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CN102812015A - 来自腔肠动物的抗原虫化合物 - Google Patents

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CN102812015A CN2011800133845A CN201180013384A CN102812015A CN 102812015 A CN102812015 A CN 102812015A CN 2011800133845 A CN2011800133845 A CN 2011800133845A CN 201180013384 A CN201180013384 A CN 201180013384A CN 102812015 A CN102812015 A CN 102812015A
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methyl
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河津信一郎
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Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine NUC
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Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine NUC
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Abstract

本发明的目的为开发具有新颖的作用机制的抗原虫治疗药。提供一种由化学式(1)表示的化合物或其药学上可允许的盐，其特征在于，在以下化学式(1)中，R1为化学式(4)的R10-或化学式(5)的R20-；R2为CHO-等；R3为氢原子、CH3-C(=O)-等；R4为氢原子、CH3-C(=O)-等；R11和R12各自独立为氢原子、甲基等；R13为-CH2-或-CH(-OH)-或-C(=O)-；R21及R22各自独立为氢原子、甲基等；R23为-CH2-、-CH(-OH)-或-C(=O)-；R24为氢原子、羟基、甲基等。

Description

来自腔肠动物的抗原虫化合物
技术领域
本发明关于来自腔肠动物的抗原虫化合物，特别关于来自腔肠动物角珊瑚Acanthoprimnoa cristata的抗原虫化合物。
背景技术
原虫感染病是未解决的严重疾病。例如，利什曼病是经白蛉叮咬传播的节肢动物媒介性人畜共患感染病，也是由可充当储存宿主的100多种脊椎动物传播给动物的原虫性疾病。在传播给人的过程中，狗、啮齿类动物特别关键，其感染患者人数在88个国家中就达约1200万人，约3亿5千万人处于被感染的危险边缘。近年来，其患者人数有增加趋势，每年新增加患者人数约为200万人，已确认仅在阿富汗包括难民在内爆发性增加新患者20万人以上。利什曼原虫已知为在巨噬细胞的细胞内增殖的专性细胞内寄生性原虫，感染人体的已知有20种以上。人类的临床症状大致分为3种类型，其1为内脏感染型，伴随着造血功能的低下直至致死，其2为皮肤型和其3为粘膜皮肤型，其所引起的皮肤损害(skin lesion)的不雅给患者造成极大地精神伤害。其中，成为最危重病症的内脏型利什曼病大多数发生在发展中国家，其发病率仅在印度、孟加拉国、巴西、苏丹4个国家就占有90%以上。针对这种情况，世界卫生组织(WHO)将利什曼病定为一类紧急且非受控性热带感染病(分类-Ⅰ)，并已将其指定为重点解决的十大热带感染病之一。
来自海洋无脊椎动物的化合物多被发现具有强烈的生物活性，且具有其独特的结构，被期待着作为医药品的研发素材(专利文献1)。本发明的发明者们将开发对利什曼病有效的治疗药物作为目标，对在日本各地采集的海洋生物进行抗原虫活性的筛选。所述筛选的结果，发现从深海所采集的腔肠动物角珊瑚Acanthoprimnoa cristata含有抗原虫活性物质。基于该发现而完成了本发明。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本未实审专利申请2007-161902号公报
