CN102757659A - 一类咔唑类半菁荧光染料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类咔唑类半菁荧光染料及其应用，所述的咔唑类半菁荧光染料具有结构通式I，式I中：R₁和R₂各自独立地选自氢、C_1-6烷基、C_1-6羟基取代烷基和C_1-6烷氧基；R₃是H或甲醛基；Y^-为卤素负离子。本发明所述的染料对环境粘度的变化具有很灵敏的响应，荧光性能受溶剂极性的影响很小，并且染料本身具有双光子性质，能用比率方法来检测环境粘度。因此本发明所述染料可用于检测细胞和组织微环境粘度变化。

Description

一类咔唑类半菁荧光染料及其应用

技术领域

本发明涉及一类基于咔唑类半菁荧光染料，以及将该荧光染料用作粘度敏感的荧光探针检测活细胞内微环境粘度的方法。

背景技术

粘度是衡量一种浓稠流体的流动性和扩散性的主要因素，同时是流体扩散速率的主要参考指标。针对宏观大体积的粘稠流体，测定流体粘度的方法和仪器已经发展的比较成熟了。对微观环境，比如组织、细胞水平的粘度测定，现有方法往往不能达到测试的目的的。而准确测定细胞水平内微环境的粘度又具有非常重要的意义。

在细胞内，粘度影响着物质和信号的传递，生物大分子间的相互作用，以及活性代谢产物（如ROS和RNS）的扩散。正常细胞内膜系统微环境的粘度最高可以达到140cp(厘泊),而细胞质中的粘度仅为1~2cp，与纯水中的粘度相近；但在病变的条件下，细胞逐渐凋亡，导致大分子偶联缠绕而致使细胞内的粘度大大的增加，最高可能达到300cp，会引起许多疾病的发生。因此在生物体系微观环境中，对粘度的精确测量至关重要。现有测试粘度的方法，如毛细管粘度计，落球粘度计，旋转粘度计等都不能在细胞水平上提供有效的粘度检测。而具有细胞膜通透性的小分子荧光传感器能有效地反应细胞内的微小的粘度变化，因此开发性能优良的可视化小分子荧光探针有着重要的意义。

目前在国际上对粘度探针的研究取得了一些优秀的成果，但仍处于发展的初期。以本组的前期工作为代表，开发了一例Cy5衍生物探针，并通过荧光增强、比例荧光和寿命荧光成像的方法较好的实现了对活细胞和病变细胞粘度的测定。但该探针的合成工作量较大，而在医疗诊断及生物荧光成像领域仍然迫切的需求可同时满足光谱性能优良，具有细胞通透性、合成简单，易于产业化的粘度探针。

近日，双光子显微镜（TPM），由于其在生物成像中独特的优势，已经成为生物实验室中成为不可缺少的工具。相比传统的荧光显微镜，TPM增加了标本的渗透，减少了背景荧光的干扰。TPM采用两个近红外光子作为激发源，穿透深度增加（>500微米）。由于长波长的激发，它有效地避免了生物体内的背景荧光。虽然单光子显微镜（OPM）在粘度检测中应经应用的比较多，据我们所知，并没有报道将TPM的方法用于测量粘度。

咔唑类半菁染料，由于其结构中存在有多个扭曲位点，在低粘度的溶液中荧光量子产率很低，双光子吸收界面也比较小。虽然粘度的增加，染料性质得到极大的变化。而到目前为止还没有文献报道，咔唑类半菁染料用来设计成对环境粘度敏感的分子转子来检测溶液或者细胞内环境的粘度。

发明内容

在现有技术的基础上，本发明旨在提供一种新型咔唑类半菁染料，该染料应当对环境粘度的变化具有很灵敏的响应，荧光性能受溶剂极性的影响很小，并且染料本身具有双光子性质，并能用比率方法来检测环境粘度。

