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CN102725397A - 用于抗菌的死乳酸菌菌体及其制备方法 - Google Patents

用于抗菌的死乳酸菌菌体及其制备方法 Download PDF

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CN102725397A CN2011800047229A CN201180004722A CN102725397A CN 102725397 A CN102725397 A CN 102725397A CN 2011800047229 A CN2011800047229 A CN 2011800047229A CN 201180004722 A CN201180004722 A CN 201180004722A CN 102725397 A CN102725397 A CN 102725397A
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Abstract

本发明涉及用于抗菌的死乳酸菌菌体；其通过如下工艺制备：将乳酸菌的发酵液进行热灭活，然后将其分离成发酵滤液和含死乳酸菌的溶液，将含死乳酸菌的溶液进行冷冻干燥，将发酵滤液进行流化床干燥或冷冻干燥，将干燥处理后的发酵滤液和死乳酸菌进行混合。本发明还涉及所述死乳酸菌菌体的制备方法。本发明用于抗菌的死乳酸菌菌体具有均匀的组成和优异的抗菌活性。因此，其可用于制备各种要求具有抗菌活性和肠道调节作用的药品、食品、动物饲料和化妆品。

Description

用于抗菌的死乳酸菌菌体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种包含热灭活(tyndallized)死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液的抗菌物质，更具体地，涉及一种包含热灭活死乳酸菌冻干物的抗菌物质，所述热灭活死乳酸菌冻干物具有均匀的外观及优异的抗菌活性，其制备包括：于热交换器中在适当温度和流速下进行间接加热的步骤，用于热灭活(tyndallization)的快速冷却步骤，流化床干燥步骤和冷冻干燥步骤；本发明还涉及所述抗菌物质的制备方法。
背景技术
一般地，活乳酸菌存在于肠道中并具有多种生理活性，可刺激肠道运动、抑制有害菌、降低血胆固醇以及提供抗癌作用。另一方面，由于乳酸和生理活性物质(抗菌活性物质)通常由乳酸菌产生，热灭活及冻干的菌体冻干物(包含死菌冻干物)可以增加肠道酸度、减慢小肠中的蠕动、帮助消化吸收和控制大肠中的肠道运动以预防腹泻。
也就是说，肠道内肠道菌群中的肠道细菌大肠杆菌(E.coli)和肠球菌(Enterococcus)增加会由此引起难治性腹泻。乳酸菌的热灭活及冻干(抗菌活性)物质及其发酵液可抑制有害菌的生长，因此对腹泻具有改善作用。此外，其基本功能之一为免疫力-促进功能。作为人体的防御机制，为治愈和预防疾病，乳酸菌的热灭活及冻干的(死的)物质可以激活用于探测免疫系统中有害菌的小吞噬细胞以快速探测细菌和病毒，并产生伽马干扰素以提高免疫力并应对疾病。
乳酸菌的热灭活及冻干物质的常规制备过程如图1所示。
对乳酸菌的发酵液进行热灭活、冷冻干燥以及研磨的步骤。在这种情况下，热灭活步骤为采用压力容器在60～120℃下热灭活发酵液10～60分钟，然后将发酵液快速冷却至20℃或以下的温度。然而，在上述常规的热灭活方法中，由于热灭活过程中的碳化，死乳酸菌的外观非常糟糕，热灭活没有得到恰当的实施，由此活乳酸菌的比例过高。
更具体地，如果提高热灭活温度，完整制备的热灭活及冻干乳酸菌具有过低的滴度，也就是过低的抑菌活性，其外观也过于浓密(thick)，商品化时存在问题。反之，如果降低热灭活温度，由于热灭活及冻干物质中仍残留有活乳酸菌，那么热灭活及冻干的乳酸菌可能无法作为死乳酸菌而正确发挥作用，活乳酸菌也可能被误认为是污染菌。
此外，活乳酸菌数根据用于发酵乳酸菌的培养基而不同，因此，热灭活步骤后的死乳酸菌数也大为不同。因此，产物不易具有均匀的外观，而且抑菌活性也会根据热灭活及冻干物质中的死乳酸菌数而变化。
发明内容
技术问题
本发明提供一种包含具有均匀外观和优异抗菌活性的热灭活死乳酸菌冻干物的抗菌物质。
本发明还提供一种制备包含热灭活死乳酸菌冻干物的抗菌物质的方法。
本发明还提供一种包含所述抗菌物质的抗菌药物组合物。
本发明还提供一种包含所述抗菌物质的抗菌食品组合物。