发明内容
发明要解决的问题
在利什曼病的治疗中，对所有的疾病类型，5价锑剂为首选药物。世界卫生组织推荐的本药剂的使用方法：其给药量为20mg锑/kg/日，30天为一疗程。世界卫生组织在经过5价锑初次治疗疗程病症未得到显著改善的情况下，推荐转至喷他脒、氨苷菌素、两性霉素B、两性霉素B脂质体等的第二选择药物。涉及该利什曼病处方的问题之一是，首选药物和第二选择药物二者都必须通过注射进行给药。在医疗设施不完备的偏僻地区的患者连续一个月注射锑药剂被认为是极其困难的。在此，需要开发不通过注射便可施用的新颖的抗利什曼原虫的治疗药物。再者，已出现对所述锑药剂产生抗药性的原虫，而且，对第二选择药物耐药性的原虫的出现也只是时间问题。在此，我们需要开发具有新颖的作用机理，且抗利什曼原虫的治疗药物。
用于解决问题的方案
本发明提供一种化合物或其药学上可允许的盐，其具有以下的化学式(1)至(3)的任意一种结构，其中，在化学式(1)至(3)中，R1为化学式(4)的R10-或化学式(5)的R20-，R2为CHO-、HO-CH2-、CH3-C(=O)-或CH3-CH(-OH)-，R3为氢原子、CH3-C(=O)-、CH3-CH2-C(=O)-、CH3-CH(-OH)-或CH3-CH2-CH(-OH)-，R4为氢原子、CH3-C(=O)-、CH3-CH2-C(=O)-、CH3-CH(-OH)-或CH3-CH2-CH(-OH)-，R11和R12各自独立为氢原子、甲基、或卤素原子，R13为-CH2-、-CH(-OH)-或-C(=O)-，R21及R22各自独立为氢原子、甲基或卤素原子，R23为-CH2-、-CH(-OH)-或-C(=O)-，R24为氢原子、羟基、甲基或卤素原子。
[化学式1]
Figure BDA00002123085100031
[化学式2]
Figure BDA00002123085100032
[化学式3]
Figure BDA00002123085100041
[化学式4]
Figure BDA00002123085100042
[化学式5]
Figure BDA00002123085100043
本发明提供一种化合物或其药学上可允许的盐，其具有以下的化学式(6)或(7)的结构，其中，在化学式(6)或(7)中，R1为化学式(8)的R10-或化学式(9)的R20-，R2为CHO-、HO-CH2-、CH3-C(=O)-或CH3-CH(-OH)-，R3为氢原子、CH3-C(=O)-、CH3-CH2-C(=O)-、CH3-CH(-OH)-或CH3-CH2-CH(-OH)-，R4为氢原子或CH3-C(=O)-、CH3-CH2-C(=O)-、CH3-CH(-OH)-或CH3-CH2-CH(-OH)-，R5为氢原子、CH3-C(=O)-或CH3-CH2-C(=O)-，R6为氢原子、CH3-C(=O)-或CH3-CH2-C(=O)-，R11及R12各自独立为氢原子、甲基或卤素原子，R13为-CH2-、-CH(-OH)-或-C(=O)-，R21及R22各自独立为氢原子、甲基或卤素原子，R23为-CH2-、-CH(-OH)-或-C(=O)-，R24为氢原子、羟基、甲基或卤素原子。
[化学式6]
[化学式7]
[化学式8]
Figure BDA00002123085100062
[化学式9]
Figure BDA00002123085100063
本发明提供具有以下化学式(10)的结构的化合物或其药学上可允许的盐。
[化学式10]
Figure BDA00002123085100071
本发明提供一种化合物或其药学上可允许的盐，其为生成本发明的化合物或其药学上可允许的盐的药物前体。
本发明提供一种含有本发明的化合物或其在药学上允许的盐的用于治疗原虫感染病的医药品组合物。
本发明的用于治疗原虫感染病的医药品组合物，其含有：从5价锑剂、喷他脒、氨苷菌素、两性霉素B以及两性霉素B脂质体组成的组中所选择的至少一种药品；和本发明的化合物或其在药学上允许的盐，其中，可同时或逐次将所述至少一种药品和本发明的化合物或其在药学上允许的盐给药。
本发明的用于治疗原虫感染病的医药品组合物可以是治疗从利什曼病、锥虫病和疟疾组成的组中所选择的至少一种原虫感染病的医药品组合物。
