CN102727505A - 红景天苷在防治肌萎缩疾病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及红景天苷在制备预防和治疗肌萎缩的药物中的应用。本发明通过实验证明红景天苷能够抑制肌萎缩发生过程中肌萎缩特异因子Atrogin-1的表达、肌管萎缩和骨骼肌纤维横截面积的减少，并具有增加骨骼肌内慢肌纤维蛋白的含量，抑制快肌纤维蛋白表达的作用，从而预防和对抗肌萎缩的发生。
Description
技术领域：
本发明涉及化合物红景天苷的新用途，具体涉及红景天苷在制备预防和治疗肌萎缩的药物中的应用。
背景技术：
红景天苷（式I）是已知化学结构的化合物，英文名Salidroside，分子式C14H20O7，CAS登录号10338-51-9。
国内外研究表明，红景天苷在抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基、增强记忆、改善睡眠中起着重要的作用。临床基础研究也提示，红景天苷能明显逆转肺动脉高压、糖尿病或低氧引起的肾脏损伤、血管平滑肌细胞增殖分化潜能削弱等以及干扰肝纤维化的形成。但迄今为止未见红景天苷在骨骼肌中的作用及机制研究的报道。
骨骼肌按照本身的代谢类型特性可分为慢肌和快肌，分别由慢肌纤维蛋白和快肌纤维蛋白组成。慢肌又称为红肌，以有氧代谢为主，收缩缓慢、持久，不易产生疲劳，主要是维持姿势和进行慢而持久的工作；快肌也称白肌，以无氧酵解代谢为主，收缩快，爆发力强，但容易出现疲劳。骨骼肌中快、慢肌纤维蛋白含量的变化对肌萎缩的发生、发展具有重要的调控作用，即慢肌纤维蛋白含量的增加，可提高机体运动耐力，对肌萎缩疾病的发生具有预防和对抗作用。而在肌萎缩疾病中常伴有快肌纤维蛋白含量的增加。由此，慢肌纤维蛋白的增加或和快肌纤维蛋白的减少可预防和治疗骨骼肌萎缩。
生理状态下，骨骼肌蛋白及其快慢肌纤维蛋白的合成和降解处于动态平衡。但临床肌营养不良性疾病（如杜氏肌营养不良、脊髓侧索硬化症等）、废用性肌萎缩（长期卧床、外伤制动、航天飞行中失重性肌萎缩等）、去/失神经性肌萎缩、老年性肌萎缩、恶性疾病（如癌症晚期恶病质、心脏衰竭、肾衰竭、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、艾滋病及长期应用糖皮质激素等疾病）晚期的肌萎缩等，骨骼肌蛋白质代谢失衡，表现为骨骼肌重量明显减轻、肌纤维横截面积的减小、肌纤维类型相关蛋白（即慢肌纤维蛋白和快肌纤维蛋白）的选择性丢失等特征性改变，导致肌力下降、运动障碍、易疲劳和代谢紊乱等，严重影响日常工作和生活。但目前临床尚无很好的治疗方法。
在肌萎缩过程中，蛋白质合成与降解的动态平衡受到破坏，蛋白质降解增加是导致骨骼肌萎缩的根本原因（Russell AP,Clinical and Experimental Pharmacology andPhysiology,37,378–384,2010;Glass DJ,Curr Opin Clin Nutr Metab Care13:225–229,2010）。目前已公认，包括骨骼肌营养不良性疾病、废用性肌萎缩、去神经性肌萎缩以及癌症晚期恶病质和艾滋病等严重疾病并发性肌萎缩等几乎所有类型肌萎缩，其最终的共同改变是骨骼肌特异的萎缩因子Atrogin-1表达增加，骨骼肌蛋白降解大于合成，引起骨骼肌纤维横截面积减小以及肌纤维类型相关蛋白改变，导致肌萎缩的发生（Bodine SC,et al.Science,294:1704-1708,2001;Foletta VC,et al.Pflugers Arch-Eur J Physiol,461:325–335,2011）。因此，通过抑制Atrogin-1的表达、增加肌纤维横截面积和调节肌纤维类型相关蛋白含量，可预防和治疗骨骼肌萎缩疾病的发生发展，提高工作和生活能力。