本发明还提供一种包含所述抗菌物质的抗菌饲料组合物。
技术方案
本发明的一个方面提供了一种包含热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液的抗菌物质，其通过包括以下步骤的工艺制备：将乳酸菌的发酵液进行热灭活，然后将热灭活的发酵液分离成热灭活发酵滤液和含热灭活死乳酸菌的溶液；将含热灭活死乳酸菌的溶液进行冷冻干燥以形成热灭活死乳酸菌冻干物；将热灭活发酵滤液进行流化床干燥或冷冻干燥以形成干燥的热灭活发酵滤液；将热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液进行混合。
发酵液的热灭活(tyndallizing)可以包括：采用热交换器在70～160℃间接加热发酵液；然后快速冷却所述发酵液至10～60℃以杀死乳酸菌。
热灭活发酵滤液和含热灭活死乳酸菌的溶液可以用至少一种选自下组的冷冻保护剂包覆：海藻糖、麦芽糖糊精、淀粉及粉状脱脂奶。
热灭活死乳酸菌冻干物的浓度可以为1.0×109～1.0×1011cfu/g，以便施用于人体时在肠道内具有适当的抑菌活性。
乳酸菌可以包括选自下组的至少一种：链球菌属(genusStreptococcus)、乳球菌属(genus Lactococcus)、肠球菌属(genusEnterococcus)、乳酸杆菌属(genus Lactobacillus)、片球菌属(genusPediococcus)、明串珠菌属(genus Leuconostoc)、魏斯氏菌属(genusWeissella)及双歧杆菌属(genus Bifidobacterium)。特别地，乳酸菌可以为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸链球菌(Lactococcus lactis)或粪肠球菌(Enterococcus faecium)。
热灭活发酵滤液的流化床干燥可以包括：通过采用选自大豆分离蛋白、粉状脱脂奶、淀粉及其混合物的吸收剂喷洒热灭活发酵滤液以对热灭活发酵滤液进行干燥。
本发明的另一个方面提供一种包含热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活滤液的抗菌物质，其通过包括以下步骤的工艺制备：将乳酸菌的发酵液分离成发酵滤液和含乳酸菌的溶液，然后分别对发酵滤液和含乳酸菌的溶液进行热灭活；将含热灭活死乳酸菌的溶液进行冷冻干燥以形成热灭活死乳酸菌冻干物；将热灭活发酵滤液进行流化床干燥或冷冻干燥以形成干燥的热灭活发酵滤液；将热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液进行混合。
发酵滤液的热灭活可以包括：采用压力容器在80～160℃间接加热发酵滤液；然后快速冷却所述发酵滤液至20～40℃；含乳酸菌的溶液的热灭活可以包括：采用蒸汽高压灭菌器在80～160℃间接加热含乳酸菌的溶液；然后在20～40℃快速冷却所述含乳酸菌的溶液。
本发明的另一个方面提供了一种制备包含热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液的抗菌物质的方法，所述方法包括以下步骤：将乳酸菌发酵以形成发酵液；将发酵液进行热灭活；将热灭活的发酵液分离成含热灭活死乳酸菌的溶液和热灭活发酵滤液；将含热灭活死乳酸菌的溶液进行冷冻干燥以形成热灭活死乳酸菌冻干物；将热灭活发酵滤液进行流化床干燥或冷冻干燥以形成干燥的热灭活发酵滤液；将热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液进行混合。
发酵液的热灭活可以包括：采用热交换器以10～100l/min的流速在80～160℃间接加热发酵液；然后快速冷却所述发酵液至20～40℃以杀死乳酸菌。
乳酸菌的发酵可以包括：加入糖类、酵母提取物、大豆蛋白胨、离子成分及生长因子后，对乳酸菌进行发酵。
含热灭活死乳酸菌的溶液和热灭活发酵滤液的冷冻干燥可以包括：在-60～-40℃快速冷冻含热灭活死乳酸菌的溶液和热灭活发酵滤液；然后在20～60℃干燥含热灭活死乳酸菌的溶液和热灭活发酵滤液24～96小时。
本发明的另一个方面提供了一种制备包含热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液的抗菌物质的方法，所述方法包括以下步骤：将乳酸菌发酵以形成发酵液；将发酵液分离成含乳酸菌的溶液和发酵滤液；将含乳酸菌的溶液热灭活以形成含热灭活死乳酸菌的溶液；将发酵滤液热灭活以形成热灭活发酵滤液；将含热灭活死乳酸菌的溶液进行冷冻干燥以形成热灭活死乳酸菌冻干物；将热灭活发酵滤液进行流化床干燥以形成干燥的热灭活发酵滤液；将热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液进行混合。
