CN102846611A - 斯克瑞泰Scriptaid在制备治疗创伤性脑损伤疾病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属医药技术领域，涉及组蛋白脱乙酰酶抑制剂斯克瑞泰Scriptaid新的药用用途，具体涉及斯克瑞泰Scriptaid在治疗创伤性脑损伤疾病药物中的用途，本发明经试验证实，所述Scriptaid能显著改善创伤性脑损伤小鼠的神经功能评分，减少损伤后脑组织缺失，同时能明显减轻海马神经元变性坏死，改善学习记忆功能，其副作用较小，安全系数较高，对于创伤性脑损害所致的急、慢性损伤均具有明显的神经保护作用。所述的Scriptaid可进一步制成缓释或控释药物制剂；制成腔肠给药、喷雾给药、透皮吸收或口服的药物制剂；制成注射制剂或输液制剂；或复方药物制剂，用于治疗各种神经或创伤性脑损伤性疾病。

Description

斯克瑞泰Scriptaid在制备治疗创伤性脑损伤疾病药物中的用途

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂斯克瑞泰(Scriptaid)新的药用用途，具体涉及斯克瑞泰Scriptaid在治疗创伤性脑损伤中的用途，

背景技术

创伤性脑损伤(traumaitc brain injury，TBI)是神经外科领域常见的急症之一，尤其是重型TBI，死亡率达到30％-50％；即便存活下来，其中轻度损伤患者中的10％会遗留永久残疾，中度和重度患者可达到66％和100％。据统计，TBI目前已成为全世界35岁以下青壮年人群第一位死亡和致残原因。在我国，随着经济的快速发展，交通运输业、建筑业、体育事业发展十分迅速，交通事故、建筑工伤、运动意外事故等意外伤害大大增加，由此造成脑外伤的发病率逐年增高，对社会和病人家庭造成极大的经济和心理负担。

组蛋白(histone)是真核生物核染色体的重要构成成分，与DNA共同构成染色体的基本结构单位-核小体。现有技术公开了4种组蛋白H2A、H2B、H3和H4，每一种组蛋白各二个分子，形成一个组蛋白八聚体，约200bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。研究报道，由组蛋白修饰所引起的染色体局部构象的改变，在真核生物基因表达调控中发挥着重要的作用，是相关基因表达开放与关闭的调节机制之一。组蛋白乙酰化水平的调控，是这种调节机制的一个基础，平衡的精确调控保证了细胞正常功能的执行。乙酰化调节还可以影响DNA与转录调节复合物的结合，调控DNA的复制和修复、基因表达、染色质组装和细胞有丝分裂。调控组蛋白乙酰化状态的酶分为2类，组蛋白乙酰化酶(histone acetylase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)，两者相互拮抗，维持体内乙酰化内稳态的平衡。HAT催化组蛋白氨基末端上数个赖氨酸残基的乙酰化，使组蛋白分子的电荷被中和，从而减弱组蛋白与DNA的结合，并影响组蛋白分子之间和组蛋白与其他转录调节蛋白的相互作用，由此促进染色质的松解和相关基因表达水平的提高；HDAC则催化组蛋白脱乙酰基，引起相应基因表达下降。

鉴于乙酰化和去乙酰化异常与很多神经系统疾病有关，国外学者已对HDAC抑制剂类神经保护剂在TBI的应用作了初步探索。有研究发现，在TBI后组蛋白乙酰化水平显著降低，并且可能与继发性氧化应激损伤和兴奋性毒性相关；使用某些HDAC抑制剂能明显改善TBI后运动功能，增强神经可塑性和学习记忆能力，减轻脑组织损伤，同时阻止神经退行性变。所述的Scriptaid是异羟肟酸类中较新型的HDAC抑制剂，副作用较小，安全系数较高，目前国内外还没有将Scriptaid运用于中枢神经系统损伤的报道。

发明内容

本发明的目的是提供组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂斯克瑞泰(Scriptaid)新的药用用途，尤其涉及斯克瑞泰Scriptaid在制备神经保护药物及治疗创伤性脑损伤药物中的用途，

具体而言，本发明进行了有关Scriptaid抗创伤性脑损伤(TBI)的实验研究，结果证实，所述的Scriptaid具有明确抗脑损伤的神经保护作用，为其作为一种新型抗中枢神经系统损伤药物及其临床应用提供了较完整的实验依据。

本发明中，通过建立小鼠局灶性脑挫裂伤模型(controlled cortical impact，CCI)，对于Scriptaid抗创伤性脑损伤作用进行验证，结果表明：