在本发明的化合物的化学式中，在不区分立体异构体和/或几何学异构体的表示的场合下可为任意一种可能的立体异构体和/或几何学异构体，也可为是两种以上的立体异构体和/或几何学异构体的混合物。也就是说，本发明的化合物将以关于特殊的立体结构已公开的化学键为例外，包括所有关于其它化学键的可能的光学活性体或外消旋体、及所有非对映异构体或这些的任意混合物。
在本发明的化合物中的“卤素”也可为氟、氯、溴和碘中的任意一种。
本发明的化合物的药学上可允许的盐的优选例，包括盐酸盐、醋酸盐和对甲苯磺酸盐等酸性附加盐，铵盐或有机胺盐等碱性附加盐、以及游离形式和盐形式的肽衍生物的任意水合物及溶剂合物等，但也并不局限于这些。
本发明的医药品组合物包括至少一种本发明的化合物或其药学上可允许的盐作为有效成分。本发明的医药品组合物可包括至少一种本发明的化合物或其药学上可允许的盐和至少一种药学上可允许的载体。作为有效成分含有本发明的化合物或其药学上可允许的盐的本发明的医药品组合物可将预防和/或治疗利什曼病作为目的来使用，并可经肠胃外给药如静脉注射、皮下给药或直肠内给药等，以及经口服给药、经粘膜给药(transmucosal administration)或经皮给药等。适合这些给药途径的各种剂型对于本领域熟练技术人员都很熟知。本领域熟练技术人员可适宜选择适合所希望的给药形式的剂型，根据需求可使用在本领域可利用的一种或多种药学上可允许的载体或制剂用添加物(formulation additive)，进而制造医药品组合物制剂。例如，通过经皮给药，其软膏及其它的涂抹剂(appliedformulation)，湿敷(poultice)及其它的贴剂等为优选。在某些情况下，作为本发明的医药的有效成分，可使用本发明的化合物或其药学上可允许的盐的水合物或溶剂合物。给药量无特别的限制，例如，在经皮给药或经粘膜给药的情况下，一次给药量为0.1-10mg，在经口服给药的情况下，一次给药量为1-100mg，可每日服用2或3次。可选地，通常成人每日给药约0.1-1,000mg，优选约1-300mg。另外，还可依据患者的体重、年龄、基因型和病情等参数设定给药量。
本发明的医药品组合物可以以片剂、颗粒剂(细粒)，胶囊、注射剂(静脉点滴剂)、贴剂、栓剂、悬浊液以及乳化液、糊剂、软膏、面霜、化妆水、滴鼻剂、滴眼剂等剂型来提供，但也并不仅限于这些。在某些情况下，本发明的医药品组合物可转换为能够长时间持续缓释的控释化药物。
本发明的医药品组合物所含有的药学上可允许的载体或制剂用添加物可包括稳定剂、表面活性剂、增溶剂和吸附剂等，但也并不仅限于这些。本发明的医药品组合物所含有的药学上可允许的载体或制剂用添加物可对应上述所列举的本发明的医药品组合物的剂型进行选择。
在本发明中，术语“原虫”是指感染人及其他哺乳动物，危害人类的所有原生生物，包括利什曼原虫(Leishmania)、疟原虫(Plasmodium)、弓形虫(Toxoplasma)和锥虫(Trypanosoma)，以及引起原虫感染病如变形虫痢疾及南美锥虫病的病原体等，但也并不仅限于这些。
附图说明
图1为表示来自腔肠动物的抗原虫活性物质的分离程序的流程图。
图2为表示来自腔肠动物的抗原虫活性物质的分离程序的流程图。
图3为表示组分3-2成分的反相HPLC分离模式的波形图。
图4为表示组分3-3成分的反相HPLC分离模式的波形图。
图5为表示组分12-3成分的反相HPLC分离模式的波形图。
图6为表示组分12-10成分的反相HPLC分离模式的波形图。
图7为表示cristaxenicin A的COSY和HMBC相关结果的图。
图8为表示cristaxenicin A的NMR(400MHz、CD3OD)分析结果的数据表。
具体实施方式
虽然通过以下的实施例对本发明加以详细说明，但本发明不受这些实施例的任何限制。
实施例1
1.来自日本近海的海洋无脊椎动物的抗原虫活性的筛选
关于在日本近海所采集的海洋无脊椎动物，用甲醇提取每一相同生物种类的抽样个体，浓缩后再用水和氯仿两相溶剂分馏提取。称量所得到的水溶性组分和脂溶性组分的粗提取物的干重。另外，由以下的生理活性试验，测定针对利什曼原虫的抗原虫活性和来自人子宫颈癌的HeLa细胞及来自小鼠淋巴肿瘤的P388细胞的细胞毒性。
2.生理活性试验
2-1抗利什曼原虫活性试验
