CN102899285A - 一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法，尤其涉及嘌呤衍生物Purmorphamine诱导Olig2⁺-GFP⁺-mES的神经细胞分化的方法及其用途。本发明采用拟胚体介导的神经诱导法，以Olig2-GFP⁺-mES作为细胞模型，以嘌呤衍生物Purmorphamine结合全反式维甲酸定向诱导所述的Olig2-GFP⁺-mES细胞分化为脊髓运动神经元和少突胶质前体细胞；经实验证实，所述的Purmorphamine可作为SHH的替代物，有效地诱导Olig2+-GFP+-mES分化为高纯度、有功能的脊髓运动神经元和少突胶质细胞，并引起相关基因表达改变；移植实验结果证实，所诱导的神经细胞能促进大鼠脊髓损伤后功能和形态的部分恢复，具有促进脊髓损伤后再生和功能重建的作用。

Description

一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及神经细胞诱导的方法，具体涉及一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法，尤其涉及嘌呤衍生物(Purmorphamine)诱导Olig2⁺-GFP⁺-mES的神经细胞分化的方法及其用途。

背景技术

脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)是临床常见的外伤性疾患之一。SCI的发生大多源于交通伤、坠落伤或运动伤等，近年呈上升趋势。SCI一旦形成，常常导致严重的行为功能障碍，给患者、家庭和社会带来极大负担。近年来，再生医学给脊髓损伤的治疗带来新的希望。胚胎干细胞(ESC)以其具有很强的增殖和分化能力，可被大量地诱导分化成为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞等优势，成为再生医学移植供体的理想来源。但由于胚胎干细胞直接移植体内具有形成畸胎瘤的危险，因此应用胚胎干细胞移植治疗脊髓损伤一般先在体外诱导分化出神经前体细胞或神经细胞，然后再移植进脊髓组织，具体而言，目前临床实施胚胎干细胞移植治疗脊髓损伤的过程包括如下两部分：一是体外诱导胚胎干细胞分化成为纯度高、数量多、有功能的神经细胞；二是移植到脊髓内的细胞可迁移、增殖以及与宿主组织形成很好的整合，从而发挥功能。

当前，胚胎干细胞的体外诱导分化方法中，还存在着诱导分化的细胞纯度低、数量少等问题。神经分化的过程受多种信号通路的调控，其中音渭酸(Sonic hedgehog，SHH)信号通路起着重要的作用。嘌呤衍生物Purmorphamine是小分子化合物，已经被证实能与SHH信号通路中的Smoothened结合，激活SHH信号通路，被认为是SHH的替代物，在发育中起着重要的作用。

目前已知，Olig基因是碱性螺旋一环一螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)转录因子家族的一员，包括Olig1和Olig2两种，最初被认为是少突胶质细胞或其前体细胞特异性表达的基因而得名；Olig1特异性地参与少突胶质细胞的发育，而Olig2早在胚胎8.5天时少突胶质细胞尚未发生时就已经表达。有研究表明，Olig2在脊髓胚胎发育中，位于腹侧的2/3区域，在SHH(胚胎发育过程中由脊索产生的一种因子)的诱导下早期能促进运动神经元、抑制V2区中间神经元的生成；后期则促进少突胶质细胞，抑制星形胶质细胞的生成，揭示Olig2与其它转录因子的协同作用共同调节神经元和少突胶质细胞的顺序发生。

目前，尚未见有关应用Purmorphamine替代SHH，诱导胚胎干细胞分化，获得纯度高、数量多、有功能的脊髓运动神经元和少突胶质细胞，以及Purmorphamine替代SHH，能否引起SHH信号通路、背-腹轴通路、运动神经元和少突胶质细胞发育中相关基因的变化，同时诱导分化的少突胶质前体细胞移植到脊髓损伤组织内，能否与宿主整合，进而迁移、分化来发挥修复损伤的作用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导神经细胞的方法，具体涉及一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法，尤其涉及嘌呤衍生物(Purmorphamine)诱导Olig2⁺-GFP⁺-mES的神经细胞分化的方法。

本发明的进一步目的是提供所述的方法在制备修复脊髓损伤的制剂中的用途。

本发明采用拟胚体介导的神经诱导法，以Olig2-GFP⁺-mES作为细胞模型，利用该细胞系在神经诱导分化过程中表达少突胶质细胞转录因子2(Oligodendrocyte transcription factor 2，Olig2)、并能方便观测到绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的表达，从而，提供Purmorphamine结合低浓度的全反式维甲酸定向诱导分化为脊髓运动神经元和少突胶质前体细胞的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一、建立Olig2⁺-GFP⁺-mES细胞模型

在小鼠胚胎干细胞的Olig2基因上转入GFP蛋白建立Olig2⁺-GFP⁺-mES细胞模型。采用无血清培养方式，以不同浓度的Purmorphamine诱导拟胚体(EBs)，通过细胞培养、免疫细胞化学、FACs和RT-PCR等方法观察其对胚胎干细胞定向分化为脊髓运动神经元和少突胶质细胞的作用。实验结果显示，Purmorphamine可以完全替代SHH促进胚胎干细胞向神经细胞分化；促进Olig2基因的表达；从而促进在EB8D后向脊髓运动神经元分化，分化率超过50％，引起与脊髓运动神经元相关基因的表达变化；促进在EB12D后向少突胶质细胞分化，分化率超过80％，引起与少突胶质细胞相关基因、背-腹轴通路和SHH信号通路相关基因的表达变化。

二、建立大鼠脊髓撞击伤模型证实获得的细胞移植后的作用

应用NYU-Impactor II建立大鼠脊髓撞击伤模型，将Purmorphamine诱导分化Olig2⁺-GFP⁺-mES获得的Olig2⁺-GFP⁺-OPC移植到脊髓损伤组织内，通过免疫组织化学、透射电镜、Western blot、行为学和神经电生理等方法观察移植细胞是否促进脊髓功能的恢复，证实获得的细胞移植在脊髓损伤恢复中所起的作用。