现基于所述方法的各个步骤详细描述本发明的架构。
(a)乳酸菌的发酵
步骤(a)中，将乳酸菌进行发酵。
乳酸菌的发酵可以包括：加入糖类、酵母提取物、大豆蛋白胨、离子成分及生长因子；然后将乳酸菌进行发酵。
此外，当乳酸菌进行发酵时，糖类、酵母提取物、大豆蛋白胨和离子成分为存活与生长所需的成分，基于蛋白水溶液的总重量，这些成分的含量可以为：1～5重量％的糖类、0.1～5重量％的酵母提取物、0.1～5重量％的大豆蛋白胨以及0.01～1重量％的离子成分。糖类可以为葡萄糖、乳糖或其混合物。另外，还可进一步加入复合维生素B或吐温80作为生长因子。
离子成分可以为，但不限于，柠檬酸铵、醋酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰或氯化钠。用于培养乳酸菌的物质可以在加入乳酸菌之前进行灭菌。
(b)乳酸菌的热灭活(tyndallizing)
步骤(b)中，通过将乳酸菌加热到一个较高的温度然后冷却乳酸菌来进行乳酸菌的热灭活。根据本发明，热灭活可以在将乳酸菌发酵液分离成含乳酸菌的溶液和发酵滤液之前进行。
在这种情况下，采用使用热交换器的间接加热方法进行热灭活。通过以1～200l/min的流速在70～160℃间接加热乳酸菌，然后快速冷却乳酸菌至10～60℃，热灭活死乳酸菌的外观可以改善为均匀的，活乳酸菌的残留比例可以降低至近乎0％，还可以获得优异的抑菌活性。在上述温度和流速下，确保了热灭活死乳酸菌外观的改善、活乳酸菌残留比例的下降以及优异的抑菌活性。
在本发明中，“热灭活(tyndallization)”是指在特定温度下杀死乳酸菌以获得死乳酸菌的操作。尽管活乳酸菌对酸很不稳定，不易到达肠道，但是死乳酸菌几乎不受环境例如胃酸的影响，因此可以到达小肠和大肠，在小肠和大肠中，死乳酸菌及其干燥的发酵滤液都具有抗菌活性。
或者，根据本发明，热灭活可以在将乳酸菌发酵液分离成含乳酸菌的溶液和发酵滤液之后独立地进行。在这种情况下，通过采用蒸汽高压灭菌器在70～130℃加热含乳酸菌的溶液，然后在10～60℃快速冷却含乳酸菌的溶液，以及采用压力容器在70～130℃加热发酵滤液，然后将发酵滤液快速冷却至10～60℃来进行热灭活。
(c)分离成含乳酸菌的溶液和发酵滤液
步骤(c)中，将热灭活的发酵液分离成含热灭活死乳酸菌的溶液和热灭活发酵滤液。使用离心机在5000～15000RPM下进行分离，离心后，热灭活的发酵液分离为位于底部的含热灭活死乳酸菌的溶液和上层的热灭活发酵滤液。
(d)含热灭活死乳酸菌的溶液的冷冻干燥
步骤(d)中，将含热灭活死乳酸菌的溶液用冷冻保护剂包覆，然后进行冷冻干燥以形成热灭活死乳酸菌冻干物。冷冻保护剂可以为海藻糖、麦芽糖糊精、淀粉或粉状脱脂奶，基于含热灭活死乳酸菌的溶液的总重量，可以加入5～40重量％的冷冻保护剂，且其可以以水溶液的形式加入。冷冻干燥可以包括：在-60～-40℃快速冷冻含热灭活死乳酸菌的溶液；然后在20～60℃干燥含热灭活死乳酸菌的溶液24～96小时。
(e)热灭活发酵滤液的干燥
步骤(e)中，将步骤(c)中分离的热灭活发酵滤液进行流化床干燥或冷冻干燥以形成热灭活的干燥的发酵滤液。热灭活发酵滤液的流化床干燥可以通过用吸收剂喷洒热灭活发酵滤液以干燥所述热灭活发酵滤液来进行。在这种情况下，吸收剂可以为大豆分离蛋白、粉状脱脂奶、淀粉或其混合物，基于热灭活发酵滤液的总重量，可以加入10～50重量％的吸收剂。
冷冻干燥可以按如下进行：使用蒸发器(浓缩器)以2倍～10倍(2×～10×)浓缩热灭活发酵滤液，加入冷冻保护剂和吸收剂，在-60～-40℃快速冷却热灭活发酵滤液，然后在20～60℃干燥热灭活发酵滤液24～96小时。在这种情况下，基于热灭活的浓缩发酵滤液的总重量，冷冻保护剂和吸收剂可以各自以5～40重量％的量加入。
(f)热灭活死乳酸菌冻干物与热灭活且干燥的发酵滤液的混合
步骤(f)中，将热灭活死乳酸菌冻干物与热灭活且干燥的发酵滤液进行混合。将步骤(d)和(e)中得到的热灭活死乳酸菌冻干物和热灭活且干燥的发酵滤液单独研磨并混合，由此制得最终的抗菌物质。
在这种情况下，包含热灭活死乳酸菌冻干物的产物可采用适当的稀释剂稀释以使热灭活死乳酸菌的浓度为1.0×109～1.0×1011cfu/g。在此浓度范围内的热灭活死乳酸菌可达到最佳的抗菌活性，并可确保均匀的外观。
