CN102816245A - 一组合成抗菌蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一组合成抗菌蛋白及其制备方法和应用，所述抗菌蛋白由一个功能亚基通过连接肽与识别亚基相接合；所述识别亚基具有类似抗体的结构，由轻链、即L链和重链、即H链通过二硫键接合构成；该合成抗菌蛋白的制备方法是通过基因工程表达获得。本发明所述合成抗菌蛋白具有比天然抗菌肽更高的抑菌活性和更快的生效速度，并可根据需要选择性地抑制某类微生物；通过改变其可变结构部分及抗菌肽部分的组合，还可灵活地调控其抗菌活性及抗菌谱范围。
Description
技术领域
本发明涉及一组合成抗菌蛋白、其制备方法及在制备治疗细菌、真菌感染的药物中的应用，该抗菌蛋白对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌有显著而特异的杀菌活性。
背景技术
抗菌蛋白的功能亚基即抗菌肽，是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60个氨基酸组成，分子量在2000-7000D左右。随着医学免疫学和分子生物学的迅速发展，抗菌肽的研究越来越成为生物技术与生物医药领域中的热门课题。至今为止，在许多动物(尤其是昆虫)、植物、微生物和人体上已发现了超过200多种抗菌肽，这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱的杀菌作用，而且对病毒、原虫及癌细胞也有攻击作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。但是抗菌肽在快速杀灭致病菌的同时，也会对人体有益菌群造成伤害。
抗体是一种高度特异的分泌型免疫蛋白，通过其可变区域内CDR可迅速而准确地与抗原结合，引发后续免疫反应。研究表明，即使抗体整体结构不完整，在保持其CDR序列完好且构象正常的情况下，仍能够有效识别抗原。
蛋白质重组融合技术可将两个蛋白质或肽链通过小的氨基酸片段进行连接，同时保证两端的结构和功能不发生明显改变，此技术不仅可以通过化学合成实现，亦可通过基因工程将待连接蛋白和连接片段DNA序列进行共转化并在细胞中表达而实现。
发明内容
本发明的目的在于：提供一组合成抗菌蛋白及其制备方法和应用，通过蛋白质融合技术以及基因操作合成，制备的抗菌蛋白可通过质谱或SDS-PAGE鉴定。利用96孔板法检测合成蛋白的杀菌活性(In Yup Park etc：FEBS Letters：437(1998)258-262)，以预先合成的天然抗菌蛋白buforin II、cecropin A1为对照，进行杀菌活性检测。结果表明本发明合成抗菌蛋白的杀菌活性强于所述两种天然抗菌蛋白的杀菌活性。利用连续培养法检测合成蛋白的杀菌速率，以预先合成的天然抗菌蛋白buforin II、cecropin A1为对照，结果表明本发明合成抗菌蛋白生效时间比所述两种天然抗菌蛋白更迅速。同时，使用上述两种实验方法还证明具有多个识别亚基或功能亚基的复合抗菌蛋白在识别特异性和杀菌反应速度上均优于天然抗菌蛋白。
本发明是这样构成的：一组合成抗菌蛋白，所述抗菌蛋白由一个功能亚基通过连接肽与识别亚基相接合；所述识别亚基具有类似抗体的结构，由轻链、即L链和重链、即H链通过二硫键接合构成。
前述的合成抗菌蛋白中，所述功能亚基羧基端与连接肽氨基端连接，连接肽羧基端与识别亚基氨基端连接。
前述合成抗菌蛋白的结构包含下述氨基酸序列：
功能亚基：见序列表中序列1；
连接肽：见序列表中序列2；
H链：序列3A 序列4B 序列5C 序列6；
L链：序列7X 序列8Y 序列9Z 序列10；
所述A为序列11时，B、C、X、Y、Z分别为序列12、序列13、序列14、序列15、序列16；A为序列17时，B、C、X、Y、Z分别为序列18、序列19、序列20、序列21、序列22；A为序列23时，B、C、X、Y、Z分别为序列24、序列25、序列26、序列27、序列28。
前述的合成抗菌蛋白中，所述连接肽的序列优选为Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser或Gly-Gly-Ala-Ser。
前述的合成抗菌蛋白中，所述H链26～35、50～65、96～102位及L链24～34、49～56、89～97位为CDR序列，用于特异性识别目标细胞；H链22位半胱氨酸与L链23位半胱氨酸形成的二硫键将两条肽链连接成为识别亚基。
本发明所述的合成抗菌蛋白还包括在所述抗菌蛋白中增加1-2个识别亚基或功能亚基并通过连接肽连接于原有蛋白而得到的功能等同物蛋白。
本发明提供的合成抗菌蛋白的制备方法为：将编码所述抗菌蛋白的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得所述抗菌蛋白。制得的抗菌蛋白可通过质谱或SDS-PAGE鉴定。
前述方法中，所述的载体是质粒或病毒中的一种；所述的宿主细胞是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
本发明所提供的合成抗菌蛋白在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染的药物中的应用。
为证实本发明所合成抗菌蛋白具有高度特异性，申请人进行了抗G+蛋白/抗G-蛋白与G+/G-细菌交叉试验。通过对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的灭杀试验，证实目标细菌杀灭率为95%时非目标细菌杀灭率小于3%，表明合成抗菌蛋白具有极高专一性。本发明提供一组新的人工设计合成的抗菌蛋白，可方便地将编码抗菌蛋白的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得。该合成抗菌蛋白对选定的革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌具有很高的杀伤活性，因此本发明合成抗菌蛋白可应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染引起的疾病的药物。本发明的优点：1、融合抗菌蛋白兼具抗菌蛋白的高杀菌活性和抗体的专一性，通过对识别亚基H链及L链上的CDR序列进行设计，可构造出针对某一种或某一类细菌/真菌进行杀灭的特异性蛋白，从而保护其他有益菌群免遭伤害。2、利用识别亚基类似于抗体的结构,可提高抗菌蛋白与目标细胞的结合速度，使其生效更快。3、通过连接肽可将多个功能亚基与识别亚基相连接，这些功能亚基既可以是相同类型也可以是不同类型。借此，可提升单位浓度下杀菌活性。