发明内容：
本发明的目的在于开发红景天苷的新用途。具体目的是通过实验证明红景天苷能够抑制骨骼肌中肌萎缩特异因子Atrogin-1的表达、肌管直径和骨骼肌纤维横截面积的减少；并发现红景天苷具有增加骨骼肌内慢肌纤维蛋白的含量，抑制快肌纤维蛋白表达的作用，从而起到预防和对抗肌萎缩的作用。最终用红景天苷制备出预防和治疗骨骼肌萎缩性疾病的药物。
本发明用以下实验证实了红景天苷的新功能：
1、红景天苷对肌萎缩特异因子Atrogin-1表达的影响
肌管（myotubes）是骨骼肌成肌细胞（myoblasts）在体外分化、融合形成的大于三个核的多核合胞体，具有肌纤维的结构与功能特性，广泛用于骨骼肌的体外实验研究，尤其用于药理学实验中观察分析药物对骨骼肌萎缩的直接作用效应。
本实验通过诱导成肌细胞C2C12体外分化形成多核肌管，并采用国际公认的体外肌管萎缩模型（Sandri M et al,Cell,30;117(3):399-412,2004）进行肌管萎缩实验，用实时定量real time PCR方法分析了红景天苷对肌萎缩特异因子Atrogin-1 mRNA表达的影响。实验结果表明，在诱导体外肌管萎缩过程中，与对照组相比，红景天苷处理组肌萎缩特异因子Atrogin-1mRNA的表达明显抑制（P<0.01）。证明红景天苷可抑制肌萎缩特异因子Atrogin-1mRNA表达，具有预防和治疗肌萎缩发生的作用。
详见实验一。
2、红景天苷对肌管萎缩的影响
肌管直径减少是体外肌管发生萎缩的直接证据。本实验利用以上所述的肌管萎缩模型，通过细胞免疫荧光的方法，分析了红景天苷对肌萎缩的直接作用。实验结果表明，在体外肌管萎缩中，与对照组相比，红景天苷处理组肌管的直径明显增加（P<0.01）。证明红景天苷对肌萎缩具有直接的抑制作用。
详见实验二。
3、红景天苷对肌萎缩的影响
为进一步验证红景天苷抑制肌萎缩的在体效应，我们应用红景天苷（50mg/公斤/天）溶液及其等体积PBS，每天灌胃处理C57小鼠，连续14天，制备红景天苷处理组及其对照组小鼠。并采用国际公认的尾悬吊方法（Gregory R.Adams,et al.J Appl Physiol95:2185–2201,2003），尾悬吊14天诱导肌萎缩形成,制备在体骨骼肌萎缩模型。
肌纤维横截面积的减小是在体骨骼肌萎缩发生的直接证据。本实验中，利用尾悬吊诱导骨骼肌萎缩后，采用免疫组织化学方法，分析了骨骼肌纤维横截面积的变化。实验结果表明，与对照组相比，红景天苷处理组小鼠肌纤维横截面积显著增加（P<0.05）。证明在整体水平上，红景天苷也发挥了抑制肌萎缩的作用效应。
详见实验三。
4、红景天苷对肌纤维类型相关蛋白表达的影响
骨骼肌中快、慢肌纤维蛋白含量的变化对肌萎缩的发生、发展具有重要的调控作用，即慢肌纤维蛋白含量的增加，可提高机体运动耐力，对肌萎缩疾病的发生具有预防和对抗作用。而在肌萎缩疾病中常伴有快肌纤维蛋白含量的增加。由此，慢肌纤维蛋白的增加或和快肌纤维蛋白的减少可预防和治疗骨骼肌萎缩。
本实验中，应用红景天苷（50mg/公斤/天）溶液及其等体积PBS，每天灌胃处理C57小鼠，连续14天，制备红景天苷处理组及其对照组小鼠。采用Western Blot方法，分析了红景天苷对小鼠快、慢肌纤维蛋白含量的影响。实验结果表明，与对照组相比，红景天苷处理组小鼠慢肌纤维标志性蛋白Troponin I-SS的表达显著增加（P<0.01）,而快肌纤维标志性蛋白Troponin I-FS有降低趋势。证明红景天苷具有预防和对抗肌萎缩的作用。
详见实验四。
以上实验所用受试品红景天苷，购买自成都普思生物科技有限公司,纯度（用HPLC方法检测）:99%。
本发明的有益效果是：
首次发现和证实了红景天苷对于预防和治疗肌肉萎缩性疾病的新功能。