因此，本发明首先提供一类咔唑类半菁荧光染料，具有结构通式I：

式I中：

R₁和R₂各自独立地选自氢、C_1-6烷基、C_1-6羟基取代烷基和C_1-6烷氧基；

R₃是H或甲醛基；

Y^-为卤素负离子。

本发明所述的通式I的咔唑类半菁荧光染料中，其母体结构上取代基的作用是调节染料在有机溶剂或者水溶液中的溶解性，或者细胞跨膜的能力。在本发明的一个具体实施方案中，通式I中的R₁和R₂各自独立地选自C_1-6烷基；优选C_1-3烷基；最优选乙基。

本发明再一具体实施方案中，所述的Y^-为Cl^-，Br^-或I^-；最优选I^-。

在最优选的实施方案中，本发明的咔唑类半菁荧光染料选自染料Qcaz和染料Hcaz。

本发明再一方面的目的在于提供上述本发明的咔唑类半菁荧光染料的制备方法，包括如下步骤：

（1）由2,3,3-三甲基-3H-吲哚与R₂CH₂Y按照摩尔比1:1~1:3在80～148℃条件下反应6~24小时制备季铵盐II，反应溶剂选自甲苯、邻二氯苯、乙醇和乙腈；

（2）咔唑与XCH₂R₁按照摩尔比1:1~1:4在25~50℃条件下反应2~5小时制备中间体化合物III，其中X是卤素；

（3）化合物III与三氯氧膦在DMF溶剂中反应制备中间体化合物IV或V，其中：

a.化合物III与三氯氧磷按照摩尔比1:1.5~1:3在80~95℃条件下反应10~15小时制备中间体化合物IV；

b.化合物III与三氯氧磷按照摩尔比1:3~1:8在90~110℃条件下反应15~24小时制备中间体化合物V；

（4）步骤（1）制得的季铵盐II与步骤（3）制得的化合物IV或V在吡啶催化下反应制备化合物I，反应溶剂为乙醇，其中：

a.季铵盐II与化合物IV按照摩尔比1.2:1在75~85℃条件下反应10~20小时制备化合物I，其中R₃为氢；

b.季铵盐II与化合物V按照摩尔比3:1在60~70℃条件下反应0.1~3小时制备化合物I，其中R₃为甲醛基。

本发明所公开的咔唑类半菁荧光染料具有双吸收和发射峰；该类化合物的荧光性能对溶液粘度非常敏感，随着溶剂粘度的增加，染料的发射强度迅速增加，而且符合

–Hoffmann关系式，在各发射峰处的强度的比例值与粘度的对数值呈线性变化，也符合

–Hoffmann关系式，符合双光子的性能，并且能用比率的方法测试化合物所处溶液环境或者生物环境的粘度，可以借此采用比例成像法来检测细胞内粘度的变化。基于此，本发明再一目的即提供本发明所述咔唑类半菁荧光染料在检测细胞和组织微环境粘度变化中的应用。

附图说明

本发明附图18幅：

图1化合物Qcaz（1μM）在不同溶剂中长波长的荧光量子产率。其中（a）二氯甲烷，（b）甲醇，（c）乙醇，（d）水，（e）DMSO，（f）二氧六环，（g）甘油：水=2:8，（h）甘油：水=4:6，（i）甘油：水=6:4，（j）甘油：水=8:2，（k）甘油。

图2化合物Hcaz（1μM）在不同溶剂中长波长的荧光量子产率。其中（a）二氯甲烷，（b）甲醇，（c）乙醇，（d）水，（e）DMSO，（f）二氧六环，（g）甘油：水=2:8，（h）甘油：水=4:6，（i）甘油：水=6:4，（j）甘油：水=8:2，（k）甘油。

图3化合物Qcaz（1μM）在不同粘度溶液中的荧光光谱的变化（λ_ex=375nm和575nm)。

图3a是340nm作为激发光，显示的是化合物Qcaz（1μM）双发射波段随着粘度增强发射峰增强的变化；

图3b是480nm作为激发光，显示的是化合物Qcaz（1μM）长波段随着粘度的增加发射峰增强的变化。

图4化合物Hcaz（1μM）在不同粘度溶液中的荧光光谱的变化（λ_ex=380nm和580nm)