本发明的热灭活死乳酸菌冻干物具有优异的抗菌活性，因此，可以加入到并用于各种药品、食品、化妆品以及饲料中以抑制细菌的生长。具体地，所述热灭活死乳酸菌冻干物可用于药物组合物、食品组合物和饲料组合物中。
本发明的另一个方面提供一种包含热灭活死乳酸菌冻干物的抗菌药物组合物。
本发明的热灭活死乳酸菌冻干物可以用于抗菌药物组合物中。在这种情况下，热灭活死乳酸菌冻干物可以以1.0×109～1.0×1011cfu/g的浓度加入到组合物中。
此外，本发明的热灭活死乳酸菌冻干物可以用于肠道调节(intestinal regulation)的组合物中。在本发明中，“肠道调节”是指治疗和改善由动物肠道菌群的异常发酵而引起的失调。所述失调包括，例如由有害微生物引起的传染性腹泻、肠胃炎、炎症性肠病、神经性肠道综合征、小肠中细菌过度生长、肠道急性腹泻等。
所述组合物可以采用本领域公知的各种方法以不同的剂型来制备和施用。例如本发明的乳酸菌或其培养物可与制药领域常用的载体进行混合，并可以以片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂、粉剂、悬浮剂、颗粒剂等形式来制备和施用。
所述载体可以是，但不限于，例如，粘合剂、助流剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、着色剂或调味剂。例如，粉剂可以按如下制备：仅将热灭活死乳酸菌冻干物与药用的适当赋形剂如乳糖、淀粉或无定形纤维素进行混合。
颗粒剂可以按如下制备：将热灭活死乳酸菌冻干物和药用的适当赋形剂以及药用的适当粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素进行混合，然后采用溶剂如水、乙醇或异丙醇进行湿法造粒，或使用压力进行干法造粒。此外，片剂可以按如下制备：将颗粒与药用的适当润滑剂如硬脂酸镁进行混合，然后采用压片机形成片剂。
所述组合物可以采用口服方式给药。此外，可以依据活性成分在人体内的吸收率、失活或排泄速度以及患者的年龄、性别、状态或疾病水平适当地选择剂量。例如，基于热灭活死乳酸菌冻干物组合物的总重量，每人每天可以给药100～5000mg一到三次。
本发明的另一个方面提供一种包含热灭活死乳酸菌冻干物的抗菌食品组合物。
热灭活死乳酸菌冻干物可以用于抗菌食品组合物中。在这种情况下，热灭活死乳酸菌冻干物可以以1.0×109～1.0×1011cfu/g的浓度加入到组合物中。
热灭活死乳酸菌冻干物组合物可适用的食品类型没有特别限制。例如，所述食品包括饮料、茶、面包、巧克力、糖果、零食以及复合维生素，还包括所有功能性食品。此外，通过额外添加饮食学上(sitologically)允许的食品添加剂并形成药品，所述组合物还可以制备为功能性保健食品。
所述功能性保健食品可以额外添加各种材料，如调味剂、天然碳水化合物、甜味剂、维生素、电解质、着色剂、果胶酸、海藻酸、有机酸、保护性胶体增稠剂(protective colloidal thickener)、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇以及碳酸化剂(carbonating agent)。
本发明的另一个方面提供一种包含热灭活死乳酸菌冻干物的抗菌饲料组合物。
热灭活死乳酸菌冻干物可以用于抗菌饲料组合物中。在这种情况下，热灭活死乳酸菌冻干物可以以1.0×109～1.0×1011cfu/g的浓度加入到组合物中。
所述饲料组合物可以用作传统抗生素的替代品，通过抑制肠道内有害菌生长、稳定保持肠道菌群以及使牲畜健康状况良好，可以改善牲畜的增重和肉质，还可以提高奶产量和免疫力水平。所述饲料组合物可以制备成，但不限于，发酵饲料、配合饲料、颗粒饲料(pellets)或青贮饲料。
发酵饲料可以按如下制备：加入热灭活死乳酸菌冻干物和各种微生物或酶，将有机物质进行发酵；配合饲料可以按如下制备：将各种常规饲料与热灭活死乳酸菌冻干物混合。此外，颗粒型饲料可以通过将发酵饲料或配合饲料在颗粒机中加热加压进行制备。
附图说明
图1是制备热灭活死乳酸菌冻干物的常规方法流程图。
图2-5是根据本发明实施方式，制备包含热灭活死乳酸菌冻干物的抗菌物质的方法流程图。
具体实施方式
下文中，将参考附图通过解释本发明的实施方式来详细描述本发明。提供以下实施方式用于充分理解本发明而不限制本发明的范围。以下说明中未涉及的事项可由本领域普通技术人员充分地从技术上推论得出，因此未在此进行描述。
现描述用于比较根据本发明制备的及根据常规方法制备的包含热灭活死乳酸菌冻干物的抗菌物质的试验例。
[比较例1]