本发明通过实验证明红景天苷具有降低肌萎缩特异因子表达；抑制肌萎缩发生过程中肌管直径和肌纤维横截面积的减小；增加骨骼肌内慢肌纤维蛋白含量和抑制快肌纤维蛋白表达的作用。
而抑制肌萎缩特异因子的表达以及增加肌管直径或肌纤维横截面积和肌肉中慢肌纤维蛋白的含量，是防止和改善肌萎缩状态的先决条件。因此，本发明证明了利用红景天苷作为原料药物可用于制备预防和治疗肌肉萎缩性疾病的药物。
四、附图说明
图1是实时定量real time PCR检测对照组及红景天苷处理组肌管萎缩后Atrogin-1的表达。
图2是细胞免疫荧光显示对照组及红景天苷处理组肌管萎缩后的形态。
图3是Image-Pro Plus6.0软件统计对照组及红景天苷组处理组肌管萎缩后直径的变化。
图4组织免疫荧光显示对照组及红景天苷组小鼠肌萎缩后腓肠肌肌纤维的横截面积。标尺为50微米。
图5Image-Pro Plus6.0软件统计对照组及红景天苷组小鼠肌萎缩后腓肠肌肌纤维横截面积的变化。
图6是Western blot检测对照组及红景天苷组小鼠骨骼肌内快、慢肌纤维蛋白（Troponin I-FS、Troponin I-SS）的表达变化。Troponin I-FS和Troponin I-SS是肌钙蛋白抑制亚单位存在于快肌纤维和慢肌纤维中的亚型，分别可以反映快肌纤维蛋白和慢肌纤维蛋白的含量；beta Actin为内参，可以反映总蛋白上样量的一致。
图7是Image-Pro Plus6.0软件统计对照组及红景天苷组小鼠骨骼肌内慢肌纤维蛋白的相对表达量。
图8是Image-Pro Plus6.0软件统计对照组及红景天苷组小鼠骨骼肌内快肌纤维蛋白的相对表达量。
具体实施方式
以下实验中所用的实验动物及材料来源如下：
实验动物：雄性C57小鼠购自北京维通利华动物中心，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001；实验动物质量合格证号：0261086。
C2C12细胞系购于中国医学科学院。
肌管为本实验制备的单核细胞C2C12体外成肌分化后形成的多核合胞体。
受试药物：红景天苷，购买自成都普思生物科技有限公司,HPLC:99%。
其它材料来源：
组织包埋剂购自Thermo公司；
兔源laminin抗体购自Abcam公司；
羊抗兔FITC荧光标记二抗购自Invitrogen公司；
羊抗鼠FITC荧光标记二抗购自Invitrogen公司；
Trizol、反转录酶购自Invitrogen公司；
SYBR购自ABI公司；
兔源Troponin I-SS抗体购自Aviva公司；
兔源Troponin I-FS抗体购自Aviva公司；
兔源beta actin抗体购自Santa Cruz公司；
鼠源myosin抗体购买自北京中山公司
DMEM培养基购自美国GIBCO公司；
胎牛血清(FBS)、马血清(HS)、胰蛋白酶购自HyClone公司；
谷氨酰胺购自Sigma公司；
青霉素和链霉素购自Sigma公司；
细胞培养液：生长液为DMEM，加20%FBS，1%谷氨酰胺，1%青霉素和链霉素双抗；分化液为DMEM，加2%HS，1%谷氨酰胺，1%青霉素和链霉素双抗；
主要仪器设备：Bio-Rad电泳仪，Bio-Rad电泳槽及湿转电转槽，ABI Step-One Plusreal time PCR仪，三洋冰冻切片机，Leica激光共聚焦显微镜，Format CO2孵箱，长城超净工作台；奥林巴斯倒置显微镜。
实验一：红景天苷对肌萎缩特异因子Atrogin-1表达的影响
1.实验目的：
本实验采用对照组和红景天苷处理组肌管，通过体外诱导肌管萎缩，用实时定量realtime PCR的方法，分析红景天苷对肌管萎缩中肌萎缩特异因子Atrogin-1表达水平的影响。
2.实验方法：
2.1成肌细胞复苏、培养
