑制剂描述于图8。酶的糖结合亚部位的命名是Davies等人，Biochem J.321：661-72(1997)的命名，并且叠加在图9中结合的抑制剂的描述之上。发现抑制剂在分子表面的深裂口中，位于(β/α)8片层桶的C端。检查收集自PS4天然晶体和用阿卡波糖浸泡24小时的晶体的数据的Fourier图谱的差异揭示与酶活性部位的-4至+3糖亚部位结合的至少7个糖残基的非常明显和连续的差异密度。这表明结晶的PS4与阿卡波糖反应，产生跨过酶活性部位结合的转糖基产物。通过O6原子差异密度的存在或不存在以及糖环的构象推导转糖基抑制剂的特性。O6原子的差异密度在+3、+2、-1、-2、-3和-4糖，但不是在+1糖上明显。此外，在+3、+2、-2、-3和-4处的糖具有椅状构象，表明葡萄糖残基结合在这些糖亚部位处。在-1糖亚部位处，糖为船状构象，表明其为环多醇糖。在+1糖亚部位处，椅状构象和缺乏O6原子的差异密度表明这一糖是双脱氧糖。环多醇糖的船状构象产生抑制剂的不同混合物。具有和没有结合的抑制剂的蛋白质结构的仅有明显差异是Glu 219和Asp 294构象中的改变，以及水分子在抑制剂结合后的替换。

实施例7

非还原末端的抑制剂的构象。当将用没有抑制剂的PS4获得的数据精修为用结合的抑制剂获得的数据时，可看到Fo-Fc差异图谱中阳性差异密度中的分叉。在-4糖构象中，相应于C1、O1、C3、O3和O6原子，而非C2、O2、C4、O5和C6原子存在阳性密度。参见图9。这一信息揭示显然存在-4糖的两个构象。第一个构象相应于如在施氏假单胞菌的酶中所见的外切特异性。参见Hasegawa等，Protein Eng.12：819-24(1999)。第二个构象似乎相应于内切特异性，因为没有看到对抑制剂还原末端的识别。

实施例8

酶/抑制剂相互作用。PS4酶和抑制剂之间的相互作用类型可划分为氢键、疏水相互作用、以及水介导的相互作用。在该蛋白质和抑制剂之间存在20个氢键。发现保守的GH13催化残基即D193、E219和D294聚集在-1和+1糖周围。参见图9。E219和D294的侧链位置与天然结构稍微不同，并且似乎是由于由抑制剂结合所诱导的小构象改变所造成的。E219的OE2离抑制剂的氮原子

其中所述氮原子模拟糖苷键的氧原子。D194的OD2形成与-1糖O6的氢键。第三个保守酸性氨基酸D294在二齿相互作用中与-1糖的O2和O3羟基氢键结合。

-4糖在抑制剂非还原末端的酶识别通过(1)E160的侧链羧基氧OE1和-4糖残基的O1和O6，(2)S161的OG和O6，以及(3)G158主链氮与相同糖残基的O1之间的氢键产生。其它关键的氢键相互作用是H307的骨架羰基氧和+3糖的O3氧之间、E226的OE2和+2糖的O1之间、R196的NH1和-1糖的O3之间、E219的OE1和-1糖的O2之间、H293的NE2与-1糖的O3、Q305的OE1与-2糖的O2之间的氢键。参见图9。

5个水分子介导该蛋白质与抑制剂的其它氢键。在晶体结构中，456号H₂O与+1糖的O2和O3、E219的骨架羰基氧原子以及W221的骨架氮原子氢键结合。464号H₂O与-3糖的O5和O6、-2糖的O6以及564的OG氢键结合。472号H₂O与-2糖的O6、W66的NE1以及E76的OE1氢键结合。516号H₂O与-2糖的O6、D62的OD2以及E76的OE1氢键结合。参见图9。

存在9个显著的疏水相互作用。其中，4个是分别在糖残基+3、+2、-1和-3与W308、W221、Y78和W66之间的共平面堆积相互作用。还有抑制剂与W25、F79、F156、I157和F194的四个其它的非平面相互作用。特别地，F156和I157形成疏水半岛，抑制剂包在其周围，使得其非还原末端与该蛋白质氢键结合。参见图9。