本发明利用96孔板法检测合成蛋白的杀菌活性(In Yup Park etc：FEBS Letters：437(1998)258-262)，以预先合成的天然抗菌蛋白buforin II、cecropin A1为对照，进行杀菌活性检测。结果表明本发明合成抗菌蛋白的杀菌活性强于所述两种天然抗菌蛋白的杀菌活性。利用连续培养法检测合成蛋白的杀菌速率，以预先合成的天然抗菌蛋白buforin II、cecropin A1为对照，结果表明本发明合成抗菌蛋白生效时间比所述两种天然抗菌蛋白更迅速。同时，使用上述两种实验方法还证明具有多个识别亚基或功能亚基的复合抗菌蛋白在识别特异性和杀菌反应速度上均优于天然抗菌蛋白。
附图说明
图1是本发明纯化Jacdurin-1抗菌蛋白SDS-PAGE鉴定电泳图；
图2是最小抑菌浓度时本发明Jacdurin-1、Jacdurin-2、Jacdurin-3抗菌蛋白对各类微生物的抑制程度示意图；
图3是本发明抗菌蛋白Jacdurin-2抑菌速率检测示意图；
图4是多亚基复合抗菌蛋白Jacdurin-11抗菌活性示意图；
图5是多亚基复合抗菌蛋白Jacdurin-24抗菌速率示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步阐述本发明，并通过实验来验证本发明的可靠性和有效性。
实施例1：抗革兰氏阳性菌蛋白Jacdurin-1基因在大肠杆菌中的表达，纯化及鉴定。
首先设计合成编码抗菌蛋白的Jacdurin-1基因，CDR序列参见人抗磷壁酸抗体可变区序列，将其克隆到pGEX-6P-1载体上(购自Amersham Pharmcia Biotech公司)，然后转化大肠杆菌JMl09，经IPTG诱导表达GST-Jacdurin-1融合蛋白，再经PreScission蛋白酶切割后，得抗菌蛋白Jacdurin-1。
实施例中使用的ATP、IPTG、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶、Klenow酶、限制性内切酶除特别指明外均为Biolab公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品，寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PreScission酶剪切试剂盒购于SIGMA公司。
有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J．沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。大肠杆菌JMl09培养在液体或固体的LB培养基中。
采用大肠杆菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌蛋白Jacdurin-1基因的DNA序列，序列如下。在抗菌蛋白Jacdurin-1基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)，所得构建基因的长度为738bp。
编码Jacdurin-1的核苷酸序列见序列表中序列29。
通过DNA合成仪直接合成该核苷酸片断。首先用PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物：5’-CCTAGGTTTACCT-3’和3’-CCGCCTGCTGAA-5’。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应30个循环。PCR反应后将该片断经过K1enow酶补平后用BamHI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与pGEX-6P-1载体的BamHI和SmaI的双酶切片断连接后转化大肠杆菌JMl09，转化子通过SmaI酶切鉴定、筛选。转化子经过IPTG诱导表达GST-Jacdurin-1融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经PreScission酶切割后得到抗菌蛋白Jacdurin-1，具体操作参照试剂盒操作说明。
Jacdurin-1蛋白序列为序列表中序列30（即序列1 序列2 序列3 序列11 序列4 序列12 序列5 序列13 序列6 序列7 序列14 序列8 序列15 序列9 序列16 序列10）
称量一定量纯化的Jacdurin-1蛋白，以PBS为缓冲液，于7%SDS/聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，结果如图1，M为分子量标准品，1、3道为Jacdurin-1蛋白，2、4道为经二硫苏糖醇还原半胱氨酸残基、PredK蛋白酶切割连接肽后获得的功能亚基与识别亚基轻、重链。图中Jacdurin-1蛋白分子量约30.5kD，与理论值30.8kD相近，其亚基片段分子量也符合预期，说明经上述步骤纯化所得蛋白确为Jacdurin-1抗革兰氏阳性菌蛋白。
使用同样方法可获得识别目标为类脂A的抗革兰氏阴性菌蛋白Jacdurin-2及识别目标为真菌糖蛋白（本例中为白色念珠菌的表面甘露醇蛋白复合体）的抗真菌蛋白Jacdurin-3。其CDR序列见序列表中序列17-序列28。
以下实施例中所使用的各种菌株购于中国药品生物制品检定所。
实施例2：合成抗菌蛋白的杀菌活性检测