A、从液氮罐中快速取出冻存的成肌细胞C2C12,将冻存管快速放于37℃水浴中,轻摇使其快速溶解。
B、转入15mL一次性灭菌离心管中,加入5mL细胞生长液,1000rpm,离心5min去除冷冻保护剂。
C、吸去上清,加入5mL细胞生长液,用吹打管轻轻吹打为细胞悬液,接种到75mm的培养瓶中。
D、5%CO2孵箱37℃条件下培养。
2.2成肌细胞实验
A、当复苏细胞生长密度达到80%时，弃去旧培养基,用PBS将细胞洗涤2次。
B、加入2mL0.25%胰蛋白酶-EDTA,在倒置显微镜下观察到细胞将要分离、呈现圆形时,加入3mL细胞生长液终止消化。
C、用吸管轻轻吹打培养瓶，使细胞脱落完全。吸出细胞悬液,放入15mL离心管中,以1000rpm的转速，离心5min。
D、吸掉上清液,加入细胞生长液5mL,并用拉制的细尖头吸管吹打细胞悬液，直至细胞均匀分散成单个细胞。
E、按照常规方法，用血细胞计数仪进行细胞计数，将细胞稀释为浓度：104/ML细胞悬液。
F、按照每60mm培养皿接种细胞悬液1mL，并加入2mL生长液，使每个60mm培养皿在3mL生长液下培养。
G、细胞生长约24小时，到达约80%生长密度。
H、将培养皿分组为：对照组和红景天苷处理组各4皿，进行标注。
2.3肌管制备
A、去除对照组和红景天苷处理组皿中生长液，更换为：
a.对照组：3ml/皿的分化液；
b.红景天苷处理组：终浓度为30ug/ml红景天苷的3ml/皿分化液。
B、诱导成肌细胞分化，每24小时更换培养液。
C、分化72小时后，可见成肌细胞形成大于三个核的多核肌管。
2.4体外肌管萎缩实验
应用以上实验分化形成的肌管，采用国际公认的体外肌萎缩模型实验方法（Sandri Met al,Cell,30;117(3):399-412,2004），吸去对照组和红景天苷组皿中的培养液，加入3mL PBS诱导肌管萎缩6小时，每组选取4皿，用于real time PCR分析。
2.5RNA的提取、检测与定量
A、裂解:吸去对照组和红景天苷组中的PBS，每皿加入1ml Trizol反复吹打裂解肌管，吸入到1.5ml的EP管中放置30min。
B、各相分离：按0.2ml氯仿/1ml Trizol的比例加入氯仿，盖紧剧烈混匀15秒，室温放置2-3分钟。4℃，12000g离心15分钟。之后吸取上清水相置于另一新的EP管中。
C、沉淀RNA:按0.5ml异丙醇/1ml Trizol的比例，向吸取的水相中加入异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟。4℃，12000g离心10分钟得到RNA沉淀。
D、漂洗RNA:弃去上清，按1ml75%乙醇/1ml Trizol的比例，加入75%的乙醇洗涤RNA沉淀两次，然后4℃，7500g离心沉淀5分钟，弃去上清。
E、重溶RNA：室温空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，以适量DEPC水溶解RNA沉淀,55℃-60℃水溶10分钟。
F、RNA纯度检测及定量：取1μl RNA溶液加入99μl DEPC水中混匀，用紫外分光光度计测定A260/A280的比值和浓度。
2.6反转录反应
25μL反应体系操作步骤：
b轻甩后,70℃10min,放-20℃3～5min,轻甩。
c在a管内加入：5×Buffer 5μL
dNTP 10μL
RNasin 1μL
M-MLV 1μL
d42℃90min,95℃10min
e合成的cDNA于-20C保存备用。
2.7引物设计
根据NCBI数据库序列利用DNAMAN软件设计引物，然后根据退火温度和序列特异性选择合适的引物进行合成（见表1）。
表1目的基因Atrogin1及内参GAPDH引物序列
2.8real time PCR检测Atrogin1mRNA的表达
