CN102719399A - 自体特异性t细胞的体外扩增方法及所制备的t细胞体系、体系的药物应用和组分监测方法 - Google Patents
自体特异性t细胞的体外扩增方法及所制备的t细胞体系、体系的药物应用和组分监测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102719399A CN102719399A CN201210130553XA CN201210130553A CN102719399A CN 102719399 A CN102719399 A CN 102719399A CN 201210130553X A CN201210130553X A CN 201210130553XA CN 201210130553 A CN201210130553 A CN 201210130553A CN 102719399 A CN102719399 A CN 102719399A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- tag
- supf
- cells
- tumour
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 146
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 110
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 92
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims abstract description 25
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 53
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 claims description 41
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 30
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 claims description 26
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 claims description 26
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 21
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 20
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 20
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 claims description 19
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 13
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 10
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 9
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 9
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 claims description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 7
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 7
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 7
- 101100545272 Caenorhabditis elegans zif-1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 102100024342 Contactin-2 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 101000909516 Homo sapiens Contactin-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 6
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 6
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 101150107439 CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 claims description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 claims description 2
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 9
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 241000768494 Polymorphum Species 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N ketoprofen Chemical compound OC(=O)C(C)C1=CC=CC(C(=O)C=2C=CC=CC=2)=C1 DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种自体特异性T细胞的体外扩增方法及采用该方法所制备的T细胞体系、该细胞体系在药物中的应用以及该细胞体系的组分监测方法，所述体外扩增方法包括如下步骤：（1）从患者的外周血中分离外周血单个核细胞；（2）根据需要加入相应的T细胞刺激因子，加入或不加入相应的细胞生长因子，在相应的培养基中对步骤（1）分离出的外周血单个核细胞进行体外培养来扩增T细胞，采用该方法可以在GMP的环境下根据临床的不同需要制备出不同功能性的多克隆免疫活性细胞，用于患者的免疫系统重建和免疫治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种自体特异性T细胞的体外扩增方法，还涉及采用该方法扩增后得到的自体特异性T细胞体系、该细胞体系在药物制备中的应用及对该细胞体系的组分监测方法。