本发明的实验结果显示，Purmorphamine作为SHH的替代物，能有效地诱导Olig2⁺-GFP⁺-mES分化为高纯度、有功能的脊髓运动神经元和少突胶质细胞，并引起相关基因的改变；移植所诱导的Olig2⁺-GFP⁺-OPC可以促进大鼠脊髓损伤后功能和形态的部分恢复，从而促进脊髓损伤后再生和功能重建的作用，为临床应用细胞移植治疗脊髓损伤提供一定的实验依据。

本发明中，所述的Olig2⁺-GFP⁺-mES是利用遗传工程的方法，通过四环素诱导表达系统，在小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cell，mESC)的Olig2基因座上插入GFP制成；其在神经诱导分化过程中，能直观地判断诱导的神经细胞的出现和筛选，也便于细胞移植时，通过观察GFP的表达来确定移植细胞在宿主体内的迁移、分化和增殖等。

本发明中，所述的Olig2⁺-GFP⁺-OPC是由Purmorphamine诱导分化Olig2⁺-GFP⁺-mES制得。

本发明的体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法，是采用拟胚体介导的神经诱导法，即综合RA诱导法和五步法使Olig2⁺-GFP⁺-mES向脊髓的运动神经元和少突胶质细胞分化的方法，其包括以下步骤：

①将Olig2⁺-GFP⁺-mES放入含有白血病抑制因子(LIF，20u/ml)的胚胎干细胞培养基悬浮培养2d；

②放入含有全反式维甲酸RA(0.5μM)和不同浓度Purmorphaine的神经分化培养基中培养4d；

③放入含有bFGF(10ng/ml)的神经分化培养基分别培养2d和6d，采用荧光激活的细胞分选(FACs)筛选Olig2⁺-GFP⁺-阳性细胞；

④分别在神经元培养基和少突胶质细胞培养基继续培养，诱导生成脊髓运动神经元和少突胶质细胞。

本发明方法的步骤④中，所述的在神经元培养基中培养为贴壁培养7～14d；所述的在少突胶质细胞培养基培养为贴壁培养14d。

本发明的方法中，Purmorphamine通过影响SHH信号通路和背-腹轴通路中的相关基因表达，分别通过上调运动神经元和少突胶质细胞的相关基因来诱导Olig2+-GFP+-mES定向分化为脊髓运动神经元和少突胶质细胞；

诱导分化的Olig2+-GFP+-OPC移植到大鼠脊髓撞击伤模型后能够和宿主整合，在宿主体内继续增殖和分化，分化成为成髓鞘的少突胶质细胞，促进神经丝蛋白和髓鞘蛋白的恢复，促进髓鞘再生和神经功能的恢复，显著改善SCI大鼠愈后。

本发明的神经细胞分化的方法具有以下优点：

①嘌呤衍生物Purmorphamine替代SHH，诱导Olig2+-GFP+-mES定向分化为脊髓运动神经元，诱导分化率超过50％；

②嘌呤衍生物Purmorphamine替代SHH，诱导Olig2+-GFP+-mES定向分化为少突胶质细胞，诱导分化率超过80％；

③嘌呤衍生物Purmorphamine在Olig2+-GFP+-mES神经诱导分化过程中引起运动神经元和少突胶质细胞相关基因的表达；

④嘌呤衍生物Purmorphamine在Olig2+-GFP+-mES神经诱导分化过程中引起SHH信号通路和背-腹轴通路中相关基因的表达；

⑤应用NYU脊髓致伤仪，成功构建大鼠脊髓撞击伤模型；

⑥诱导得到的Olig2+-GFP+-OPC移植到脊髓损伤模型后，成功在宿主体内进行增殖并分化，分化为少突胶质细胞和神经元，促进髓鞘再生和神经功能的恢复。

附图说明

图1是本发明中Olig2⁺-GFP⁺-mES和MEF的形态图，

其中，A～C：Olig2+-GFP+-mES在MEF上生长，克隆边缘清晰，结构紧密，隆起生长，细胞间界线不清楚；A：bar＝100μm；B：bar＝50μm；C：bar＝10μm；★示MEF，▲示Olig2+-GFP+-mES。

图2是本发明中Olig2+-GFP+-mES的免疫荧光鉴定图，

其中，A：mESC的Oct-3/4和Sox-1的共标；B：mESC的Oct-3/4和Sox-2的共标，bar＝50μm；免疫荧光染色显示，Olig2+-GFP+-mES细胞克隆的Oct-3/4、Sox-1和Sox-2染色强阳性，而Olig2+-GFP+-mES周围的MEF完全不着色。

图3是本发明中Olig2+-GFP+-mES免疫荧光染色的阳性细胞计数分析图，

其中，阳性细胞百分率＝阳性细胞数/DAPI复染细胞总数。

图4表明Olig2+-GFP+-阳性细胞在EB不同阶段的表达，

其中，bar＝50μm，不同阶段的EB均有上百个细胞组成，其形态基本为圆球形，表面不光滑；EB2D无Olig2表达，EB6D开始表达Olig2，随着诱导时间延长，Olig2的表达逐渐增多，至EB12D Olig2表达量最高。

图5表明Purmorphamine诱导Olig2和Nestin的表达，

其中，图A：EB6D神经球Olig2和Nestin共表达，bar＝100μm；图B：是A图方框中的高倍图，箭头表示“玫瑰花环”的神经管样状，bar＝25μm。

图6表明免疫细胞化学检测Olig2和Hb9在EB8D的表达，

其中，图A：免疫细胞化学检测Olig2和Hb9在不同处理组中的表达，bar＝100μm；图B：统计直方图显示EB8D，Olig2和Hb9在不同处理组中的阳性细胞表达率；Purmorphamine组与SHH组和Control组相比较，**P＜0.01。

图7表明免疫细胞化学检测Olig2在神经元不同阶段的表达，

其中，图A：Olig2和Tuj1在神经元不同阶段的免疫荧光染色，a：表示神经元前体细胞；b：表示成熟神经元，bar＝100μm；图B：统计直方图显示，Olig2在神经元不同阶段的阳性细胞表达率；神经元前体细胞组与成熟神经元组相比较，**P＜0.01。