(1)HDAC抑制剂Scriptaid对于创伤性脑损伤小鼠具有明显的神经保护作用，且存在着明显的量效关系，结果显示，低剂量(1.5μg/g)时效果不十分显著；随着使用量逐渐增加(3.5、5.5μg/g)能明显改善TBI后小鼠神经行为学障碍，减少脑创伤后组织缺失；

(2)Scriptaid(3.5μg/g)能明显减轻海马神经元变性坏死，显著改善TBI后小鼠学习记忆功能；

(3)Scriptaid能显著抑制TBI后的HDAC活性，促进乙酰化H3、H4水平显著增加，该分子机制可参与其神经保护作用。

本发明经试验证实，所述的Scriptaid副作用较小，安全系数较高，对于创伤性脑损害所致的急、慢性损伤均具有明显的神经保护作用。

本发明所述的Scriptaid适用于制成药物制剂，可进一步制成缓释或控释药物制剂；制成腔肠给药、喷雾给药、透皮吸收或口服的药物制剂；制成注射制剂或输液制剂；或与其它药物组成复方药物制剂。

本发明制成的药物制剂，用于治疗各种神经或创伤性脑损伤性疾病。所述药物优选以片剂或胶囊形式使用，或以无菌注射剂或滴注液形式使用。

本发明所涉及的神经损伤性疾病包括：由作用于脑底或脊柱的物理力，局部缺血，中风，呼吸停止，心跳停止，脑血检形成或检塞，AIDS所致神经障碍，和大脑出血，脑脊髓炎，脑积水，术后事件，脑感染，震荡或颅内压升高所引起的创伤性脑损伤，和/或上述病症的后遗症。

本发明的优点是：

本发明将Scriptaid对于TBI损伤的神经保护作用作了全面评估，同时对于其可能涉及作用靶点作了初步验证；所述新靶点的验证，为神经保护药物的开发提供更多的理论依据和新的研究思路；在临床应用时，为TBI治疗提供一个新的药物选择，同时将会有广泛的商业化应用前景，在促进人类的健康事业方面亦具有十分明显的社会意义。

附图说明

图1：TBI术前及术后1、3、5、7天各组小鼠肌力测试结果，

其中：分数越高，表明神经功能越正常。与同一时间的对照组(0μg/g)相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图2：TBI术前及术后3、5、7天各组肢体不对称测试结果，

其中：正常情况下，小鼠左右对称使用前肢，纵坐标越高表明患肢使用率越少。与同一时间的对照组(0μg/g)相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图3：TBI术前及术后1、3、5、7天各组小鼠错步测试结果，

其中：分数越少，表明神经功能越正常。与同一时间的对照组(0μg/g)相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图4：TBI后7天各组小鼠脑片焦油紫染色例图，

其中：Scriptaid各治疗剂量组与对照组相比，缺损区域不同程度变小。

图5：TBI后第29至33天水迷宫学习训练结果，

其中：与同一时间假手术组相比，^##P＜0.01；与同一时间对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图6：TBI后第35天各组大鼠海马CA3区焦油紫染色图，

其中：假手术组海马组织无明显损伤，CA3区锥体细胞核大而圆，核仁明显，可见浅染的突起，锥体细胞排列整齐致密，形态完整，尼氏小体丰富；对照组损伤侧海马组织有明显损伤，主要表现在CA3区大量锥体细胞缺失，残留的锥体细胞排列松散不规则，多数细胞胞核固缩，核仁欠清晰，尼氏小体减少或消失；Scriptaid治疗组损伤侧海马锥体细胞排列比较整齐致密，胞核饱满，核仁较清晰，仅有少量散在的锥体细胞缺失或胞核固缩。

图7：各组Westernblot例图，

其中，有左至右，各组依次代表：假手术组，对照组，Scriptaid小剂量组(1.5μg/g)、中剂量组(3.5μg/g)、高剂量组(5.5μg/g)；分别提取各组TBI后1天损伤侧脑皮层核蛋白行Western blot，总的H3蛋白作为内参。