如图1所示，使用常规制备热灭活死乳酸菌冻干物的方法。具体地，采用压力容器如发酵管将乳酸菌的完全发酵液在60～120℃下热灭活10～60分钟，然后快速冷却至20℃或以下。之后，将发酵液冷冻干燥并研磨，由此得到死乳酸菌冻干物。以上试验的结果如表1和2所示。
表1显示根据热灭活温度和热灭活时间的活乳酸菌数和残留比例(细胞/g)
表1
Figure BDA00001698489300101
如表1所示，在采用压力容器如发酵管进行的乳酸菌热灭活中，可根据热灭活温度和热灭活时间考查活乳酸菌的残留比例，考虑到活乳酸菌的残留比例，热灭活的温度须等于或高于120℃(热灭活之前的活乳酸菌数为8.6E+09)。
表2显示根据热灭活温度和热灭活时间的死乳酸菌的浊度。
表2
Figure BDA00001698489300111
如表2所示，在采用压力容器如发酵管进行的乳酸菌热灭活中，热灭活后的热灭活死乳酸菌的外观(浊度)取决于热灭活温度和热灭活时间，热灭活温度等于或高于100℃及热灭活时间等于或大于30分钟时，浊度较高。如果浊度过高，则不易进行商品化和销售。如果热灭活温度过高，由于不良的外观和低抗菌活性，抑菌活性将有所降低。另外，如果热灭活温度过低，活乳酸菌的残留比例将增加。而且，如果热灭活时间过长，由于碳化，死乳酸菌将具有不良的外观及低的抑菌活性。
<1-1>产物外观：将0.1g产物溶于10ml纯化水中，测量其浊度(OD610nm，分光光度计)。
<1-2>活菌数：计数热灭活后产物中的活乳酸菌数(细胞/g)。
实施例1
如图5所示，采用本发明的制备热灭活死乳酸菌冻干物的方法。
具体地，使用7,260RPM的离心机将完全发酵液分离成发酵滤液和含乳酸菌的溶液。将发酵滤液转移至压力容器(发酵罐)中，在90℃下热灭活10分钟，冷却至40℃，110℃下重复热灭活10分钟，冷却至40℃，采用流化床干燥机进行2倍(2×)浓缩，采用大豆分离蛋白和粉状脱脂奶作为吸收剂，由此制得热灭活且干燥的发酵滤液。
将含乳酸菌的溶液混匀，用纯化水以1∶2的比例稀释，于蒸汽高压灭菌器中在121℃下热灭活20分钟，基于含热灭活死乳酸菌溶液，用20重量％的海藻糖和淀粉作为冷冻保护剂在室温下进行包覆，然后进行预冷冻和冷冻干燥，由此得到热灭活死乳酸菌冻干物。将所得的热灭活且干燥的发酵滤液和热灭活死乳酸菌冻干物单独进行研磨然后混合。
实施例2
如图2所示，采用本发明的制备热灭活死乳酸菌冻干物的方法。
将乳酸菌的完全发酵液在90℃下热灭活10分钟，冷却至40℃，在110℃下重复热灭活10分钟，冷却至40℃，然后采用离心机分离成含热灭活死乳酸菌的溶液和热灭活发酵滤液。然后，采用流化床干燥机将热灭活发酵滤液进行2倍(2×)浓缩，采用大豆分离蛋白和粉状脱脂奶作为吸收剂，由此制得热灭活且干燥的发酵滤液。
室温下用基于含热灭活死乳酸菌溶液的20重量％的海藻糖和淀粉作为冷冻保护剂，对含热灭活死乳酸菌的溶液进行包覆，然后进行预冷冻和冷冻干燥，由此得到热灭活死乳酸菌冻干物。之后，将所得的热灭活且干燥的发酵滤液和热灭活死乳酸菌冻干物单独进行研磨然后混合，由此完成整个过程。
实施例3
如图3所示，采用本发明的制备热灭活死乳酸菌冻干物的方法。
将乳酸菌的完全发酵液在90℃下热灭活10分钟，冷却至40℃，在110℃下重复热灭活10分钟，冷却至40℃，采用离心机将其分离成含热灭活死乳酸菌的溶液和热灭活发酵滤液。然后，采用蒸发器(浓缩器)将分离的热灭活发酵滤液进行5倍(5×)浓缩，采用基于热灭活发酵滤液的20重量％的大豆分离蛋白和粉状脱脂奶作为吸收剂，于冷冻器中在-40℃或以下的温度冷冻48小时，于冷冻干燥机中冷冻干燥96小时，研磨，由此制得热灭活且干燥的发酵滤液。
室温下用基于含热灭活死乳酸菌溶液的20重量％的海藻糖和淀粉作为冷冻保护剂，对含热灭活死乳酸菌的溶液进行包覆，然后进行预冷冻和冷冻干燥，由此得到热灭活死乳酸菌冻干物。之后，将热灭活且干燥的发酵滤液和热灭活死乳酸菌冻干物单独进行研磨然后混合，加入适当的稀释剂，由此完成整个过程。
实施例4
如图4所示，采用本发明的制备热灭活死乳酸菌冻干物的方法。
将乳酸菌的完全发酵液于热交换系统中(UHT，阿尔法-拉伐(α-Laval)制造)在125℃下以30l/min的流速进行热灭活，然后冷却至40℃或以下。然后，采用离心机(SC-35分离器，韦斯伐利亚(Westfalia)制造)将完全冷却的热灭活发酵液分离成含热灭活死乳酸菌的溶液和含有抗菌活性物质的热灭活发酵滤液。