图8表明免疫细胞化学检测脊髓运动神经元相关蛋白的表达，

其中，图A-a：倒置相差显微镜下观察，bar＝50μm；b：神经元的Hb9阳性表达，bar＝50μm；c：神经元的MNR2阳性表达，bar＝100μm；d：神经元的Isll阳性表达，bar＝10μm；e：神经元的Olig2阴性表达，bar＝10μm；f：神经元的Hoxb4阳性表达，bar＝10μm；图B：统计直方图显示，脊髓运动神经元相关蛋白的阳性表达率。

图9表明RT-PCR检测脊髓运动神经元相关基因的表达，

其中，图A：PCR产物的2％琼脂糖凝胶电泳；图B：RT-PCR半定量统计图。

图10是相差显微镜下Olig2+-GFP+-OPC的形态，

其中，a和b：相差显微镜下观察，可见双极或三极的OPC；c和d分别为a和b的荧光相差显微镜下观察；a，c bar＝100μm；b，d bar＝50μm。

图11是相差显微镜下Olig2+-GFP+-少突胶质谱系的形态，

其中，a：可见大量OPC从神经球中迁出，bar＝50μm；b：可见双极的OPC，bar＝50μm；c：箭头表示未成熟的少突胶质细胞，bar＝25μm；d：箭头表示成熟少突胶质细胞，bar＝10μm。

图12是荧光相差显微镜下Olig2+-GFP+-少突胶质谱系的形态，

其中，a：可见大量OPC从球中迁出，bar＝50μm；b：可见未成熟的少突胶质细胞，箭头表示未成熟少突胶质细胞，bar＝50μm；c：示成熟的少突胶质细胞，bar＝25μm；d是c方框中的高倍图，箭头表示成熟少突胶质细胞，bar＝10μm。

图13是Olig2+-GFP+-成熟少突胶质细胞的免疫荧光染色，

其中，a：少突胶质细胞的Olig2和CNPase共表达，bar＝25μm；b：少突胶质细胞的Olig2和GC共表达，bar＝25μm。

图14表明星形胶质细胞不表达Olig2(bar＝25μm)。

图15是SHH信号通路中相关基因在Olig2+-GFP+-mES神经诱导分化过程中表达，

其中，图A：PCR产物的2％琼脂糖凝胶电泳；图B：统计折线图显示，SHH信号通路中相关基因在神经诱导分化过程中的表达变化。

图16是背-腹轴中的相关基因在Olig2+-GFP+-mES神经诱导分化过程中的表达，

其中，图A：PCR产物的2％琼脂糖凝胶电泳；图B：统计折线图显示，背-腹轴中的相关基因在神经诱导分化过程中的表达变化。

图17表明SCI行为学评分，

其中，A：BBB评分；B：Tarlov评分；n＝6，与假手术组比较，*P＜0.05。

图18表明脊髓后索髓鞘相对光密度值(n＝12，**P＜0.01)。

图19表明移植细胞在SCI后脊髓组织内分化，

其中，A：Olig2和GFAP共表达；B：Olig2和NG2共表达，箭头表示移植细胞是少突胶质前体细胞；C：Olig2和MAP2共表达，箭头表示移植细胞和神经元共标；D：Olig2和MBP共表达，箭头表示移植细胞表达MBP，bar＝10μm。

图20是脊髓后索髓鞘在移植前后的超微结构，

其中，A和B：假手术组，B是A的高倍图，

示致密髓鞘；C和D：细胞移植前(即SCI后7d)，D是C中方框中的高倍图，☆示空泡样变性，▲示小胶质细胞，★示变性的髓鞘，箭头表示无髓鞘轴突；E和F：细胞移植组，＊示少突胶质细胞，箭头表示再生的髓鞘结构松散。

图21是细胞移植后SCI大鼠的Tarlov和BBB评分图，

其中，A：Tarlov评分；B：BBB评分，n＝6，↓示移植时间，*P＜0.05vs假手术组，▲P＜0.05vs手术对照组。

图22是细胞移植前后SCI大鼠MEP检测图，

其中，A：假手术组；B：细胞移植前(即SCI后7d)；C：细胞移植后1w(即SCI后14d)；D：细胞移植后2w(即SCI后21d)；E：细胞移植后4w(SCI后35d)；F：MEP的潜伏期(ms)；G：MEP的波幅(mv)；n＝6。

具体实施方式

实施例1Olig2⁺-GFP⁺-mES的培养和鉴定

1，实验所用细胞：小鼠(CF-1)胚胎成纤维细胞(MEF)，原代培养；

，2，Olig2⁺-GFP⁺-mES细胞系由复旦大学长江学者特聘教授张素春教授提供。

，3，主要试剂：

明胶Gelatin、DAPI、DMSO：购自Sigma(美国)；

DME/F12谷氨酰胺、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、丙酮酸钠、胰酶-EDTA，胎牛血清(FBS)：购自Gibco BRL公司(美国)；

6孔和24孔细胞培养板、离心管、巴斯德吸管：购自Greiner公司(德国)；

荧光封片剂：购自Vector公司(美国)；

小鼠抗Oct-3/4抗体(Santa Cruz，SC-5279)、山羊抗Sox2抗体(R&D，AF2018)、山羊抗Sox1抗体(R&D，AF3369)；

驴抗山羊荧光Alexa594标记IgG二抗，驴抗小鼠荧光Alexa

488标记IgG二抗：购自Invitrogen公司(美国)；

其它试剂均为进口或国产分析纯试剂。

4，主要仪器设备：

相差显微镜(Nikon-TS 100)，荧光显微镜(Nikon-Eclipse TE 2000-S)，湿度CO₂细胞培养箱(Heraus)，超净工作台(苏静集团安森公司)，Milli-Q超纯水制备系统(Millipore，D-5623)，离心机(Eppendorf)，液氮罐(Mve)，冻存盒(Nalgene)。

