CN102716485A - 鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液及其制备方法，包括以下步骤：分离毒株制备疫苗，免疫健康鸭群制得蛋，将蛋经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、分装得到鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液。本申请制备方法特点在于通过对发病率高的地区采样分离病毒，筛选出覆盖面较广的病毒株，制备疫苗；其次经过冷、热酸化处理得到澄清卵黄抗体粗液，这项技术在现生产中未曾提到；再者经过辛酸、低温高速离心和微滤及超滤制得卵黄抗体液。这种方法制备的二联卵黄抗体注射液不仅剂型不同其他公司，也存在其他优势特征生产过程中损失少、纯度高、生物活性高、无临床副作用。
Description
技术领域
本发明属于禽类用生物制品技术领域，涉及一种鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液，同时还涉及一种该鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液的制备方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎简称鸭肝炎，是危害雏鸭最严重的疫病之一，主要危害20日龄以内的雏鸭，雏鸭日龄越小，死亡率越高，最高死亡率可达90%-95%，并且所有的抗菌素对本病无效。鸭病毒性肝炎早在1958年在我国发现，20世纪80年代初期起本病在我国再次流行，此后，各地疫情此起彼伏，疫情能够被鸭病毒性肝炎I型弱毒疫苗的免疫所控制；1997年以来，本病在某些地区出现较严重的流行，其疫情不能被标准鸭病毒性肝炎I型弱毒疫苗完全地控制，怀疑有I型鸭病毒性肝炎病毒变异株出现。
鸭瘟（Duck plape）又名鸭病毒性肠炎（Duck virus enteritis,DVE），是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。该病的特征是流行广泛，传播迅速，发病率和死亡率都高。早在1923年Baudet氏在荷兰首次发现本病，直到1940年Bos氏首次提出鸭瘟的名称，并确认是一种不同于鸡瘟的新病毒病。鸭瘟在我国流行的正式报道是黄引贤1957年在广东首先提出的，随后武汉、上海、浙江、江苏、广西、湖南和福建等地陆续发现，至80年代传播到东北各省。1957年以来，本病广泛流行于我国华南、华中、华东养鸭业较发达地区，造成很大的经济损失。
鸭病毒性肝炎、鸭瘟病是养鸭业中常见的疾病，容易大范围内爆发，二者有时会混合感染，给治疗增加了难度。主要防治方法包括抗病毒药、中西药及制剂、卵黄抗体及其他生物制剂等，其中卵黄抗体是最有效的治疗鸭发生病毒病的方法。
卵黄抗体IgY是的一种免疫球蛋白Ig，IgY在功能上相当于哺乳动物IgG，但结构上有所不同，具有典型的的免疫球蛋白的空间构象。卵黄抗体具有很多优越性：（1）由于鸟类与哺乳类动物种系发生学的差距，鸟类更适于生产抗哺乳动物抗原的特异性抗体；卵黄抗体不会激发补体系统，不与抗哺乳动物抗原的抗体发生反应，不与哺乳动物和细菌的Fc受体结合，这在免疫诊断中具有重要意义。（2）卵黄抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白，在贮存、生产、加工、摄食及消化过程中保证其稳定性是非常关键的。多项试验表明，IgY具有较好的稳定性，耐酸、耐碱、耐热。卵黄抗体较易保存，4℃条件下存放5年或室温条件下存放6个月对抗体活性无明显影响。（3）卵黄抗体量大，成本低，便于规模化生产。卵黄中抗体浓度能长期维持在相当于甚至超过血清抗体浓度的水平上。1只产蛋（以平均每周产蛋5-6枚，平均每枚蛋蛋黄大约15mL计算）所产蛋生产的抗体量相当于90-100mL血清或180-200mL血液中抗体的量，例如1只兔子1个月可提取IgG约200mg，而1个月1只蛋可从蛋中提取IgY2000mg以上。此外，在实际生产中，动物的采血不仅对动物本身是极大的应激，而且费时、费工，大规模生产是不切实际的，而利用蛋生产抗体要方便的多。总的来讲，卵黄抗体对动物没有毒副作用，用卵黄抗体治疗动物疾病不但避免了血清价格昂贵、产量低的缺点，而且可以避免血清在治疗过程中引起的副作用，是一种很有前途的新型免疫球蛋白制剂。因此，卵黄抗体在禽畜疾病诊断、治疗和预防的应用越来越多。目前卵黄抗体的制备及生产工艺已经成熟，可以保质保量的生产。
市场上现有的产品一般都是按标准毒株生产的疫苗，用常见的水稀释法结合硫酸铵盐析法得到卵黄抗体产品，溶解度低、生产时抗体回收率低等缺点；而本发明在酸化水处理、加入冷热技术，使本产品的纯度提高，损失减少，在机体内吸收快，生物利用度高，生物活性不受影响等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液，该注射液的优点是纯度提高，损失减少，在机体内吸收快，生物利用度高，生物活性好等优点。