实施例9

通过蛋白质工程改变PS4的外切和内切活性。具有外切活性的酶通常具有封闭在一端的活性部位裂口，仅允许底物在大分子链的末端结合。在PS4中，活性部位的非还原末端受到S64和G75之间大环的限制，但其没有完全封闭。确实存在使淀粉链在该环和由残基155-163形成的环之间通过的足够空间。在PS4中，外切淀粉酶活性似乎受到淀粉链的非还原末端与G158、E160和S161的氢键结合的驱动，其与在施氏假单胞菌G4-淀粉酶中观察到的非常类似。考虑到底物之间的相互作用总数，如通过酶抑制剂复合物所模拟的那样，参与淀粉链非还原末端识别的能量似乎比参与结合的总能量更小，其总计为仅是23个氢键中的4个，以及4个共平面堆积相互作用。F(阿卡波糖)-F(天然)差异图谱显示抑制剂在非还原末端的两种构象。结合这些提示了与淀粉链非还原末端的氢键结合不足以强到提供100％的外切特异性，这在该酶的酶学特征中得以报道。因此，PS4的抑制剂复合物的晶体结构提供了通过该酶混合的外切和内切淀粉的附加证据。这进一步提示可应用蛋白质工程改变该酶的外切和内切活性，并且因此改变该反应的产物。

实施例10

定点诱变。应用定点诱变产生PS4变体。PS4变体的代表性实例具有如图3所示的单氨基酸替换。使用Quick Change^TM方法(Stratagene，California)根据试剂盒提供的说明书有一定修改地将突变引入编码PS4酶的核酸中。简而言之，挑选单菌落并在10ml Falcon管中在3ml补充有50μg/ml卡那霉素(Sigma)的LB(22g/l Lennox L Broth Base，Sigma)中接种。在200rpm、37℃温育过夜后，在5000rpm离心培养物5分钟。移除培养基并且应用QIAGEN柱(QIAGEN)制备双链DNA模板。根据生产商的方案设计引物。例如，表5列出了用于在如SEQ ID NO：1或2所示的PS4序列的基础上产生骨架pMS382的引物；以及表6列出了用于产生pMS382在位置E223处的变体的引物。

接下来，进行PCR以合成突变链。PCR反应混合物含有以下：

2.5μl    10X QuickChange Multi反应缓冲液

0.75μl   QuickSolution

Xμl     引物(28-35nt的引物为10pmol；24-27nt的引物为7pmol；20-23nt的引物为5pmol)

1μl     dNTP混合物

X μl   ds-DNA模板(200ng)

1μl    QuickChange Multi酶混合物(2.5U/μl)(PfuTurbo DNA聚合酶)

X μl dH₂O(至终体积25μl)

在Eppendorf热循环仪上进行PCR反应，进行变性(96℃1分钟)、引物退火(62.8℃1分钟)以及延伸(65℃15分钟)的35个循环，并且随后保持在4℃。对于每一扩增反应，加入2μl DpnI限制性酶(10U/μl)，并在37℃温育该混合物～3小时。

然后应用经DpnI处理的DNA转化

Ultracompetent细胞(Stratagene)。在冰上解冻

细胞。对于每一诱变反应，将45μl细胞加入到预冷的Falcon管中。随后，加入2μl β-巯基乙醇混合物至每一管中。在冰上温育该混合物10分钟，每2分钟涡旋振荡一次。然后，将1.5μl经DpnI处理的DNA加入每一等分细胞中，并且在冰上温育该混合物30分钟。然后在42℃使样本进行热脉冲30秒，并然后置于冰上再2分钟。将0.5ml预热的NZY⁺肉汤加入每一样本中，并在37℃温育1小时，同时在225-250rpm振摇。将200μl每一转化反应物涂板于补充有1％淀粉和50μg/ml卡那霉素的LB板(33.6g/l Lennox L Agar，Sigma)上。在37℃温育该板过夜。通过DNA测序鉴定拥有所期望的突变的单个菌落，并且进行质粒制备以获得具有所期望的突变的质粒。

