CN102757936B - 人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法 - Google Patents
人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102757936B CN102757936B CN 201210197417 CN201210197417A CN102757936B CN 102757936 B CN102757936 B CN 102757936B CN 201210197417 CN201210197417 CN 201210197417 CN 201210197417 A CN201210197417 A CN 201210197417A CN 102757936 B CN102757936 B CN 102757936B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- concentration
- derived stem
- stem cell
- human adipose
- proliferation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 86
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 claims abstract description 24
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims abstract description 24
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims abstract description 13
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims abstract description 12
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 claims abstract description 12
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108010000685 platelet-derived growth factor AB Proteins 0.000 claims abstract description 11
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims abstract description 11
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 10
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 101001135767 Rattus norvegicus Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 10
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 10
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 claims description 9
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims description 9
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 claims description 9
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 8
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 claims description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 4
- 101000716729 Homo sapiens Kit ligand Proteins 0.000 claims description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 abstract description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 abstract description 2
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 abstract description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 abstract description 2
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 abstract 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 abstract 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 abstract 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 abstract 1
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 abstract 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 abstract 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 abstract 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 abstract 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 17
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 244000309466 calf Species 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 3
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 3
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 description 3
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 3
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 description 3
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 3
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 2
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 2
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- NWNOWCGAHDFNFJ-RUCXOUQFSA-N (2s)-2,5-bis(azanyl)-5-oxidanylidene-pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O NWNOWCGAHDFNFJ-RUCXOUQFSA-N 0.000 description 1
- WAPPRYMYMNVAFR-UHFFFAOYSA-N 2-sulfanylethanol Chemical compound OCCS.OCCS WAPPRYMYMNVAFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 1
- 102100024210 CD166 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100022002 CD59 glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100023126 Cell surface glycoprotein MUC18 Human genes 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102100025680 Complement decay-accelerating factor Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 230000004668 G2/M phase Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 1
- 101000980840 Homo sapiens CD166 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000897400 Homo sapiens CD59 glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000623903 Homo sapiens Cell surface glycoprotein MUC18 Proteins 0.000 description 1
- 101000856022 Homo sapiens Complement decay-accelerating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000994369 Homo sapiens Integrin alpha-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001008874 Homo sapiens Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102100032817 Integrin alpha-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 1
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 1
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003470 adrenal cortex hormone Substances 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N alstonine Natural products C1=CC2=C3C=CC=CC3=NC2=C2N1C[C@H]1[C@H](C)OC=C(C(=O)OC)[C@H]1C2 WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000000630 fibrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004995 multiple fission Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000006508 oncogene activation Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000025053 regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本申请公开了一种人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法。