5，主要试剂配制

表1小鼠胚胎成纤维培养基

表2MEF冻存液

表3胚胎干细胞培养基

表4胚胎干细胞冻存液

6，实验方法

1)小鼠胚胎干细胞的培养

CF-1系小鼠购于中科院细胞所，将雄性和雌性成年小鼠按1∶2于5:00PM左右合笼，第二天7:30AM前检查阴栓，检栓当日中午记为孕0.5d，取孕13.5d小鼠胚胎分离胎鼠成纤维细胞(MEF)。

2)制备MEF饲养层

MEF分离：

(1)常规处理13.5d孕鼠，获得胚胎，去除胚胎外组织，用PBS洗胚胎三次；

(2)常规处理胚胎组织；

(3)将(2)的组织移至15ml离心管中，加入约5ml 0.25％胰酶溶液消化30min后，用MEF培养基终止；1000rpm，离心5min收集细胞；

(4)接种细胞：按照每只胚胎接种3瓶T25细胞培养瓶的比例接种；

(5)接种24h后更换新鲜MEF培养基。细胞汇合至90％时，部分冻存于液氮中，留作种子细胞；部分继续扩增培养(3代以内)，照射后冻存于液氮中，复苏后直接作为饲养层细胞应用。

MEF冻存：MEF生长至90％融合的细胞，吸去培养液，PBS清洗，加入0.25％胰酶-EDTA消化，用含血清的MEF培养基中止消化，细胞悬液转移至10ml离心管中，1000rpm，离心5min；细胞沉淀用MEF冻存液重悬，移入冻存管，-80℃过夜，次日移入液氮罐中长期保存，冻存的细胞密度为1×10⁶cells/cm²。

MEF复苏：从液氮中取出细胞冻存管，浸入37℃水浴锅，使冰晶融化，融化的细胞悬液转移至装有培养液的离心管中，吹打混匀，常温，1000rpm，离心5min，细胞沉淀用MEF培养基重悬，细胞密度按照0.7×10⁵cells/cm²接种于6孔培养板；第二天更换培养液，去除死细胞，2-～3d即可传代，或制备饲养层。

MEF照射：MEF传代培养2～4次后，用⁶⁰Coγ处理照射，总剂量达8000rads，灭活其有丝分裂活性，照射后换新鲜的培养液，置37℃平衡至少4h，消化、以1×10⁶cells/cm²分支冻存于液氮中；使用时MEF需提前复苏，接种至0.1％明胶包被的6孔细胞培养板中即可，细胞密度按照0.7×10⁵cells/cm²接种。

3)Olig2⁺-GFP⁺-mES的培养：

将Olig2⁺-GFP⁺-mES细胞接种在MEF饲养层上，加入mESC培养基，37℃，5％CO₂条件下培养，隔日更换培养液，3～4d传代。

(1)Olig2⁺-GFP⁺-mES的消化、传代

提前1d制备MEF饲养层，于第2d吸去培养液，PBS清洗3次后，加入mESC细胞培养液，37℃培养箱中平衡至少1h，吸去mESCs细胞培养液，PBS清洗3次，加入0.05％胰酶-EDTA1ml，37℃水浴锅中放置5min后，加入培养基终止消化，1000rpm，离心5min，以1×10⁴cells/cm²的密度传代至含有mESC细胞培养液的六孔培养板上，剩余细胞用于EB的神经诱导分化。

(2)Olig2⁺-GFP⁺-mES的冻存和复苏

胰酶法消化Olig2⁺-GFP⁺-mES，1000rpm，离心5min后去除上清，加入mESC冻存液制成细胞悬液，装入冻存管，冻存盒中-80℃过夜，次日转移到液氮中长期保存；

将冻存管由液氮中取出，浸入37℃水浴锅，当仅剩一小块冰晶时，将冻存管取出，吸出细胞悬液，加入到预先备有9ml mESC细胞培养基的15ml离心管中，轻吹打使细胞混匀；常温，1000rpm，离心5min，除去上清液，再重复用培养基洗一次；加入2ml细胞培养基重悬细胞，逐滴接种至预先铺有MEF并平衡后的6孔板中；隔24h后给细胞换液。

4)免疫细胞化学染色

体外培养5～7d的Olig2⁺-GFP⁺-mES细胞，用免疫荧光细胞化学方法检测细胞表面抗原Oct-3/4、Sox-1、Sox-2的表达，以确定其全能性和未分化性。

(1)吸出培养基，用PBS洗3次，；

(2)吸出PBS，加入4％多聚甲醛室温固定20min；

(3)吸出固定液，用PBS洗3次，每次10min；

(4)加入0.3％Triton X-100，室温静置15min；PBS洗3次，每次10min；

(5)加入驴血清封闭，室温静置15min；

(6)吸出血清，加入相应的一抗(1∶2000抗Oct-3/4+1∶2000抗Sox-1和抗Sox-2)，4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次10min；

(7)加入驴抗山羊荧光Alexa

594标记IgG二抗和驴抗小鼠荧光Alexa

488标记IgG二抗，室温静置60min；

(8)加入DAPI(1∶1000稀释)染细胞核10min；PBS洗3次，每次10min；

(9)封片剂封片，荧光显微镜下观察、照相。

5)阳性细胞计数

应用ImageJ软件对拍好的荧光照片进行细胞计数。分别计数DAPI、Oct-3/4、Sox-1、Sox-2的阳性细胞数后，进行数据统计。

实验数据用均数±标准差表示，用SPSS统计软件进行分析处理，组间比较用t检验。

结果显示，如图1所示，原代MEF细胞不纯，除有成纤维样细胞外，还有神经样细胞、心肌细胞以及一些类型不明确的细胞；经过细胞传代后杂细胞迅速减少，传2～3代后细胞成分趋于单一，均为成纤维细胞。经⁶⁰Coγ照射后，细胞失去增殖能力，贴壁培养可维持10～14d，照射后的细胞有序排列呈长梭形或条带状，细胞之间相互接触呈单层排列。细胞质中央为卵圆形核，周边向外伸出纤维状伪足(见图1中★)。作为mESC饲养层的适宜细胞密度为0.75×10⁵cells/cm²。