转化入枯草芽孢杆菌。用突变的质粒DNA根据以下方案转化枯草芽孢杆菌(菌株DB104A；Smith等，Gene 70，351-361(1988))。

A.用于原生质体和转化的培养基

2x SMM    每升：342g蔗糖(1M)；4.72g马来酸钠(0.04M)；8.12g MgC1₂·6H₂0(0.04M)；用浓NaOH调节至pH6.5。分装为50ml一份并高压灭菌10分钟。

4x YT(1/2NaCl)每100ml 2g酵母提取物+3.2g胰蛋白胨+0.5gNaCl。

SMMP    混合等体积的2x SMM和4x YT.

PEG    在25ml 1x SMM中10g聚乙二醇6000(BDH)或8000(Sigma)(高压灭菌10分钟)。

B.用于平板接种/再生的培养基

琼脂        4％Difco最小琼脂。高压灭菌15分钟。

琥珀酸钠    270g/1(1M)、用HCl调节至pH 7.3。高压灭菌15分钟。

磷酸盐缓冲液    每100ml 3.5g K₂HPO₄+1.5g KH₂PO₄。高压灭菌15分钟。

MgCl₂    每100ml(1M)20.3g MgC1₂·6H₂O(1M)

酪蛋白氨基酸  5％(w/v)溶液。高压灭菌15分钟。

酵母提取物    每100ml 10g，高压灭菌15分钟。

葡萄糖        20％(w/v)溶液。高压灭菌10分钟。

DM3再生培养基：在60℃(水浴，500ml瓶)混合：

250ml琥珀酸钠

50ml酪蛋白氨基酸

25ml酵母提取物

50ml磷酸盐缓冲液

15ml葡萄糖

10ml MgCl₂

100ml熔化的琼脂

加入合适的抗生素：氯霉素和四环素，5μg/ml；红霉素1μg/ml。在DM3培养基中在卡那霉素上的选择是不确定的：可能需要250μg/ml的浓度。

C.制备原生质体

全部使用无洗涤剂的塑料或玻璃器皿。

从单菌落接种在100ml烧瓶中的10ml 2x YT培养基。在摇床中(200转/分钟)在25-30℃生长为过夜培养物。

稀释该过夜培养物20倍至100ml新鲜2x YT培养基(250-ml烧瓶)中并在摇床中(200-250转/分钟)在37℃生长直到OD₆₀₀＝0.4-0.5(约2h)。

通过离心收集细胞(9000g，20分钟，4℃)。

用移液管移除上清，并且将细胞重悬于5ml SMMP+5mg溶菌酶中(经无菌过滤)。

在水浴摇床(100rpm)中在37℃温育。

30分钟后，以及随后以15分钟的间隔，通过显微镜检查25μl样本。持续温育直到99％的细胞原生质体化(球形外观)。通过离心(4000g，20分钟，RT)收集原生质体，并且移除上清液。温和地将沉淀重悬于1-2mlSMMP中。

原生质体现即可使用。可在-80℃冷冻部分原生质体(例如，0.15ml)用于将来使用(不需要添加甘油)。尽管这可能导致转化性的一些减少，但用冷冻的原生质体可获得每ug DNA的10⁶个转化子。

D.转化

转移450μl PEG至微型管中。

混合1-10μl DNA(0.2μg)和150μl原生质体，并且将该混合物加入到具有PEG的微型管中。立即但温和地混合。

在室温下放置2分钟，并随后加入1.5ml SMMP并混合。

通过离心(10分钟，13,000rpm(10,000-12,000g))收获原生质体，并且倒出上清液。用薄织物移除剩余的液滴。

加入300μl SMMP(不涡旋)并在水浴摇床(100rpm)中在37℃温育60-90分钟，以允许抗生素耐性标记的表达。(通过水浴的振摇作用，原生质体变得充分地重悬浮)。在1x SSM中适当稀释并平板接种0.1ml至DM3板上。