图4a是340nm作为激发光，显示的是化合物Hcaz（1μM）双发射波段随着粘度增强发射峰增强的变化；

图4b是480nm作为激发光，显示的是Hcaz（1μM）长波段随着粘度的增加发射峰增强的变化。

图5化合物Qcaz在两发射峰强度处比值的对数与粘度对数之间的线性关系。

图6化合物Hcaz在两发射峰强度处比值的对数与粘度对数之间的线性关系。

图7化合物Qcaz（0.1mmol）在甘油中，虽然温度的增加，甘油粘度降低，染料强度逐渐降低。

图8化合物Hcaz（0.1mmol）在甘油中，虽然温度的增加，甘油粘度降低，染料强度逐渐降低。

图9化合物Qcaz（0.1mmol）随着粘度的增加，染料双光子吸收界面强度的变化。

图10化合物Hcaz（0.1mmol）随着粘度的增加，染料双光子吸收界面强度的变化。

图11化合物Qcaz（0.1mmol）中加入不同生物大分子荧光强度变化：1母体染料初始强度，2为半胱氨酸，3为牛血清蛋白,4为谷胱甘肽，5为脱氧核糖核酸,6为甘油中强度。

图12化合物Hcaz（0.1mmol）中加入不同生物大分子荧光强度变化：1母体染料初始强度，2为半胱氨酸，3为牛血清蛋白,4为谷胱甘肽，5为脱氧核糖核酸,6为甘油中强度。

图13化合物Qcaz（5μM）在HeLa细胞中的荧光成像，Leica激光共聚焦荧光显微镜×100objective lens，激发波长800nm，其中：

图13a是绿色通道荧光图片；

图13b是红色通道荧光图片；

图13c是图13b与图13a的荧光比例图片。

图14化合物Qcaz（5μM）在HeLa细胞中的荧光成像，Leica激光共聚焦荧光显微镜×100objective lens，激发波长800nm，其中：

图14a是绿色通道荧光图片；

图14b是红色通道荧光图片；

图14c是图14b与图14a的荧光比例图片。

图15化合物Hcaz（8μM）用488nm激发，在死细胞HeLa中的单光子长波长荧光成像，收集波普范围为：555-595nm。

图15a是化合物Hcaz在死细胞HeLa中的荧光成像；图15b是化合物Hcaz在死HeLa中的白光图。

图16化合物Hcaz（8μM）用488nm激发，在HeLa细胞中的单光子长波长荧光成像，收集波普范围为：570-610nm。

图16a是化合物Hcaz在活细胞HeLa中的荧光成像；图16b是化合物Hcaz在活HeLa中的白光图。

图17化合物Qcaz（8μM）用488nm激发，在HeLa细胞中的单光子长波长荧光成像，收集波普范围为：555-595nm。

图17a是化合物Qcaz在活细胞HeLa中的荧光成像；图17b是化合物Qcaz在活HeLa中的白光图。

图18化合物Qcaz（8μM）用488nm激发，在死细胞HeLa中的单光子长波长荧光成像，收集波普范围为：555-595nm。

图18a是化合物Qcaz在死细胞HeLa中的荧光成像；图18b是化合物Qcaz在死HeLa中的白光图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

化合物Hcaz的合成

化合物Hcaz的合成流方法如下：

（1）2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉（化合物1）的合成按照fisher吲哚合成方法：

称量苯肼54g（0.5mol）加入到250mL两口瓶中，搅拌下缓慢滴加3-甲基-2-丁酮43g（0.5mol）加热到70~80℃，反应4小时，分去水层，水层用乙醚萃取，与乙醚层合并后用无水硫酸镁干燥过滤，减压蒸出溶剂，即得到粗制的腙70g，收率80%。

将上步粗制的腙70g（0.4mol）与150mL冰醋酸混合，在90℃油浴中反应3小时，冷却至室温，用饱和碳酸钠水溶液中和水层至中性，分离水相和有机相，水相用乙醚萃取，萃取液与有机相合并，无水硫酸钠干燥过滤后蒸出乙醚，再减压蒸馏，收集130~140℃（0.08~0.09Mp）沸程的馏分。产品为单换色油状液体52g（收率82%）。