将含有抗菌活性物质的热灭活发酵滤液于包含有基于发酵滤液的50重量％的大豆分离蛋白和粉状脱脂奶作为吸收剂的流化床干燥机中进行喷雾和干燥，由此得到热灭活且干燥的发酵滤液，将分离的含热灭活死乳酸菌的溶液用基于含热灭活死乳酸菌溶液的20重量％的海藻糖和淀粉作为冷冻保护剂进行包覆，然后于冷冻干燥机中在40℃下干燥96小时，由此得到热灭活死乳酸菌冻干物。之后，将热灭活且干燥的发酵滤液和热灭活死乳酸菌冻干物单独进行研磨，然后于圆筒混合机中混合。
现描述用于测定实施例1-4的抗菌活性的试验例。
[试验例1]
对于实施例1-4制备的包含热灭活死乳酸菌冻干物的抗菌物质，测定其外观和活乳酸菌数(残留比例)，通过抑菌试验考查其抗菌活性。
在这种情况下，使用副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi)、志贺氏杆菌属(Shigella genus)和埃希氏杆菌属(Escherichia genus)作为细菌，采用韩国食品药品管理局(Korea Food and DrugAdministration)出版的“药品等的参考文献和试验方法，第2版(References and Test Methods for Medicines etc.，2nd Revision)”所公开的抑菌试验方法进行抑菌试验。
试验方法描述如下：
<1-1>产物外观：将0.1g产物溶于10ml纯化水中，测定其浊度(OD610nm，分光光度计)。
<1-2>活菌数：计数热灭活后产物中的活乳酸菌数(细胞/g)。
<1-3>抑菌试验
-试验细菌和试验细菌溶液：采用甲型副伤寒沙门菌(Salmonellaparatyphi A)作为试验细菌。37℃下将试验细菌在酪蛋白胨(胰蛋白酶大豆琼脂)中培养18-24小时，然后计数细菌数(细胞/g)。
-试验溶液A的制备：准确地将1.7g采用上述热灭活方法制备的每种抗菌物质加入到20ml用于悬浮试验细菌的液体培养基中，室温下搅拌5-10分钟，在5,000RPM下离心分离15分钟。然后取上清液过滤并灭菌。
-试验溶液B的制备：准确地将2.4g采用上述热灭活方法制备的每种抗菌物质进行如试验溶液A的操作和制备。
-操作方法：分别将5ml试验溶液A、试验溶液B和对照培养基置于三支内径16mm、长160mm的灭菌试管中，准确地接种0.1ml试验细菌溶液(副伤寒沙门菌)。分别将5ml试验溶液A和试验溶液B置于另外两支试管中，用作空白试验溶液。将这些试管在37℃下培养，观察相对于各自空白试管的细菌生长。
-测定：5-6小时的培养过程之后，试验溶液A和试验溶液B中的细菌应当没有生长，对照培养基中应当有生长。24小时之后，对照培养基中的细菌应当在活跃地生长，试验溶液B中应当没有生长。
以上试验的结果如表3所示。
表3
如表3所示，与实施例1-3的热灭活死乳酸菌冻干物相比，采用本发明制备方法制备的实施例4的热灭活死乳酸菌冻干物具有更低的浊度，因此具有均匀的外观，还具有非常少的活乳酸菌数，并具有最佳的抑菌活性。然而，与比较例1相比，实施例1-3中外观均匀、抑菌活性优异。
[试验例2]
在采用热交换器的发酵液热灭活中，根据接收热交换器热量的加热部件的温度、热灭活实际发生的在管(保温管)中的保留时间(流速)以及冷却部件的温度，热灭活的质量可能不同，滴度(抑菌活性)也可能不同。因此，考查了每个工艺条件下热灭活死乳酸菌冻干物的外观、活乳酸菌数以及抑菌活性。
<2-1>当热交换器中的加热温度为140℃、冷却温度为40℃时，依据流速对热灭活后乳酸菌的外观和活菌数的试验
当接收热交换器热量的加热部件温度为140℃、冷却部件温度为40℃时，依据流速对热灭活后乳酸菌的外观和活菌数进行比较。
表4
  流速(l/min.)   外观   热灭活后的活菌数
  1   0.120   痕量
  40   0.032   痕量
  60   0.030   ＜E+02
  120   0.028   ＞E+05
如表4所示，如果流速过低，热交换器中的保留时间长，发生过度杀菌，因而其外观不合适。如果流速过高，保留时间短，热灭活(杀菌)没有恰当地进行，因而热灭活后的活乳酸菌数量大。
<2-2>当热交换器中的流速为40l/min、冷却温度为40℃时，依据加热温度对热灭活后乳酸菌的外观和活菌数的试验
当管中保留时间即流速为40l/min、冷却部件温度为40℃时，依据加热部件的温度对热灭活后乳酸菌的外观和活菌数进行比较。
表5
  加热温度(℃)   外观   热灭活后的活菌数
  50   0.027   ＞E+05
  70   0.028   ＞E+05
  140   0.031   痕量
  170   0.058   痕量