50μL反应体系操作步骤：
PCR反应条件：94℃变性5分钟。94℃40秒，62℃15秒，72℃20秒，40个循环。72℃延伸10分钟。
3.数据分析方法
数据以平均值±标准差表示，数据分析采用组间t检验。p≤0.01表示具有显著性统计学差异。
4.实验结果
如图1所示。可见，红景天苷组处理组肌管萎缩后肌萎缩特异因子Atrogin-1mRNA的表达仅为对照组的39%，与对照组相比，Atrogin-1mRNA的表达受到了明显抑制（**P<0.01）。
5.实验结论
红景天苷可显著抑制肌萎缩特异因子Atrogin-1mRNA的表达,对抗肌萎缩。
实验二：红景天苷对肌管萎缩的影响
1.实验目的：
本实验采用对照组和红景天苷处理组肌管，通过体外诱导肌管萎缩，用细胞免疫荧光化学方法，分析红景天苷对体外肌管萎缩的影响。
2.实验方法：
2.1成肌细胞复苏、培养
A、从液氮罐中快速取出冻存的成肌细胞C2C12,将冻存管快速放于37℃水浴中,轻摇使其快速溶解。
B、转入15mL一次性灭菌离心管中,加入5mL细胞生长液,1000rpm,离心5min去除冷冻保护剂。
C、吸去上清,加入5mL细胞生长液,用吹打管轻轻吹打为细胞悬液,接种到75mm的培养瓶中。
D、5%CO2孵箱37℃条件下培养。
2.2成肌细胞实验
A、当复苏细胞生长密度达到80%时，弃去旧培养基,用PBS将细胞洗涤2次。
B、加入2mL0.25%胰蛋白酶-EDTA,在倒置显微镜下观察到细胞将要分离、呈现圆形时,加入3mL细胞生长液终止消化。
C、用吸管轻轻吹打培养瓶，使细胞脱落完全。吸出细胞悬液,放入15mL离心管中,以1000rpm的转速，离心5min。
D、吸掉上清液,加入细胞生长液5mL,并用拉制的细尖头吸管吹打细胞悬液，直至细胞均匀分散成单个细胞。
E、按照常规方法，用血细胞计数仪进行细胞计数，将细胞稀释为浓度：104/ML细胞悬液。
F、按照每60mm培养皿接种细胞悬液1mL，并加入2mL生长液，使每个60mm培养皿在3mL生长液下培养。
G、细胞生长约24小时，到达约80%生长密度。
H、将培养皿分组为：对照组和红景天苷处理组各4皿，进行标注。
2.3肌管制备
A、去除对照组和红景天苷处理组皿中生长液，更换为：
a.对照组：3ml/皿的分化液；
b.红景天苷处理组：终浓度为30ug/ml红景天苷的3ml/皿分化液。
B、诱导成肌细胞分化，每24小时更换培养液。
C、分化72小时后，可见成肌细胞形成大于三个核的多核肌管。
2.4体外肌管萎缩实验
应用以上实验分化形成的肌管，采用国际公认的体外肌萎缩模型实验方法（Sandri M etal,Cell,30;117(3):399-412,2004），吸去对照组和红景天苷组皿中的培养液，加入3mLPBS诱导肌管萎缩6小时，每组选取4皿，用于细胞免疫荧光化学染色分析。
2.5细胞免疫荧光化学染色分析
A、将对照组和红景天苷组肌管培养皿中的PBS吸去。
B、加入4%多聚甲醛2ml，室温放置30min。
C、吸去甲醛，加入PBS稀释的0.3%Triton X-100室温处理30分钟。
D、吸去0.3%Triton X-100，加入5%的羊血清室温封闭1小时。
E、弃去封闭液，加入抗myosin一抗(1:100稀释)，4℃过夜。
F、0.1%PBST洗3次，每次10分钟。
G、加入FITC-标记IgG二抗（1:1000稀释），室温30分钟。
H、PBST洗3次，每次10分钟。
I、DAPI封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。
2.6应用Image-Pro Plus6.0软件对图像进行定量分析。
3.数据分析
数据以平均值±标准差表示，数据分析采用组间t检验。P≤0.01表示具有显著性统计学差异。
4.实验结果