背景技术
肿瘤的治疗一直采用三种传统治疗方法，即放疗、化疗及手术治疗。传统的手术治疗只能解决局部问题，放疗及化疗在杀伤癌细胞的同时还会使人体正常组织和细胞受到损伤，尤其是对主导细胞免疫的T细胞的免疫功能影响极大，易形成二次肿瘤。因此，放疗、化疗及手术三大传统治疗方式一直存在着不彻底、易转移、副作用大等弊端。
近年来，一个新的肿瘤自体细胞免疫治疗方法（也称肿瘤生物治疗）已成为现代肿瘤治疗的第四种模式。包括CIK（Cytokine Induced Killer,细胞因子诱导的杀伤细胞）细胞免疫疗法、LAK细胞（Lymphokine Activated Killer Cells,淋巴因子激活的杀伤细胞）免疫疗法、TIL细胞 (Tumor Infiltrating Lymphocyte,肿瘤浸润淋巴细胞)免疫疗法和DC细胞（树突状细胞）免疫疗法等。
其中， CIK细胞是用CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(又称CD3AK细胞)，是LAK和TIL之后出现的一种较新型的抗肿瘤效应细胞，目前在国内应用较多。CIK细胞具有体外扩增能力强和一定的抗瘤能力等特点，克服了LAK和TIL细胞在肿瘤治疗中的一些不足，但是CIK疗法的主要局限性是此法细胞体外激活具有广谱性，缺乏对某些肿瘤细胞特异的杀伤作用。
总之，目前，肿瘤自体细胞免疫疗法遇到的瓶颈主要在以下两个方面：
1. 自体细胞进行体外细胞培养的体系不够完善，存在很多不可控制的因素，从而导致细胞扩增数量不足或扩增失败，更关键的是培养后的细胞缺乏杀伤肿瘤的特异性；
2. 缺乏体外细胞培养制备的质控监测与评价方法，回输患者体内后其疗效又不能被准确和及时的评价，阻碍了这项新技术规范化与标准化的实施。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种自体特异性T细胞的体外扩增方法及培养得到的产品（自体特异性T细胞体系）、该产品在制药中的应用和对该产品组分的监测方法，采用该体外扩增方法可以在GMP的环境下根据临床的不同需要制备出不同功能性的多克隆免疫活性细胞，可用于肿瘤、病毒感染或放、化疗引起的免疫损伤后的免疫重建, 也可制备出具有杀伤病毒或肿瘤作用的高度特异性的克隆化T细胞，称为CTC（The Cloned T cells, CTC），用于抗肿瘤及抗病毒的细胞免疫治疗，相应的组分监测方法可用于所制备的自体特异性T细胞体系或药物的质量监控与评价，以保证该体外扩增方法及其制备的自体特异性T细胞体系的规范化与标准化，并可以对临床疗效进行有效的评价。
本发明采用的主要技术方案是：
一种自体特异性T细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：
步骤（1），从患者的外周血中分离外周血单个核细胞（即PBMCs）；
步骤（2），根据需要加入相应的T细胞刺激因子，加入或不加入相应的细胞生长因子，在相应的培养基中对步骤（1）分离出的外周血单个核细胞进行体外培养来扩增T细胞。
在所述步骤（2）中，还可以生产也可以不生产DC细胞疫苗，所述生产DC细胞疫苗的方式为：在所述外周血单个核细胞体外培养时加入相应的DC细胞成熟因子以获取成熟的DC细胞，在获取的成熟的DC细胞中加入相应的肿瘤或病毒特异性抗原进行抗原刺激以生产DC细胞疫苗。
所述促进DC成熟因子优选在体外培养之前加入。
优选地，根据特异性要求及培养需要，所述T细胞刺激因子可以包括下列中的任意一种、任意几种或全部细胞因子：SUPF-1、SUPF-2、SUPF-3、SUPF-4、SUPF-5、SUPF-6、SUPF-7、SUPF-8、SUPF-9、SUPF-10和SUPF-31，当加入多种T细胞刺激因子时，各种T细胞刺激因子的比例可以依特异性要求确定，可以根据实验验证、理论推导或者在实验指导下确定在不同情况下所要加入的T细胞刺激因子种类以及所加入的T细胞刺激因子的加入量以及各种T细胞刺激因子的比例关系。
所述培养基通常可以采用或者包括无血清培养基。
所述无血清培养基优选采用或者包括培养基MEDO-A。
优选地，所述步骤（2）包括：
步骤（2.1），用培养基MEDO-A将所述步骤（1）分离得到的外周血单个核细胞制成细胞密度为1x106/ml-2x106/ml的细胞悬液；
步骤（2.2），所述步骤（2.1）之后，加入SUPF-31、SUPF-5、SUPF-6和SUPF-7进行供培养，培养时间一般为48-72小时左右，之后，去除或不去除T细胞刺激因子的附加物，所述加入SUPF-31、SUPF-5、SUPF-6和SUPF-7的方式优选为先分别制成SUPF–31和SUPF-5的混合物以及SUPF-6和SUPF-7的混合物，然后再分别添加；
步骤（2.3），所述步骤（2.2）之后再加入SUPF-3和SUPF-10在培养基MEDO-A里继续培养，所述加入SUPF-3和SUPF-10的方式优选为二者分别添加。
通常，所述步骤（2.3）之后还包括：步骤（2.4），收获T细胞。
可以根据细胞数量确定培养时间，例如，通常，所述收获T细胞的条件可以为下列任一条件：所述步骤（2.3）的培养时间达到10-12天(用于免疫重建时)或10-14天（用于免疫治疗时）；或者，T细胞数量达到培养要求；或者，全程体外培养时间达到10-12天(用于免疫重建时)或10-14天（用于免疫治疗时）。
优选地，所述步骤（1）中的外周血可以用EDTA或肝素抗凝，可以采用密度梯度法分离外周血单个核细胞。
优选为地，对于上述任意一种所述的自体特异性T细胞的体外扩增方法，所述步骤（2）中，还通过添加肿瘤抗原进行刺激以便增加扩增后的T细胞中具有抗肿瘤能力和免疫活性的CTC细胞前体。
所述进行肿瘤抗原刺激的方式可以为：添加肿瘤或病毒特异性抗原直接刺激，和/或，由自体抗原递呈细胞携带所述特异性抗原刺激。
优选为，所述肿瘤抗原包括下列中的任意一种、任意几种或全部：TAG-1、TAG-2、TAG-3、TAG-4、TAG-5、TAG-6、TAG-7、TAG-9、TAG-10、TAG-11、TAG-12、TAG-13、TAG-14、TAG-15、TAG-16、TAG-17、TAG-18、TAG19和TAG-20。
可以采用下列方式对所述步骤（2）进行改进，将所述步骤（2.1）制得的细胞悬液首先进行贴壁培养，再将贴壁培养后的细胞悬液和贴壁细胞分别单独进行培养，然后，将细胞悬液单独培养所得的细胞悬液和贴壁细胞单独培养所得的贴壁细胞混合，混合后加SUPF-6和SUPF-7，之后执行所述步骤（2.3）。
所述贴壁培养的条件可以为37℃ 5% CO2 贴壁培养2小时-3小时。
所述贴壁培养后的贴壁细胞的单独培养可以按如下步骤进行：
（i）加入TAG-1或TAG-2中的任意一种以及TAG-3、TAG-4、TAG-5、TAG-6、TAG-7、TAG-9、TAG-10、TAG-11、TAG-12、TAG-13、TAG-14、TAG-15、TAG-16、TAG-17、TAG-18、TAG19和TAG-20，所述TAG19和TAG-20混合后加入，在培养基MEDO-A里培养，培养时间可以为48小时左右；