所述的人脂肪干细胞增殖促进剂由胰岛素、氢化可的松、甲状旁腺激素、雌二醇、睾酮、血小板衍生生长因子-AB、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、白血病抑制因子、L-抗坏血酸、生物素、地塞米松、IGF-I和SCF组成。本发明应用于脂肪干细胞的增殖传代培养，不但能特异性促进脂肪干细胞生长速度和扩增数量程几何级数增长，又能抑制其过早分化成熟，避免干细胞在培养中凋亡或早衰，保持脂肪干细胞旺盛活跃的分化潜能。在脂肪干细胞培养领域有着良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及细胞工程领域，特别涉及一种人脂肪干细胞增殖促进剂。
背景技术
人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖1倍。多次传代(10-20代)后,细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15%[3]。ADSCs具有与骨髓间充质干细胞基本相同的细胞免疫表型，经流式细胞仪分析CD9,CD10,CD13,CD29,CD44,CD49d,CD49e,CD54,CD55,CD59,CD90,CD105,CD117,CD146,CD166,STRO-1均为阳性,而CD31,CD34,CD45均为阴性。最大的区别是ADSCs表达CD49d,不表达CD106;而正好相反,BMSCs表达CD106,不表达CD49d。
目前常用的ADSCs分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞，经机械和酶处理方法除去红细胞等成熟细胞后，利用饲养层细胞与采用含10%胎牛血清的培养基进行培养。这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢。
发明内容
本发明的目的是提供一种人脂肪干细胞增殖促进剂，用于提高继代增殖效率。
常用的培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢。
根据本发明的一个方面，提供一种人脂肪干细胞增殖促进剂，其特征在于:由胰岛素、氢化可的松、甲状旁腺激素、雌二醇、睾酮、血小板衍生生长因子-AB、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、白血病抑制因子、L-抗坏血酸、生物素、地塞米松、胰岛素样生长因子IGF-I和人干细胞因子SCF组成。在加入人脂肪干细胞培养基后人脂肪干细胞增殖促进剂中各成分作用浓度依次为胰岛素浓度为0.1~10μg/mL、氢化可的松浓度为10-10~5×10-9mol/L、甲状旁腺激素浓度为2×10-10~7×10-10mol/L、雌二醇浓度0.2~3.5ng/mL、睾酮浓度为0.8~15ng/mL、血小板衍生生长因子-AB浓度为1~8ng/mL、表皮生长因子浓度为2~16ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子浓度为2~20ng/mL、L-谷氨酰胺优选浓度为0.4~4mmol/L、2-巯基乙醇浓度为0.07~0.15mmol/L、白血病抑制因子浓度为1~7ng/mL、L-抗坏血酸浓度为10~80μg/mL、生物素浓度为10~45μg/mL、地塞米松浓度为10-8~5×10-8mol/L、IGF-I浓度为1~10ng/mL和SCF浓度为0.8~15ng/mL。其中胰岛素最优选浓度为6.25μg/mL，氢化可的松最优选浓度为1×10-9mol/L，甲状旁腺激素最优选浓度为5×10-10mol/L，雌二醇最优选浓度为1ng/mL，睾酮最优选浓度为4ng/mL，血小板衍生生长因子-AB最优选浓度为4ng/mL，表皮生长因子最优选浓度为10ng/mL，碱性成纤维细胞生长因子最优选浓度为10ng/mL，L-谷氨酰胺最优选浓度为2mmol/L，2-巯基乙醇最优选浓度为0.1mmol/L，白血病抑制因子最优选浓度为5ng/mL，L-抗坏血酸最优选浓度为50μg/mL，生物素最优选浓度为33μg/mL，地塞米松最优选浓度为10-8mol/L，IGF-I最优选浓度为5ng/mL，SCF组成最优选浓度为5ng/mL。
本发明提供对维持细胞指数生长的激素和各种生长因子作用如下：
insulin胰岛素：能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸
hydrocortisone氢化可的松：刺激干细胞的生长，保证细胞功能
parathyroid hormone甲状旁腺激素：刺激干细胞的生长
estradiol雌二醇：刺激干细胞的生长，保证细胞功能
testosterone睾酮：刺激干细胞的生长，保证细胞功能
PDGF-AB血小板衍生生长因子-AB：促细胞分裂剂，可刺激成纤维细胞和其他多种细胞分裂增殖。
EGF表皮生长因子：对多种组织细胞有强烈的促分裂作用
bFGF碱性成纤维细胞生长因子：能刺激细胞增殖、迁移，诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性，是与肝素有高亲和力的细胞促分裂原。
L-Glutamine L-谷氨酰胺：增加细胞的体积，促进细胞增长
2-Mercaptoethanol 2-巯基乙醇：可以保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，促进细胞的贴壁和增殖。
LIF白血病抑制因子：具有抑制干细胞分化等功能，用于维持培养中的干细胞处于未分化状态。
L-ascorbic acid L-抗坏血酸：抗氧化剂皆能促进干细胞的生长,增加成活率。