具体实施方式

1、实验材料和方法

1.1实验动物与分组

清洁级成年雄性C57/BL6鼠(由中科院动物中心提供)，8-10周龄，25-28g，术前动物在本实验室动物房饲养2～3天，自由饮食，室温20-22℃，每日光照12h/黑暗12h，使动物适应环境。将小鼠随机分为假手术组、对照组、Scriptaid小剂量组(1.5μg/g)、中剂量组(3.5μg/g)、高剂量组(5.5μg/g)，每组12只行神经功能测评，其中8只组织学染色，余下4只急性取脑组织提取蛋白；上述所有动物术后观察1周。另取一批小鼠随机分为假手术组、对照组、Scriptaid组(3.5μg/g)，每组8只用于水迷宫测定及组织学染色，共观察5周。手术后即腹腔注射相应剂量的Scriptaid，假手术组、对照组注射等量的生理盐水

1.2模型制备

利用PSI公司的TBI-0310颅脑损伤仪制备标准化的小鼠局灶性脑挫裂伤模型(controlled cortical impact，CCI)。密封罐内异氟醚诱导小鼠麻醉后，剪去其头顶部皮毛，俯卧位固定于Knof立体定位仪上，打开麻醉机，通过面罩持续麻醉(15-2％异氟醚/空气、呼吸频率65次/分钟、吸呼比1∶1、潮气量3ml)。碘伏皮肤消毒，沿头皮中线切开皮肤，用撑开器或止血钳固定头皮和筋膜，止血后用棉签分离骨膜，充分暴露颅顶骨，尤其前囟区域。以前囟前1.5mm，中线右侧旁开1.5mm处为中心，以牙科钻开一直径为3mm的骨窗(中心区域为额顶叶交界处的感觉运动混合皮层)，充分暴露硬脑膜，并保持硬脑膜外形完整，注意止血。打开压缩空气推动撞击器，设定参数，撞击速度：3.5m/s，撞击深度：1.5mm，撞击停留时间：150ms，然后撞击，及时止血。缝合头皮，置IVC鼠笼喂养。假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不打击。

1.3神经功能评估

1.3.1Wire-hanging test(肌力测试)

将小鼠放置于直径2mm，长度50cm的不锈钢丝中点上，平台高度37cm，共观察4次，每次30s。评分细则：0分，30s内从钢丝掉下；1分，用两只前爪紧抓在钢丝上；2分，除了上述1分之外，尝试爬到钢丝上；3分，用两只前爪和一只(或两只)后爪紧抓在钢丝上；4分，用四肢紧抓在钢丝上，并且用尾巴缠绕在钢丝上；5分，30内逃到一侧的支架。

1.3.2Cylinder test(前肢不对称测试)

将小鼠置于直径7.5cm，高度为38cm透明圆柱中，摄像机全方位连续拍摄5min。分析时用每秒10帧速度观察，实验中小于5次起身的小鼠被排除。统计时，同时计算左侧、右侧及双侧前肢接触圆柱壁的次数。前肢不对称使用率＝(右侧碰壁次数-左侧碰壁次数)/(左侧碰壁次数+右侧碰壁次数+双侧碰壁次数)×100％；数值越高，表明损伤程度越重。

1.3.3Grid walking and footfault test(错步实验)

将小鼠鼠放于不锈钢架上，此架上有2cm×2cm的正方形小栅栏，钢架长40cm，宽20cm上，距离地面50cm；分别计数动物1分钟内左前肢和左后肢在栅栏上走的总步数，同时分别计数动物左前肢和左后肢没有踏在栅栏上而踏空了的步数作为踏错步数。错步率＝踏错步数/总步数×100％。

1.3.4Morris water maze(水迷宫测试)

具体操作方法如下：水迷宫分为四个象限，将一圆形平台固定于水迷宫的第一象限，低于水面1cm的深度，实验分两个阶段，第一阶段——学习期(TBI后第29-33天)：将实验动物分别于第二、三、四象限的指定位置随机放入水中，动物入水时面向水池壁，由安装于水迷宫正上方的摄像头监控动物90s内在水中的运动情况，包括游泳速度、经过各象限的时间和距离、到达平台的潜伏期等指标。如果动物在90s内未能到达平台，由实验操作人员引导其找到平台，动物到达平台后，让其在平台上滞留10s后再进行后续实验。第二阶段——记忆期(TBI后第34天)：将平台从第一象限移走，把经过前一阶段训练的动物于同样的位置随机放入水中，动物入水时面向水池壁，由安装于水迷宫正上方的摄像头监控动物90s内在水中的运动情况，包括游泳速度，经过各象限的时间和距离，经过之前平台所在位置的次数等指标。

1.4焦油紫染色(CV staining)