将转EGFP基因的利什曼原虫(LaEGFP,Okuno T等，Exp.Anim.52:109(2003))的1×105个细胞接种在96孔细胞培养板上，加入用培养基稀释的试样后培养72小时。然后，用荧光平板读取器测试各个细胞培养孔内的荧光强度，进而计算出试样的抗利什曼原虫活性。
2-2细胞毒性试验
将来自人类子宫颈癌的HeLa细胞和来自小鼠淋巴肿瘤的P388细胞的悬浮液(1×104个细胞/mL)按每200μL分别注入在96孔细胞培养板的A～H行的1～11列的细胞培养孔内，37℃条件下培养24小时。之后，向96孔细胞培养板的A行的1～10列的细胞培养孔内分别添加2μL试样的甲醇溶液(1mg/mL)，另外，作为阳性对照在A行11列的细胞培养孔内添加2μL的阿霉素(1mg/mL)。在A～D行12列的细胞培养孔内仅分别添加200μL的培养基，在E～H行12列的细胞培养孔内分别添加200μL的1×104个细胞/mL的所述细胞的悬浮液。使用多道移液枪抽取50μL的A行各列的细胞培养孔内的培养液，进而添加到B行各列的细胞培养孔内，然后抽取50μL的B行各列的细胞培养孔内的培养液，进而添加到C行各列的细胞培养孔内。依此同样，将从A-列至H列依次进行5倍稀释，试样被稀释为8个水平。经72小时培养后，在各细胞培养孔内分别加入50μL的MTT(溴化3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-联苯·四唑)1mg/mL的PB S溶液。经3小时培养后，去掉各细胞培养孔内的全部培养液，分别添加150μL的DMSO。通过多孔平板读取计测定各细胞培养孔内溶解在DMSO内的色素(colorimetric substrate)的吸光度，进而确定细胞的半数死亡的浓度IC50值。
3.结果
腔肠动物角珊瑚Acanthoprimnoa cristata的抽样(抽样代码编号：C07110)在鹿儿岛县屋久岛新曾根(北纬29°46′55"，东经130°21′92″水深138m～北纬29°46′71"，东经130°22′06"，水深135m)捕捞。有关抽样C07110和同时被筛选的种名未识别的海绵动物的抽样(抽样代码编号：S07161)的筛选结果如表1所示。
[表1]
Figure BDA00002123085100121
如表1中所示，抽样C07110的脂溶性组分相对于利什曼原虫的IC50值为1.1μg/mL，但相对人类的HeLa细胞和小鼠P388细胞的IC50值为10μg/mL。即该组分的抗原虫活性与对人类和小鼠细胞的毒性相比，其选择性高约10倍。相比之下，抽样S07161的脂溶性组分相对利什曼原虫的IC50值为0.6μg/mL，其活性比C07110高。但由于相对人类的HeLa细胞和小鼠P388细胞的IC50值均为0.08μg/mL，其活性比抗原虫活性高，产生了在选择性方面的问题。在此，以下进行来自抽样C07110的抗利什曼原虫的活性物质的分离。
实施例2
新颖抗原虫活性物质的分离
1.组分5-10
来自90g抽样C07110的腔肠动物角珊瑚的抗原虫活性物质的分离程序如图1和图2所示。参照图1，用甲醇提取动物个体，浓缩后再用水和氯仿两相溶剂分馏提取。进一步用正丁醇提取水层，将所得到的正丁醇层和氯仿层混合后浓缩。对该提取物组分加以Kupchan分馏(Kupchan,S.M.等，J.Org.Chem.,38:178-179(1973))，得到正己烷组分、氯仿组分和60%甲醇的可溶性组分2-3。用OD S快速柱层析法[50%甲醇、70%甲醇、70%乙腈、85%乙腈、甲醇、氯仿/甲醇/水(6:4:1)]将所述组分2-3分馏。在所得组分中表示强抗利什曼原虫活性的70%甲醇组分(3-2组分为76.8mg，其中71.2mg用于进一步的分离。)最终用使用C 18层析柱(70-90%甲醇)的反相HPLC分馏。图3为表示组分3-2适合于用已充填CO SMO SIL-5C18-AR-II的直径2厘米、长25厘米的层析柱，在每分钟6mL的流速和70%至90%的甲醇浓度梯度的条件下所分离的结果的波型图。图3的纵轴为220nm紫外线吸光度的相对值，图3的横轴从右至左表示保留时间的递增。沿横轴的箭头表示3分钟。用粗线所表示的高峰值组分5-10的收获量为19.7mg。组分5-10通过进一步分析显示由单一物质组成。在此，使组分5-10进行仪器分析。
2.组分13-2和13-4