biotin生物素：生物素又被称作维生素H，属于水溶性B族维生素家族，参与帮助脂肪细胞内物质正常的合成与代谢。促进干细胞生长。
Dexamethasone地塞米松：属于肾上腺皮质激素类药物，在细胞培养过程中起到生长因子的作用，促进细胞的增殖分化。
IGF-I胰岛素样生长因子：是一类多功能细胞增殖调控因子。在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。
SCF人干细胞因子：是一种广泛表达的Ⅰ型跨膜糖蛋白，可促进干细胞成活、加速增殖。
根据本发明的一个方面，提供的一种人脂肪干细胞增殖促进剂，包含对维持细胞指数生长的激素和各种生长因子，用于脂肪干细胞的增殖传代培养，不但能特异性促进脂肪干细胞生长速度和扩增数量呈几何级数增长，又要抑制其过早分化成熟，避免干细胞在培养中凋亡或早衰，保持脂肪干细胞旺盛活跃的分化的潜能，促进提取出的干细胞成活。
附图说明
图1是本发明中添加人脂肪干细胞增殖促进剂的基础培养基与未添加人脂肪干细胞增殖促进剂的基础培养基培养人脂肪干细胞生长曲线图；
图2是本发明中使用普通基础培养基组培养人脂肪干细胞培养6天时细胞的形态;
图3是本发明中使用人脂肪干细胞增殖促进剂培养人脂肪干细胞培养6天时细胞的形态；
图4是本发明中使用人脂肪干细胞增殖促进剂培养人脂肪干细胞人脂肪干细胞端粒酶活性检测结果。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。
实施例1：普通人脂肪干细胞基础培养基配制:
取900mL的DMEM/F12细胞培养液（从TAKARA BIO INC.购得）加抗生素：青霉素90000U，链霉素90000U。
调pH值：用质量分数5％NaHCO3调节pH到7.2。
过滤除菌：采用孔径0.45μm和0.22μm滤膜各一张，上层为0.45μm，下层为0.22um，以保证过滤效果。
加小牛血清：临用前将加入小牛血清定容至1000mL（从TAKARA BIOINC.购得）。
实施例2：制备一种含人脂肪干细胞增殖促进剂的增殖培养基A
预定量为1000mL则取900mL的DMEM/F12细胞培养液（TAKARABIO INC.），加抗生素：青霉素90000U，链霉素90000U。
调pH值：用质量分数5％NaHCO3调节pH到7.2。
加入增殖促进剂：按下表1所示成分与量称量并依次加入到上述配制好的DMEM/F12细胞培养液中，振荡或超声助溶，不加热助溶。
表1
则上表所示各成分在增殖培养基A中浓度依次为胰岛素0.1μg/mL、氢化可的松10-10mol/L、甲状旁腺激素2×10-10mol/L、雌二醇0.2ng/mL、睾酮0.8ng/mL、血小板衍生生长因子-AB 1ng/mL、表皮生长因子2ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子2ng/mL、L-谷氨酰胺0.4mmol/L、2-巯基乙醇0.07mmol/L、白血病抑制因子1ng/mL、L-抗坏血酸10μg/mL、生物素10μg/mL、地塞米松10-8mol/L、IGF-I 1ng/mL和SCF 0.8ng/mL
过滤除菌：采用孔径0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。
加小牛血清：临用前将加入小牛血清定容至1000mL（从TAKARA BIOINC.购得）。
实施例3：制备一种含人脂肪干细胞增殖促进剂的增殖培养基B
制备方法及预定量如实施例2，但称量时将表1中各成分按能使其在增殖培养基B中浓度依次为胰岛素10μg/mL、氢化可的松5×10-9mol/L、甲状旁腺激素7×10-10mol/L、雌二醇3.5ng/mL、睾酮15ng/mL、血小板衍生生长因子-AB8ng/mL、表皮生长因子16ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子20ng/mL、L-谷氨酰胺4mmol/L、2-巯基乙醇0.15mmol/L、白血病抑制因子7ng/mL、L-抗坏血酸80μg/mL、生物素45μg/mL、地塞米松5×10-8mol/L、IGF-I10ng/mL和SCF 15ng/mL的量称量。
实施例4：制备人脂肪干细胞增殖促进剂的增殖培养基C
制备方法及预定量如实施例2，但称量时将表1中各成分按能使其在增殖培养基C中浓度依次为胰岛素6.25μg/mL，氢化可的松1×10-9mol/L，甲状旁腺激素5×10-10mol/L，雌二醇1ng/mL，睾酮4ng/mL，血小板衍生生长因子-AB 4ng/mL，表皮生长因子10ng/mL，碱性成纤维细胞生长因子10ng/mL，L-谷氨酰胺2mmol/L，2-巯基乙醇0.1mmol/L，白血病抑制因子5ng/mL，L-抗坏血酸50μg/mL，生物素33μg/mL，地塞米松10-8mol/L，IGF-I5ng/mL，SCF 5ng/mL的量称量。
实施例5：利用本发明的增殖剂培养细胞和测试
使用上述4种培养基培养人脂肪干细胞
1.将1×106个的脂肪干细胞分别接种到四组盛有不同的培养基的直径100mm培养皿中并混匀，每组10个培养皿，置于倒置显微镜下观察；
2.加入培养基：
对照组10个培养皿，加入实施例1中普通培养基5mL；
第A组10个培养皿，加入增殖培养基A5mL；
第B组10个培养皿，加入增殖培养基B5mL；
第C组10个培养皿，加入增殖培养基C5mL。
3.将细胞放在在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养；倒置式显微镜观察，每隔3天用移液管吸去上层培养基，加入新的培养基，继续培养。
4.细胞计数：每天在各组中取一个培养皿放入洁净工作台，然后用移液管吸弃培养基。PBS缓冲液洗涤2次，加入1mL胰蛋白酶复合体Trypsin-EDTA，倒置显微镜下发现贴壁细胞分离后，加入4mL含有10%牛血清FBS的基础培养基终止胰酶作用。
使用台盼蓝（Typan Blue）染色血细胞计数板计数活细胞数。