PS4变体在摇瓶中的发酵。通过在水中溶解以下物质制备摇瓶底物：

用4N硫酸或氢氧化钠在高压灭菌前将底物调节至pH 6.8。将100ml底物置于具有一个挡板的500ml烧瓶中，并高压灭菌30分钟。随后，加入6ml无菌葡萄糖浆。通过混合一体积的50％w/v葡萄糖和一体积的水并随后高压灭菌20分钟制备葡萄糖浆。

用变体接种摇瓶，并在温育器中在35℃及180rpm下温育24小时。温育后，通过离心(10000g，10分钟)从肉汤中分离细胞，并且最后通过0.2μm的微孔过滤使上清液无细胞。将无细胞的上清液用于测定法和应用测试。

PS4变体的酶学特征。应用

测定法(Megazyme，Ireland)测试通过诱变产生的PS4变体的外切淀粉酶活性。一个Betamyl单位定义为降解0.0351摩尔/分钟PNP偶联的麦芽五糖的活性。该测定法含有50μL 50mM柠檬酸钠、5mM氯化钙，pH 6.5，和25μL Betamyl底物。在40℃温育该测定混合物30分钟，然后通过添加150μL 4％Tris终止。应用ELISA读数仪测量在420nm的吸光度，并且根据以下公式计算Betamyl活性：活性＝A420x d，以Betamyl单位/ml所测定的酶样本为单位，其中“d”是酶样本的稀释倍数。应用Phadebas蓝测定法(Pharmacia andUpjohn Diagnostics AB)确定内切淀粉酶活性，根据生产商的说明书进行。外切活性指数是Betamyl活性与Phadebas活性之比。野生型PS4具有50的Betamyl/Phadebas活性比。具有比50低的比值的变体比野生型更具内切特异性。具有大于50的比值的那些更具外切特异性。为PS4变体测量的Betamyl和Phadebas活性以及它们的Betamyl对Phadebas活性之比在表7中列出。在上表7中的突变根据各个骨架的序列列出，其在每一表格的左上角标出。“Na-Acet.”表示醋酸钠；“Na-citr.”表示柠檬酸钠；72、75、80或85表示如实施例1所述那样确定了半寿期的温度，单位是℃；“Beta”代表如实施例10所述的Betamyl活性；“Phad”代表如实施例10所述的Phadebas活性；以及“B/P”代表Betamyl活性与Phadebas活性之比。

实施例11

PS4的蛋白质工程。没有突变接近+1和-1残基之间的经水解的糖苷键的活性部位残基，因为预期改变这些残基可能会影响催化活性本身，而非外切特异性的程度。参见图9。基于上面公开的酶抑制剂复合物信息，靶向残基W66、I157、E160、S161、R196、W221、K222、H307和W308用于诱变和表征。K222是包括R196和E226的盐桥网络的一部分，其与底物相互作用。选择这些残基用于诱变，因为改变这些残基可能改变底物结合。还应用该基因的易错PCR文库制备了整个PS4蛋白的突变文库，其中所述易错PCR文库根据本领域公知的方法制备。

对-4结合部位的突变。突变E160D的分析揭示对Betamyl/Phadebas活性比没有影响。为测试外切活性是否需要通过残基160识别非还原性糖，还制备了突变E160G。在这一情况下，Betamyl/Phadebas比是12，代表内切活性显著升高。通过E160突变为P、F、R、S和L证实了残基160处E或D对外切特异性的重要性，这些突变显著增加了内切特异性。这清楚地证实了对于外切特异性，需要通过E/D160识别非还原端糖。突变S161A类似地对内切活性具有显著影响，其Betamyl/Phadebas比是18。

对-3结合部位的突变。获得了W66的5个突变。至L、V、F和M的保守突变对外切特异性几乎没有影响。然而突变W66S增加了外切特异性并且展示出更低的表达活性。

对-2结合部位的突变。进行了Q305的三个突变。突变Q305T和Q305L显著降低了外切特异性。相反，Q305E对外切特异性没有可感知的影响。

对+2结合部位的突变。在R196处的三个突变展示出外切特异性的大量增加。R196V具有最大的外切特异性，随后是R196H和R196P。突变H307L具有与这些R196突变类似的外切特异性。