所述OD S快速柱层析法的70%乙腈组分(3-3)也被确认具有与所述70%甲醇组分(3-2)相同的活性。图4为用使用C 18层析柱(70-90%甲醇)的反相HPLC进行分馏的结果。图4为组分3-3适合于用已充填CO SMO SIL-5C18-AR-II的直径2厘米、长25厘米的层析柱，以每分钟8mL的流速和70%至90%的甲醇浓度梯度的条件下所分离的结果的波型图。图4的纵轴为220nm紫外线吸光度的相对值。图4的横轴从右至左表示保留时间的递增。横轴的箭头表示6分钟。用粗线所表示的高峰值组分12-3和12-7及12-10的收获量分别为2.5mg、3.4mg及1.2mg。图2显示从组分12-3、12-7及12-10分离的抗原虫活性成分的程序。参照图4，通过使用C18层析柱的反相HPLC分馏组分12-3、12-7及12-10。组分12-3适合于用已充填COSMOSIL-5C18-AR-II的直径1厘米、长25厘米的层析柱，以每分钟2mL的流速和50%至70%的甲醇浓度梯度的条件进行分离。图5为组分12-3适合于用已充填COSMOSIL-5C18-AR-II的直径1厘米、长25厘米的层析柱，在每分钟2mL的流速和50%至70%的甲醇浓度梯度的条件下所分离的结果的波型图。图5的纵轴为220nm紫外线吸光度的相对值，图5的横轴从右至左表示保留时间的递增。横轴的箭头表示6分钟。将组分12-3的收获量的约一半用于层析柱分离。用粗线所表示的高峰值组分13-2和13-4的收获量分别为0.2mg和0.3mg。高峰值组分13-2和13-4均显示抗原虫活性。组分13-2和13-4通过进一步分析显示由单一物质组成(图中未显示)。在此，使组分13-2和13-4进行仪器分析。
3.组分12-7
组分12-7通过进一步分析显示为由单一物质组成(图中未显示)。在此，组分12-7被提供给仪器分析。
4.组分14-1和14-2
组分12-10适合于用已充填COSMOSIL-5C18-AR-II的直径1厘米、长25厘米的层析柱，在每分钟2mL的流速和65%至75%的甲醇浓度梯度的条件下所分离。图6为表示组分12-10适合于用已充填COSMOSIL-5C18-AR-II的直径1厘米、长25厘米的层析柱，在每分钟2mL的流速和65%至75%的甲醇浓度梯度的条件下所分离的结果的波型图。图6的纵轴为220nm紫外线吸光度的相对值，图6的横轴从右至左表示保留时间的递增。横轴的箭头表示6分钟。组分12-10的收获量的约一半用于层析柱分离，用粗线所表示的高峰值组分14-1和14-2的收获量分别为0.8mg及0.2mg。组分14-1和14-2均显示抗原虫活性。组分14-1及14-2通过进一步分析显示由单一物质组成(图中未显示)。在此，使组分14-1及14-2进行仪器分析。
实施例3
新颖抗原虫活性物质的结构解析
1.组分5-10
抗利什曼原虫活性物质组分5-10的仪器分析数据如下所示。[α]21.7D+90.5°(c0.22,MEOH)；IR 2931、1755、1681、1616、1454、1371、1340、1209、1176、1108、1076、1015cm-1；UV(MeOH)231nm(logε4.28)；FABMS m/z 431[M+H]+、453[M+Na]+；HRFABMS m/z 431.2089(C24H31O7计算为431.2070)。
高分辨率快速原子轰击质谱法(HRFABMS)的结果，已确认分离为组分5-10的抗利什曼原虫活性物质的分子式为C24H30O7。1H NMR光谱分析的结果表明，所述抗利什曼原虫活性物质具有2个乙酰基(δH 2.10,2.05)、1个醛基(δH 9.27)及2个甲基(δH 1.75、1.68)。从13C NMR光谱分析结果确认24个碳原子，并揭示所述抗利什曼原虫活性物质具有共轭的酮基(δ198.2)。从1H-1H相关二维NMR光谱分析(COSY)的结果，得到3个自旋系统。HMBC分析的结果揭示所述醛基与C-6(δ153.4)、C-7(δ-144.9)和C-8(δ21.2))相关，确认在所述抗利什曼原虫活性物质中所述醛基结合在C-7上。再者，由于发现从H-18(δH 6.98)到乙酰基的羰基碳相关，确认所述抗利什曼原虫活性物质的所述乙酰基之一通过氧原子结合在C-18上。再者，由于还已知从H-18到C-10(δ28.8)、C-11(δ120.6)和C-11a相关，确认2个自旋系统相联，形成9元环。