本发明的目的还在于提供一种鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液的制备方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液，由以下重量百分数的组分组成：鸭病毒性肝炎卵黄抗体50-60%、鸭瘟卵黄抗体35-45%、辛酸0.8-1.0%、甲醛0.2-0.3%、硫柳汞0.01-0.02%及余量的水。
一种所述鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液的制备方法，包括以下步骤：分离毒株制备疫苗，免疫健康鸭群制得蛋，将蛋经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、分装得到鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液。
所述的鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液的制备方法，具体步骤是：
1）分离毒株制备疫苗：本次病毒样品主要从江苏南京和福建分别采集鸭病毒性肝炎样品和鸭瘟样品，经过无菌采集临床上发病症状明显的病例，将采集的样品研磨，经过3次冻融，15000rpm/min高速离心留取上清液，将上清液接种于鸡胚囊中传代经过62代的传递，根据传代胚胎病变和人工致病试验，验证得弱毒株JSNJ62株；鸭瘟病毒株经过上述的方式得到病毒株FJ株，根据GenBank登录号为EF643557公布UL28基因序列设计引物，扩增产物经胶回收纯化后，连接至PMD18-T载体并转化感受细胞DH5α，测序，得到克隆完整UL28基因序列2415bp；
2）免疫健康鸭群制得蛋：采用自备的鸭病毒性肝炎灭活疫苗和鸭瘟灭活疫苗对健康鸭群交替免疫，免疫接种鸭病毒性肝炎灭活疫苗1.5mL（含毒103.2ELD50/0.1mL）和鸭瘟灭活疫苗1.5mL（含毒102.8ELD50/0.1mL），第一次免疫健康鸭群使用鸭病毒性肝炎灭活疫苗，每次免疫间隔7天时间，以后免疫加1倍量，两种疫苗交替免疫，交替免疫三次，第二次免疫后开始抗体效价检测，使抗体效价达到1：256时，开始收集种蛋；开始收集蛋，收集的蛋进行清理、消毒，晾干备用；
3）水稀释法酸化处理：分离蛋卵黄，加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液；将卵黄溶液放入60-65℃水浴锅内均匀加热30min，然后加入pH为4.8-5.2、温度为4-6℃的酸化水溶液，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，4℃放置4-8h静置沉淀，取上清液，离心20min，15000rpm/min，留上清液；
4）辛酸处理：向步骤3）上清液中加入辛酸，加入量为溶液体积的0.8-1.0%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，离心10min，20000rpm/min，留取上清液，静置；
5）对步骤4）所得上清液依次用0.45μm的滤膜截流分子量为200KD以上大分子物质，留取滤液；
6）向步骤5）所得滤液加入甲醛、硫柳汞，甲醛的加入量为0.2-0.3%，硫柳汞为0.01-0.02%；
7）除菌滤膜进行过滤，分装，保存。
本发明在酸化水处理、加入冷热技术，经过粗滤、微滤、除菌过滤等细微处理，使本产品的纯度提高，损失减少，在机体内吸收快，生物利用度高，生物活性不受影响等优点。
具体实施方式
实施例1.本实施例鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液，由以下重量百分数的组分组成：鸭病毒性肝炎卵黄抗体50%、鸭瘟卵黄抗体35%、辛酸0.8%、甲醛0.2%、硫柳汞0.01%及13.99%的水。
本实施例的鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液的制备方法，包括以下步骤：分离毒株制备疫苗，免疫健康鸭群制得蛋，将蛋经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、分装得到鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液。
本实施例鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液的制备方法，具体步骤是：