Olig2⁺-GFP⁺-mES细胞在小鼠成纤维细胞即饲养层上呈团聚状生长，细胞克隆呈典型集落状生长，呈圆形或椭圆形，克隆边缘清晰、光滑，细胞体积小而排列紧密，呈圆形，核大、核仁清晰，细胞核/细胞质比高。克隆周边与MEF饲养层界限清楚，无分化迹象(见图1中▲)。一般接种2～3d后集落接近汇合状态，需进行传代。传代比例一般为1∶6～1∶8。

通过对长期培养传代的Olig2⁺-GFP⁺-mES定期检测其特异性抗原的表达来鉴定该细胞的全能性、未分化性(如图2所示)，并通过细胞计数其特异性标志物Oct-3/4，Sox-1，Sox-2的阳性率(如图3所示)。统计结果表明：Olig2⁺-GFP⁺-mES的Oct-3/4，Sox-1，Sox-2的阳性细胞率分别为84.24±0.04％，83.28±0.04％，85.18±0.05％，均超过80％，表明在此培养体系下的Olig2⁺-GFP⁺-mES能保持良好的全能性和未分化性。

本实施例的结果表明，采用有饲养层的体外培养方式培养Olig2⁺-GFP⁺-mESC，通过对胚胎干细胞相关基因Oct-3/4、Sox-1、Sox-2的检测，发现Oct-3/4、Sox-1、Sox-2的细胞阳性率均超过80％以上，表明该培养体系下的Olig2⁺-GFP⁺-mESC维持着未分化的状态，为后续实验提供可信的种子细胞。

实施例2Purmorphamine诱导Olig2⁺-GFP⁺-mESC定向分化为脊髓运动神经元

1)细胞

与实施例1相同。

2)主要试剂和用品

RA：购自Sigma公司(美国)；

N2、B27、Neurobasal培养基：购自Gibco BRL公司(美国)；

Purmorphamine：购自Calbiochem公司(美国)；

bFGF、NT3、GDNF、BDNF、PDGF-AA：购自R&D公司(美国)；

RNA酶抑制剂、Oligo(dT)、dNTP、DNA聚合酶：购自Takara公司(中国大连)；

引物：上海生工公司合成；

M-MLV逆转录试剂盒、Total RNA抽提试剂用Trizol：购自Invitrogen公司(美国)；

兔抗Tuj1抗体(Convance，PRB-435P)、小鼠抗Tuj1抗体(Sigma，T8660)、山羊抗Hb9抗体(Santa cruz，SC-22542)、小鼠抗MNR2抗体(DHSB，81.5C10)，兔抗Isl1抗体(Chemicon，AB5754)，小鼠抗Hoxb4抗体(R&D，AF3369)，小鼠抗Nkx2.2抗体(DHSB，74.5A5)，山羊抗Olig2抗体(Santa cruz，SC-19969)小鼠抗Nestin抗体(Chemicon，MAB353)；

驴抗兔荧光Alexa

594标记IgG二抗，驴抗小鼠荧光Alexa

594标记IgG二抗：购自Invitrogen公司(美国)；

无RNA酶枪头、离心管：购自Axyge公司(美国)；

其余用品与实施例1相同。

3)主要实验仪器：

EPICS ALTRA流式细胞仪(Beckman)，PCR仪(Bio-Rad)，紫外凝胶成像分析仪(Syngene)，GS-800光密度扫描仪(BIO-RAD)，恒温冰冻切片机CM1900(LEICA)，高速台式低温离心机(Eppendorf)，电热恒温箱DHP-9052(上海华进医疗器械有限公司)，Nanodrop2000超微量分光光度计(Thermo)。

4)主要试剂配制

表5改良的神经培养基(ModifiedNS Medium，MNS)

表6改良的神经元培养基(Modified Differentiation Medium of Neuron，Mdiff)

5)实验方法

MEF的去除：

利用Olig2⁺-GFP⁺-mES和MEF在明胶上贴壁速率的差异，以去除贴壁较快的MEF细胞，获得高纯度的Olig2⁺-GFP⁺-mES。步骤为：胰酶消化在MEF上进行培养的Olig2⁺-GFP⁺-mES，用mES培养液终止消化并吹打成单细胞后，铺至明胶预处理的100mm培养皿，于37℃细胞培养箱静置30min后吸取上清液，转移至另一明胶预处理的100mm培养皿，再于37℃细胞培养箱静置30min，吸取上清液，离心收集细胞后用培养液重悬并计数。

神经前体细胞的诱导：

类胚体(EB)形成：取1×10⁵cells/cm²去除MEF后的Olig2⁺-GFP⁺-mES于100mm低粘附性培养皿中悬浮培养，所用培养基为含LIF(1∶5000)的mES培养基。两天后可形成大量个体较小的EB球，更换神经分化培养基，在神经分化培液中添加全反式维甲酸(RA，0.5μM)和不同浓度的Purmorphamine(0、0.25、0.5、0.75和1μM)，诱导4d。每天观察GFP的表达情况，观察至第十二天的EB球(EB12D)。

Olig2⁺-GFP⁺-mES诱导分化为脊髓运动神经元：

EB6D后撤除RA和Purmorphamine，添加bFGF(10ng/ml)，诱导培养2d后，以0.05％胰酶-EDTA消化5min，用胰酶抑制剂终止消化，反复吹打成小细胞球，离心1000rpm，5min，去除碎片收集细胞。将收集到的细胞种植在已经涂过层黏连蛋白(laminin)的24孔培养板，用神经元培养基进行单层培养。次日即可观察神经元从球中迁出，培养7～14d后固定，进行细胞荧光免疫化学染色和细胞计数。

在不同的时间点做以下的检测：①首先在EB6D检测有无Nestin的表达；②在EB8D检测运动神经元特异性标志物Hb9的表达情况；③贴壁后7和14d分别检测神经元前体细胞和成熟神经元的Olig2和Tuj1的共表达情况；④贴壁后14d检测与参与运动神经元发育的基因即Hb9，MNR2，Isl1，Olig2，Hoxb4和神经元标志物Tuj 1的共表达情况(由于本实施例采用的是Olig2⁺-GFP⁺-mES，所以Olig2的表达无需用Olig2抗体检测)。

