CN102816788A - 一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1e蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，涉及一种表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法。本发明是要解决目前乳酸乳球菌中无法表达鸡艾美耳球虫子孢子/裂殖子阶段表面抗原3-1E的问题。方法：将鸡堆型艾美耳球虫3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密码子偏好性进行优化，插入克隆载体并转化大肠杆菌感受态细胞，得阳性转化子；将阳性转化子和乳酸菌表达载体酶切后连接，构建重组表达载体；转化乳酸菌感受态细胞，鉴定；进行重组菌培养及诱导，即完成在乳酸乳球菌NZ9000中表达3-1E蛋白。本发明将密码子优化后的经人工合成的3-1E蛋白成功的在乳酸乳球菌中进行了表达。本发明方法用于球虫病的预防领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法。
背景技术
鸡艾美耳球虫是严重危害养禽业发展的重要疾病之一。鸡球虫在体内繁殖过程中可导致上皮细胞发生损伤和炎症反应，广泛损伤可引起鸡发生腹泻，脱水，体重丧失，直肠脱垂，痢疾等严重临床疾病，有时可致鸡死亡。全世界每年因球虫病而造成的经济损失约为30亿美元，其中80％是由于鸡增重下降、饲料转化率降低及死亡等直接原因，20％是由于化学药物研究的费用。已经证实：频繁使用化学药物可导致耐药性虫株的出现，药物残留可带来动物源性食品安全等问题。新型抗球虫药物研发的高额费用使制药企业对开发新的抗球虫药物不感兴趣。因此球虫病的预防与控制已经成为丞待解决的重要课题。从研究趋势看，虫苗预防必将会逐渐发展为防治鸡球虫病的主要手段。
乳酸菌是人和动物肠道内常见益生菌，被公认为安全级(GRAS)微生物。乳酸菌作为表达外源蛋白的理想菌株安全、无毒，免疫途径简单。乳酸菌作为表达载体区别于其它未被归于安全范围内的活疫苗载体(如减毒沙门氏菌，大肠杆菌和痘病毒等)。乳酸菌载体本身不会引起强烈免疫应答，可以利用此载体对动物进行多次口服免疫。
3-1E基因为鸡艾美耳球虫子孢子与裂殖子阶段的表面抗原，蛋白分子量为18-27ku，序列全长1086bp，3-1E蛋白由170个氨基酸组成，在柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)和毒害艾美耳球虫(E.necatrix)之间均有很高同源性，可以作为基因工程疫苗的候选基因。但目前国内外尚无在乳酸乳球菌中表达鸡艾美耳球虫子孢子/裂殖子阶段表面抗原3-1E的报道。
发明内容
本发明是要解决目前乳酸乳球菌中无法表达鸡艾美耳球虫子孢子/裂殖子阶段表面抗原3-1E的问题，提供一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法。
本发明在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，按以下步骤进行：
一、将鸡堆型艾美耳球虫3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密码子偏好性进行优化，得到人工合成的3-1E基因，并在其5′端和3′端分别引入BamH 1和Xba 1的识别序列，之后与克隆载体pUC57连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子pUC57-3-1E；
二、将pUC57-3-1E和大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pTX8048分别经BamH 2和Xba2双酶切后，分别回收3-1E片段和载体片段，经T4 DNA连接酶连接后构建重组表达载体pTX8048-3-1E；
三、将pTX8048-3-1E经电转化入乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞中，经筛选得到含有重组质粒的阳性重组乳酸乳球菌NZ9000/pTX8048-3-1E，从阳性重组乳酸乳球菌中用质粒提取试剂盒提取质粒，之后针对步骤一中人工合成的3-1E基因序列设计引物，分别进行PCR鉴定，酶切鉴定以及序列测定；
四、将NZ9000/pTX8048-3-1E接种于含氯霉素的GM17液体培养基中，经30℃厌氧培养过夜后，以1∶50的体积比转接入含氯霉素的GM17液体培养基中进行扩增培养，30℃厌氧培养至OD600为0.4～0.6，之后用10ng/ml的乳链菌肽继续诱导培养3h，即完成了在乳酸乳球菌NZ9000中表达3-1E蛋白。
鸡艾美耳球虫子孢子通过肠黏膜上皮细胞侵入机体内，子孢子表面的一系列分泌抗原可以刺激感染鸡产生免疫应答。可以表达外源蛋白的乳酸菌所激发的免疫应答与球虫的侵入途径相似，可以激发动物体产生有效的肠道保护性免疫应答。
本发明在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白，解决了应用其他一系列的乳酸菌表达载体均未能表达3-1E蛋白的问题。这将对今后研制基于鸡源肠道共生乳酸菌为宿主菌的乳酸菌口服疫苗研究奠定坚实的基础。本发明将密码子优化后的经人工合成的3-1E蛋白成功的在乳酸乳球菌NZ9000中进行了表达。