如图2所示。可见，对照组肌管饥饿6小时后，肌管直径明显变小；而红景天苷处理组肌管比对照组肌管直径明显增加；应用Image-Pro Plus6.0软件统计分析后表明，红景天苷处理组肌管直径为对照组的2.15倍（**P<0.01）(见图3)。说明红景天苷抑制了肌管萎缩。
5.实验结论
红景天苷可通过增加肌管萎缩中的肌管直径,对抗肌管萎缩。
实验三：红景天苷对肌纤维横截面积的影响
1.实验目的：
本实验采用尾悬吊诱导骨骼肌萎缩，用组织免疫荧光化学方法，分析红景天苷对小鼠肌萎缩中肌纤维横截面积降低的影响。
2.实验方法：
2.1红景天苷处理和未处理小鼠模型的制备
将红景天苷粉剂用PBS稀释成10mg/ml浓度。24只雄性C57按照体重相近的原则分为两组，小鼠于尾悬吊前14天，红景天苷处理组按照每天每公斤体重50mg（50mg/kg/day）红景天苷剂量、未处理对照组用处理组等体积溶剂PBS同步每天灌胃，连续14天。灌胃时间统一为上午8-9点。
2.2尾悬吊小鼠肌萎缩模型的制备
将红景天苷处理组和未处理对照组C57小鼠，按照国际公认的小鼠尾悬吊方法（Gregory R.Adams,et al.J Appl Physiol95:2185–2201,2003），使小鼠后肢刚好离地，身体与地面的倾斜角度大约为30°。小鼠可以在鼠笼内头低位自由活动、摄食和饮水。动物均单笼饲养，室温保持在23±2℃，每日保持12小时光照。尾悬吊14天诱导肌萎缩形成，结束后，颈部脱臼猝死小鼠，取小鼠后肢背侧腓肠肌。
2.3组织冰冻切片
A、预冷：将盛有异戊烷的小烧杯放在液氮内，预冷10分钟。
B、包埋：用铂纸做成托，滴上包埋剂，将取出的新鲜组织放入包埋剂内，置于异戊烷中30秒-1分钟，待包埋剂变成乳白色。
C、切片：在轮转切片机上切片。
D、固定：将切片放置丙酮中固定5分钟，之后放置-20℃保存。
2.4组织免疫荧光化学染色分析
A、将切片放置在PBST中，洗5分钟。
B、0.3%Triton X-100室温作用30分钟。
C、5%的羊血清室温封闭1小时。
D、加入抗Laminin一抗(1:500稀释)，4℃过夜。
E、PBST洗3次，每次10分钟。
F、加入FITC-标记IgG二抗（1:1000稀释），室温30分钟。
G、PBST洗3次，每次10分钟。
H、DAPI封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。
2.5应用Image-Pro Plus6.0软件对图像进行分析。
3.统计学分析
数据以平均值±标准差表示，数据分析采用组间t检验。0.01＜p≤0.05表示具有统计学差异。
4.实验结果
对照组小鼠尾悬吊14天后，腓肠肌肌纤维的横截面积平均为1415μm2，而喂食红景天苷组小鼠尾悬吊14天后，腓肠肌肌纤维的横截面积平均为1669μm2，相对于对照组，红景天苷组小鼠萎缩后肌纤维的横截面积明显增加（*P<0.05）（见图4，图5）。
5.实验结论
红景天苷可通过增加小鼠肌萎缩形成中肌纤维的横截面积，对抗肌萎缩。
实验四：红景天苷对小鼠肌纤维类型相关蛋白表达的影响
1.实验目的：
本实验通过提取对照组及红景天苷组小鼠腓肠肌蛋白，利用Western blot的方法，检测红景天苷处理后对小鼠腓肠肌内慢肌纤维蛋白和快肌纤维蛋白表达的影响。
2.实验方法
2.1组织蛋白的提取
A、组织蛋白裂解液配制：
表2组织蛋白裂解液的组成成分及含量
| 试剂 | 浓度 | 体积 |
| Tris | 1M | 1ml |
| EDTA | 0.5M | 0.4ml |
| NaCl | 5M | 3ml |
| Briji96 | 10% | 8.75ml |
| NP40 | 10% | 1.25ml |