（ii），步骤（i）之后再加入TAG-4和TAG-5继续培养，培养时间可以为24小时左右，例如，可以培养至次日；
（iii），步骤（ii）之后再加入相应的肿瘤或病毒抗原多肽共培养，培养时间可以为3小时。
所述贴壁培养后的细胞悬液的单独培养可以按所述步骤（2.2）进行。
一种自体特异性T细胞体系，其中的全部或部分T细胞为采用上述任意一种自体特异性T细胞的体外扩增方法（或权利要求1-15中的任意一方法）经体外扩增制得的。
优选地，其中的T细胞总量（CD3+ T细胞）高于98%。
当所述体系用于免疫重建时，其中的CD4 T细胞亚群（CD3+ CD4+ T细胞）含量高于60%；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD4 T细胞亚群（CD3+ CD4+ T细胞）含量不低于15%。
当所述体系用于免疫重建时，其中的CD8 T细胞亚群（CD3+ CD8+ T细胞）含量不高于40%且不低于20%；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD8 T细胞亚群（CD3+ CD8+ T细胞）含量高于80%，优选为高于90%。
其中T细胞含量高于90%，优选为高于95%。所述活化的T细胞亚群通常应包括CD4+ CD38+ HLADR+和CD8+ CD38+ HLADR+两个T细胞亚群，优选地，CD4+ CD38+ HLADR+和CD8+ CD38+ HLADR+各自的含量均高于45%。
其中的抗肿瘤活性T细胞亚群（CD8+ CD45RO+CD62L+ ，Tcm）含量高于70%，优选为高于90%。
所述抗肿瘤活性T细胞亚群（CD8+ CD45RO+CD62L+ ，Tcm）不超过5%不表达CD62L，优选为不超过1%不表达CD62L，更优选为不超过0.1%不表达CD62L。
其中的记忆T细胞亚群含量高于95%。所述记忆T细胞亚群通常应为CD8+ CD45RO+，优选地，CD8+ CD45RO+的含量高于95%。
优选为，上述任一种自体特异性T细胞体系，其中的调节性T细胞亚群（CD4+ CD25+FoxP3+ ，Treg）含量低于5%。
一种自体特异性T细胞体系在制备用于免疫系统重建和免疫治疗的药物中的应用，所述自体特异性T细胞体系由上述任意一种自体特异性T细胞体系（或由权利要求16-28中任意一项权利要求所述的自体特异性T细胞体系）构成。
通常，所述免疫系统重建主要指对于因肿瘤、病毒感染或放疗、化疗引起的免疫系统损伤后的免疫系统重建，所述免疫治疗主要指对于肿瘤、病毒感染的细胞免疫生物治疗。
上述任一种所述自体特异性T细胞体系在制备药物中的应用，其药物中的有效成分可以全部为所述自体特异性T细胞体系（即该体系的独立应用），也可以部分为所述自体特异性T细胞体系（即该体系与其它成分的混合应用）。
一种自体特异性T细胞体系的组分监测方法，可以用于上述任一种自体特异性T细胞体系（或权利要求16-31中任一项权利要求所述的体系）的组分监测，包括细胞表型分析和/或TCR克隆化分析。
可以采用流式细胞分析术进行所述的细胞表型分析。例如，可以首先采用荧光标记单克隆抗体与所述体系中的细胞进行组合，然后进行细胞表型的定量分析。
所述单克隆抗体可以包括下列中的任意一种、任意几种或全部：抗CD3+，CD4+，CD8+，CD45RA+，CD45RO+，CD38+，CD62L+，HLADR+，CD25+，FoxP3+，CD28+ 和CD57+。
所述细胞表型分析的具体监测项目包括：T细胞总量（CD3+ T细胞）、CD4 T细胞亚群（CD3+ CD4+ T细胞）、CD8 T细胞亚群（CD3+ CD8+ T细胞）、活化的T细胞亚群（CD4+ CD38+ HLADR+和/或CD8+ CD38+ HLADR+）、抗肿瘤活性T细胞亚群（CD8+ CD45RO+CD62L+ ，Tcm）、调节性T细胞亚群（CD4+ CD25+FoxP3+ ，Treg, 和/或CD8+CD28-/CD8+CD57+）、记忆T细胞亚群（CD4+CD45RO+和/或CD8+ CD45RO+）。
所述TCR克隆化分析可以包括对T细胞受体的22个Vβ基因家族进行可视化和/或定量化分析。
所述TCR克隆化分析的具体方法可以为：通过测定TCR CDR3基因区的克隆化出现的频率、长度以及分布状态定量化的来反映抗原特定T细胞的抗病毒或肿瘤的功能状态。
本发明的有益效果是：
本发明提供了自体细胞进行体外培养的标准方法，细胞体外扩增效果稳定，成功率高，可以根据临床的各种需求制备相应功能的免疫活性细胞，如对于因肿瘤、病毒感染或放疗、化疗引起免疫损伤的患者，可以通过体外培养使其紊乱的T细胞体系恢复常态，并能达到百倍的多克隆化的扩增，回输至患者体内后可以用于患者的免疫系统重建，另外，也可以培养出具有杀伤病毒和肿瘤作用的高度特异性的克隆化T细胞，可以用于抗肿瘤和抗病毒的细胞免疫治疗，尤其是可以在培养体系中产生大量的具有抗肿瘤能力和免疫活性的CTC细胞前体，使得克隆化的T细胞在患者体内的存留更加持久，有利于提高疗效；
经实验验证，对于同源的平行样本，采用本发明的方法培养后，CD3+CD8+ T细胞表达高达92.46%，远高于现有技术的49.25%，且几乎全部为高表达的CD8+ T细胞，尤其是几乎全部表达CD3CD8细胞，与现有技术的方法培养后尚有很多低表达的CD8+ T细胞和不表达的CD3CD8细胞相比有益效果明显，更为重要的是，采用本发明的方法培养后的样本中，表型为CD8CD45ROCD62L具有高度肿瘤杀伤作用的中央型记忆细胞（Tcm）高达92.85%，且其中仅仅0.09%不表达CD62L，而用现有技术的方法培养后的样本中，其Tcm只占39.64%，且其中有47.77%的记忆细胞（CD45RO）不表达CD62L；
本发明的组分监测方法可以对培养后的细胞体系进行有效的分析和评价，不仅可以在应用前、后分别进行分析和评价，尤其是可以全程追踪T细胞的克隆化变化，可以准确反应细胞体系中的有效成分含量，为评价细胞体系的疗效及患者的恢复状况提供了有效的监测，有助于治疗方案的调整，有助于达到最佳的疗效。
附图说明
图1是本发明的抗肿瘤特异性T细胞的体外扩增方法、抗肿瘤特异性T细胞体系的应用及抗肿瘤特异性T细胞杀伤肿瘤的原理图；
图2是本发明的自体特异性T细胞的体外扩增方法的一个实施例的流程示意图（制备后的自体特异性T细胞体系可以用于免疫重建）；
图3是本发明的自体特异性T细胞的体外扩增方法的另一个实施例的流程示意图（制备后的自体特异性T细胞体系可以用于细胞免疫治疗）；
图4是采用本发明的自体特异性T细胞的体外扩增方法与现有技术对同一份样本进行培养，并采用本发明的监测方法对得到的体系进行细胞表型分析所得到的结果对照示意图（主要示出了具有杀伤病毒和肿瘤的CD8+ T细胞亚群，其中，A1、A2为采用现有技术和本发明的方法分别培养之后得到的T细胞体系中的CD3+ CD8+ T细胞亚群含量分析、B1、B2为采用现有技术和本发明的方法分别培养之后得到的T细胞体系中的CD8+ CD45RO+ CD62L+ T细胞亚群含量分析）；