附图说明
图1为实施例的步骤三中PCR鉴定结果图；图2为实施例的步骤三中酶切鉴定结果图；图3为实施例中提取菌体总蛋白进行Western blot分析结果图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，按以下步骤进行：
一、将鸡堆型艾美耳球虫3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密码子偏好性进行优化，得到人工合成的3-1E基因，并在其5′端和3′端分别引入BamH 2和Xba 2的识别序列，之后与克隆载体pUC57连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子pUC57-3-1E；
二、将pUC57-3-1E和大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pTX8048分别经BamH 3和Xba3双酶切后，分别回收3-1E片段和载体片段，经T4 DNA连接酶连接后构建重组表达载体pTX8048-3-1E；
三、将pTX8048-3-1E经电转化入乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞中，经筛选得到含有重组质粒的阳性重组乳酸乳球菌NZ9000/pTX8048-3-1E，从阳性重组乳酸乳球菌中用质粒提取试剂盒提取质粒，之后针对步骤一中人工合成的3-1E基因序列设计引物，分别进行PCR鉴定，酶切鉴定以及序列测定；
四、将NZ9000/pTX8048-3-1E接种于含氯霉素的GM17液体培养基中，经30℃厌氧培养过夜后，以1∶50的体积比转接入含氯霉素的GM17液体培养基中进行扩增培养，30℃厌氧培养至OD600为0.4～0.6，之后用10ng/ml的乳链菌肽继续诱导培养3h，即完成了在乳酸乳球菌NZ9000中表达3-1E蛋白。
步骤一中克隆载体pUC57购买自南京金斯瑞生物科技有限公司。
步骤二中大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pTX8048已在《Microbial Cell Factories，2011，10：66doi：10.1186/1475-2859-10-66，Expanding the molecular toolbox for Lactococcus lactis：construction of an inducible thioredoxin gene fusion expression system》即《微生物细胞工厂，2011，10：66 doi：10.1186/1475-2859-10-66，乳酸乳球菌分子工具盒的扩展-可诱导的含硫氧还蛋白基因的融合表达系统》中公开，由爱尔兰考克大学van Sinderen D.教授馈赠。该载体的特点是引入了组氨酸标签(6×His)和硫氧还蛋白A(TrxA)，利于异源蛋白的融合表达。
步骤三中乳酸乳球菌NZ9000购买自荷兰NIZO研究所，其感受态细胞按照《ApplEnviron Microbiol，1989(55)：3119-3123》中的乳酸菌感受态制备方法制得。
具体实施方式二：本实施方式是对具体实施方式一所述的在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法步骤二中pUC57-3-1E双酶切做进一步的说明，步骤二中pUC57-3-1E双酶切的体系如下：
| 成分 | 用量 |
| pUC57-3-1E | 14μL |
| 10×H Buffer | 4μL |
| BamH 3 | 2μL |
| Xba 3 | 2μL |
| ddH2O | 18μL |
酶切反应条件为37℃反应3h。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式是对具体实施方式一所述的在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法步骤二中表达载体pTX8048双酶切做进一步的说明，步骤二中表达载体pTX8048双酶切的体系如下：
| 成分 | 用量 |
| 表达载体pTX8048 | 14μL |
| 10×H Buffer | 4μL |
| BamH 4 | 2μL |
| Xba 4 | 2μL |
| ddH2O | 18μL |
酶切反应条件为37℃反应3h。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式是对具体实施方式一所述的在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法步骤二中的连接做进一步的说明，步骤二中的连接体系如下：
| 成分 | 用量 |
| 双酶切回收的3-1E片段 | 6μL |
| 双酶切回收的pTX8048片段 | 2μL |
| T4DNA连接酶 | 1μL |
| 10×T4DNA连接酶缓冲液 | 1μL |