对+3结合部位的突变。对W221的突变具有非常低的表达活性。仅有W221A具有用于表征的足够表达活性，并且其稍微增加了外切活性。W308的4个突变即W308A、W308S、W308L和W308S具有显著的表达活性。所有四个突变显示了外切特异性的显著改善，最好的是W308S。

突变K222T展示出最高的外切活性。K222的侧链没有与底物直接相互作用，然而这一残基的突变给出了外切特异性的最大正升高。该外切活性的升高不可能是对相邻W221的影响，因为W221的突变仅不太大地影响特异性。K222周围的区域分析揭示其为离子对网络的一部分。K222与D254离子配对，其还与R196离子配对。R196又与E226离子配对。R196位于与+2糖的O2和O3的氢键结合。E226与+2糖氢键结合。因此，K222T突变的外切特异性的大量增加可能是由于R196和E226的同时再定向，其弱化了与+2糖的底物结合。

总之，对-结合亚部位的突变增加了酶的内切特异性。该数据还揭示对+结合亚部位的突变可大大地增加外切特异性。底物结合部位和淀粉链末端之间的强相互作用促进外切特异性。类似地，弱化这些相互作用增加了酶的内切特异性。对“+”结合亚部位的突变的影响揭示了通过底物结合部位的相互作用的精细平衡。此外，-结合亚部位对+结合亚部位相互作用强度的相对底物相互作用强度决定了酶的外切特异性程度。相对于+结合亚部位降低“-”结合亚部位亲和性的改变增加内切特异性。反之，相对于-结合亚部位降低+结合亚部位亲和性的改变增加外切特异性。

本领域技术人员显而易见地知道在不背离预期用途的精神或范围的情况下可应用相同的对该组合物和方法进行修饰和改变。因此，所提供的修饰和改变也在所附权利要求和它们等同物的范围之内。