图5是本发明的T细胞受体（TCR）克隆化分析的流程示意图；
图6是采用本发明的监测方法对本发明的自体特异性T细胞在培养前后的样本分析结果示意图（A为对培养前的PCMCs样本的分析，B为对来自A的同一份样本采用图3示出的步骤进行培养后得到的自体特异性T细胞体系的分析）。
具体实施方式
参见图2示出的实施例，首先，采集患者50mlEDTA抗凝血，然后，采用密度梯度法分离外周血单个核细胞（PBMCs），根据需要留取一定量的外周血单个核细胞，以便进行细胞表型流式分析及TCR多态性分析，再将余下的外周血单个核细胞用培养基MEDO-A准备细胞悬液40ml，然后加刺激因子SUPF-31和SUPF-5，SUPF-6， SUPF-7之后在培养基MEDO-A里共培养48-72小时，再加入SUPF-3和SUPF-10刺激因子，在培养基MEDO-A继续培养，10-14天后收获细胞（具体培养时间可以根据细胞数量确定），之后进行细胞表型流式分析及TCR克隆化分析。
为了更好的解释本发明，以便更好的理解，下面结合附图通过具体实施方式对本发明进行更详细的描述。
参见图1至图6，本发明提供了一种自体特异性T细胞的体外扩增方法和由此方法制得的自体特异性T细胞体系，还提供了所述自体特异性T细胞体系在免疫重建和免疫治疗药物中的应用以及用于监测该自体特异性T细胞体系的品质（即其中的组分）的监测方法。
所述自体特异性T细胞的体外扩增方法包括如下步骤：
（1）从患者的外周血中分离外周血单个核细胞（即PBMCs）；
（2）根据需要加入相应的T细胞刺激因子，加入或不加入相应的细胞生长因子，在相应的培养基中对步骤（1）分离出的外周血单个核细胞进行体外培养来扩增T细胞，还加入或不加入促进DC成熟因子来产生成熟的DC细胞，所述促进DC成熟因子优选在体外培养之前加入，加入相应的细胞生长因子可以增加T细胞数量和T细胞受体多态性以用于T细胞免疫重建。
优选为，所述T细胞刺激因子包括下列中的任一种、任几种或全部：SUPF-1、SUPF-2、SUPF-3、SUPF-4、SUPF-5、SUPF-6、SUPF-7、SUPF-8、SUPF-9、SUPF-10、SUPF-31。所选用的T细胞刺激因子的种类可以根据患者的肿瘤状况进行选择，优选为至少包括可以在培养后的T细胞体系中产生出对患者所患的肿瘤具有特异性杀伤作用的T细胞的T细胞刺激因子，当选用一种以上的T细胞刺激因子时，各种T细胞刺激因子可以按照任意比例混合，选用的原则可以为：依据经验，根据患者所患的肿瘤通常会扩散或转移而形成的新肿瘤选用T细胞刺激因子，或提高能够生成对该新肿瘤具有特异性杀伤作用的T细胞的T细胞刺激因子的占比。
其中，SUPF-1、SUPF-2、SUPF-3、SUPF-4、SUPF-5、SUPF-6、SUPF-7、SUPF-8、SUPF-9、SUPF-10和SUPF-31是相应的细胞因子，如IL2,IL4,IL12,GMC-SF等。
所述培养基包括无血清培养基，优选为全部为无血清培养基。
所述无血清培养基包括培养基MEDO-A，优选为全部为培养基MEDO-A。
优选为，步骤（2）包括：
（2.1），用培养基MEDO-A将步骤（1）分离得到的外周血单个核细胞制成细胞密度为1x106/ml-2x106/ml的细胞悬液；
（2.2），步骤（2.1）之后加入SUPF-31、SUPF-5、SUPF-6和SUPF-7后共培养48-72小时，之后，去除或不去除T细胞刺激因子的附加物，优选为首先分别制成SUPF–31和SUPF-5的混合物以及SUPF-6和SUPF-7的混合物，之后再分别添加；
（2.3），步骤（2.2）之后再加入SUPF-3和SUPF-10在培养基MEDO-A里继续培养，优选为二者分别添加。
步骤（2.3）之后还可以包括：（2.4），收获T细胞。
收获T细胞的条件可以为：步骤（2.3）的培养时间达到10-12天或10-14天；或者，T细胞数量达到培养要求；或者，全程培养时间达到10-12天或10-14天。
步骤（1）中的外周血可以用EDTA或肝素抗凝，可以采用密度梯度法分离外周血单个核细胞。
参见图2示出的实施例，首先，采集患者50mlEDTA抗凝血，然后，采用密度梯度法分离外周血单个核细胞（PBMCs），根据需要留取一定量的外周血单个核细胞，以便进行细胞表型流式分析及TCR克隆化分析，再在余下的外周血单个核细胞中加刺激因子SUPF-31和SUPF-5、SUPF-6和SUPF7，之后在培养基MEDO-A里共培养72小时，培养后去除刺激因子的附加物，之后再加入SUPF-3和SUPF-10刺激因子，在培养基MEDO-A继续培养，10-12天后收获细胞（具体培养时间可以根据细胞数量确定），之后进行细胞表型流式分析及TCR克隆化分析，细胞表型流式分析结果见下表。
优选为，上述任意一种所述的自体特异性T细胞的体外扩增方法，步骤（2）中还包括通过添加肿瘤抗原进行刺激以便增加扩增后的T细胞中具有抗肿瘤能力的中央型记忆T细胞和/或回输至体内后产生具有杀伤肿瘤能力的克隆化T细胞的CTC细胞前体（即具有抗肿瘤能力和免疫活性的CTC细胞前体）的步骤，所述肿瘤抗原的刺激包括：采用肿瘤或病毒特异性抗原直接刺激，和/或，由自体抗原递呈细胞携带所述特异性抗原刺激。
添加的所述肿瘤抗原包括或不包括能使成熟的DC细胞生成DC细胞疫苗的特异性抗原。
优选为，所述肿瘤抗原包括下列中的任一种、任几种或全部：TAG-1、TAG-2、TAG-3、TAG-4、TAG-5、TAG-6、TAG-7、TAG-9、TAG-10、TAG-11、TAG-12、TAG-13、TAG-14、TAG-15、TAG-16、TAG-17、TAG-18、TAG19和TAG-20。
增加所述CTC细胞前体的步骤的具体内容可以为：将步骤（2.1）制得的细胞悬液首先进行贴壁培养，再将贴壁培养后的细胞悬液和贴壁细胞分别单独进行培养，然后，将细胞悬液单独培养所得的细胞悬液和贴壁细胞单独培养所得的贴壁细胞混合，混合后加SUPF-6和SUPF-7，之后执行步骤（2.3）。通常，优选为贴壁细胞更有利于获得成熟的DC细胞，可以用于培养DC细胞疫苗，而细胞悬液中的非贴壁细胞更有利于扩增T细胞，可以用于T细胞扩增。
贴壁培养的条件可以为37℃ 5% CO2 贴壁培养2小时~3小时。
贴壁培养所得的细胞悬液可以按步骤（2.2）进行培养。
贴壁培养后的贴壁细胞可以按如下步骤培养：
（i），贴壁细胞加入多种肿瘤抗原在培养基MEDO-A里培养，所述多种肿瘤抗原包括TAG-1或TAG-2中的一种、TAG-3、TAG-4、TAG-5、TAG-6、TAG-7、TAG-9、TAG-10、TAG-11、TAG-12、TAG-13、TAG-14、TAG-15、TAG-16、TAG-17、TAG-18以及按任意比例混合的TAG19和TAG-20，例如贴壁细胞加SUPF-1、SUPF-2和SUPF-3在培养基MEDO-A里培养，培养时间可以为48小时；