（2）碘化N-乙基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉季铵盐（化合物2）的合成

将3.2g（20mmol）的2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉和4.7g碘乙烷混合于100mL圆底烧瓶中，加入约30mL甲苯，于氮气保护下加热回流7小时，停止加热冷却至室温，过滤生成的固体，用乙醚洗涤得到粉红色固体季铵盐5.4g（收率86%）。

（3）N-乙基咔唑（化合物3）

用分析天平准确称取咔唑(5.0g，30mmol)、氢化钠(0.25g，54mmol)置于100mL干燥的单口烧瓶中，并加入碘乙烷(5.1g，33mmol)和30mL DMF，抽真空充氮气保护，回流反应24h。反应结束后，将溶液倒入水中，固体析出，过滤，然后余物用乙醇(2×300mL)重结晶，得白色晶体，产率76%(4.5g)。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):1.31(t,3H,CH₃,J=13.2Hz),4.22(bp,2H,CH₂，J=7.2Hz),7.19(bp,2H,ArH,J=7.2Hz),7.31(d,2H,ArH,J=8.0Hz),7.41(bp,2H,ArH,J=8.0Hz),8.05(d,2H,ArH,J=8.0Hz)

（4）N-乙基-3-醛基咔唑（化合物4）的合成：

移液管准确量取9mL干燥的DMF置于100mL干燥的单口烧瓶中，将单口烧瓶置于冰水浴中，将5mL三氯氧磷滴入单口烧瓶。分析天平准确称取N-乙基咔唑(2.8g，14.3mmol)溶于40mL氯苯置于恒压滴液漏斗，装上恒压滴液漏斗。0.5h后，将N-乙基咔唑的氯苯溶液缓缓滴入单口烧瓶，在80~90℃的油浴中搅拌反应11h。反应完毕后，冷却，用10%碳酸氢钠溶液调pH至中性，用氯仿萃取，再用无水硫酸钠干燥，减压脱去溶剂，无水乙醇(2×200mL)重结晶，得白色粉末2，产率80%(2.17g)

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):1.34(t,3H,CH₃,J=8.0Hz),4.2(bp,2H,CH₂，J=8.0Hz),7.23(bp,H,ArH,J=6.8Hz),7.315(bp,2H,ArH),7.88(d,H,ArH,J=6.8Hz),8.02(d,H,ArH,J=8.0Hz),8.44(d,H,ArH),9.99(s,H,CHO)

（5）3-[2-（1-N-乙基-3，3-二甲基-2-3氢-吲哚啉基）乙烯基]-9-乙基-咔唑季铵盐半菁染料（化合物Hcaz）的合成：

准确称量中间体化合物4（1.0g,2mmol）和2（0.75g,3.0mmol）,置于100mL单口圆底烧瓶中，加入40mL乙醇，再加入0.5mL哌啶作为催化剂，在80℃的油浴中搅拌反应8h。反应完毕后蒸干溶剂，得到红色油状液体。硅胶柱层析提纯，洗脱液为二氯甲烷/甲醇（20:1），得到产物为棕黄色晶体，产率64%（0.96g）。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):1.43(t,3H,CH₃,J=8.0Hz),1.62(t,3H,CH₃,J=7.6Hz),1.85(s,6H,CH₃),4.33(bp,2H,CH₂,J=8.0Hz),5.0(bp,2H,CH₂,J=7.6Hz),7.33(t,H,ArH，J=6.0Hz),7.42(t,2H,ArH,J=8.2Hz),7.51(bp,5H,ArH),7.89(d,H,CH，J=12.4Hz),8.39(d,H,CH,J=12.4Hz),8.46(d,H,ArH,J=8.2Hz),8.52(d,H,ArH,J=8.2Hz),9.07(s,H,ArH)