5.实验结果如图1所示，使用增殖培养基C能十分有效地加速脂肪干细胞的繁殖。使用普通基础培养基和增殖培养基A的细胞生长曲线近似倒“S”形，在接种的前3d细胞处于滞留期，而后进入对数生长期，约在第6天达最高峰。之后细胞增长减速进入平台区，到第9天凋亡的细胞增多，细胞满盘率达到90%以上，但使用增殖培养基A仍优于普通基础培养基。使用高剂量（B组）和最优选剂量（C组）细胞增殖剂的人脂肪干细胞能很快从成活并加速增殖，表现在滞留期很短，只不到两天的时间就开始迅速分裂增殖，比普通培养基组细胞提前进入对数增长期，增长数目约是普通培养基组的5-6倍。到第5天起高剂量组与最优选剂量组的细胞增长率发生区别，最优选剂量组的细胞持续增长到第7天达到高峰值，细胞数量达到7x107，此后进入平台区，9天始见少数凋亡细胞。而高剂量组的细胞最多只长到5x107，此后凋亡细胞不断增加，细胞数量渐减，到第8天以后该组细胞数量与低剂量组和普通基础培养基没有有意义的差别。所以高剂量增殖剂并不能得到最佳的人脂肪干细胞增殖的效果，C组剂量促进干细胞繁殖增长并且在体外培养10天未出现大量凋亡。
细胞增殖剂培养人脂肪干细胞安全性测试
1细胞形态：
初分离的细胞接种4h后开始贴壁，无论哪一组细胞在停滞期的细胞形态都呈小圆形，细胞核居中，可出现双核或多核。进入增长期后细胞出现伸展生长，细胞增长明显加快，呈纺锤形、多角形等改变，接着进入高峰期时可见贴壁细胞出现梭形及纤维细胞状形态。四组细胞在形态上完全相同只不过在某一时间点上，表现出细胞数量明显差异（图2、图3），仍然凸显出使用C剂量细胞增殖剂的脂肪干细胞细胞生长密集而活跃。
2表面抗原分析：
取培养的脂肪原代培养的干细胞，去掉培养液，用体积比1∶1的2.5%的胰蛋白酶溶液和0.02%EDTA溶液混合消化，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤后制成每100ul含有1×106个细胞的单细胞悬液，等分为7份，分别加入7个Eppendorf管中，一号管加入共20μL的FITC Mouse IgG1、APC-CY7Mouse IgG2b和染色缓冲液用于检测由于抗体非特异性结合产生的背景作为对照，其他试管分别加入CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、HLA.DR单克隆抗体各20μL，每管分别加入细胞悬液100μL(含1×106个细胞)，室温孵育25min，用含1%BSA的PBS洗涤后，流式细胞仪检测。
流式细胞仪分析原代人脂肪干细胞表型：CD29+(77.5%)，CD34-(3.3%)，CD44+(26.8%)，CD45-(3.8%)，CD105+(30.1%)，HLA.DR-(2.0%)，表明该细胞具有干细胞特性。HLA.DR表达不明显，排除该类细胞是成纤维细胞。
3增殖中端粒酶活性的测定：
用TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒(Chemocon Inc.)按说明书(TRAP法)检测体外培养6天以上的人脂肪干细胞，同时以人胚肾细胞293细胞株细胞(293T)为阳性对照，干扰素为阴性对照(试剂盒内提供)。检测方法如下，取2×106个细胞，裂解细胞，取离心上清2μL进行端粒酶催化特异底物反应的PCR，PCR产物变性后用DIG标记的特异探针杂交，而后用偶联过氧化物酶的抗DIG抗体行ELISA反应，在酶标仪测定ELISA结果。测定波长为450nm和690nm吸光度(A)值，吸光度差值△A=A450—A690，△A代表端粒酶活性。结果判断标准：阳性对照△A>1.5，阴性对照△A<0.25，待测样品△A值减去阴性对照△A值，△A>0.2者为阳性。采用SAS9.0软件包进行结果分析，测定值以均值±标准差表示。
使用最适宜剂量细胞增殖剂培养的人脂肪干细胞样本测定值为第6天人脂肪干细胞为(0.050±0.002)，第10天人脂肪干细胞为(0.055±0.012)，阳性对照293细胞为2.1，阴性对照干扰素为0.048（图4）。
端粒是染色体末端由TTAGGG重复序列和相关结合蛋白质所组成的特殊结构，与细胞的增殖分裂能力密切相关。已证明约80%的恶性肿瘤和永生化细胞系细胞（如本实验的阳性对照293细胞）表达高水平的端粒酶活性，而正常体细胞端粒酶表达水平很低。因此，增殖培养基培养的无论是在生长的最旺盛的第6天以及持续增殖的第10天，细胞端粒酶活性始终保持正常水平，说明培养的细胞正常，没有癌变。
4人脂肪干细胞的染色体核型分析：
各取增殖剂培养的第6天、第10天的脂肪干细胞，加入5g/L的秋水仙素(终质量浓度为0.04mg/L)，然后置于37℃、5%(体积分数)CO2孵箱中培养5h，消化、离心，加入0.075%kcl，静置20min，加入少许固定液(10%福尔马林)预固定后离心，然后固定30min，离心，滴片，干燥后Giemsa染色，烘干，显微镜下观察。以上各方法用不同样本细胞重复实验3次。结果显示：使用本专利细胞增殖剂在体外培养扩增的条件下，人脂肪干细胞的染色体核型未发生易位、倒位、缺失或复制、融合等异常变化。染色体核型的异常改变和癌症的发生有着密切关系。目前的研究已经证实肿瘤的发生与细胞染色体互易、缺失、插入和倒位致染色体特异性断裂点区域癌基因激活表达或抑癌基因缺失，导致相关编码蛋白异常和细胞生物学性状改变之间存在着必然的联系。因此,人脂肪干细胞在体外条件下分离培养、扩增数代后，其染色体核型是否发生异常改变，这与其作为组织工程种子细胞的安全性有着重要的关系。本专利实验结果表明：经过细胞增殖剂多日培养，人脂肪干细胞核型均未发生易位、倒位、缺失或复制、融合等异常变化，为正常的细胞核型。