表3在代表性PS4变体中的单氨基酸替换

A3S

G70D

V113I

G134C

G158T

A179N

G223P

W232P

G303L

R316P

A3T

G70K

N116D

R137C

G158F

A179R

G223I

W232Q

G303E

R316K

P7S

G70E

N119S

N138D

G158P

A179E

G223L

W232R

G303D

W323M

A8N

G70S

N119G

N138E

G158I

A179T

G223V

W232S

Q305E

T324L

G9A

G70Q

N119Y

N138S

G158A

R182S

G223C

W232Y

Q305T

T324M

H13R

G70A

N119E

C140R

G158V

R182H

G223T

W232T

Q305L

T324A

N26E

G70V

G121W

C140A

G158L

R182M

G223S

R233H

H307D

S325G

N26D

G70L

G121A

A141S

G158Q

R182D

G223Y

N234R

H307L

S334R

P32S

G70P

G121F

A141P

G158C

R182G

G223W

A236E

H307R

S334Q

N33Y

K71R

G121L

D142N

E160D

S183G

G223Q

S237G

H307K

S334H

D34N

K71M

G121T

D142G

S161V

G184Q

G223N

S237D

H307G

S334A

I38M

S72E

G121S

D142E

S161A

G188A

G223D

W238Q

H307P

S334M

I46F

S72K

G121E

P143T

S161T

G188H

G223H

W238G

H307I

S334L

D49V

S72N

G121K

G144E

S161K

G188T

G223K

W238K

H307S

S334P

D62N

S72T

G121R

N145D

S161P

G188S

G223R

W238R

H307M

H335M

F63L

G73M

G121H

N145S

S161G

F192Y

G223M

W238P

H307Q

W339E

F63A

G73S

G121M

Y146G

S161R

F192F

G223A

W238E

H307V

W339A

F63D

G73T

G121V

Y146E

S161H

F192M

G223E

Q239L

H307W

Y341E

F63E

G73N

G121P

Y146D

L163M

V195D

G223F

V253G

H307Y

Y341C

F63V

G73L

G121I

N148S

N164R

R196P

S225G

D255V

H307C

D343E

S64T

G73E

G121D

N148K

G166N

R196Q

S225E

A257V

H307F

R353T

S64N

G73D

Y122W

D149V

P168L

R196T

S225V

E260R

H307E

R358A

T67V

G74S

Y122A

D149L

Q169R

R196K

E226W

E260K

W308C

R358T

T67K

G75C

Y122Q

D149H

Q169K

R196Y

E226C

N264D

W308T

R358L

T67Q

G75S

Y122E

C150A

Q169V

R196S

E226D

V267I

W308K

R358V

T67H

G75R

P123S

D151W

Q169G

R196G

E226G

D269V

W308N

R358Q

T67R

G75Y

D124S

D151A

Q169E

R196A

Y227G

D269S

W308R

R358E

T67G

G75F

K125E

D151V

Q169N

R196V

Y227T

D269N

W308S

R358N

T67N

G75W

K125G

G153D

Q169D

Y198W

Y227D

K271L

W308G

R358G

D68C

G75E

K125A

S334K

I170M

Y198F

Y227K

K271Q

W308Q

S367R

D68E

E76V

K125W

S334T

I170E

A199P

Y227C

K271A

W308A

S367Q

G69M

G100A

K125D

G153A

I170L

P200G

S229N

H272Q

A309T

S379G

G69I

G100S

K125Q

D154G

I170K

P200A

S229P

G276R

A309E

D390E

G69H

G104R

K125P

D154E

I170N

R202K

W232F

W282S

A309M

S399P

G69E

G104N

E126N

D154Y

L178N

S208T

W232G

V285A

A309V

S420G

G69A

G106K

E126D

F156Y

L178W

S213N

W232H

V290I

A309I

D422N

G69R

V107M

N128E

I157L

L178Q

L220A

W232I

T295C

A309P

D422Q

G69P

L110F

P130S

I157V

L178F

L220T

W232K

Y297H

D312E

D422P

G69T

D112E

A131T

I157M

A179P

K222Y

W232L

G300E

R316Q

G424S

G69K

G134R

G158S

A179S

K222M

W232N

N302K

R316S

G424D

表5.用于pMS382骨架的引物

表6.产生pMS382在位置E223处的PS4变体的引物

pMS382	突变	Na-acet.+NaCl
						ID	1	80	Beta	Phad	B/P
pMS382avg.		2.1			170
						pMS454	E223E	2.1	181	0.9	212
pMS455	E223I	1.2	170	0.8	220
						pMS456	E223L	1.4	152	0.6	238
pMS457	E223V	1.4	101	0.7	140
						pMS458	E223F	1.6	197	0.6	346
pMS459	E223E	2.0	152	0.7	220
						pMS460	E223C	1.6	75	0.1	682
pMS461	E223A	2.2	177	1.1	167
						pMS462	E223G	1.5	109	0.7	147
pMS463	E223P	1.8	205	0.6	353
						pMS464	E223T	1.5	231	0.7	325
pMS465	E223S	2.1	254	1.7	149
						pMS466	E223Y	1.4	148	0.7	205
pMS467	E223W	1.6	130	0.4	361
						pMS468	E223Q	1.9	204	0.9	217
pMS469	E223N	2.1	225	1.1	199
						pMS470	E223D	2.3	209	1.1	192
pMS471	E223H	1.8	160	0.7	232
						pMS472	E223K	1.8	142	0.3	414
pMS473	E223R	1.8	122	0.5	263
						pMS474	E223M	1.7	154	0.6	269

Claims (29)

1.加工淀粉的方法，其包括通过添加嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)淀粉酶(PS4)变体而液化淀粉和/或糖化淀粉液化物以形成糖浆，其中所述变体的多肽序列包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且其中所述PS4变体至少包含一个在SEQ ID NO：1位置169处的氨基酸替换。

2.权利要求1的方法，其中所述的PS4变体包含与SEQ ID NO：1、SEQID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。