以上成分加ddH2O至100ml，使用时加蛋白酶抑制剂PMSF、Leupeptin、Aprotinin至终浓度100μg/ml、2μg/ml和2μg/ml。
B、取50-100mg肌肉组织加入到1mL组织裂解液中（已加入蛋白酶抑制剂），用匀浆器在冰上充分匀浆。
C、冰上裂解30分钟。
D、4℃，12000g离心20分钟，取上清，置-80℃保存。
E、将0.2mg/ml的BSA稀释成一系列标准溶液(0、25、50、100、200μg/ml)，取标准溶液和适当稀释的待测样品各20μl，加入5倍稀释的蛋白浓度分析试剂中，振荡混匀后，595nm波长下测光密度值。以标准蛋白浓度的光密度值作标准曲线，计算待测样品蛋白浓度。
2.2SDS-PAGE电泳
A、灌胶：分别配制12%的分离胶和5%的积层胶，灌制分离胶和积层胶；
B、样品制备：在样品加入5×凝胶加样缓冲液(终浓度1×)，沸水变性3-5min；
C、上样：组织蛋白80μg/孔，蛋白分子量marker10μl/孔；
D、电泳：恒压电泳（积层胶90V，分离胶180V），电泳至凝胶底部；
E、取下凝胶，放入预冷的电转缓冲液中平衡5min。
2.3转膜
A、裁剪与凝胶大小相同的厚滤纸和NC膜，在预冷的电转缓冲液中平衡5min。
B、在半干式电转仪的正极极板上依次放置4层厚滤纸、NC膜、凝胶和4层厚滤纸，赶走各层间的气泡，压上负极极板。
C、以1.25mA/cm2的恒流进行电转。
D、电转结束后，将膜置于TBS中漂洗3次，每次5min.
2.4抗原抗体反应
A、封闭：将转印膜放入杂交袋内，加入适量封闭液，室温轻摇2h.
B、一抗反应：倾掉封闭液，按照0.1ml/cm2的比例加入用封闭液稀释的一抗(TroponinI-SS或Troponin I-FS)，除尽气泡，封口，4度轻摇过夜。
C、漂洗：取出转印膜，用TBS-T洗3次，每次10min。
D、二抗反应：将转印膜放入杂交袋内，按照0.1ml/cm2的比例加入封闭液稀释的二抗，赶除气泡后封口，在室温振荡2h.
E、漂洗：取出转印膜，用TBS-T洗3次，每次10min。
2.5ECL显色
A、各取等体积ECL试剂A液、B液混合（按照每平方厘米转引膜0.125ml ECL混合液计算）。
B、将转印膜轻轻接触滤纸吸干液体，有蛋白质的一面朝上放在保鲜膜上。
C、将ECL混合液加到转印膜上，反应1min，提起转印膜，用滤纸吸干液体。
D、用保鲜膜覆盖转印膜，注意表面要平整。
E、用透明胶带将保鲜膜覆盖的转印膜固定在暗盒中，有蛋白的一面朝上。在暗室进行X光曝光，冲片观察结果。
2.6应用Image-Pro Plus6.0软件对图像灰度进行分析。
3.数据分析
数据以平均值±标准差表示，数据分析采用组间t检验。p≤0.01表示具有显著性统计学差异。
4.实验结果
红景天苷灌胃14天后，腓肠肌内慢肌纤维蛋白（Troponin I-SS）的表达比对照组增加了6.2倍（**P<0.01）（见图6，图7），而快肌纤维蛋白（Troponin I-FS）的表达比对照组减少了8%，（见图6，图8）。
5.实验结论
红景天苷能够显著增加骨骼肌内慢肌纤维蛋白的含量，并具有抑制快肌纤维蛋白表达的趋势，可发挥预防和治疗肌萎缩的作用。
Claims (7)
1.红景天苷在制备预防和治疗肌萎缩的药物中的应用。
2.权利要求1所述的应用，所述肌萎缩是骨骼肌肌管直径减小。
3.权利要求1所述的应用，所述肌萎缩是骨骼肌纤维横截面积减小。
4.权利要求1所述的应用，所述肌萎缩是肌萎缩特异因子（Atrogin-1）表达的增加。
5.权利要求1所述的应用，所述肌萎缩是慢肌纤维蛋白含量减少。
6.权利要求1所述的应用，所述肌萎缩是快肌纤维蛋白含量增加。
7.一种预防和治疗肌萎缩的药物，其活性成分是红景天苷。
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