由上可见，使用本专利发明的细胞增殖剂刺激人脂肪干细胞在体外进行增殖和分裂过程中其端粒酶是呈阴性或低于TRAP法检测水平的低水平表达，而不像肿瘤细胞那样持续高表达端粒酶活性。此外，其染色体核型也未见异常改变。这一研究预示体外培养的人脂肪干细胞可能是安全的，为其进一步应用于各项研究提供了安全性指标及理论基础。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改变和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种人脂肪干细胞增殖促进剂，其特征在于:由胰岛素、氢化可的松、甲状旁腺激素、雌二醇、睾酮、血小板衍生生长因子-AB、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、白血病抑制因子、L-抗坏血酸、生物素、地塞米松、胰岛素样生长因子IGF-I和人干细胞因子SCF组成,各成分的比例为使得在加入人脂肪干细胞培养基后人脂肪干细胞增殖促进剂中各成分作用浓度依次为胰岛素浓度为0.1～10μg/mL、氢化可的松浓度为10-10～5×10-9mol/L、甲状旁腺激素浓度为2×10-10～7×10-10mol/L、雌二醇浓度0.2～3.5ng/mL、睾酮浓度为0.8～15ng/mL、血小板衍生生长因子-AB浓度为1～8ng/mL、表皮生长因子浓度为2～16ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子浓度为2～20ng/mL、L-谷氨酰胺浓度为0.4～4mmol/L、2-巯基乙醇浓度为0.07～0.15mmol/L、白血病抑制因子浓度为1～7ng/mL、L-抗坏血酸浓度为10～80μg/mL、生物素浓度为10～45μg/mL、地塞米松浓度为10-8～5×10-8mol/L、IGF-I浓度为1～10ng/mL和SCF浓度为0.8～15ng/mL。
2.如权利要求1所述的人脂肪干细胞增殖促进剂，其特征在于：各成分的比例为使得在加入人脂肪干细胞培养基后人脂肪干细胞增殖促进剂中各成分作用浓度依次为胰岛素浓度为6.25μg/mL，氢化可的松浓度为1×10-9mol/L，甲状旁腺激素浓度为5×10-10mol/L，雌二醇浓度为1ng/mL，睾酮浓度为4ng/mL，血小板衍生生长因子-AB浓度为4ng/mL，表皮生长因子浓度为10ng/mL，碱性成纤维细胞生长因子浓度为10ng/mL，L-谷氨酰胺浓度为2mmol/L，2-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L，白血病抑制因子浓度为5ng/mL，L-抗坏血酸浓度为50μg/mL，生物素浓度为33μg/mL，地塞米松浓度为10-8mol/L，IGF-I浓度为5ng/mL，SCF浓度为5ng/mL。
3.权利要求1-2中任一项所述的人脂肪干细胞增殖促进剂的应用方法，其特征在于：将所述人脂肪干细胞增殖促进剂各成分加入人脂肪干细胞的培养基中。
4.根据权利要求3所述的一种人脂肪干细胞增殖促进剂的应用方法，其特征在于：所述的人脂肪干细胞的培养基为DMEM/F12细胞培养基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210197417 CN102757936B (zh) | 2012-06-15 | 2012-06-15 | 人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210197417 CN102757936B (zh) | 2012-06-15 | 2012-06-15 | 人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102757936A CN102757936A (zh) | 2012-10-31 |
| CN102757936B true CN102757936B (zh) | 2013-10-23 |
Family
ID=47052588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201210197417 Active CN102757936B (zh) | 2012-06-15 | 2012-06-15 | 人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102757936B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2024529034A (ja) * | 2021-09-29 | 2024-08-01 | イー・エイチ・エル・バイオ カンパニー リミテッド | 尿由来幹細胞の培養のための培地組成物、これを用いた尿由来幹細胞の分離及び培養方法、腎臓疾患治療機能が向上した尿由来幹細胞及びこれを含む細胞治療剤組成物 |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104164403B (zh) * | 2014-07-25 | 2017-04-12 | 大连大学 | 一种提取及培养脂肪干细胞的方法 |
| CN105441387B (zh) * | 2014-09-03 | 2019-01-25 | 黄福来 | 亚全能干细胞专用培养基及其专用培养方法 |
| CN104611290A (zh) * | 2015-02-10 | 2015-05-13 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞的方法 |
| CN105112363B (zh) * | 2015-08-18 | 2019-03-29 | 广东美赛尔细胞生物科技有限公司 | 一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 |
| CN105112364B (zh) * | 2015-08-18 | 2019-04-02 | 广东美赛尔细胞生物科技有限公司 | 人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 |
| CN105132369B (zh) * | 2015-08-25 | 2018-06-26 | 青岛瑞思科生物科技有限公司 | 一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂及诱导培养基 |
| CN107603945A (zh) * | 2016-11-24 | 2018-01-19 | 广东万海细胞生物科技有限公司 | 一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物的制备方法 |