连接反应条件为16℃反应过夜。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式是对具体实施方式一所述的在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法步骤三中PCR鉴定做进一步的说明，步骤三中PCR鉴定的反应体系如下：
PCR反应条件为94℃预变性1min，95℃变性30s，57.6℃下退火30s，72℃下延伸1min，共循环30次，72℃下终止延伸2min，4℃下保存。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式是对具体实施方式一所述的在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法步骤四中含氯霉素的GM17液体培养基做进一步的说明，步骤四中含氯霉素的GM17液体培养基为含5μg/mL氯霉素和质量浓度0.5％葡萄糖的M17肉汤培养基。其它与具体实施方式一相同。
其中M17肉汤培养基购买自北京陆桥技术有限责任公司。
实施例：
在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，按以下步骤进行：
一、将来自美国国立生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)登陆号为EF426471的鸡堆型艾美耳球虫(E.acervulina)3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密码子偏好性进行优化，得到人工合成的3-1E基因，并在其5′端和3′端分别引入BamH 5和Xba 5的识别序列，之后与克隆载体pUC57连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子pUC57-3-1E；
二、将pUC57-3-1E和大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pTX8048分别经BamH 5和Xba5双酶切后，分别回收3-1E片段和载体片段，经T4 DNA连接酶连接后构建重组表达载体pTX8048-3-1E；
三、将pTX8048-3-1E经电转化入乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞中，经筛选得到含有重组质粒的阳性重组乳酸乳球菌NZ9000/pTX8048-3-1E，从阳性重组乳酸乳球菌中用质粒提取试剂盒提取质粒，之后针对步骤一中人工合成的3-1E基因序列设计引物，分别进行PCR鉴定，酶切鉴定以及序列测定；
四、将鉴定正确的NZ9000/pTX8048-3-1E接种于含氯霉素的GM17液体培养基(即为含5μg/mL氯霉素和质量浓度0.5％葡萄糖的M17肉汤培养基)中，经30℃厌氧培养过夜后，以1∶50的体积比转接入含氯霉素的GM17液体培养基中进行扩展培养，30℃厌氧培养至OD600为0.4～0.6，之后用10ng/ml的乳链菌肽继续诱导培养3h，即完成了在乳酸乳球菌NZ9000中表达3-1E蛋白。
步骤一中登陆号为EF426471的鸡堆型艾美耳球虫3-1E基因序列如SEQ ID NO：1所示，人工合成的3-1E基因序列如SEQ ID NO：2所示。步骤一中人工合成的3-1E基因由南京金斯瑞生物公司合成。
步骤二中pUC57-3-1E双酶切的体系如下：
| 成分 | 用量 |
| pUC57-3-1E | 14μL |
| 10×H Buffer | 4μL |
| BamH 6 | 2μL |
| Xba 6 | 2μL |
| ddH2O | 18μL |
酶切反应条件为37℃反应3h。
步骤二中表达载体pTX8048双酶切的体系如下：
| 成分 | 用量 |
| 表达载体pTX8048 | 14μL |
| 10×H Buffer | 4μL |
| BamH 6 | 2μL |
| Xba 6 | 2μL |
| ddH2O | 18μL |
酶切反应条件为37℃反应3h。
步骤二中的连接体系如下：
| 成分 | 用量 |
| 双酶切回收的3-1E片段 | 6μL |
| 双酶切回收的pTX8048片段 | 2μL |
| T4DNA连接酶 | 1μL |
| 10×T4 DNA连接酶缓冲液 | 1μL |
连接反应条件为16℃反应过夜。
步骤三中PCR鉴定的反应体系如下：
PCR反应条件为94℃预变性1min，95℃变性30s，57.6℃下退火30s，72℃下延伸1min，共循环30次，72℃下终止延伸2min，4℃下保存。
PCR鉴定结果如图1所示，图中M为DNA Marker(DL2000)，从上至下为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，泳道1、2和3为PCR结果，可以看出3-1E目的片段大小为510bp，与预期的大小相同。
步骤三中酶切鉴定体系如下：
| 成分 | 用量 |
| 从阳性重组乳酸乳球菌中提取的质粒 | 4μL |
| 10×H Buffer | 1μL |
| BamH 7 | 0.5μL |
| Xba 7 | 0.5μL |
| ddH2O | 7μL |