（ii），步骤（i）之后再加入SUPF-4和SUPF-5继续培养，培养时间可以为24小时，例如，可以培养至次日；
（iii），步骤（ii）之后再加入相应的肿瘤或病毒抗原多肽共培养，所述相应的肿瘤或病毒抗原多肽可以为所述多种肿瘤抗原中的一种，培养时间可以为3小时。
参见图3示出的实施例，首先，采集患者50mlEDTA抗凝血，然后，采用密度梯度法分离外周血单个核细胞（PBMCs），根据需要留取一定量的外周血单个核细胞，以便进行细胞表型流式分析及TCR克隆化分析，再将余下的外周血单个核细胞用培养基MEDO-A准备细胞悬液40ml，然后37℃ 5% CO2 贴壁培养3小时，培养后分离贴壁细胞和悬浮细胞并分别培养，即，在分离后的悬浮细胞中加刺激因子SUPF-31和SUPF-5，之后在培养基MEDO-A里共培养72小时，培养后去除刺激因子的附加物，同时将分离后的贴壁细胞加SUPF-1、SUPF-2和SUPF-3，培养48小时后加SUPF-4和SUPF-5，次日加肿瘤或病毒抗原多肽共培养3小时，将分别培养之后的贴壁细胞和悬浮细胞混合，再加入SUPF-6和SUPF7，再加入SUPF-3和SUPF-10刺激因子，在培养基MEDO-A继续培养，10-14天后收获细胞（具体培养时间可以根据细胞数量确定），之后进行细胞表型流式分析及TCR克隆化分析，细胞表型流式分析的部分结果见图4，TCR克隆化分析的部分结果见图6。
由图4可知，采用现有技术的方法培养之后的样本中，CD3+CD8+ T细胞表达49.25%，且有很多低表达的CD8+ T细胞和不表达的CD3CD8细胞（参见图4A1），相比较，采用本发明的方法培养之后的样本中，CD3+CD8+ T细胞表达92.46%，尤其是几乎全部为高表达的CD8+ T细胞，并且几乎全部表达CD3CD8细胞（参见图4A2）。更为重要的是，具有高度肿瘤杀伤作用的中央型记忆细胞（Tcm）其表型为CD8CD45ROCD62L，用现有技术的方法培养后的样本中，其Tcm只占39.64%，且有47.77%的记忆细胞（CD45RO）不表达CD62L（参见图4B1），而采用本发明的方法培养后的样本中，其Tcm可高达92.85%，而仅仅0.09%的记忆细胞不表达CD62L。
由图6可知，本发明的方法可以在体外培养出CTC克隆化前体，这些克隆化前体在回输至患者体内后可以产生大量的克隆化T细胞（CTC），这些细胞是杀伤肿瘤或病毒特异的T细胞。
本发明的方法可以在体外培养出具有多态性的T细胞。这些多克隆T细胞在回输至化疗病人体内后可以达到免疫重建的目的。
所述自体特异性T细胞体系，其中的全部或部分T细胞为采用上述任一种自体特异性T细胞的体外扩增方法（或权利要求1-15中的任一方法）经体外扩增制得的。
优选为，其中的T细胞总量（CD3+ T细胞）高于98%。
当所述体系用于免疫重建时，其中的CD4 T细胞亚群（CD3+ CD4+ T细胞）含量高于60%；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD4 T细胞亚群（CD3+ CD4+ T细胞）含量不低于15%。
当所述体系用于免疫重建时，其中的CD8 T细胞亚群（CD3+ CD8+ T细胞）含量不高于40%且不低于20%；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD8 T细胞亚群（CD3+ CD8+ T细胞）含量高于80%，优选为高于90%。
其中活化的T细胞亚群含量高于90%，优选为高于95%。优选为，所述活化的T细胞亚群包括CD4+ CD38+ HLADR+和CD8+ CD38+ HLADR+。优选为，CD4+ CD38+ HLADR+和CD8+ CD38+ HLADR+各自的含量均高于45%。
其中的抗肿瘤活性T细胞亚群（CD8+ CD45RO+CD62L+ ，Tcm）含量高于70%，优选为高于90%。所述抗肿瘤活性T细胞亚群（CD8+ CD45RO+CD62L+ ，Tcm）不超过5%不表达CD62L，优选为不超过1%不表达CD62L，更优选为不超过0.1%不表达CD62L。
其中的记忆T细胞亚群含量高于95%。优选为，所述记忆T细胞亚群为CD8+ CD45RO+。优选为，CD8+ CD45RO+的含量高于95%。
优选为，上述任一种自体特异性T细胞体系，其中的调节性T细胞亚群（CD4+ CD25+FoxP3+ ，Treg）含量低于5%。。
所述自体特异性T细胞体系在制备用于免疫系统重建和免疫治疗的药物中的应用，所述自体特异性T细胞体系中的全部或部分来自于上述任一种自体特异性T细胞体系（或来自于权利要求16-28中任一项权利要求所述的体系）。
优选为，所述免疫系统重建主要指对于因肿瘤、病毒感染或放疗、化疗引起的免疫系统损伤后的免疫系统重建，所述免疫治疗主要指对于肿瘤、病毒感染的细胞免疫生物治疗。成功治疗的病例。病例1.患者赵某，女性，38岁，乳腺癌，经两个疗程化疗，其T淋巴细胞亚群CD4和CD8的T细胞受体多态性均发生改变，经11天的体外培养，95%发生改变的T细胞亚群恢复了多态性。病例2.患者王某某，男性，74岁，小细胞肺癌。治疗前，肿瘤为5 x 4 cm,经3个疗程的免疫治疗后其肿瘤减小为1x2cm。病人的其它状态也都相应的得到改善。
上述任一种所述自体特异性T细胞体系在制药中的应用，可以全部为所述自体特异性T细胞体系（即单独使用），也可以部分为所述自体特异性T细胞体系（即不单独使用或称混合使用）。
所述自体特异性T细胞体系的监测方法，可以用于上述任一种自体特异性T细胞体系（或权利要求16-31中任一项权利要求所述的体系）中相应成分含量的监测，包括细胞表型分析和/或TCR克隆化分析。
包括在使用前和使用后对所述体系中相应成分含量的监测。所述使用前指培养完成后输入人体之前，所述使用后指输入人体之后，对采集于患者的外周血中的相应成分含量进行监测。
可以采用流式细胞分析术进行细胞表型分析。
首先采用荧光标记单克隆抗体与所述体系中的细胞进行组合，然后进行细胞表型的定量分析。
所述单克隆抗体包括下列中的任一种、任几种或全部：抗CD3+，CD4+，CD8+，CD45RA+，CD45RO+，CD38+，CD62L+，HLADR+，CD25+，FoxP3+ ，CD28+ 和CD57+。所述单克隆抗体指的是单抗及一些附加物，如抗CD3+指的是抗CD3单抗及一些附加物，抗CD28+指的是抗CD28单抗及一些附加物。
所述细胞表型分析的具体监测项目包括：T细胞总量（CD3+ T细胞）、CD4 T细胞亚群（CD3+ CD4+ T细胞）、CD8 T细胞亚群（CD3+ CD8+ T细胞）、活化的T细胞亚群（CD4+ CD38+ HLADR+和/或CD8+ CD38+ HLADR+）、抗肿瘤活性T细胞亚群（CD8+ CD45RO+CD62L+ ，Tcm）、调节性T细胞亚群（CD4+ CD25+FoxP3+ ，Treg, 和/或CD8+CD28-/CD8+CD57+）、记忆T细胞亚群（CD4+CD45RO+和/或CD8+ CD45RO+）。