| CN106754675B (zh) * | 2016-12-21 | 2019-11-22 | 广东科玮生物技术股份有限公司 | 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法和用途 |
| CN106635979A (zh) * | 2017-01-16 | 2017-05-10 | 广东万海细胞生物科技有限公司 | 脂肪间充质干细胞的无血清培养基 |
| CN106957818A (zh) * | 2017-05-03 | 2017-07-18 | 泰州市数康生物科技有限公司 | 一种高效促使脂肪干细胞增殖的方法及其试剂盒 |
| CN107686827B (zh) * | 2017-10-30 | 2018-11-16 | 集钧（上海）医疗科技发展有限公司 | 人脂肪干细胞特异性培养基 |
| CN109097430A (zh) * | 2018-07-12 | 2018-12-28 | 江苏瑞思坦生物科技有限公司 | 临床用脂肪干细胞检测体系 |
| CN109266601A (zh) * | 2018-07-12 | 2019-01-25 | 江苏瑞思坦生物科技有限公司 | 构建临床脂肪干细胞库的方法 |
| CN108812645A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-11-16 | 吉林济惠生物科技有限公司 | 一种人脐带间充质干细胞的细胞冻存液 |
| TWI715874B (zh) * | 2018-09-27 | 2021-01-11 | 台灣粒線體應用技術股份有限公司 | 無血清培養液以及使用此無血清培養液分離和放大培養幹細胞方法 |
| CN110343661B (zh) * | 2019-04-24 | 2021-08-24 | 朗姿赛尔生物科技（广州）有限公司 | 一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法 |
| CN113416694A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-09-21 | 江苏瑞思坦生物科技有限公司 | 一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法 |
| CN115747151B (zh) * | 2022-11-25 | 2024-06-21 | 南开大学 | 一种通过调控端粒以稳定扩增脂肪干细胞的方法 |
| CN118370772B (zh) * | 2024-06-25 | 2024-10-01 | 山东省泉溪生物技术有限公司 | 一种干细胞在治疗血管损伤中的用途 |
| CN121006319A (zh) * | 2025-10-24 | 2025-11-25 | 深圳泰华赛尔生物科技有限公司 | 一种宠物干细胞诱导培养基及制备方法和培养方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7531355B2 (en) * | 2005-07-29 | 2009-05-12 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for smooth muscle reconstruction |
| CN102433298A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-05-02 | 安徽农业大学 | 小鼠脂肪干细胞培养液 |
| CN102443566A (zh) * | 2012-01-20 | 2012-05-09 | 天津和泽干细胞科技有限公司 | 一种脂肪干细胞的获取方法 |
| CN102485885A (zh) * | 2011-06-09 | 2012-06-06 | 臻景生物技术（上海）有限公司 | 脂肪干细胞的分离方法和用途 |
-
2012
- 2012-06-15 CN CN 201210197417 patent/CN102757936B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7531355B2 (en) * | 2005-07-29 | 2009-05-12 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for smooth muscle reconstruction |
| CN102485885A (zh) * | 2011-06-09 | 2012-06-06 | 臻景生物技术（上海）有限公司 | 脂肪干细胞的分离方法和用途 |
| CN102433298A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-05-02 | 安徽农业大学 | 小鼠脂肪干细胞培养液 |
| CN102443566A (zh) * | 2012-01-20 | 2012-05-09 | 天津和泽干细胞科技有限公司 | 一种脂肪干细胞的获取方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2024529034A (ja) * | 2021-09-29 | 2024-08-01 | イー・エイチ・エル・バイオ カンパニー リミテッド | 尿由来幹細胞の培養のための培地組成物、これを用いた尿由来幹細胞の分離及び培養方法、腎臓疾患治療機能が向上した尿由来幹細胞及びこれを含む細胞治療剤組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102757936A (zh) | 2012-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102757936B (zh) | 人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法 | |