实施2

化合物Qcaz的合成

化合物Qcaz的合成方法如下：

（1）N-乙基-3,6-二醛基咔唑（化合物5）的合成：

移液管准确量取18mL干燥的DMF置于100mL干燥的单口烧瓶中，将单口烧瓶置于冰水浴中，将15mL三氯氧磷滴入单口烧瓶。分析天平准确称取N-乙基咔唑(2.8g，14.3mmol)溶于40mL氯苯置于恒压滴液漏斗，装上恒压滴液漏斗。0.5h后，将N-乙基咔唑的氯苯溶液缓缓滴入单口烧瓶，在90~95℃的油浴中搅拌反应60h。反应完毕后，冷却，用10%碳酸氢钠溶液调pH至中性，用氯仿萃取，再用无水硫酸钠干燥，减压脱去溶剂，无水乙醇(2×200mL)重结晶，得白色粉末5，产率90%(3.17g)

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):1.34(t,3H,CH₃,J=8.0Hz),4.2(bp,2H,CH₂，J=8.0Hz),7.23(bp,H,ArH,J=6.8Hz),7.315(bp,2H,ArH),7.88(d,H,ArH,J=6.8Hz),8.02(d,H,ArH,J=8.0Hz),8.44(d,H,ArH),9.99(s,H,CHO)

（2）3-[2-（1-N-乙基-3，3-二甲基-2-3氢-吲哚啉基）乙烯基]-6-醛基-9-乙基-咔唑季铵盐半菁染料（化合物Qcaz）的合成：

准确称量中间体化合物5（1.1g,2mmol）和2（0.375g,1.5mmol）,置于100mL单口圆底烧瓶中，加入40mL乙醇，再加入0.5mL哌啶作为催化剂，在75℃的油浴中搅拌反应4h。反应完毕后蒸干溶剂，得到红色油状液体。硅胶柱层析提纯，洗脱液为二氯甲烷/甲醇（18:1），得到产物为棕黄色晶体，产率45%（0.54g）。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):1.43(t,3H,CH₃,J=8.0Hz),1.69(t,3H,CH₃,J=7.6Hz),1.86(s,6H,CH₃),4.35(bp,2H,CH₂,J=8.0Hz),5.11(bp,2H,CH₂,J=7.6Hz),7.45(t,H,ArH，J=6.0Hz),7.53(bp,2H,ArH,J=8.2Hz),7.58(bp,3H,ArH),8.2(d,H,ArH,J=7.6Hz),8.05(d,H,CH，J=12.4Hz),8.39(d,H,CH,J=12.4Hz),8.43(d,H,ArH),9.17(s,H,ArH),9.35(s,H,ArH),10.12(s,H,CHO)

¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):13.95,14.46,18.42,27.42,30.93,38.60,43,73,52.03,58.37,109.67,110.7,114.0,122.7,123.17,124.32,126.32,127.68,129.32,131.65,140.42,143.22,144.04,156.78,180.68,191.95,207.03

HRMS-ESI:m/z calcd M⁺for C29H29N2O⁺,421.2274;found,421.2285

实施例3

化合物Qcaz和Hcaz的粘度试验

配制浓度为1×10^-3M的化合物Qcaz和Hcaz的DMSO溶液，分别精确量取10μL该溶液加入到10mL甘油-水溶液中，超声10分钟，除掉气泡后静置1小时，在紫外分光光度仪和荧光光度仪上测量其吸收和发射光谱。所选用激发波长是330nm。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500，荧光寿命测试仪：Horiba Jobin YvonFluoromax-4p。双光子激发荧光光谱的激发源是一台锁模飞秒钛蓝宝石激发器，荧光检测利用莱卡共聚焦显微镜荧光检测系统检测。

其中，甘油-乙醇溶液包括甘油、乙醇以及V_甘油:V_水分别是1:9,2:8,3:7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1的两相混合溶液。