采用96孔板法对合成抗菌蛋白的杀菌活性进行检测，并用固相化学法合成的抗菌肽cecropinAl和buforin II作为对照，以评价本发明中作为示例的三种抗菌蛋白Jacdurin-1、Jacdurin-2和Jacdurin-3的杀菌活性。
按以下步骤测定抗菌蛋白的杀菌活性：
菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑菌于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使菌浓度为104-105CFU/mL，按每孔l00ul菌液接种于96孔板中，将蛋白以一定比例稀释后，每孔中加入10ul，将96孔板置于37℃培养过夜，酶标仪检测OD620值(In Yup Parketc：FEBS Letters：437(1998)258-262)。检测结果见表1。
含有抗菌蛋白的细菌的生长浓度(OD620)与不加抗菌蛋白的细菌的生长浓度的比值大于90％时的抗菌蛋白浓度即为最小抑菌浓度(最小抑菌浓度(MIC)定义为显著抑制细菌生长的最低的浓度)。
表1 Jacdurin抗菌蛋白与两种抗菌肽对微生物的最小抑菌浓度(MIC)
表1中的最小抑菌浓度值越小，则代表抗菌能力越强。
实施例3：融合抗菌蛋白Jacdurin-2抑菌速率检测
采用连续培养法对合成抗菌蛋白的杀菌速率进行检测，以固相化学法合成的抗菌肽cecropinAl和buforin II作为对照，大肠埃希氏菌ATCC8099与Jacdurin-2为实验组，按以下步骤测定抗菌蛋白的杀菌活性：
菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑菌于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使菌浓度为103-104CFU/mL，置于100mL LB液体培养基37℃连续培养，加入lOmL以一定比例稀释的蛋白，蛋白浓度为5倍MIC，每隔1h取样，用酶标仪检测OD620值(In Yup Parketc：FEBS Letters：437(1998)258-262)。检测结果见图3。
以空白对照的Logistic拟合曲线作为理论生长曲线（100%），测定对应微生物被杀灭25%、50%及75%所需时间，结果如表2。
表2 抗菌蛋白Jacdurin抑菌时间
实施例4：多亚基复合抗菌蛋白抗菌活性检测
本实施例用于检测包含一个以上识别亚基或一个以上功能亚基的融合抗菌蛋白抗菌活性，使用Jacdurin-1和Jacdurin-2作为对照。
多识别亚基蛋白Jacdurin-11为Jacdurin-1蛋白在功能亚基游离端通过连接肽接入Jacdurin-2识别亚基，具备上述两者全部CDR序列，其制备提纯方法同实施例1。
多识别亚基蛋白Jacdurin-24为Jacdurin-2蛋白在识别亚基游离端通过连接肽接入另一个功能亚基，其制备提纯方法同实施例1。
以实施例2之方法检测Jacdurin-11蛋白对微生物生长的抑制情况，以Jacdurin-1和Jacdurin-2为对照，其结果如图4。
以实施例3之方法检测Jacdurin-24蛋白对以大肠埃希氏菌为代表的革兰氏阴性菌抑制情况，以Jacdurin-2为对照，其结果如图5。
由上述两例实验可见，多识别亚基复合抗菌蛋白Jacdurin-11能同时有效抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生长，兼具Jacdurin-1和Jacdurin-2功能。多功能亚基复合抗菌蛋白Jacdurin-24抑菌生效时间比Jacdurin-2更快，半数杀灭时间仅为5.3小时。因此，通过改变亚基的组合方式，可高效高特异性地抑制某种或某类微生物的生长。
序列表
<110>郭铠
<120>一组合成抗菌蛋白及其制备方法和应用
<130>AJ122261
<160>30
<210>SEQ ID NO:1
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<223>Jacdudin蛋白家族的功能亚基
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Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly
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Leu Arg Lys Leu Leu Lys
20
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<212>PRT
<213>人工序列
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<223>Xaa=Ser或无
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<400>2
Gly Gly Xaa Xaa Xaa
5
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<223>Jacdudin蛋白家族的识别亚基-H链非CDR-1
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Gln Val Gln Gln Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<213>人工序列
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<223>Jacdudin蛋白家族的识别亚基-H链非CDR-2
<400>4
Trp Cys Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
5 10
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<223>Jacdudin蛋白家族的识别亚基-H链非CDR-3
<400>5
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Val