1）选择自行分离毒株制备成疫苗：本次病毒样品主要从江苏南京和福建分别采集鸭病毒性肝炎样品和鸭瘟样品，经过无菌采集临床上发病症状明显的病例，将采集的样品研磨，经过3次冻融，15000rpm/min高速离心留取上清液，将上清液接种于鸡胚囊中传代经过62代的传递，根据传代胚胎病变和人工致病试验，验证得弱毒株JSNJ62株；鸭瘟病毒株经过上述的方式得到病毒株FJ株，根据GenBank登录号为EF643557公布UL28基因序列设计引物，扩增产物经胶回收纯化后，连接至PMD18-T载体并转化感受细胞DH5α，测序，得到克隆完整UL28基因序列2415bp；
2）免疫健康鸭群制得蛋：采用自备的鸭病毒性肝炎灭活疫苗和鸭瘟灭活疫苗对健康鸭群交替免疫，免疫接种鸭病毒性肝炎灭活疫苗1.5mL（含毒103.2ELD50/0.1mL）和鸭瘟灭活疫苗1.5mL（含毒102.8ELD50/0.1mL），第一次免疫健康鸭群使用鸭病毒性肝炎灭活疫苗，每次免疫间隔7天时间，以后免疫加1倍量，两种疫苗交替免疫，交替免疫三次，第二次免疫后开始抗体效价检测，使抗体效价达到1：256时，开始收集种蛋；开始收集蛋，收集的蛋进行清理、消毒，晾干备用；
3）水稀释法酸化处理：分离蛋卵黄，加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液；将卵黄溶液放入60℃水浴锅内均匀加热30min，然后加入pH为4.8、温度为4℃的酸化水溶液，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，4℃环境放置4-8h静置沉淀，取上清液，离心20min，15000rpm/min，留上清液；
4）辛酸处理：向步骤3）上清液中加入辛酸，加入量为溶液体积的0.8%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，离心10min，20000rpm/min，留取上清液，静置；
5）对步骤4）所得上清液依次用0.45μm的滤膜截流分子量为200KD大分子物质，留取滤液；
6）向步骤5）所得滤液加入甲醛、硫柳汞，甲醛的加入量为0.2%，硫柳汞为0.01%；
7）除菌滤膜进行过滤，分装，保存。
为了检测卵黄抗体注射液在常温下的放置时抗体效价变化，以此来确定本产品的保质期，做了以下试验：将本品保存在37℃培养箱中，保存24个月，分别1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用琼脂扩散（AGP）法，测定每个时间点取样品的卵黄抗体效价变化，结果见表1。
表1.常温放置注射液不同时间段效价的变化
质量标准：
[性状]本品为淡黄色液体。
[无菌检验]按《中国兽药典》进行，无菌生长。
[支原体检验]按《中国兽药典》进行，无支原体生长。
[外源病毒检验]按《中国兽药典》进行，符合规定。
[安全检验]用7日龄雏鸭5只，各肌肉注射羽份，观察2周，应全部健活，注射部位没有病变。
[效力检验]按生产的规格进行稀释至1羽份/mL。
1）保护力检测：用7日龄雏鸭30只，其中10只，每只肌肉注射1羽份卵黄抗体，另20只对照隔离饲养。24h后，取试验组和对照组中的10只雏鸭肌注接种DHV和DPV稀释后病毒液，记录96h死亡情况，试验组的保护率在96%以上，攻毒对照组死亡率在90%以上，空白对照组雏鸭无任何变化。
2）治愈力测定：用7日龄雏鸭90只，30只作阴性对照，60只点眼接种DHV和DPV稀释的病毒液，感染12h后，其中30只，每只肌肉注射本品，每日1次，连续3日，另30只做阳性对照，隔离饲养。治疗后72h，记录各组死亡情况，攻毒阳性对照组死亡率在85%以上，治疗组存活率在95%以上，健康阴性对照组30只无任何变化。
[剩余水分测定]按《中国兽药典》进行，符合兽用生物制品通则规定。
[真空度测定]按《中国兽药典》进行，符合规定。
[保质期]根据常温效价检测实验结果，可以存放2年。
实施例2.本实施例鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液，由以下重量百分数的组分组成：鸭病毒性肝炎卵黄抗体55%、鸭瘟卵黄抗体35%、辛酸1.0%、甲醛0.3%、硫柳汞0.02%及8.68%水。
一种鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液的制备方法，包括以下步骤：分离毒株制备疫苗，免疫健康鸭群制得蛋，将蛋经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、分装得到鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液。
本实施例鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液的制备方法，具体步骤是：