当上述配制好的溶液在一定温度下静置一段时间待气泡消除后，在紫外吸收光谱仪和荧光仪上测试，计算出染料在不同溶剂中和各种体积比下化合物的荧光量子产率（如图1，2），从图中可以知道染料在不同种类的低粘度溶剂中的荧光量子产率变化不大，说明染料对溶剂的极性不敏感。然而，当逐渐增加溶剂的粘度的时候，染料的紫外吸收光谱也变化不大，但是荧光发射的强度却随着粘度的增加明显增加，以化合物Qcaz为例，在330nm处激发时，染料在375nm处发射峰的荧光强度增强5倍，在575nm处发射峰的荧光强度则增强50倍（如图3）；575nm处的荧光强度与375nm处的荧光强度比值的对数与溶剂粘度的对数具有很好线性关系（如图5），可用于检测生物环境（如细胞内）的粘度。同时，我们测试了温度对染料的影响。荧光强度随着环境温度的变化会相应的变化（如图7），染料在甘油中，当环境温度从1至49°C变化时，染料在长波长和短波长处的发射强度都降低，但是长波长处的荧光强度变化更明显，这和改变水和甘油的比例测试结果相同，说明温度的改变导致了粘度的变化，出现相同的荧光显现。化合物Hcaz的测试结果与化合物Qcaz现象类似。330nm处激发时，染料在380nm处发射峰的荧光强度增强7倍，在580nm处的发射峰荧光强度则高达40倍（如图4）；580nm处的荧光强度与380nm处的荧光强度比值的对数与溶剂粘度的对数具有很好线性关系（如图6），荧光强度随着环境温度的变化会相应的变化（如图8）。

利用双光子激发波长从720到920nm的范围，测试了染料Qcaz和Hcaz的双光子吸收界面（Φδ）。我们可以看到，随着粘度的增加，双光子吸收界面增强。根据测试结果得到了双光子吸收截面随双光子激发波长变化的关系图（图9，10）。当逐渐增加溶剂的粘度时，染料的双光子吸收界面逐渐增大。在720nm处，Qcaz的双光子吸收截面随着粘度的增加也是逐渐变大，从60%甘油低粘度的10GM，增加粘度到99.9%甘油中时，截面积增大到74GM。Hcaz的双光子吸收截面从低粘度的5GM，增强到82GM。由此看出，染料在高粘度条件下，双光子性能大大的增加。由此，我们可以利用双光子长波长激发，短波长发射的优点，降低生物体自发背景荧光的干扰，结合染料的双发射比率方法，能很好的应用于双光子细胞显微镜中进行细胞成像实验，更加灵敏的检测细胞生物体中的粘度。

生物体系内（如细胞）的黏度对生命活动具有非常重要的意义，因此检测生物体系（细胞内）的粘度是一项非常重要的工作。由于细胞内环境的复杂性，细胞内含有的生物大分子如蛋白质、DNA等可能会影响探针的荧光性能，对检测结果造成干扰，所以需要考察染料与这些大分子的作用（如图11,12）。从测试结果我们可以看出，蛋白质、氨基酸及DNA对染料的影响可以忽略，可以认为此种染料可以用作细胞内微环境的黏度研究。

实施例4

化合物Qcaz和Hcaz的细胞实验

激光共聚焦扫描显微镜下观察化合物对活细胞HeLa的染色：

分别加配有化合物Qcaz和化合物Hcaz浓度为5μM的PBS缓冲液12μL于培养好HeLa细胞的六孔板中，在37°C，5%CO₂的细胞培养箱中孵育30min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦扫描显微镜（Leica，TCS-SP2,Germany）观察细胞形态。选取代表性区域，用油镜（100×）观察，重复三次。

激光共聚焦扫描显微镜下观察化合物对活细胞HeLa的染色：

本发明染料具有细胞膜的通透性，小分子染料具有活细胞膜渗透性。进入到细胞内后，探针在细胞不同位置分布，荧光强度不同程度的增强，实验结果见附图13，是化合物Qcaz在双光子激光共聚焦显微镜下显示的HeLa细胞内的成像结果，激发波长用800nm。由于染料有两组发射波长分别位于375nm和575nm，那么就采用双通道检测，短波长通道取(375±20)nm的蓝色通道（如图13a）；长波长则是取（575±20）nm的红色通道（如图13b），而对两通道的荧光强度做比值后，得到化合物Qcaz在HeLa细胞内的比例成像图（如图13c），根据图片能很清楚的看出，细胞内不同粘度位置的分布，达到对细胞内粘度分布比例成像的目的。在比例图中，细胞中伪彩色主要是绿色和蓝色部分，可以知道染料荧光比值小，细胞内的黏度低。只一部分的颜色达到黄色甚至红色，说明细胞内黏度在这些位置比较高。化合物Hcaz的细胞测试中，实验结果见附图14，激发波长用800nm。由于染料有两组发射波长分别位于380nm和575nm，那么就采用双通道检测，短波长通道取(380±20)nm的蓝色通道（如图14a）；长波长则是取（580±20）nm的红色通道（如图14b），两者的叠加图片呈粉红色（如图14c），而对两通道的荧光强度做比值后，得到化合物Hcaz在HeLa细胞内的比例成像图（如图14d）。