5 10 15
Gln Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Tyr Cys Ile Arg
20 25 30
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<400>6
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<400>7
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Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
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5 10
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<223>Jacdudin蛋白家族的识别亚基-L链非CDR-3
<400>9
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
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Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳性抗磷壁酸CDR-1H
<400>11
Leu Ser Ile Gly Gly Gln Arg Val Leu Gly
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<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳性抗磷壁酸CDR-2H
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Arg Gly Trp Ile Gly Ala Gln Thr Val Ser Ser Gly Gly Ala Arg Leu
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<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳性抗磷壁酸CDR-3H
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Trp Val Glu Gly Ala Arg Val
5
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<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳性抗磷壁酸CDR-1L
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Ala Gly Asp Leu Ser Lys Thr Arg Val Gln Ala
5 10
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<213>人工序列
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<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳性抗磷壁酸CDR-2L
<400>15
Arg Gly Val Asp Trp Ala Arg Ile
5
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<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳性抗磷壁酸CDR-3L
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Leu Gly Ser Gln Asp Asp Ala Leu Lys
5
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<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳阴性抗类脂A CDR-1H
<400>17
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5 10
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<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳阴性抗类脂A CDR-2H
<400>18
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<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳阴性抗类脂A CDR-3H
<400>19
Ala Ala Gly Arg Leu Val Ser
5
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<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳阴性抗类脂A CDR-1L
<400>20
Leu Ser Asp Gly Ala Val Arg Leu Ser Gly Ile
5 10
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳阴性抗类脂A CDR-2L
<400>21
Arg Lys Ser Leu Gly Gly Val Arg
5
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<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-革兰氏阳阴性抗类脂A CDR-3L