酶切反应条件为37℃反应3h。酶切鉴定结果如图2所示，图中M为DNA Marker(DL2000)，从上至下为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，泳道1和2为pTX8048-3-1E双酶切结果，切下3-1E目的片段大小为510bp。
步骤三中序列测定是送到南京金斯瑞生物公司进行测序，测序结果表明优化的3-1E基因成功插入目的载体pTX8048中。
步骤四诱导终止后经超声处理(200W超声8分钟，间隔8s)，提取菌体总蛋白进行SDS-PAGE(蛋白质电泳)和Western blot(免疫印迹杂交)分析，一抗为兔抗3-1E蛋白多克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG。Western blot分析结果如图3所示，图3中泳道1为预染蛋白双色Marker(TIANGEN公司)；泳道2为NZ9000/pTX8048-3-1E诱导菌(约34KDa)；泳道3为NZ9000/pTX8048诱导菌；泳道4为pET30a-3-1E在大肠杆菌中表达蛋白阳性对照(约28KDa)。阳性重组乳酸乳球菌NZ9000/pTX8048-3-1E经乳链菌肽诱导后有目的条带出现，说明经突变的人工合成的3-1E基因在乳酸乳球菌中成功表达。
Claims (6)
1.一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，其特征在于在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，按以下步骤进行：
一、将鸡堆型艾美耳球虫3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密码子偏好性进行优化，得到人工合成的3-1E基因，并在其5′端和3′端分别引入BamH 1和Xba 1的识别序列，之后与克隆载体pUC57连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子pUC57-3-1E；
二、将pUC57-3-1E和大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pTX8048分别经BamH 1和Xba 1双酶切后，分别回收3-1E片段和载体片段，经T4DNA连接酶连接后构建重组表达载体pTX8048-3-1E；
三、将pTX8048-3-1E经电转化入乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞中，经筛选得到含有重组质粒的阳性重组乳酸乳球菌NZ9000/pTX8048-3-1E，从阳性重组乳酸乳球菌中用质粒提取试剂盒提取质粒，之后针对步骤一中人工合成的3-1E基因序列设计引物，分别进行PCR鉴定，酶切鉴定以及序列测定；
四、将NZ9000/pTX8048-3-1E接种于含氯霉素的GM17液体培养基中，经30℃厌氧培养过夜后，以1∶50的体积比转接入含氯霉素的GM17液体培养基中进行扩增培养，30℃厌氧培养至OD600为0.4～0.6，之后用10ng/ml的乳链菌肽继续诱导培养3h，即完成了在乳酸乳球菌NZ9000中表达3-1E蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，其特征在于步骤二中pUC57-3-1E双酶切的体系如下：
酶切反应条件为37℃反应3h。
3.根据权利要求1所述的一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，其特征在于步骤二中表达载体pTX8048双酶切的体系如下：
酶切反应条件为37℃反应3h。
4.根据权利要求1所述的一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，其特征在于步骤二中的连接体系如下：
连接反应条件为16℃反应过夜。
5.根据权利要求1所述的一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，其特征在于步骤三中PCR鉴定的反应体系如下：
PCR反应条件为94℃预变性1min，95℃变性30s，57.6℃下退火30s，72℃下延伸1min，共循环30次，72℃下终止延伸2min，4℃下保存。
6.根据权利要求1所述的一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，其特征在于步骤四中含氯霉素的GM17液体培养基为含5μg/mL氯霉素和质量浓度0.5％葡萄糖的M17肉汤培养基。
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| CN110267679A (zh) * | 2016-12-05 | 2019-09-20 | 美国农业部 | 用于预防家禽中的球虫病的口服的基于大肠杆菌载体的疫苗 |
| CN112028995A (zh) * | 2020-07-22 | 2020-12-04 | 东北农业大学 | 抗鸡球虫感染的多肽及其应用 |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121212 |