如表5所示，如果热交换器的加热温度过低，热灭活(杀菌)没有恰当地进行，因而热灭活后的活菌数量大。如果加热温度过高，由于温度的原因，会发生部分碳化，因而其外观不合适。
<2-3>当热交换器中的加热温度为140℃、流速为40l/min时，依据冷却温度对热灭活后乳酸菌的外观和活菌数的试验
当接收热交换器热量的加热部件的温度为140℃以及流速为40l/min时，依据冷却部件的温度对热灭活后乳酸菌的外观和活菌数进行比较。
表6
  冷却温度(℃)   外观   热灭活后的活菌数
  10   0.031   痕量
  40   0.030   痕量
  60   0.030   痕量
  80   0.032   ＜E+02
如表6所示，如果冷却温度等于或低于60℃，热灭活后的外观和活菌数没有显著差异，仅是动力(utility)的消耗会有所增加，因此将最佳的条件确定为约60℃。
<2-4>当流速为120l/min时，依据加热部件温度对外观、活菌数及抑菌活性的测定
当管中保留时间即流速为120l/min时，依据接收热交换器热量的加热部件的温度对外观、活菌数及抑菌活性进行测定(表7)。采用试验例1的测定方法，并将冷却部件的温度设定为40℃。
表7
Figure BDA00001698489300171
<2-5>当流速为30l/min时，依据加热部件温度对外观、活菌数及抑菌活性的测定
当管中保留时间即流速为30l/min时，依据接收热交换器热量的加热部件的温度对外观、活菌数及抑菌活性进行测定(表8)。采用试验例1的测定方法，并将冷却部件的温度设定为40℃。
表8
Figure BDA00001698489300172
<2-6>当加热部件的温度为130℃时，依据流速对产物外观、活菌数及抑菌活性的测定
当接收热交换器热量的加热部件的温度为130℃时，对产物的外观、活菌数及抑菌活性进行测定(表9)。采用试验例1的测定方法，并将冷却部件的温度设定为20℃。
表9
Figure BDA00001698489300181
<2-7>当加热部件的温度为150℃时，依据流速对产物外观、活菌数及抑菌活性的测定
当接收热交换器热量的加热部件的温度为150℃时，对产物的外观、活菌数及抑菌活性进行测定(表10)。采用试验例1的测定方法，并将冷却部件的温度设定为40℃。
表10
Figure BDA00001698489300182
<2-8>当加热部件的温度为140℃以及流速为35l/min时，依据冷却温度对产物外观、活菌数及抑菌活性的测定
当接收热交换器热量的加热部件的温度为125℃以及流速为35l/min时，对产物的外观、活菌数及抑菌活性进行测定(表11)。采用试验例1的测定方法。
表11
Figure BDA00001698489300183
<2-9>当加热部件的温度为130℃、流速为35l/min以及冷却温度为40℃时，依据混合之后的死菌数对外观、活菌数及抑菌活性的测定
当接收热交换器热量的加热部件的温度为130℃、流速为35l/min以及冷却温度为40℃时，对产物的外观、活菌数及抑菌活性进行测定(表12)。采用试验例1的测定方法。
表12
Figure BDA00001698489300192
工业适用性
本发明的热灭活死乳酸菌冻干物可具有均匀的外观和改善的抗菌活性。
此外，在本发明的制备包含热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液的抗菌物质的方法中，由于在热灭活之前或之后将乳酸菌的发酵液分离成含乳酸菌的溶液和发酵滤液，以及对含乳酸菌的溶液和发酵滤液单独进行干燥，死乳酸菌数可以人为地、多样地进行调节，因而可产生具有均匀外观的各种产品。
而且，本发明的制备包含热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液的抗菌物质的方法，在乳酸菌发酵以后和在将发酵乳酸菌分离成菌体和发酵滤液之前，采用间接及瞬时热灭活的热交换器，可以实现工艺的简化和质量的改善。
因此，本发明的抗菌物质及其制备方法可以适用于制备各种要求具有抗菌活性和肠道调节作用的药品、食品、饲料、化妆品等。

Claims (17)

1.一种包含热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液的抗菌物质，其通过包括以下步骤的工艺制备：
将乳酸菌的发酵液进行热灭活，然后将热灭活的发酵液分离成热灭活发酵滤液和含热灭活死乳酸菌的溶液；
将含热灭活死乳酸菌的溶液进行冷冻干燥以形成热灭活死乳酸菌冻干物；
将热灭活发酵滤液进行流化床干燥或冷冻干燥以形成干燥的热灭活发酵滤液；和