<400>22
Arg Leu Ala Val Ser Gln Arg Leu Val
5
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<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-真菌抗甘露醇蛋白 CDR-1H
<400>23
Ala Pro Gly Gln Leu Gly Ser Asp Val Gly
5 10
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<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-真菌抗甘露醇蛋白CDR-2H
<400>24
Gly Glu Leu Ser Asp Arg Gln Val Val Ala Gly Gly Gly Gly Leu Gln
5 10 15
<210>SEQ ID NO:25
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<213>人工序列
<220>
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<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-真菌抗甘露醇蛋白 CDR-3H
<400>25
Ala Arg Val Ile Leu Ala Phe
5
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<211>11
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<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-真菌抗甘露醇蛋白 CDR-1L
<400>26
Leu Ser Asp Gly Ala Val Arg Val Ala Leu Gly
5 10
<210>SEQ ID NO:27
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-真菌抗甘露醇蛋白 CDR-2L
<400>27
Gly Gly Gln Val Asp Ile Ser Gly
5
<210>SEQ ID NO:28
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>Jacdudin蛋白家族识别亚基-真菌抗甘露醇蛋白CDR-3L
<400>28
Ser Val Gly Ala Gln Gly Asp Leu Glu
5
<210>SEQ ID NO:29
<211>738
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>编码Jacdurin-1的核苷酸序列
<400>29
GGATCCAAATGGAAACTGTTTAAAAAAATTGGCATTGGCCGCCTGCTGAAACGCGGCCTGCGCAAGCTGCTGAAACAAGTTCAACAACTAGAATCGGGAGGAGGAGTTGTTCAACCCGGACGATCGCTACGACTATCGTGCGCAGCATCGCTATCGATAGGAGGACAACGAGTTCTAGGATGGTGCCGACAAGCACCCGGAAAAGGACTAGAATGGGTTGCACGAGGATGGATAGGAGCACAAACCGTTTCGTCGGGAGGAGCACGACTACGATTCACCATATCGCGAGATAACTCGAAAAACACCCTATATCTAGAAGTTCAAACCGAAGATACCGGAGTTTATTATTATTGCATACGATGGGTTGAAGGAGCACGAGTTTGGGGACAAGGAACCCTAGTTACCGTTTCGTCGGATGTTCAAATGACCCAATCGCCCTCGGCAATGGCAGCATCGGTTGGAGATCGAGTTACCATAACCTGCGCAGGAGATCTATCGAAAACCCGAGTTCAAGCATGGTTCCAACAAAAACCCGGAAAAGTTCCCAAACGACTAATACGAGGAGTTGATTGGGCACGAATAGGAGTTCCCTCGCGATTCTCGGGATCGGGATCGGGAACCGAATTCACCCTAACCATATCGTCGCTACAACCCGAAGATTTCGCAACCTATTATTGCCTAGGATCGCAAGATGATGCACTAAAATTCGGAGGAGGAACCAAAGTTGAAATAAAATAG
<210>SEQ ID NO:30
<211>247
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>Jacdurin-1蛋白序列
<400>30
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu ArgLys Leu Leu Lys Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Gln Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val ValGln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Leu Ser Ile Gly Gly Gln ArgVal Leu Gly Trp Cys Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Gly TrpIle Gly Ala Gln Thr Val Ser Ser Gly Gly Ala Arg Leu Arg Phe Thr Ile Ser Arg