流式细胞计数(荧光激活的细胞分选)：

由于Olig2⁺-GFP⁺-mES只有在诱导分化为神经前体细胞时才开始表达Olig2，为了明确该细胞株于何时开始表达(即在荧光显微镜下可见绿色荧光)和表达量的多少，本实施例中采用荧光显微镜观察，和用流式细胞仪进行活细胞检测不同浓度的Purmorphamine对Olig2表达的影响。

分别于EB0D、EB2D、EB4D、EB6D、EB8D、EB10D、EB12D七个时间点收集细胞，进行流式细胞仪检测。步骤如下：将EB球用0.01M PBS清洗一遍后，加入0.05％胰酶-EDTA消化10min，以胰酶抑制剂终止消化，用30μm的筛网过滤，以去除未消化成单细胞的细胞球，1000rpm离心5min，弃上清液；加入神经分化培养基(用PBS替代DMEM/F12和Neurobasal)作为FACs buffer，吹散细胞；将细胞转移至流式细胞检测专用管中，在EPICS ALTRA流式细胞仪上检测。

细胞总RNA的提取：

分别于EB0D、EB2D、EB4D、EB6D、EB8D、EB10D、EB12D七个时间点收集细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，观察Purmorphamine对参与运动神经元相关的基因在神经诱导过程的变化：步骤如下：

(1)将细胞(5～10×10⁶)用PBS清洗2遍，加入1ml Trizol，吹打使其混匀；将裂解后的细胞并Trizol液一起移入1.5ml EP管中，室温(15～30℃)静置孵育10min；

(2)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温(15～30℃)静置15min；

(3)预冷离心机至4℃，12000rpm，离心15min；

(4)吸取上层无色水相，加入500μl异丙醇，混匀，室温静置10min；

(5)4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，片状RNA沉于管底；

(6)1ml 75％乙醇(DEPC水配制)洗涤2次，涡旋振荡，悬浮沉淀，8000rpm，离心5min，弃上清，RNA沉于管底，室温自然干燥5min，室温自然干燥5min；

(7)用30～50μl的DEPC处理水(或0.01mM TE；0.5％SDS)溶解RNA，或60℃水浴10min促溶；

(8)用1％琼脂糖凝胶电泳检验RNA的完整性，并用Nanodrop2000超微量分光光度计测OD值，RNAA260/A280比值1.6～1.8为质量良好，RNA浓度(μg/ml)＝OD260×K(40)×稀释倍数(50)。-80℃保存备用，或直接进行下一步实验。

逆转录反应：

(1)取5μg总RNA，1μl Olig(dT)₂₀、1μl 10mM的dNTP混合物和适当体积DEPC水混合至13μl，65℃，5min后放到冰上至少1min；

(2)加入4μl 5×First-Strand Buffer，1μl 0.1MDTT，1μl RNA酶抑制剂(RNase OUT)和1μl M-MLV逆转录酶(SuperScript^TM III RT)混合均匀，25℃，5min；

(3)转入50℃，30～60min；

(4)70℃，15min，终止反应，cDNA置-20℃贮存备用。

表7为反应体系；表8为RT-PCR反应体系；表9为引物序列及反应条件。

表7

表8

PCR反应程序为：

表9

扩增片段用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，120V，20-30min。

细胞免疫荧光化学：

为了检测Purmorphamine对神经元不同阶段的影响，于EB6D和EB8D时收集细胞球分别检测Nestin和Hb9的表达；贴壁7d后的神经元前体细胞检测Olig2和Tuj1的共表达；贴壁14d后成熟运动神经元分别检测Hb9、MNR2、Isl1、Olig2、Hoxb4和Tuj1的共表达情况。

结果显示，应用Purmorphamine诱导的神经分化，能模拟胚胎发育过程中的体内环境，诱导Olig2⁺-GFP⁺-mES定向分化为脊髓运动神经元，并提供了更高分化率的诱导途径。

实施例3Purmorphamine诱导Olig2+-GFP+-mES定向分化为少突胶质细胞

实验细胞与实施例1相同。主要实验仪器与实施例2相同。

主要试剂和用品：

Insulin，Transferrin，BSA，Progeserone，Na Solenite，Putrescine，T3，Biotin，NAC：购自Sigma公司(美国)；

兔抗NG2抗体(Chemicon，MAB5320)、小鼠抗O4抗体(Chemicon，MAB345)、小鼠抗MBP抗体(Chemicon，MAB389)、兔抗PDGFR-a抗体(Santacruz，SC-338)，小鼠抗Nkx2.2抗体(DHSB，74.5A5)，兔抗GFAP抗体(Invitrogen，709135A)；

驴抗兔荧光Alexa

594标记IgG二抗，驴抗小鼠荧光Alexa

594标记IgG二抗：购自Invitrogen公司(美国)；

主要试剂配制：

表10100×SATO培养基

表11改良后SATO培养基

表12星形胶质细胞培养基(ASM)

实验方法：

1)Olig2⁺-GFP⁺-mES向少突胶质前体细胞分化

本实施例采用4步程序法诱导Olig2+-GFP+-mES定向分化为少突胶质前体细胞：将消化后的ES在含有LIF(20U/ml)的胚胎干细胞培养基悬浮培养2d，神经分化培养基悬浮培养4d(此阶段开始加RA和0.5μM Purorphamine)，神经分化培养基悬浮培养6d(此阶段于EB6D撤除RA和Purmorphamine，添加10ng/ml bFGF和PDGF-AA)，在改良的SATO培养基中贴壁培养7d，撤除PDGF-AA和NT-3后继续培养7天，促使少突胶质前体细胞成熟，分化位少突胶质细胞；

其中，将EB12D的神经前体细胞球分为三组：对照组(无Purmorphamine，含DMSO)，Purmorphamine组(0.5μM)和SHH组(100ng/ml)。

表13引物序列及反应条件

其余实验方法与实施2相同。

结果显示，本发明中Purmorphamine通过参与SHH信号通路和背-腹侧轴通路，启动胶质细胞分化相关基因的表达，诱导Olig2⁺-GFP⁺-mES分化为少突胶质细胞，