3.权利要求2的方法，其中所述的PS4变体至少包含一个SEQ IDNO：1的Q169D/E/G/K/N/R/V的氨基酸替换。

4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述的PS4变体还包含一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQ ID NO：1的26，34，49，104，121，142，157，158，161，200，229，272，276，324，374。

5.权利要求4的方法，其中所述的PS4变体还包含一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQ ID NO：1的N26E，N34D，D49V，G104R，G121R，Q142E，L157M，G158T，A161S，P200A，P229S，Q272H，G276R，T324L，A374V。

6.权利要求1的方法，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有改变的热稳定性。

7.权利要求6的方法，其中所述的PS4变体比SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列更热稳定。

8.权利要求1的方法，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有改变的内切淀粉酶活性、改变的外切淀粉酶活性和/或改变的外切淀粉酶活性与内切淀粉酶活性比。

9.权利要求8的方法，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有升高的内切淀粉酶活性或降低的外切淀粉酶活性与内切淀粉酶活性比。

10.权利要求8的方法，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有升高的外切淀粉酶活性或升高的外切淀粉酶活性与内切淀粉酶活性比。

11.权利要求1的方法，其还包括添加脱支酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、或所述酶的任意组合至所述淀粉液化物。

12.权利要求1的方法，其中所述淀粉来自玉米、玉米穗、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。

13.权利要求1的方法，其还包括发酵所述糖浆以产生乙醇。

14.权利要求13的方法，其还包括回收乙醇。

15.权利要求14的方法，其还包括蒸馏所述淀粉以获得所述乙醇，其中所述的发酵和蒸馏同时、分别或顺次进行。

16.权利要求3的方法，其中在位置Q169的氨基酸替换选自D、E、G、K、N、R、V。

17.嗜糖假单胞菌淀粉酶(PS4)变体，其包含与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且其中所述PS4变体至少包含一个在SEQ ID NO：1位置169处的氨基酸替换。

18.权利要求17的PS4变体，其包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。

19.权利要求17的PS4变体，其中所述的PS4变体至少包含一个SEQID NO：1的Q169D/E/G/K/N/R/V氨基酸替换。

20.权利要求17至19任一项的PS4变体，其中所述的PS4变体还包含一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：26，34，49，104，121，142，157，158，161，200，229，272，276，324，374。

21.权利要求20的PS4变体，其中所述的PS4变体还包含一个或多个以下氨基酸替换：N26E，N34D，D49V，G104R，G121R，Q142E，L157M，G158T，A161S，P200A/G，P229S，Q272H，G276R，T324L，A374V。

22.权利要求17的PS4变体，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有改变的热稳定性。

23.权利要求22的PS4变体，其中所述的PS4变体比SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列更热稳定。

24.权利要求17的PS4变体，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有改变的内切淀粉酶活性、改变的外切淀粉酶活性和/或改变的外切淀粉酶活性与内切淀粉酶活性比。

25.权利要求24的PS4变体，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有升高的内切淀粉酶活性或降低的外切淀粉酶活性与内切淀粉酶活性比。

26.权利要求24的PS4变体，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有升高的外切淀粉酶活性或升高的外切淀粉酶活性与内切淀粉酶活性比。

27.权利要求17的PS4变体，其中在位置Q169的氨基酸替换选自D，E，G，K，N，R，V。

28.权利要求21的PS4变体，其中所述氨基酸替换选自(Q142E，Q169R)；(Q169R，P200G)；(Q169D，P229S)；(G104R，Q169R)；(N26E，P200G，Q169R)；(N26E，P200G，L157M，Q169R)；(N26E，P200G，L157M，Q169R，G158T)；(P200A，G104R，Q169R，T324L)；(P200A，G104R，Q169R)；(P200A，Q169R，T324L)；(D49V，G121R，Q169R，A374V)；(N34D，A161S，Q169D)；(A161S，Q169D，P229S)；(A161S，Q169D，P229S，Q272H)；(Q169D，P229S，Q272H)；(Q169D，P229S，Q272H，G276R)。

29.权利要求17至28任一项的PS4变体的用途，用于液化淀粉和/或糖化淀粉液化物以形成糖浆。

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