优选为，上述任一种自体特异性T细胞体系的监测方法，所述TCR克隆化分析包括对T细胞受体的22个Vβ基因家族进行可视化和/或定量化分析。
所述TCR克隆化分析的具体方法可以为：通过测定TCR CDR3基因区的克隆化出现的频率、长度以及分布状态定量化的来反映抗原特定T细胞的抗病毒或肿瘤的功能状态。由于每一个T细胞都有一个抗原受体，这个受体的CDR3区（由V-D-J组成）是与抗原表位结合的主要位点，在识别抗原过程中基因发生重排、编辑、修正或优势扩增，形成具有特定CDR3基因区的不同的T淋巴细胞克隆，表示这个抗原引起了特异的T细胞免疫应答，因此测定特定TCR CDR3基因区的克隆化出现的频率、长度以及分布状态（多态性）可以反映抗原特定 T淋巴细胞的抗病毒或肿瘤的功能状态。
为了保证T细胞受体克隆化分析的准确性、可靠性及可重复性，可以选用任何适宜的方法，如可以采用能测到百万分之一克隆的方法。例如，T细胞受体定性和定量化分析可以参照专利US007375211的记载进行。此项专利技术是专门为生物免疫治疗包括过继性T细胞免疫治疗、治疗性肿瘤疫苗的临床疗效评价而设计的。该专利包括技术、方法及用于统计学定量T细胞克隆化和多态性的分析软件。应用该技术可检测到67个V（Variable）区基因，2个D（Diversity）区基因，13个J（Joining）区基因和2个C（Constant）区基因不同排列所组成的24个T细胞受体Vβ 基因家族。其中应用统计学定量软件不仅可以定量克隆化的程度，同时也可以计算这些克隆化程度与疗效之间的关系。
图5是T细胞受体克隆化检测流程。应用预先包被各种试剂的PCR反应板使其条件一致，以保证其测定结果有可比性。具体检测方法是：提取细胞中的总RNA，然后将其加入到预先包被有TCR受体的特异引物及各种RT及PCR反应的24孔PCR反应板，再加入PCR反应缓冲液及酶后，在PCR扩增仪上进行扩增，扩增后的PCR产物可进行高分辨率凝胶分离和扫描定量。该方法采用单克隆细胞株作为阳性对照，应用高分辨率胶使得3到5个碱基不同即可分离，多克隆、寡克隆或单克隆都能够清楚地观察到（参见图5）。
本发明中涉及几种物质混合使用的技术内容时，除非有特别说明，否则均指的是可以按照任意比例进行混合，并且，对于本领域技术人员而言，其混合后的每种物质各自的效果均可以依据所选用的混合物质的种类推导出来，故在本发明中不再赘述。
Claims (38)
1.一种自体特异性T细胞的体外扩增方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤（1），从患者的外周血中分离外周血单个核细胞；
步骤（2），根据需要加入相应的T细胞刺激因子，加入或不加入相应的细胞生长因子，在相应的培养基中对步骤（1）分离出的外周血单个核细胞进行体外培养来扩增T细胞，生产或不生产DC细胞疫苗，所述生产DC细胞疫苗的方式为：在所述外周血单个核细胞体外培养时加入相应的DC细胞成熟因子以获取成熟的DC细胞，在获取的成熟的DC细胞中加入相应的肿瘤或病毒特异性抗原进行抗原刺激以生产DC细胞疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述T细胞刺激因子包括下列中的任一种、任意几种或全部SUPF-1、SUPF-2、SUPF-3、SUPF-4、SUPF-5、SUPF-6、SUPF-7、SUPF-8、SUPF-9、SUPF-10和SUPF-31。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述培养基包括无血清培养基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述无血清培养基包括培养基MEDO-A。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤（2）包括：
步骤（2.1），用培养基MEDO-A将所述步骤（1）分离得到的外周血单个核细胞制成细胞密度为1x106/ml-2x106/ml的细胞悬液；
步骤（2.2），所述步骤（2.1）之后加入SUPF–31、SUPF-5、SUPF-6和SUPF-7后共培养48-72小时，之后，去除或不去除T细胞刺激因子的附加物；
步骤（2.3），所述步骤（2.2）之后再加入SUPF-3和SUPF-10在培养基MEDO-A里继续培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤（2.3）之后还包括：
步骤（2.4），收获T细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于收获T细胞的条件为下列任一条件：
T细胞数量达到培养要求；
步骤（2.3）的培养时间达到10-12天(用于免疫重建时)或10-14天（用于免疫治疗时）;
全程体外培养时间达到10-12天(用于免疫重建时)或或10-14天（用于免疫治疗时）。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中的外周血用EDTA或肝素抗凝，采用密度梯度法分离外周血单个核细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中，还通过添加肿瘤抗原进行刺激以便增加扩增后的T细胞中具有抗肿瘤能力和免疫活性的CTC细胞前体，所述添加肿瘤抗原进行刺激的方式为：采用肿瘤或病毒特异性抗原直接刺激，和/或，由自体抗原递呈细胞携带所述特异性抗原刺激。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述肿瘤抗原包括下列中的任意一种、任意几种或全部：TAG-1、TAG-2、TAG-3、TAG-4、TAG-5、TAG-6、TAG-7、TAG-9、TAG-10、TAG-11、TAG-12、TAG-13、TAG-14、TAG-15、TAG-16、TAG-17、TAG-18、TAG19和TAG-20。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于将步骤（2.1）制得的细胞悬液首先进行贴壁培养，再将贴壁培养后的细胞悬液和贴壁细胞分别单独进行培养，然后，将单独培养所得的细胞悬液和贴壁细胞混合，混合后加SUPF-6和SUPF-7，之后执行步骤（2.3）。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述贴壁培养的条件为37℃ 5% CO2 贴壁培养2小时-3小时。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述贴壁培养后的贴壁细胞的单独培养按如下步骤进行：