另一方面，由于已知从H-1(δ5.86)到乙酰基相关，确认所述乙酰基的另外1个已经通过氧原子结合在C-1上。基于从H-3到C-4(δ120.2)、C-4a(δ35.9)和C-1(δ94.5)的相关性，以及H-3(δH7.68)及H-1(δH 5.86)的化学位移，发现所述抗利什曼原虫活性物质具有二氢吡喃环结构。由于发现从所述2个甲基(H-16和H-17)到C-15(δ134.9)和C-14(δ116.9)相关，确认所述2个甲基结合到C-15上。由于发现从H-3、H-13a及H-13b到C-12(δ198.2)相关，确认所述共轭的酮基位于C-13和C-4之间。图7表示COSY和HMBC相关的结果。图8表示所述抗利什曼原虫活性物质的NMR(400MHz、CD3OD)的分析结果的数据。根据以上的分析结果，所述抗利什曼原虫活性物质被确定为具有用以下的化学式(11)所表示的结构的新颖的Xenicane型萜类化合物。将该物质在其出处的生物种名的基础上命名为cristaxenicin A。
[化学式11]
Figure BDA00002123085100161
关于所述抗利什曼原虫活性物质的相对构型，由于H-11a、H-1及H-4a之间的偶联常数大(J=9.5，11.4Hz)，暗示这些为轴向质子，具有相互反向关系。
2.组分12-7
通过使用在实施例2中所说明的C18层析柱的反相HPLC，组分12-7由于和cristaxenicin A的保留时间相同，定论为其结构也相同。
3.组分13-2和13-4
组分13-2和13-4收获量少。从图5中清楚地看出，在组分12-3中已明确不含有组分13-2和13-4以外的主要成分，因而组分12-3的1H NMR光谱测定为组分13-2和13-4的混合物。另外，在以下描述中，组分13-2和13-4的成分分别称为“化合物A”和“化合物B”。组分12-3的NMR测量结果显示类似于cristaxenicinA的高峰值群，因而组分12-3的成分，即化合物A和B被推定为cristaxenicin A的类似体。测定E SIMS的结果，观测到了469.2[M+Na]+和485.2[M+K]+的高峰值，因而其分子式推定为比cristaxenicin A多1个氧的C24H30O8。组分12-3与c ristaxenicin A的1H NMR光谱比较的结果，在cristaxenicin A中所看到的H-13(δH 3.33/3.40)和H-14(δH 5.30)的高峰值消失，取而代之的是在低磁场侧观察到了2个偶极子(doublet)烯烃的高峰值[δH 6.68d(15.8Hz)，6.91d(15.8Hz)]。再者，已确认cristaxenicin A的侧链末端的2个单线态(singlet)甲基显示高磁场位移(1.36s,1.37s)。这些解析结果显示，化合物A和B虽然是cristaxenicin A的类似体，但暗示为与cristaxenicin A结合在吡喃环的侧链的部分结构不同。
化合物A和B的13C NMR、HMQ C和HMBC光谱分析的结果，酮基的光谱呈高磁场位移(在δ190附近)，确认从偶极子烯烃高峰值[δH6.68d(15.8Hz),6.91d(15.8Hz)]到酮基的HMBC相关，因而已知在12C-13和C-14之间形成双键，并与C-12的酮共轭。基于从C-14和2个单线态甲基C-16和C-17的质子到在δ82.5的碳信号的HMBC存在相关，已确认该碳信号由C-15产生。将所述HMB C相关表示在以下的化学式12中。基于化学位移值(δ82.5)，推定羟基结合在C-15上。此前所报道的tsitsixenicin C(Hooper,G.J.及Davies-Coleman,M.,Tetrahedron,51:9973(1995))与所推定组分结构存在相同的单元。比较1H NMR和13C NMR的光谱揭示光谱基本一致(化合物A和B的结果示于以下化学式13，tsitsixenicin C的结果示于以下化学式14)。基于以上结果，确认化合物A和B之一具有以下化学式15的结构。
[化学式12]
Figure BDA00002123085100181
[化学式13]
Figure BDA00002123085100182
[化学式14]
Figure BDA00002123085100191
[化学式15]
Figure BDA00002123085100192
4.组分14-1和14-2