实施例4建立大鼠脊髓撞击伤模型

1)实验动物

清洁级健康成年Wistar雌性(200～250g)大鼠，共60只，购自中国科学院(上海)斯莱克公司，饲养于复旦大学医学院实验动物中心。以日光灯维持每天12h的光照(7:00AM-7:00PM)，室温保持在25℃左右，所有实验动物喂养及实验程序均严格遵照复旦大学实验动物保护条款。

2)主要试剂

兔抗NF-200抗体(Chemicon，AB1989)，大鼠抗MBP抗体(Abcam，ab7349)，兔抗NG2抗体(Chemicon，MAB5320)，驴抗兔荧光Alexa

594标记IgG二抗，驴抗小鼠荧光Alexa

594标记IgG二抗，驴抗兔荧光Alexa

488标记IgG二抗(Invitrogen公司，美国)。

3)主要仪器设备

NYU脊髓致伤仪(NYU-Impactor modle-II Spinal cord contusion system，美国)，脊柱固定装置(Clamping systems，USA)，石蜡切片机(FJ-200，上海)，冰冻切片机CM1900(LEICA)，恒温水浴箱。

4)实验方法

按常规方法制作实验大鼠脊髓撞击伤模型，实验的动物在进行正式实验前均经7～10d的术前行为学训练，包括熟悉旷场的BBB(Basso，Beattie and Bresnahan)评分，斜板Tarlov实验和足迹印迹实验。

表14实验动物分组，

(A组)损伤组(44只)：打开椎板，进行脊髓T10撞击损伤；

(B组)假手术组(10只)：仅打开椎板，不进行撞击脊髓；

(C组)正常对照组(6只)：不做任何处理。

大鼠脊髓损伤的行为学鉴定：假手术组和手术组随机取6只大鼠分别于术前、术后1、3、7、14、21和28d进行改良Tarlov和BBB联合的运动神经功能评分。

表15Tarlov评分标准

分值	特征
		0和1分	没有自主性运动，仅限于髋关节的非反射性运动
2分	肢体髋、膝、踝三个主要关节的运动
		3分	能主动支持体重和不协调步态

4分	前肢和后肢协调的步态，行走时有趾间关节的运动
		5分	正常步态

大鼠在造模前先暴露在开放的实验环境中，使大鼠熟悉环境。术后，用BBB评分法对每只大鼠的后肢运动能力进行评分，每次观察5min。

表16BBB评分标准

模型鼠脊髓损伤的形态学研究观察：

按常规方法，取脊髓损伤部位冰冻切片，用于后续的免疫组织化学染色，苏木精、伊红染色，快蓝Luxol Fast blue染色，髓鞘染色相对光密度测量；实验数据用均数±标准差

表示，用SPSS16.0统计软件进行分析处理，组间比较用t检验(两组间比较)或单因素方差分析F检验(两组以上比较)；P＞0.05为在统计学上差异无意义；P＜0.05为差异在统计学上有显著性意义；P＜0.01为差异在统计学上有非常显著性意义。

实验结果显示，本发明从大鼠SCI后的行为学评分与组织学观察，应用NYU脊髓致伤仪成功建立大鼠急性脊髓损伤模型；本发明的实验动物模型制作方便，且模型制作过程中的操作对大鼠的创伤小，形成的损伤稳定、重复性好，能较好地反映人类脊髓损伤的病理生理过程。

实施例5Olig2⁺-GFP⁺-OPC移植治疗实验大鼠脊髓损伤

实验动物、主要试剂与仪器设备和脊髓撞击伤模型的建立与上述实施例相同。

细胞处理：收集EB12D的少突胶质前体细胞球，经Trypsin-accutase消化成单细胞后，FACs筛选出Olig2⁺-GFP⁺-OPC，用0.4％苔盼蓝溶液检测细胞活力，同时调整细胞浓度至1×10⁶/μl备用。

活细胞率检测：取9滴细胞悬液并滴加1滴0.4％苔盼蓝溶液混匀，3min内用细胞计数板分别计数活细胞(不着色的细胞)和死细胞(着色的细胞)，根据以下公式计算细胞活力：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。

细胞移植：按表17实验分组，

表17

(A组)Olig2⁺-GFP⁺-OPC移植组：移植筛选的Olig2⁺-GFP⁺-OPC；

(B组)手术对照组：SCI后1w移植培养基(DMEM)；

(C组)假手术组(sham group)：只打开椎板，不施行SCI；

(1)移植前将细胞浓度调整为1×10⁶cells/μl，置于冰上备用；移植所用玻璃电极的平口端通过塑料套管套接5μl的微量注射器，先使玻璃电极充满无菌的生理盐水，玻璃电极的尖端由空气封闭，然后将准备的细胞通过微量注射器吸3μl细胞入玻璃电极内，将玻璃电极固定在立体定位仪上备用；

(2)实验大鼠术前一天注射免疫抑制剂CsA(10mg/kg)，麻醉用3％戊巴比妥钠腹腔注射(30mg/kg体重)，术中，选取距离脊髓损伤部位处5mm的脊髓上下端，即损伤与正常交界处各取左右两个位点，共4个位点进行细胞移植；

(3)调节立体定位仪缓慢下降玻璃电极，以15°斜角插入脊髓，缓慢手动旋转微量注射器，调节细胞移植入脊髓的速度为0.5μl/min，待细胞完全注射完毕，原位留针5min，然后用立体定位仪缓慢将针拔出，逐层缝合伤口。每只动物共移植3×10⁶细胞(4个位点)。手术对照组按上述方法注入等量的培养基。结果显示，移植手术中见大鼠损伤的组织呈炎症修复改变，损伤脊髓组织的质地较邻近正常脊髓节段明显偏软。将细胞悬液缓慢注射入脊髓损伤与正常交界处，在移植过程中未见液体外渗和局部组织肿胀，确保移植的细胞能够顺利地进入到脊髓组织内。