（i）加入TAG-1或TAG-2中的任意一种以及TAG-3、TAG-4、TAG-5、TAG-6、TAG-7、TAG-9、TAG-10、TAG-11、TAG-12、TAG-13、TAG-14、TAG-15、TAG-16、TAG-17、TAG-18、TAG19和TAG-20，所述TAG19和TAG-20混合后加入，在培养基MEDO-A里培养；
（ii）步骤（i）之后再加入TAG-4和TAG-5继续培养；
（iii），步骤（ii）之后再加入相应的肿瘤或病毒抗原多肽共培养。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述步骤（i）、（ii）、（iii）的培养时间分别为48小时、24小时和3小时。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述贴壁培养后的细胞悬液的单独培养按所述步骤（2.2）进行。
16.一种自体特异性T细胞体系，其特征在于其中的全部或部分为采用权利要求1-15中的任一方法经体外扩增制得的。
17.根据权利要求16所述的体系，其特征在于其中的T细胞总量（CD3+ T细胞）高于98%。
18.根据权利要求16所述的体系，其特征在于当所述体系用于免疫重建时，其中的CD4 T细胞亚群（CD3+ CD4+ T细胞）含量高于60%；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD4 T细胞亚群（CD3+ CD4+ T细胞）含量不低于15%。
19.根据权利要求16所述的体系，其特征在于当所述体系用于免疫重建时，其中的CD8 T细胞亚群（CD3+ CD8+ T细胞）含量不高于40%且不低于20%；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD8 T细胞亚群（CD3+ CD8+ T细胞）含量高于80%，优选为高于90%。
20.根据权利要求16所述的体系，其特征在于其中T细胞含量高于90%，优选为高于95%。
21.根据权利要求20所述的体系，其特征在于所述活化的T细胞亚群包括CD4+ CD38+ HLADR+和CD8+ CD38+ HLADR+两个T细胞亚群。
22.根据权利要求21所述的体系，其特征在于CD4+ CD38+ HLADR+和CD8+ CD38+ HLADR+各自的含量均高于45%。
23.根据权利要求16所述的体系，其特征在于其中的抗肿瘤活性T细胞亚群（CD8+ CD45RO+CD62L+ ，Tcm）含量高于70%，优选为高于90%。
24.根据权利要求23所述的体系，其特征在于所述抗肿瘤活性T细胞亚群（CD8+ CD45RO+CD62L+ ，Tcm）不超过5%不表达CD62L，优选为不超过1%不表达CD62L，更优选为不超过0.1%不表达CD62L。
25.根据权利要求16所述的体系，其特征在于其中的记忆T细胞亚群含量高于95%。
26.根据权利要求25所述的体系，其特征在于所述记忆T细胞亚群为CD8+ CD45RO+。
27.根据权利要求26所述的体系，其特征在于CD8+ CD45RO+的含量高于95%。
28.根据权利要求16-27中任一项权利要求所述的体系，其特征在于其中的调节性T细胞亚群（CD4+ CD25+FoxP3+ ，Treg）含量低于5%。
29.一种自体特异性T细胞体系在制备用于免疫系统重建和免疫治疗的药物中的应用，其特征在于所述自体特异性T细胞体系由权利要求16-28中任意一项权利要求所述的自体特异性T细胞体系构成。
30.根据权利要求29所述的应用，其特征在于所述免疫系统重建主要指对于因肿瘤、病毒感染或放疗、化疗引起的免疫系统损伤后的免疫系统重建，所述免疫治疗主要指对于肿瘤、病毒感染的细胞免疫生物治疗。
31.根据权利要求29或30所述的应用，其特征在于所述自体特异性T细胞体系为独立应用或与其它成分混合应用。
32.一种可用于权利要求16-31中任一项权利要求所述的自体特异性T细胞体系的自体特异性T细胞体系的组分监测方法，其特征在于包括细胞表型分析和TCR克隆化分析。
33.根据权利要求32所述的监测方法，其特征在于采用流式细胞分析术进行所述的细胞表型分析。
34.根据权利要求33所述的监测方法，其特征在于首先采用荧光标记单克隆抗体与所述体系中的细胞进行组合，然后进行细胞表型的定量分析。
35.根据权利要求34所述的监测方法，其特征在于所述单克隆抗体包括下列中的任一种、任几种或全部：抗CD3+，CD4+，CD8+，CD45RA+，CD45RO+，CD38+，CD62L+，HLADR+，CD25+，FoxP3+ ，CD28+ 和CD57+。
36.根据权利要求35所述的监测方法，其特征在于所述细胞表型分析的具体监测项目包括：T细胞总量（CD3+ T细胞）、CD4 T细胞亚群（CD3+ CD4+ T细胞）、CD8 T细胞亚群（CD3+ CD8+ T细胞）、活化的T细胞亚群（CD4+ CD38+ HLADR+和/或CD8+ CD38+ HLADR+）、抗肿瘤活性T细胞亚群（CD8+ CD45RO+CD62L+ ，Tcm）、调节性T细胞亚群（CD4+ CD25+FoxP3+ ，Treg, 和/或CD8+CD28-/CD8+CD57+）、记忆T细胞亚群（CD4+CD45RO+和/或CD8+ CD45RO+）。
37.根据权利要求32、33、34、35或36所述的监测方法，其特征在于所述TCR克隆化分析包括对T细胞受体的22个Vβ基因家族进行可视化和/或定量化分析。
38.根据权利要求37所述的监测方法，其特征在于所述TCR克隆化分析的具体方法为：通过测定TCR CDR3基因区的克隆化出现的频率、长度以及分布状态定量化的来反映抗原特定T细胞的抗病毒或肿瘤的功能状态。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210130553XA CN102719399A (zh) | 2012-04-28 | 2012-04-28 | 自体特异性t细胞的体外扩增方法及所制备的t细胞体系、体系的药物应用和组分监测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210130553XA CN102719399A (zh) | 2012-04-28 | 2012-04-28 | 自体特异性t细胞的体外扩增方法及所制备的t细胞体系、体系的药物应用和组分监测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102719399A true CN102719399A (zh) | 2012-10-10 |
Family