将热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液进行混合。
2.根据权利要求1所述的抗菌物质，其中所述发酵液的热灭活包括：
采用热交换器在70～160℃间接加热所述发酵液；和
快速冷却所述发酵液至10～60℃以杀死乳酸菌。
3.根据权利要求1所述的抗菌物质，其中所述热灭活发酵滤液和含热灭活死乳酸菌的溶液用至少一种选自下组的冷冻保护剂进行包覆：海藻糖、麦芽糖糊精、淀粉及粉状脱脂奶。
4.根据权利要求1所述的抗菌物质，其中所述热灭活死乳酸菌冻干物的浓度为1.0×109～1.0×1011cfu/g。
5.根据权利要求1所述的抗菌物质，其中所述乳酸菌包括选自下组的至少一种：链球菌属、乳球菌属、肠球菌属、乳酸杆菌属、片球菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属和双歧杆菌属。
6.根据权利要求1所述的抗菌物质，其中所述热灭活发酵滤液的流化床干燥包括：通过采用选自大豆分离蛋白、粉状脱脂奶、淀粉及其混合物的吸收剂喷洒热灭活发酵滤液，对所述热灭活发酵滤液进行干燥。
7.一种包含热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活滤液的抗菌物质，其通过包括以下步骤的工艺制备：
将乳酸菌的发酵液分离成发酵滤液和含乳酸菌的溶液，然后分别对发酵滤液和含乳酸菌的溶液进行热灭活；
将含热灭活死乳酸菌的溶液进行冷冻干燥以形成热灭活死乳酸菌冻干物；
将热灭活发酵滤液进行流化床干燥或冷冻干燥以形成干燥的热灭活发酵滤液；和
将热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液进行混合。
8.根据权利要求7所述的抗菌物质，其中发酵滤液的热灭活包括：
采用压力容器在70～130℃加热所述发酵滤液；和
快速冷却所述发酵滤液至10～60℃，以及
其中含乳酸菌的溶液的热灭活包括：
采用蒸汽高压灭菌器在70～130℃加热所述含乳酸菌的溶液；和
在10～60℃快速冷却所述含乳酸菌的溶液。
9.一种制备包含热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液的抗菌物质的方法，所述方法包括以下步骤：
将乳酸菌发酵以形成发酵液；
将所述发酵液进行热灭活；
将热灭活的发酵液分离成含热灭活乳酸菌的溶液和热灭活发酵滤液；
将含热灭活死乳酸菌的溶液进行冷冻干燥以形成热灭活死乳酸菌冻干物；
将热灭活发酵滤液进行流化床干燥或冷冻干燥以形成干燥的热灭活发酵滤液；和
将热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液进行混合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述发酵液的热灭活包括：
采用热交换器在70～160℃间接加热所述发酵液；和
快速冷却所述发酵液至10～60℃以杀死乳酸菌。
11.根据权利要求10所述的方法，其中采用热交换器间接加热所述发酵液时，所述发酵液以1～200l/min的流速流入热交换器中。
12.根据权利要求9所述的方法，其中乳酸菌的发酵包括：加入糖类、酵母提取物、大豆蛋白胨和离子成分后，对乳酸菌进行发酵。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述含热灭活乳酸菌的溶液和热灭活发酵滤液的冷冻干燥包括：
在-60～-40℃快速冷冻所述含热灭活死乳酸菌的溶液和热灭活发酵滤液；和
在20～60℃干燥所述含热灭活死乳酸菌的溶液和热灭活发酵滤液24～96小时。
14.一种制备包含热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液的抗菌物质的方法，所述方法包括以下步骤：
将乳酸菌发酵以形成发酵液；
将所述发酵液分离成含乳酸菌的溶液和发酵滤液；
将含乳酸菌的溶液热灭活以形成含热灭活死乳酸菌的溶液；
将发酵滤液热灭活以形成热灭活发酵滤液；
将含热灭活死乳酸菌的溶液进行冷冻干燥以形成热灭活死乳酸菌冻干物；
将热灭活发酵滤液进行流化床干燥以形成干燥的热灭活发酵滤液；和
将热灭活死乳酸菌冻干物和干燥的热灭活发酵滤液进行混合。
15.包含权利要求1所述抗菌物质的抗菌药物组合物。
16.包含权利要求1所述抗菌物质的抗菌食品组合物。
17.包含权利要求1所述抗菌物质的抗菌饲料组合物。
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