术后，在大鼠处理伤口局部滴加青霉素防止感染，及注射免疫抑制剂CsA(10mg/kg)，以减轻细胞移植后的排斥反应，观察直到大鼠自身排尿反射恢复。

本发明采用Tarlov评分、BBB评分和足迹分析等行为学方法，观察细胞移植对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响：

Tarlov和BBB评分评分方法同前；

足迹分析：实验所得印有大鼠足迹的白纸，将其前后各去除15cm，对剩余的中间段(70cm)进行分析。在实验过程中，如果大鼠在行进中在通道中间有停留，则该次实验作废处理；

将术前大鼠足迹分析数据作为其基础水平数值，然后从SCI后7d(即细胞移植前)、SCI后14d(即细胞移植后7d)、SCI后21d(即细胞移植后14d)和SCI后35d(即细胞移植后28d)进行足迹分析。足迹分析中检测的指标包括步幅大小(Stride length，同侧相邻两个后脚掌中心的距离)、外旋角度(Angle of rotation，后脚掌中心点和第三脚趾形成的直线与经过脚掌中心点和行进方向平行的直线间形成的一个夹角)。实验过程中，每只大鼠重复3次足迹分析，然后取其平均值。最后，将术后足迹分析所得的数据与术前足迹分析所得的基础数据相比得到的百分比值，作为统计学分析的数据。

神经电生理功能检测：SCI通常造成脊髓运动、感觉神经传导通路受损，引起运动诱发电位(Motor Evoked Potentials，MEPs)和体感诱发电位(Somato Sensary Evoked Potentials，SSEPs)的改变，MEPs是通过刺激端脑的运动中枢，同时在脊髓、外周神经或肌肉上记录到的电信号，能够直接反映脊髓下行传导束或外周运动神经的功能状态。因此，本实验进一步采用神经电生理检测方法评估、分析Olig2⁺-GFP⁺-OPC移植治疗对脊髓神经传导功能的影响；实验分别对假手术组、细胞移植前(SCI后7d)、细胞移植后7d(SCI后14d)、14d(SCI后21d)和28d(SCI后35d)时检测大鼠MEPs的变化情况。

免疫组织化学：移植细胞28d后，取Olig2⁺-GFP⁺-OPC移植组6只大鼠灌注取材，取材部位为SCI部位上下各1cm，行脊髓横切面进行免疫组织化学染色。由于移植细胞是Olig2⁺-GFP⁺-OPC，分别用山羊抗GFP抗体和神经元的标志物(MAP2)、星形胶质细胞标志物(GFAP)、少突胶质前体细胞标志物(NG2)和髓鞘碱性蛋白(MBP)进行双标，观察移植细胞在宿主内整合、迁移和分化情况。

透射电镜：分别取假手术组(即pre-injury)、细胞移植前(SCI后7d)、细胞移植后28d(即SCI后35d)三组大鼠各两只，切取损伤区组织进行透射电镜观察，主要观察皮质脊髓束的形态结构。

蛋白免疫印迹(Western blot)：分别取假手术组(即sham组)、细胞移植前(SCI后7d)、细胞移植后1w、细胞移植后2w、细胞移植后3w和细胞移植后4w六组大鼠各两只，切取损伤区和移植区域的脊髓组织进行Western blot检测，观察移植前后，脊髓组织NF-200和MBP的蛋白表达。

表18蛋白质浓度测定加样量

组分	1	2	3	4	5	6	7	待测样品
									BSA(μl)	0	2.5	5	10	15	20	25	10
H2O(μl)	25	22.5	20	15	10	5	0	15
									AB(μl)	200	200	200	200	200	200	200	200
Con(μg/ml)	0	50	100	200	300	400	500

表1912％分离胶5ml和5％浓缩胶3ml的配方

本实施例所采用的观察移植前后，脊髓组织NF-200和MBP的蛋白表达的试验方法可参照本领域技术人员知悉的实验方法。

实验数据以均数±标准差

表示，用SPSS16.0统计软件进行数据分析处理，组间比较用t检验(两组间比较)或单因素方差分析F检验(两组以上比较)，P＜0.05为差异在统计学上有显著性意义。

本发明通过形态学、Western blot、行为学和神经电生理学研究实验，结果显示，Olig2⁺-GFP⁺-OPC移植治疗大鼠SCI能显著改善愈后；所述的Olig2⁺-GFP⁺-OPC将成为脊髓损伤后细胞移植治疗的另一个细胞来源。

Claims (10)

1.一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法，其特征在于，采用拟胚体介导的神经诱导法，以Olig2-GFP⁺-mES作为细胞模型，以嘌呤衍生物Purmorphamine结合全反式维甲酸定向诱导所述的Olig2-GFP⁺-mES细胞分化为脊髓运动神经元和少突胶质前体细胞；包括下述步骤：

①将Olig2⁺-GFP⁺-mES放入含有白血病抑制因子LIF的胚胎干细胞培养基悬浮培养2天；

②放入含有全反式维甲酸RA和嘌呤衍生物Purmorphaine的神经分化培养基中培养4天；

③放入含有bFGF的神经分化培养基分别培养2天和6天，采用荧光激活的细胞筛选Olig2⁺-GFP⁺-阳性细胞；

④分别在神经元培养基和少突胶质细胞培养基继续培养，诱导生成脊髓运动神经元和少突胶质细胞。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤①的Olig2⁺-GFP⁺-mES是利用遗传工程的方法，通过四环素诱导表达系统，在小鼠胚胎干细胞的Olig2基因座上插入GFP制成。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤①的胚胎干细胞培养基中含有白血病抑制因子LIF的浓度为20u/ml。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤②的神经分化培养基中含有全反式维甲酸RA的浓度为0.5μM。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤③的神经分化培养基中bFGF的含量为10ng/ml。

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤④的在神经元培养基中培养为贴壁培养7～14d。

7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤④的在少突胶质细胞培养基培养为贴壁培养14d。

8.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Olig2-GFP⁺-mES细胞分化为脊髓运动神经元，其分化率超过50％。

9.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Olig2-GFP⁺-mES细胞分化为少突胶质细胞分化，其分化率超过80％。

10.权利要求1所述的方法在用于制备修复脊髓损伤的制剂中的用途。 

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