染料直接染色：

将可传代Hela细胞接种于6孔板，37℃，5%CO₂条件下培养24小时，加入染料，终浓度为8μM，37℃孵育30min，吸掉培养基，PBS洗2遍，加入1200μL新鲜培养基，488nm激发照荧光。

乙醇固定：将可传代Hela细胞接种于6孔板，37℃，5%CO₂条件下培养24小时，吸掉培养基，用PBS洗2遍，加入适量70%乙醇，37℃孵育30min，吸掉固定用乙醇，用PBS洗2遍，加1200μLPBS，加入染料，终浓度为8μM，37℃孵育30min，488nm激发照荧光。

化合物Qcaz和Hcaz的进一步单光子荧光成像图片，染料Qcaz（图15，16所示）和染料Hcaz可以看出（图17，18所示），对于活细胞图16,17中，相同的测试条件下，荧光较弱，表明细胞内的黏度比较低，细胞内的黏度最大是100cP左右。单细胞被固定后（15,18所示）细胞确定死亡，观察到的细胞内的荧光明显增加，说明黏度值升高，黏度值最大在300cP以上。

Claims (7)

1.一类咔唑类半菁荧光染料，具有结构通式I：

式I中：

R₁和R₂各自独立地选自氢、C_1-6烷基、C_1-6羟基取代烷基和C_1-6烷氧基；

R₃是H或甲醛基；

Y^-为卤素负离子。

2.权利要求1所述的咔唑类半菁荧光染料，其特征在于所述的R₁和R₂各自独立地选自C_1-6烷基。

3.权利要求1所述的咔唑类半菁荧光染料，其特征在于所述的R₁和R₂各自独立地选自C_1-3烷基。

4.权利要求1所述的咔唑类半菁荧光染料，其特征在于所述的R₁和R₂是乙基。

5.权利要求1所述的咔唑类半菁荧光染料，其特征在于所述的Y^-为Cl^-、Br^-或I^-。

6.权利要求1所述的咔唑类半菁荧光染料的制备方法，包括如下步骤：

（1）由2,3,3-三甲基-3H-吲哚与R₂CH₂Y按照摩尔比1:1~1:3在80~148℃条件下反应6~24小时制备季铵盐II，反应溶剂选自甲苯、邻二氯苯、乙醇和乙腈；

（2）咔唑与XCH₂R₁按照摩尔比1:1~1:4在25~50℃条件下反应2~5小时制备中间体化合物III，其中X是卤素；

（3）化合物III与三氯氧膦在DMF溶剂中反应制备中间体化合物IV或V，其中：

a.化合物III与三氯氧磷按照摩尔比1:1.5~1:3在80~95℃条件下反应10~15小时制备中间体化合物IV；

b.化合物III与三氯氧磷按照摩尔比1:3~1:8在90~110℃条件下反应15~24小时制备中间体化合物V；

（4）步骤（1）制得的季铵盐II与步骤（3）制得的化合物IV或V在吡啶催化下反应制备化合物I，反应溶剂为乙醇，其中：

a.季铵盐II与化合物IV按照摩尔比1.2:1在75~85℃条件下反应10~20小时制备化合物I，其中R₃为氢；

b.季铵盐II与化合物V按照摩尔比3:1在60~70℃条件下反应0.1~3小时制备化合物I，其中R₃为甲醛基。

7.权利要求1~5中任一权利要求所述的咔唑类半菁荧光染料在检测细胞和组织微环境粘度变化中的应用。

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