通过NMR分析结果的比较，组分14-1被确认为与cristaxenicin A相同。组分14-2的质子NMR分析结果与组分14-1不同，组分14-2的成分(以下，称为化合物C)的结构与组分14-1不同。
实施例4
新颖的抗原虫活性物质的生理活性
1.抗利什曼原虫活性试验
将转EGFP基因的利什曼原虫(LaEGFP,Okuno T等，Exp.Anim.52:109(2003))的1×105个细胞接种在96孔细胞培养板上。加入用培养基稀释的试样后培养72小时。然后，用荧光平板读取器测试各个细胞培养孔内的荧光强度，进而计算出试样的抗利什曼原虫活性。
2.抗锥虫原虫活性试验
在96孔细胞培养板上，接种2×105个细胞的非洲锥虫原虫Trypanosoma congolense(血流型)。加入用培养基稀释的试样后培养48小时。然后，为了计数活细胞数，在各个细胞培养孔中添加10μL TetraColor ONE(生物化学工业股份有限公司)，4小时后测定450nm吸光度
3.抗疟疾原虫活性试验
在96孔细胞培养板上接种90μL的已同步化的0.5%环形期疟疾原虫Plasmodium falciparum K-1菌株后，加入用培养基稀释的试样培养48小时。然后，分别向各细胞培养孔注入100μL通过向1mL裂解缓冲液(20mM Tris(pH7.5),5mM EDTA，0.008%(wt/vol)皂甙，0.08%(vol/vol)Triton X-100)添加0.2μLSYBR GREEN而制备的混合液，然后通过涡旋振荡器搅拌。在暗处静置一小时后，用激发波长为485nm和检测波长为530nm的荧光光度计测定荧光。
4.细胞毒性试验
将来自人类子宫颈癌的HeLa细胞、来自人类前骨髓球性白血病的HL-60细胞及来自小鼠淋巴肿瘤的P388细胞的悬浮液(1×104个细胞/mL)按每200μL分别注入96孔细胞培养板的A-H行的1-11列的细胞培养孔内，37℃条件下培养24小时。之后，再向96孔细胞培养板的A行的1-10列的细胞培养孔内分别添加2μL试样的甲醇溶液(1mg/mL)，A行的11列的细胞培养孔内添加2μL的阿霉素(1mg/mL)作为阳性对照。在A-D行12列的细胞培养孔内仅分别添加200μL的培养基，在E-H行12列的细胞培养孔内分别添加200μL的1×104个细胞/mL的所述细胞的悬浮液。使用多道移液枪抽取50μL A行各列的细胞培养孔内的培养液添加到B行各列的细胞培养孔内。然后，抽取50μL B行各列的细胞培养孔内的培养液添加到C行各列的细胞培养孔内。依此同样，从A列至H列依次进行5倍稀释，试样被稀释为8个水平。经72小时培养后，在各细胞培养孔内分别加入50μL的MTT(溴化3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-联苯·四唑)1mg/mL的PB S溶液。经3小时培养后，去掉各细胞培养孔内的全部培养液，分别添加150μL的DMSO。通过多孔平板读取计测定各细胞培养孔内溶解在DMSO内的色素的吸光度，进而确定细胞的半数死亡的浓度IC50值。
5.结果
相对所述LaEGFP的cristaxenicinA的IC50值为36ng/mL。这比作为利什曼病的第二选择药物的两性霉素B的IC50值(约为20ng/mL)高。已报道作为利什曼病的首选药物的5价锑剂对利什曼原虫的IC50值为9μg/mL(Vermeersch,M等，Antimicrob.AgentsChemother.,53:3855(2009))，cristaxenicin A显示极高的活性。
相对T.congolense的cristaxenicin A的IC50值为107ng/mL。这比作为所报道的具有对锥虫原虫的活性的两性霉素B的IC50值(约为811ng/mL)低。已报道作为家畜锥虫原虫病的首选药物的二脒那秦对T.congolense的IC50值为0.1～1μg/mL(Kaminsky等，Vet Parsitol 52:235(1994))，表明cristaxenicin A即使相对于锥虫原虫也显示出高活性。再者，相对于Plasmodium falciparum K-1菌株的cristaxenicin A的IC50值为4.6μg/mL。另外，组分12-3(化合物A和B的混合物)和组分12-10(cristaxenicin A和化合物C的混合物)的抗利什曼原虫活性IC50值分别为1,209ng/mL和286ng/mL。