AspAsn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Val Gln Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr TyrCys Ile Arg Trp Val Glu Gly Ala Arg Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val SerSer Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ala Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Ala Gly Asp Leu Ser Lys Thr Arg Val Gln Ala Trp Phe Gln Gln LysPro Gly Lys Val Pro Lys Arg Leu Ile Arg Gly Val Asp Trp Ala Arg Ile Gly Val ProSer Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu GlnPro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Gln Asp Asp Ala Leu Lys Phe GlyGly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
Claims (10)
1.一组合成抗菌蛋白，其特征在于：所述抗菌蛋白由一个功能亚基通过连接肽与识别亚基相接合；所述识别亚基具有类似抗体的结构，由轻链、即L链和重链、即H链通过二硫键接合构成。
2.根据权利要求1所述的合成抗菌蛋白，其特征在于：所述功能亚基羧基端与连接肽氨基端连接，连接肽羧基端与识别亚基氨基端连接。
3.根据权利要求1所述的合成抗菌蛋白，其特征在于：其结构包含下述氨基酸序列：
功能亚基：见序列表中序列1；
连接肽：见序列表中序列2；
H链：序列3A 序列4B 序列5C 序列6；
L链：序列7X 序列8Y 序列9Z 序列10；
所述A为序列11时，B、C、X、Y、Z分别为序列12、序列13、序列14、序列15、序列16；A为序列17时，B、C、X、Y、Z分别为序列18、序列19、序列20、序列21、序列22；A为序列23时，B、C、X、Y、Z分别为序列24、序列25、序列26、序列27、序列28。
4.根据权利要求3所述的合成抗菌蛋白，其特征在于：所述连接肽的序列为Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser或Gly-Gly-Ala-Ser。
5.根据权利要求1、2或3所述的合成抗菌蛋白，其特征在于：所述H链26～35、50～65、96～102位及L链24～34、49～56、89～97位为CDR序列，用于特异性识别目标细胞；H链22位半胱氨酸与L链23位半胱氨酸形成的二硫键将两条肽链连接成为识别亚基。
6.根据权利要求1所述的合成抗菌蛋白，其特征在于：还包括在所述抗菌蛋白中增加1-2个识别亚基或功能亚基并通过连接肽连接于原有蛋白而得到的功能等同物蛋白。
7.权利要求1-6所述合成抗菌蛋白的制备方法，其特征在于：将编码所述抗菌蛋白的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得所述抗菌蛋白。
8.根据权利要求7所述合成抗菌蛋白的制备方法，其特征在于：所述的载体是质粒或病毒中的一种。
9.根据权利要求7或8所述合成抗菌蛋白的制备方法，其特征在于：所述的宿主细胞是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
10.权利要求1-6所述合成抗菌蛋白的应用，其特征在于：所述抗菌蛋白在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210303670 CN102816245A (zh) | 2012-08-23 | 2012-08-23 | 一组合成抗菌蛋白及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210303670 CN102816245A (zh) | 2012-08-23 | 2012-08-23 | 一组合成抗菌蛋白及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102816245A true CN102816245A (zh) | 2012-12-12 |
Family
ID=47300720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN 201210303670 Pending CN102816245A (zh) | 2012-08-23 | 2012-08-23 | 一组合成抗菌蛋白及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102816245A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016110177A1 (zh) * | 2015-01-07 | 2016-07-14 | 中山大学 | 碱性抗菌肽及其靶向设计和应用 |
-
2012
- 2012-08-23 CN CN 201210303670 patent/CN102816245A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016110177A1 (zh) * | 2015-01-07 | 2016-07-14 | 中山大学 | 碱性抗菌肽及其靶向设计和应用 |
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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