1）选择自行分离毒株制备成疫苗：本次病毒样品主要从江苏南京和福建分别采集鸭病毒性肝炎样品和鸭瘟样品，经过无菌采集临床上发病症状明显的病例，将采集的样品研磨，经过3次冻融，15000rpm/min高速离心留取上清液，将上清液接种于鸡胚囊中传代经过62代的传递，根据传代胚胎病变和人工致病试验，验证得弱毒株JSNJ62株；鸭瘟病毒株经过上述的方式得到病毒株FJ株，根据GenBank登录号为EF643557公布UL28基因序列设计引物，扩增产物经胶回收纯化后，连接至PMD18-T载体并转化感受细胞DH5α，测序，得到克隆完整UL28基因序列2415bp；
2）免疫健康鸭群制得蛋：采用自备的鸭病毒性肝炎灭活疫苗和鸭瘟灭活疫苗对健康鸭群交替免疫，免疫接种鸭病毒性肝炎灭活疫苗1.5mL（含毒103.2ELD50/0.1mL）和鸭瘟灭活疫苗1.5mL（含毒102.8ELD50/0.1mL），第一次免疫健康鸭群使用鸭病毒性肝炎灭活疫苗，每次免疫间隔7天时间，以后免疫加1倍量，两种疫苗交替免疫，交替免疫三次，第二次免疫后开始抗体效价检测，使抗体效价达到1：256时，开始收集种蛋；开始收集蛋，收集的蛋进行清理、消毒，晾干备用；
3）水稀释法酸化处理：分离蛋卵黄，加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液；将卵黄溶液放入62℃水浴锅内均匀加热30min，然后加入pH为5.0、温度为4℃的酸化水溶液，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，静置沉淀，取上清液，离心20min，15000rpm/min，留上清液；
4）辛酸处理：向步骤3）上清液中加入辛酸，加入量为溶液体积的1.0%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，离心10min，20000rpm/min，留取上清液，静置；
5）对步骤4）所得上清液用0.45μm的滤膜截流分子量为300KD的大分子物质，留取滤液；
6）向步骤5）所得滤液加入甲醛、硫柳汞，甲醛的加入量为0.3%，硫柳汞为0.02%；
7）除菌滤膜进行过滤，分装，保存。
为了检测卵黄抗体注射液在常温下的放置时抗体效价变化，以此来确定本产品的保质期，做了以下试验：将本品保存在37℃培养箱中，保存24个月，分别1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用琼脂扩散（AGP）法，测定每个时间点取样品的卵黄抗体效价变化，结果见表2。
表2.常温放置注射液不同时间段效价的变化
质量标准：
[性状]本品为淡黄色透明液体。
[无菌检验]按《中国兽药典》进行，无菌生长。
[支原体检验]按《中国兽药典》进行，无支原体生长。
[外源病毒检验]按《中国兽药典》进行，符合规定。
[安全检验]用7日龄雏鸭5只，各肌肉注射羽份，观察2周，应全部健活，注射部位没有病变。
[效力检验]按生产的规格进行稀释至1羽份/mL。
1）保护力检测：用7日龄雏鸭30只，其中10只，每只肌肉注射1羽份卵黄抗体，另20只对照隔离饲养。24h后，取试验组和对照组中的10只雏鸭肌注接种DHV和DPV稀释后病毒液，记录96h死亡情况，试验组的保护率在95%以上，攻毒对照组死亡率在85%以上，空白对照组雏鸭无任何变化。
2）治愈力测定：用7日龄雏鸭90只，30只作阴性对照，60只点眼接种DHV和DPV稀释的病毒液，感染12h后，其中30只，每只肌肉注射本品，每日1次，连续3日，另30只做阳性对照，隔离饲养。治疗后72h，记录各组死亡情况，攻毒阳性对照组死亡率应85%以上，治疗组存活率在95%以上，健康阴性对照组30只无任何变化。
[剩余水分测定]按《中国兽药典》进行，符合兽用生物制品通则规定。
[真空度测定]按《中国兽药典》进行，符合规定。
[保质期]根据常温效价检测实验结果，可以存放2年。
实施例3.本实施例鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液，由以下重量百分数的组分组成：鸭病毒性肝炎卵黄抗体60%、鸭瘟卵黄抗体35%、辛酸0.9%、甲醛0.25%、硫柳汞0.015%及3.835%水。
本实施例的鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液可以采用常规制备注射液的方法来进行制备。
为了检测卵黄抗体注射液在常温下的放置时抗体效价变化，以此来确定本产品的保质期，做了以下试验：将本品保存在37℃培养箱中，保存24个月，分别1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用琼脂扩散（AGP）法，测定每个时间点取样品的卵黄抗体效价变化，结果见表3。
表3.常温放置注射液不同时间段效价的变化
质量标准：
[性状]本品为淡黄色透明液体。
[无菌检验]按《中国兽药典》进行，无菌生长。
[支原体检验]按《中国兽药典》进行，无支原体生长。