4％多聚甲醛灌注后取脑，经后固定、蔗糖平衡后，行快速冷冻切片，片厚25μm。将脑片直接贴于涂明胶的载玻片上，并置于室温下风干一天，利于贴附。将切片依次放入氯仿30min，丙酮15min，100％乙醇30min，95％乙醇30s，70％乙醇30s，ddH₂O 30s(两次)，焦油紫染液20min，ddH₂O30s(三次)，70％乙醇60s，95％乙醇60s，100％乙醇60s，氯仿5min，分化剂3-5min，95％乙醇1-2min，100％乙醇2-3min，100％乙醇2-3min，二甲苯1-2min，二甲苯2-3min，二甲苯2-3min。最后中性树胶封片，盖玻片封闭，晾干后观察。

1.5脑缺损体积测定

每只小鼠脑片从前囟前2.96mm开始收集，每12张取1张，共取10张脑片，焦油紫染色之后作脑梗死体积百分比的分析。采用lecai Q1050图象分析仪测量每张脑片缺血同侧未梗死面积及缺血对侧面积，依据公式：

计算出脑缺损体积百分比。

1.6细胞核、质分离

应用细胞核、质蛋白的分离提取试剂盒，操作步骤如下：动物断头取脑，迅速于冰上分离大脑皮层，将相同处理组2个同侧大脑皮层置于1ml玻璃匀浆器中，加入预冷的0.01M PBS 0.5ml，上下匀浆约25；匀浆液用纱布过滤，收集于1.5ml离心管中；4℃800g离心5min沉淀细胞；弃上清，沉淀用400μl buffer A重悬，冰浴10min；加入10μl新鲜配置的10％NP-40液，用玻璃匀浆器匀浆10次；4℃2000g离心5min沉淀细胞核；收集上清4℃14000g离心30min为胞浆蛋白。细胞核沉淀用400μl buffer A洗2次，即吹打重悬再离心4℃2000g，5min；细胞核沉淀用20μl buffer B重悬，冰上作用10min；超生裂解细胞5mV上下10次，共3次；4℃14000g离心30min收集上清为核蛋白。

1.7Western blot印迹

用改良Lowry法进行核蛋白定量。然后取各样本40μg蛋白质进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，电转移法将蛋白质转移到PVDF膜，室温下5％脱脂奶粉封闭2h；TBST洗涤3次，加入相应的一抗孵育(4℃过夜)；经TTBS充分洗涤后，在膜的正面滴加含有二抗(羊抗兔IgG/HRP或羊抗小鼠IgG/HRP)的封闭液，室温摇床反应2h。取出滤膜，经TBST溶液充分漂洗后，ECL法显影，采用Bio-Rad图像成像仪进行拍照，Quantity One图像分析软件进行定量分析。

1.8数据处理及统计分析

利用SPSS 16.0统计软件分析处理数据，以均数±标准误

表示。单因数方差分析(one way ANOVA)比较各组之间的差异，两两比较用Scheffe法，P＜0.05为显著性界值。

2、结果

2.1TBI后7d各组疗效观测

2.1.1神经功能评估

如图1(Wire-hanging test)所示，对照组(0μg/g)在TBI后较术前和假手术组相比，肌力显著下降(P＜0.01)，随着时间的延长，逐渐恢复，但第7天时仍较假手术组有显著差异(P＜0.01)；小剂量组(1.5μg/g)较对照组相比，有肌力恢复趋势，但尚无统计学差异；中剂量组(3.5μg/g)较对照组相比，术后第1天即有显著学差异，直至第7天(P＜0.01)；高剂量组较中剂量组疗效有所下降，与对照组相比，术后前3天有差异(P＜0.01或P＜0.05)，但第5、7天差异消失。

如图2(Cylinder test)所示，对照组TBI后左侧前肢使用率显著下降；小剂量组较对照组相比有所改善，于术后第5天出现统计学差异(P＜0.05)；中剂量组与对照组相比，TBI后第3天即出现显著性统计学差异(P＜0.01)，直至第7天；高剂量组效果与中剂量组相仿。

如图3(Grid walking)所示，对照组左前肢错步率显著增加，使用不同剂量的Scriptaid后错步率均显著较少(P＜0.01或P＜0.05)，尤以中、高剂量减少最明显(P＜0.01)。

2.1.2脑缺损体积测定

如CV染色脑片整体观(图4)所示，各剂量组的Scriptaid能不同程度地减少了脑创伤所致的脑组织缺失，尤以中剂量组最为明显。通过软件及前述计算公式分析组织缺失(每组n＝8)，量化结果显示对照组缺失体积为28.3％±7.5％；小剂量组减少到21.6％±5.2％，但尚无统计学意义(P＞0.05)；中剂量为13.7％±4.1％(P＜0.01)，高剂量为18.2％+5.2％(P＜0.05)。

2.2TBI后35d各组疗效观测

2.2.1对小鼠学习能力的影响

如图5所示：在学习训练过程中，对照组到达指定位置平台的时间明显延长，提示早期脑缺血缺氧所导致海马损伤严重影响了远期的学习记忆功能，治疗组动物自学习训练第3天开始，到达平台的潜伏期明显较对照组缩短(P＜0.01或P＜0.05)。前5天学习训练结束后，第6天撤掉平台后，假手术组在目标象限停留时间比为38.7％±3.5％，对照组降为18.6％±1.9％，而Scriptaid治疗组升至26.7％±2.5％，与对照组相比具有显著性统计学意义(P＜0.05)。可见，Scriptaid干预可以有效改善脑损伤引起的学习记忆功能障碍。

2.2.2脑缺损体积测定

TBI后35天测定小鼠脑缺损体积，结果显示对照组缺损体积比为30.4％±3.2％，较7天时(28.3％±7.5％)有所增加；反观Scriptaid治疗组，缺损体积仍在较小范围内(14.4％±1.9％)，与对照组相比，具有显著性统计学意义，P＜0.01。

2.2.3组织学观测(焦油紫染色)

如图6所示，假手术组海马组织无明显损伤，CA3区锥体细胞核大而圆，核仁明显，可见浅染的突起，锥体细胞2-3层，排列整齐致密，形态完整，尼氏小体丰富；对照组缺血侧海马组织有明显损伤，主要表现在CA1区大量锥体细胞缺失，残留的锥体细胞排列松散不规则，多数细胞胞核固缩，核仁欠清晰，尼氏小体减少或消失；Scriptaid组较对照组有明显好转，仅有少量散在的锥体细胞缺失或胞核固缩。

显微镜下(10×20倍)计数各组染色切片损伤侧海马CA3区每1mm区段内未损伤的锥体细胞(细胞核完整)的数目，每张切片计数3个区段取其平均数为神经元密度，每只动物取连续的6张切片。对照组海马CA1区锥体细胞稀疏，细胞层次不清楚，神经元密度明显降低。Scriptaid组海马组织学特征与假手术组相似，神经元密度较对照组相比显著增加，差别具有统计学意义(P＜0.01)。表明复方治疗组可明显阻止大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤造成的海马神经元缺失，如表1，图7所示。

表1：海马CA1区锥体层细胞密度(

n＝10)

注：与对照组比较，^**P＜0.01

2.3Scriptaid神经保护作用靶点

如图7(Western blot)所示：TBI损伤后1天，与假手术组相比，HDAC-1表达增强(P＜0.05)，而使用Scriptaid后呈现剂量依赖性抑制其表达(P＜0.05或P＜0.01)，从而使得乙酰化H3、H4水平由损伤后明显增加(P＜0.05或P＜0.01)，尤以中、高剂量(3.5、5.5μg/g)明显。此结果表明，TBI后HDAC-1水平增加，从而使得相应的乙酰化H3、H4水平下降，而使得引起相应基因表达下降，加剧TBI损伤；使用Scriptaid后通过抑制HDAC的活性，在转录水平调控基因的表达，通过诱导蛋白乙酰化引起染色体重建等一系列生物学效应，从而起到纠正疾病异常状态的作用。

Claims (7)

1.斯克瑞泰Scriptaid在制备治疗创伤性脑损伤疾病药物中的用途。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的创伤性脑损伤疾病包括的急、慢性脑损伤损疾病。

3.权利要求1所述的斯克瑞泰Scriptaid在制备神经保护药物中的用途。

4.按权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于，所述的斯克瑞泰Scriptaid制成制成缓释或控释药物制剂；制成腔肠给药、喷雾给药、透皮吸收或口服的药物制剂；制成注射制剂或输液制剂；或复方药物制剂。

5.按权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于，所述的创伤性脑损伤疾病包括：由作用于脑底或脊柱的物理力，局部缺血，中风，呼吸停止，心跳停止，脑血检形成或检塞，AIDS所致神经障碍，和大脑出血，脑脊髓炎，脑积水，术后事件，脑感染，震荡或颅内压升高所引起的创伤性脑损伤，和/或上述病症的后遗症。

6.按权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于，所述的药物以片剂或胶囊形式使用。

7.按权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于，所述的药物以无菌注射剂或滴注液形式使用。

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