ID=46945272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210130553XA Pending CN102719399A (zh) | 2012-04-28 | 2012-04-28 | 自体特异性t细胞的体外扩增方法及所制备的t细胞体系、体系的药物应用和组分监测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102719399A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105349488A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-02-24 | 深圳源正细胞医疗技术有限公司 | 一种诱导肿瘤特异性t细胞的组合因子及其获得肿瘤特异性t细胞的方法 |
| CN108603171A (zh) * | 2015-12-23 | 2018-09-28 | 基因医疗免疫疗法有限责任公司 | 新一代抗原-特异性tcr |
| CN110241086A (zh) * | 2012-06-11 | 2019-09-17 | 威尔逊沃夫制造公司 | 用于过继细胞疗法的改进的细胞培养方法 |
| CN112304851A (zh) * | 2020-10-28 | 2021-02-02 | 上海睿钰生物科技有限公司 | 一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用 |
| JP2023551819A (ja) * | 2020-11-25 | 2023-12-13 | ジーニアス・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド | 抗原特異的ｔ細胞並びにその作製及び使用方法 |
-
2012
- 2012-04-28 CN CN201210130553XA patent/CN102719399A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110241086A (zh) * | 2012-06-11 | 2019-09-17 | 威尔逊沃夫制造公司 | 用于过继细胞疗法的改进的细胞培养方法 |
| CN105349488A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-02-24 | 深圳源正细胞医疗技术有限公司 | 一种诱导肿瘤特异性t细胞的组合因子及其获得肿瘤特异性t细胞的方法 |
| CN108603171A (zh) * | 2015-12-23 | 2018-09-28 | 基因医疗免疫疗法有限责任公司 | 新一代抗原-特异性tcr |
| CN112304851A (zh) * | 2020-10-28 | 2021-02-02 | 上海睿钰生物科技有限公司 | 一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用 |
| JP2023551819A (ja) * | 2020-11-25 | 2023-12-13 | ジーニアス・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド | 抗原特異的ｔ細胞並びにその作製及び使用方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101918544B (zh) | 提高免疫反应性的方法 | |
| CN109715788A (zh) | 用于免疫疗法的t细胞组合物 | |
| AU2021200648A1 (en) | Activation of marrow infiltrating lymphocytes in hypoxic alternating with normoxic conditions | |
| CN104357390A (zh) | 同时高效扩增cd3+cd56+cik细胞和cd3-cd56+nk细胞的方法 | |
| CN105087487A (zh) | 一种高效扩增cik的方法 | |
| CN102719399A (zh) | 自体特异性t细胞的体外扩增方法及所制备的t细胞体系、体系的药物应用和组分监测方法 | |
| Kiaei et al. | Advances in natural killer cell therapies for breast cancer | |
| CN103525763A (zh) | 一种高效cik细胞的培养方法 | |
| CN105349489A (zh) | 一种cik细胞的培养方法 | |
| CN105316287A (zh) | 一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法 | |
| JP2008509683A (ja) | 抗原提示ヒトγδＴ細胞の調製及び免疫療法における使用 | |
| CN117247466B (zh) | 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合抗原受体及其用途 | |
| AU2025204845A1 (en) | Highly potent m-cenk cells and methods | |
| CN110016465A (zh) | 一种包含b细胞及肿瘤双识别性t细胞的免疫细胞药物 | |
| Venzin et al. | CD4+ T cells license Kupffer cells to reverse CD8+ T cell dysfunction induced by hepatocellular priming | |
| CN103239479B (zh) | 一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法 | |
| CN105367661A (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化her1靶向性的nkt细胞及其应用 | |
| CN109266607A (zh) | 一种优化的临床用tcm分选、诱导培养和质量控制鉴定试剂盒及应用 | |
| CN110205341A (zh) | 一种lrfft2细胞的构建方法 | |
| CN104804092A (zh) | 一种抗b细胞生长刺激因子的纳米抗体及其用途 | |
| CN109957543A (zh) | 利用脐带血大量扩增脐血nk细胞的方法 | |
| CN102898528A (zh) | 钙网蛋白-可溶性程序性死亡受体1的融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN108014327A (zh) | 针对肿瘤相关巨噬细胞的肿瘤免疫治疗靶标 | |
| WO2024183205A1 (zh) | 靶向bcma嵌合抗原受体及其应用 | |
| CN109294997A (zh) | 一种lrfft1细胞 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20121010 |