[外源病毒检验]按《中国兽药典》进行，符合规定。
[安全检验]用7日龄雏鸭5只，各肌肉注射羽份，观察2周，应全部健活，注射部位没有病变。
[效力检验]按生产的规格进行稀释至1羽份/mL。
1）保护力检测：用7日龄雏鸭30只，其中10只，每只肌肉注射1羽份卵黄抗体，另20只对照隔离饲养。24h后，取试验组和对照组中的10只雏鸭肌注接种DHV和DPV稀释后病毒液，记录96h死亡情况，试验组的保护率在95%以上，攻毒对照组死亡率在85%以上，空白对照组雏鸭无任何变化。
2）治愈力测定：用7日龄雏鸭90只，30只作阴性对照，60只点眼接种DHV和DPV稀释的病毒液，感染12h后，其中30只，每只肌肉注射本品，每日1次，连续3日，另30只做阳性对照，隔离饲养。治疗后72h，记录各组死亡情况，攻毒阳性对照组死亡率在85%以上，治疗组存活率在95%以上，健康阴性对照组30只无任何变化。
[剩余水分测定]按《中国兽药典》进行，符合兽用生物制品通则规定。
[真空度测定]按《中国兽药典》进行，符合规定。
[保质期]根据常温效价检测实验结果，可以存放2年。
实验例
用7日龄雏鸭60只，第一组30只作本产品组，第二组30只作为市售二联冻干卵黄抗体产品组，隔离饲养，点眼接种DHV和DPV稀释的病毒液，表现出临床症状时，开始治疗，第一组每只肌肉注射本品2mL，每日1次，连续3日，第二组肌肉注射市售产品2mL，每日1次，连续3日。治疗后72h，记录各组发病及治疗情况。表4。
表4 实验情况
Claims (3)
1.一种鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液，其特征在于，由以下重量百分数的组分组成：鸭病毒性肝炎卵黄抗体50-60%、鸭瘟卵黄抗体35-45%、辛酸0.8-1.0%、甲醛0.2-0.3%、硫柳汞0.01-0.02%及余量的水。
2.一种如权利要求1所述鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：分离毒株制备疫苗，免疫健康鸭群制得蛋，将蛋经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、分装得到鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液。
3.根据权利要求1所述的鸭病毒性肝炎和鸭瘟二联高免卵黄抗体注射液的制备方法，其特征在于，具体步骤是：
1）分离毒株制备疫苗：本次病毒样品主要从江苏南京和福建分别采集鸭病毒性肝炎样品和鸭瘟样品，经过无菌采集临床上发病症状明显的病例，将采集的样品研磨，经过3次冻融，15000rpm/min高速离心留取上清液，将上清液接种于鸡胚囊中传代经过62代的传递，根据传代胚胎病变和人工致病试验，验证得弱毒株JSNJ62株；鸭瘟病毒株经过上述的方式得到病毒株FJ株，根据GenBank登录号为EF643557公布UL28基因序列设计引物，扩增产物经胶回收纯化后，连接至PMD18-T载体并转化感受细胞DH5α，测序，得到克隆完整UL28基因序列2415bp；
2）免疫健康鸭群制得蛋：采用自备的鸭病毒性肝炎灭活疫苗和鸭瘟灭活疫苗对健康鸭群交替免疫，免疫接种鸭病毒性肝炎灭活疫苗1.5mL（含毒103.2ELD50/0.1mL）和鸭瘟灭活疫苗1.5mL（含毒102.8ELD50/0.1mL），第一次免疫健康鸭群使用鸭病毒性肝炎灭活疫苗，每次免疫间隔7天时间，以后免疫加1倍量，两种疫苗交替免疫，交替免疫三次，第二次免疫后开始抗体效价检测，使抗体效价达到1：256时，开始收集种蛋；开始收集蛋，收集的蛋进行清理、消毒，晾干备用；
3）水稀释法酸化处理：分离蛋卵黄，加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液；将卵黄溶液放入60-65℃水浴锅内均匀加热30min，然后加入pH为4.8-5.2、温度为4-6℃的酸化水溶液，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，放置4℃环境中4-8h静置沉淀，取上清液，离心20min，15000rpm/min，留上清液；
4）辛酸处理：向步骤3）上清液中加入辛酸，辛酸加入量为溶液体积的0.8-1.0%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，离心10min，20000rpm/min，留取上清液，静置；
5）对步骤4）所得上清液依次用0.45mm的滤膜截流分子量为200KD的大分子物质，留取滤液；
6）向步骤5）所得滤液加入甲醛、硫柳汞，甲醛的加入量为0.2-0.3%，硫柳汞为0.01-0.02%；
7）除菌滤膜进行过滤，分装，保存。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20121010 |