相对于来自人类子宫颈癌的HeLa细胞、来自人类前骨髓球性白血病的HL-60细胞及来自小鼠淋巴肿瘤的P388细胞的cristaxenicin A的IC50值分别为2.0μg/mL、0.727μg/mL及0.89μg/mL。因此，与人类培养细胞相比较，cristaxenicin A对利什曼原虫显示出约20倍至56倍的选择毒性。

Claims (7)

1.一种化合物或其药学上可允许的盐，其特征在于，所述化合物具有以下的化学式(1)至(3)的任意一种结构，其中，
在化学式(1)至(3)中，R1为化学式(4)的R10-或化学式(5)的R20-，R2为CHO-、HO-CH2-、CH3-C(=O)-或CH3-CH(-OH)-，R3为氢原子、CH3-C(=O)-、CH3-CH2-C(=O)-、CH3-CH(-OH)-或CH3-CH2-CH(-OH)-，R4为氢原子、CH3-C(=O)-、CH3-CH2-C(=O)-、CH3-CH(-OH)-或CH3-CH2-CH(-OH)-，R11和R12各自独立为氢原子、甲基、或卤素原子，R13为-CH2-、-CH(-OH)-或-C(=O)-，R21及R22各自独立为氢原子、甲基或卤素原子，R23为-CH2-、-CH(-OH)-或-C(=O)-，R24为氢原子、羟基、甲基或卤素原子。
[化学式1]
Figure FDA00002123085000011
[化学式2]
Figure FDA00002123085000012
[化学式3]
Figure FDA00002123085000021
[化学式4]
Figure FDA00002123085000022
[化学式5]
Figure FDA00002123085000023
2.一种化合物或其药学上可允许的盐，其特征在于，所述化合物具有以下的化学式(6)或(7)的结构，其中，
在化学式(6)或(7)中，R1为化学式(8)的R10-或化学式(9)的R20-，R2为CHO-、HO-CH2-、CH3-C(=O)-或CH3-CH(-OH)-，R3为氢原子、CH3-C(=O)-、CH3-CH2-C(=O)-、CH3-CH(-OH)-或CH3-CH2-CH(-OH)-，R4为氢原子、CH3-C(=O)-、CH3-CH2-C(=O)-、CH3-CH(-OH)-或CH3-CH2-CH(-OH)-，R5为氢原子、CH3-C(=O)-或CH3-CH2-C(=O)-，R6为氢原子、CH3-C(=O)-或CH3-CH2-C(=O)-，R11及R12各自独立为氢原子、甲基或卤素原子，R13为-CH2-、-CH(-OH)-或-C(=O)-，R21及R22各自独立为氢原子、甲基或卤素原子，R23为-CH2-、-CH(-OH)-或-C(=O)-，R24为氢原子、羟基、甲基或卤素原子。
[化学式6]
Figure FDA00002123085000031
[化学式7]
Figure FDA00002123085000041
[化学式8]
Figure FDA00002123085000042
[化学式9]
3.一种化合物或其药学上可允许的盐，其特征在于，所述化合物具有以下化学式(10)的结构，
[化学式10]
Figure FDA00002123085000051
4.一种化合物或其药学上可允许的盐，其特征在于，
其作为生成根据权利要求1至3的任意一项所述的化合物或其药学上可允许的盐的药物前体。
5.一种用于治疗原虫感染病的医药品组合物，其特征在于，
所述组合物含有根据权利要求1至4的任意一项所述的化合物或其药学上可允许的盐。
6.一种用于治疗原虫感染病的医药品组合物，其特征在于，
所述组合物含有：选自由5价锑剂、喷他脒、氨苷菌素、两性霉素B以及两性霉素B脂质体组成的组中的至少一种药品；和根据权利要求1至4的任意一项所述的化合物或其药学上可允许的盐，其中，同时或逐次将所述至少一种药品和根据权利要求1或4的任意一项所述的化合物或其药学上可允许的盐给药。
7.根据权利要求5或6所述的用于治疗原虫感染病的医药品组合物，其特征在于，
所述原虫感染病为选自由利什曼病、锥虫病以及疟疾组成的组中的至少一种原虫感染病。
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