| Lee et al. | Human adipose-derived stem cells display myogenic potential and perturbed function in hypoxic conditions | |
| RU2528250C2 (ru) | Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и мезенхимальные стволовые клетки, полученные этим способом | |
| Cheng et al. | The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities | |
| Abdallah et al. | Maintenance of differentiation potential of human bone marrow mesenchymal stem cells immortalized by human telomerase reverse transcriptase gene despite of extensive proliferation | |
| Blasi et al. | Dermal fibroblasts display similar phenotypic and differentiation capacity to fat-derived mesenchymal stem cells, but differ in anti-inflammatory and angiogenic potential | |
| Han et al. | The three-dimensional collagen scaffold improves the stemness of rat bone marrow mesenchymal stem cells | |
| Hua et al. | Characterization of mesenchymal stem cells (MSCs) from human fetal lung: potential differentiation of germ cells | |
| CN102618491B (zh) | 诱导脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及诱导方法和用途 | |
| Gottipamula et al. | Isolation, expansion and characterization of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in serum-free conditions | |
| CN101748096A (zh) | 亚全能干细胞、其制备方法及其用途 | |
| He et al. | Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue | |
| CA2649874C (en) | Immune privileged and modulatory progenitor cells | |
| CN104611292B (zh) | 一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法 | |
| CN102250829B (zh) | 人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 | |
| CN107557331A (zh) | 一种分离和培养人脂肪干细胞的方法 | |
| US9481867B2 (en) | Method of rapidly inducing large-scale and high-purity mesenchymal stem cells to transdetermine into hematopoietic stem cells | |
| Dergilev et al. | Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs | |
| CN106754675A (zh) | 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法和用途 | |
| CN101531996B (zh) | 源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法 | |
| Li et al. | Mesenchymal stem cell-like cells from children foreskin inhibit the growth of SGC-7901 gastric cancer cells | |
| Liang et al. | Human adipose tissue derived mesenchymal stem cells are resistant to several chemotherapeutic agents | |
| Liu et al. | Characteristics of mesenchymal stem cells isolated from bone marrow of giant panda | |
| KR102123489B1 (ko) | 자연살해세포 배양액 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 배양방법 | |
| Danoviz et al. | Adipose tissue–derived stem cells from humans and mice differ in proliferative capacity and genome stability in long-term cultures |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |