CN102676508A - 基于纳米金和适配体的小分子探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于纳米金和适配体的小分子探针及其制备方法，本发明的小分子探针包括纳米金颗粒，以及组装在纳米金颗粒上的一种以上巯基修饰
DNA
片段，还包括一种以上的荧光基团标记的适配体，且所述一种以上适配体至少部分片段与所述的一种以上巯基修饰
DNA
组互补杂交。本发明的小分子探针检测时间短，操作简单，特异性强、重复性好、准确率高，有效减少了假阳性结果。由于本发明采用适配体技术，具有相对较高的检测灵敏度，而且能同时检测多种分子。
Description
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及一种基于纳米金和适配体的小分子探针及其制备方法。
背景技术
核酸适配体（aptamer）是一类体外人工筛选出来的DNA或RNA寡核苷酸序列，可以高效、专一地识别其配体（A. D. Ellington, J. W. Szostak, Nature 1990, 346, 818-822），在临床诊断和疾病治疗领域成为越来越重要的分子工具。核酸适配体是一系列单链核酸分子，能够与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体与靶分子相互作用的基础是空间结构的互补，在结合靶分子前后核酸适配体通常会有显著的结构变化：这一特性广泛应用于电化学、荧光、石英晶体微天平等信号检测手段。近年来，基于核酸适配体的比色策略发展迅速，人们可以直接用肉眼实现对靶分子的直接检测。核酸适配体具有易于合成、化学稳定性高和目标分子范围的特点。
分子信标（molecular beacon）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标因具有灵敏度高、特异结合性好、靶分子不用标记无需分离等优点而被广泛应用于生物学和生物分析领域。分子信标中最常用的淬灭基团是DABSYL 、TMARA等有机淬灭剂，这些淬灭剂可以有效淬灭大部分的荧光素，但是对于不同的荧光素的淬灭效率差异很大，对于长波长发射的荧光素例如Cy5， Texas Red等的淬灭效果就很差。
纳米金具有高的消光系数和较宽的光谱吸收特性，它比常规有机发光团分子的消光系数高3～5个数量级（Jin, R.; Wu, G.; Li, Z.; Mirkin, C. A.; Schatz, G. C., J. Am. Chem. Soc. 2003, 1643-54）。纳米金作为信号传导载体在生物技术和纳米技术领域有着广泛的应用。Fan等发现纳米金可以淬灭聚芴阳离子的荧光，Stern-Volmer常数可达10
11
/M，比小分子荧光淬灭剂提高了9-10个数量级。近年来，纳米金作为淬灭基团在纳米金－荧光素复合物体系中理论模型、淬灭效率以及实际应用的研究越来越多。将纳米金应用到分子信标中，与常规淬灭基团DABCYL相比, 纳米金可以在可见到近红外的波长范围内，有效淬灭各种荧光染料，而且金颗粒在较低的离子强度条件下吸收效果较好，所以用纳米金粒子代替DABSYL大大提高了分子信标的灵敏度和特异性。
发明内容
本发明所要解决的第一问题在于克服现有技术中分子信标在检测长波长发射时灵敏度和特异性降低等问题，提供一种基于纳米金和适配体的小分子探针。
本发明所要解决的又一技术问题在于提供一种基于纳米金和适配体的小分子探针的制备方法。
本发明所要解决的又一技术问题在于提供一种包括基于纳米金和适配体的小分子探针的试剂盒。
本发明所要解决的又一技术问题在于提供一种基于纳米金和适配体的小分子探针的使用方法。
为了解决现有技术中的这些问题，在第一个方面，本发明提供的技术方案是：基于纳米金和适配体的小分子探针，包括纳米金颗粒，以及组装在纳米金颗粒上的一种以上巯基修饰DNA片段，其特征在于，还包括一种以上的荧光基团标记的适配体，且所述一种以上适配体至少部分片段与所述的一种以上巯基修饰DNA组互补杂交。
优选的，所述巯基修饰DNA片段，其3’端为巯基-SH修饰且在该末端有6-10个长度的胸腺嘧啶T作为间隔，其5’端的部分碱基与所述的荧光基团标记的适配体能够互补杂交。
优选的，所述纳米金的粒径为13纳米-15纳米。
优选的，所述组装在纳米金颗粒上的巯基修饰DNA片段为3种，与其互补杂交的适配体为3种。
优选的，所述一种以上的荧光基团标记的适配体，其5’端修饰有不同的荧光基团，包括但不限为-ROX，-FAM 或-Cy5。
优选的，所述纳米金颗粒与核酸适配体荧光基团的距离控制在2-3 纳米。巯基修饰DNA片段，其3’端为巯基（-SH）修饰且在该末端有6-10个长度的胸腺嘧啶T作为间隔，标记有荧光基团的核酸适配体与所述巯基修饰DNA片段的间隔部分之外的碱基互补杂交，通过间隔的碱基数目控制所述纳米金颗粒与核酸适配体荧光基团的距离。
优选的，所述小分子探针，包括至少下列一对荧光基团标记的适配体及与其互补杂交的组装在纳米金颗粒上的巯基修饰DNA片段：
与腺苷A特异结合的适配体如SEQ ID No.1所示AA:5’ -AGAGA ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巯基修饰的与腺苷A特异性结合的核酸适配体互补的DNA片段如SEQ ID No.4所示PA: 5’-CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’：
与钾离子K
+
特异结合的适配体如SEQ ID No.2所示AK:5’- -TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巯基修饰的与钾离子K+特异性结合的核酸适配体互补的DNA片段如SEQ ID No.5所示PK: 5’-CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’：
与可卡因特异结合的适配体如SEQ ID No.3所示AC:5’--AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巯基修饰的与可卡因特异性结合的核酸适体互补的DNA片段如SEQ ID No.6所示PC: 5’-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3’；
上述的三种适配体的5’端连接有-ROX，-FAM 或-Cy5荧光基因中的一种，且各个适配体的荧光基因各不相同。
在第二个方面，本发明提供了基于纳米金和核酸适配体的小分子探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）准备与核酸适配体互补的巯基修饰的DNA片段及纳米金颗粒，还加入了为核酸适配体1.5-2.5倍摩尔浓度的10个胸腺嘧啶T，通过金硫键将DNA片段组装到纳米金表面得到纳米金-DNA片段；
（2）准备荧光基团标记的核酸适配体，将等摩尔量的核酸适配体与步骤（1）制备的纳米金-DNA片段混合得到所述基于纳米金和核酸适配体的小分子探针。
优选的，在第二个方面的制备方法，所述步骤（1）为: 将一定量的巯基修饰的DNA和纳米金混合，得到纳米金-DNA片段，过夜后加入一定浓度的PBS，离心去掉未组装到纳米金表面的DNA片段。
优选的，在第二个方面的制备方法，步骤（2）加入的胸腺嘧啶T为核酸适配体2倍摩尔浓度的胸腺嘧啶。
优选的，在第二个方面的制备方法，所述纳米金的粒径为13纳米-15纳米。
优选的，在第二个方面的制备方法，在最终的纳米金-DNA片段混合溶液中，巯基修饰的DNA : 10个胸腺嘧啶T : 纳米金的浓度为 1 : 2 : 10000。
在第三个方面，本发明提供了一种包括基于纳米金和适配体的小分子探针的试剂盒，所述试剂盒，包括纳米金颗粒，还包括组装在纳米金颗粒上的一种以上巯基修饰DNA片段，一种以上的荧光基团标记的适配体，且所述一种以上适配体至少部分片段与所述的一种以上巯基修饰DNA组互补杂交。
优选的，在第三个方面的试剂盒，所述巯基修饰DNA片段，其3’端为巯基-SH修饰且在该末端有6-10个长度的胸腺嘧啶T作为间隔，其5’端的部分碱基与所述的荧光基团标记的适配体能够互补杂交。
优选的，在第三个方面的试剂盒，所述纳米金的粒径为13纳米-15纳米。
优选的，在第三个方面的试剂盒，所述一种以上的荧光基团标记的适配体，其5’端修饰有不同的荧光基团，包括但不限为-ROX，-FAM 或-Cy5。
优选的，在第三个方面的试剂盒，包括至少下列一对荧光基团标记的适配体及与其互补杂交的组装在纳米金颗粒上的巯基修饰DNA片段：
与腺苷A特异结合的适配体如SEQ ID No.1所示AA:5’-ROX-AGAGA ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巯基修饰的与腺苷A特异性结合的核酸适配体互补的DNA片段如SEQ ID No.4所示PA: 5’-CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’：
与钾离子K + 特异结合的适配体如SEQ ID No.2所示AK:5’-FAM-TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巯基修饰的与钾离子K+特异性结合的核酸适配体互补的DNA片段如SEQ ID No.5所示PK: 5’-CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’：
与可卡因特异结合的适配体如SEQ ID No.3所示AC:5’-Cy5-AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巯基修饰的与可卡因特异性结合的核酸适体互补的DNA片段如SEQ ID No.6所示PC: 5’-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3’。
在第四个方面，本发明提供了基于纳米金和适配体的小分子探针的使用方法，其特征在于，将所述小分子探针加入待测溶液，室温放置1-24小时然后测量荧光信号的变化。
优选的，在第四个方面的使用方法，所述待测溶液还加入了待测小分子类似物。为了验证该方法的特异性，即该探针能够特异性检测靶分子，而其类似物分子不会对结果产生干扰，所以在实验过程中加入了小分子的类似物，比如腺苷A的类似物，腺苷G，T，C。钾离子K
+
的类似物Li
+
，Na
+
。可卡因的类似物芽子碱甲酯（EME）、苯甲酸（BE）。
本专利申请中的术语“适配体”是本领域技术人员所熟知的，指的是能够与特定的靶分子结合的单链核酸，包括DNA或RNA。本发明使用的核酸适配体5’端修饰有不同的荧光基团。本发明中，三条适配体aptamer链用不同的荧光基团标记，与纳米金表面组装的互补DNA杂交，一起构成纳米金多色探针。未检测反应前，由于适配体荧光基团靠近纳米金表面，其荧光被纳米金淬灭，信号水平很低。当存在其中可与其中一种适配体特异性结合的小分子时，适配体就与小分子结合，并离开纳米金表面，因此，纳米金的淬灭作用不发挥作用，该适配体释放强烈的荧光信号。
本专利申请中的术语“荧光基团”是本领域技术人员所熟知的，能够标记到DNA上的荧光基团都可以，但是三种不同的荧光基团的激发和发射峰位置需要相差50 nm以上，避免发射光谱的叠加。修饰好的荧光基团的核酸适配体可以从生物公司购买，但在荧光基团的选择上要求各个核酸适配体荧光基团的激发和发射波长不能有重叠。因此也不宜采用磷光基团。
本专利申请中的术语“巯基修饰DNA片段”是本领域技术人员所熟知的，就是在实验采用的DNA片段的末端标记有巯基。
本发明中的探针设计，先将几种不同序列巯基修饰的DNA片段（单链）组装在纳米金颗粒上，这几条DNA片段单链可以分别与其特定需要的适配体（aptamer）互补杂交。且适配体链用不同的荧光基团标记，与纳米金表面组装的互补DNA杂交，一起构成纳米金多色探针。由于荧光基团靠近纳米金表面，其信号很低，只要存在其中一种小分子时，aptamer远离纳米金表面，释放强烈荧光信号
相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：
1．本发明的小分子探针具有相对较高的检测灵敏度，纳米金具有极高的淬灭能力, 而且金颗粒在较低的离子强度条件下吸收效果较好，所以用纳米金粒子代替DABSYL大大提高了分子信标的灵敏度和特异性。
特异性强、重复性好、准确率高，有效减少了假阳性结果。由于本发明采用适配体技术，因而能保持结果的正确，大大降低了假阳性结果出现的几率，使得本发明适宜实际推广。本发明的方法可以利用未经精度提纯的待测样品直接检测而仍旧能保持实用的灵敏度和特异性，不会出现适配体与靶分子（MAM mRNA）和其他非特异核酸序列互相干扰的情况。
操作简单，检测时间短。由于本发明小分子探针的检测方法实际上只需要将小分子探针和带检测的样品简单混合放置后，然后测量荧光信号的变化。除去检测步骤，其他步骤操作简单、方便，耗时短，无需复杂仪器及特别技巧，尤其是该方法可以利用未经精度提纯的待测样品直接检测这样极大地方便了检测操作，节省了试剂使用并加快了检测进程，可以推广进行实际的产业应用。
检测分子种类多，本发明的纳米金（AuNPs）探针，探针结合适配体技术，该探针将荧光基团标记的适配体及其巯基修饰的互补序列共组装到纳米金表面，可以在均相体系中检测多种小分子，该策略为快速检测多种小分子提供一种潜在的方法。
产品质量稳定，储存条件要求不高。适配体比蛋白抗体更稳定，不易变性，容易长时间保存，这造成产品的有效期将大大延长。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为基于纳米金和适配体的小分子探针的设计以及检测原理示意图。
图2A为本发明小分子探针对腺苷A检测结果及空白对照；图2B为本发明小分子探针对腺苷A及类似物腺苷（T,G,C）检测的信号对比。
图3A为本发明小分子探针对钾离子K+检测结果及空白对照；图3B为本发明小分子探针对钾离子K+及类似物离子（Li ，Na）检测的信号对比。
图4A为本发明小分子探针对可卡因cocaine检测结果及空白对照；图4B为本发明小分子探针对可卡因及类似物芽子碱甲酯（EME）、苯甲酸（BE）检测的信号对比。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，如《分子克隆实验手册》以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用分析级，实验用水经Milli-XQ 过滤，各试剂均和材料可以商用渠道获得，腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)购自sigma公司，荧光基团标记的适配体以及互补DNA片段购自大连TKARA公司，各种金属离子购自国药集团，纳米金由本实验室合成。
实施例
实施例1 纳米金-DNA片段的制备
1.1 准备纳米金颗粒
纳米金的合成，高浓度纳米金为柠檬酸还原法制备后用离心法浓缩制得（Hurst, S. J.; Lytton-Jean, A. K.; Mirkin, C. A., Anal Chem 2006, 8313-8.）。4℃保存，使用时根据具体需要进行稀释或浓缩，合成的纳米金为13纳米。
准备三条分别与腺苷、钾离子以及可卡因适配体互补的巯基修饰的DNA片段，直接从商业渠道获得。
通过金硫键将DNA片段组装到纳米金表面得到纳米金-DNA片段
将三条分别与腺苷、钾离子以及可卡因的适配体互补的巯基修饰的DNA以及有利于DNA杂交的巯基修饰的10个T构成的DNA(SH-T10)和10 nM的纳米金混合，核酸体DNA终浓度为1 μM，而SH-T10的终浓度为2 μM。过夜后加入浓度为0.1 M的PBS， pH值为7.4，采用12000 rpm速度，在4度下离心3次，每次用0.1 M 的PBS悬浮，去掉未组装到纳米金表面的DNA。
实施例2 荧光基团标记的核酸适配体及纳米金和核酸适配体的小分子探针的制备
2.1 准备荧光基团标记的腺苷、钾离子以及可卡因适配体，直接从商业渠道获得。能够标记到DNA上的荧光基团都可以，但是三种不同的荧光基团的激发和发射峰位置需要相差50 nm以上，避免发射光谱的叠加。
将荧光基团标记的腺苷、钾离子以及可卡因的适配体按等摩尔量与实施例1中组装好DNA片段的纳米金溶液混合，在室温下放置一夜。适配体与上述DNA片段杂交。离心去掉多余的适配体，得到需要的小分子探针。
实施例3 使用本发明的基于纳米金和适配体的小分子探针的检测
取实施例2中制备好的小分子探针，同时加入10 mM的A、100 mM KCl和1 mM可卡因，室温放置1小时，空白对照是等量的去离子水，然后用相应波长激发测量其荧光信号。
为了考察该探针的特异性，实验过程中同时加入各种检测物的类似物，例如腺苷A的类似物T、C、G，K
+
的类似物Li
+
、Na
+
以及可卡因的类似物芽子碱甲酯（EME）、苯甲酸（BE），各自浓度与其类似物相同，如图2- 4所示，可以看到，该探针的选择性非常好。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (18)
1.基于纳米金和适配体的小分子探针，包括纳米金颗粒，以及组装在纳米金颗粒上的一种以上巯基修饰DNA片段，其特征在于，还包括一种以上的荧光基团标记的适配体，且所述一种以上适配体至少部分片段与所述的一种以上巯基修饰DNA组互补杂交。
2.根据权利要求1所述的基于纳米金和适配体的小分子探针，其特征在于，所述巯基修饰DNA片段，其3’端为巯基-SH修饰且在该末端有6-10个长度的胸腺嘧啶T作为间隔，其5’端的部分碱基与所述的荧光基团标记的适配体能够互补杂交。
3.根据权利要求1所述的基于纳米金和适配体的小分子探针，其特征在于，所述纳米金的粒径为13纳米-15纳米。
4.根据权利要求1所述的基于纳米金和适配体的小分子探针，其特征在于，所述纳米金颗粒与核酸适配体荧光基团的距离控制在2-3 纳米。
5.根据权利要求1所述的基于纳米金和适配体的小分子探针，其特征在于，所述一种以上的荧光基团标记的适配体，其5’端修饰有各不相同的荧光基团，为-ROX，-FAM 或-Cy5。
6.根据权利要求1所述的基于纳米金和适配体的小分子探针，其特征在于，所述组装在纳米金颗粒上的巯基修饰DNA片段为3种，与其互补杂交的适配体为3种。
7.根据权利要求1-6任一项所述的基于纳米金和适配体的小分子探针，其特征在于，所述小分子探针，包括至少下列一对荧光基团标记的适配体及与其互补杂交的组装在纳米金颗粒上的巯基修饰DNA片段：
与腺苷A特异结合的适配体如SEQ ID No.1所示AA:5’- AGAGA ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巯基修饰的与腺苷A特异性结合的核酸适配体互补的DNA片段如SEQ ID No.4所示PA: 5’-CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’：
与钾离子K+特异结合的适配体如SEQ ID No.2所示AK:5’- TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巯基修饰的与钾离子K+特异性结合的核酸适配体互补的DNA片段如SEQ ID No.5所示PK: 5’-CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’：
与可卡因特异结合的适配体如SEQ ID No.3所示AC:5’- AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巯基修饰的与可卡因特异性结合的核酸适体互补的DNA片段如SEQ ID No.6所示PC: 5’-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3’；
上述的三种适配体的5’端连接有-ROX，-FAM 或-Cy5荧光基因中的一种，且各个适配体的荧光基因各不相同。
8.制备权利要求1-7所述的基于纳米金和核酸适配体的小分子探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）准备与核酸适配体互补的巯基修饰的DNA片段及纳米金颗粒，还加入了为核酸适配体1.5-2.5倍摩尔浓度的10个胸腺嘧啶T，通过金硫键将DNA片段组装到纳米金表面得到纳米金-DNA片段；
（2）准备荧光基团标记的核酸适配体，将等摩尔量的核酸适配体与步骤（1）制备的纳米金-DNA片段混合得到所述基于纳米金和核酸适配体的小分子探针。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）为: 将一定量的巯基修饰的DNA和纳米金混合，得到纳米金-DNA片段，过夜后加入一定浓度的PBS，离心去掉未组装到纳米金表面的DNA片段。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）加入的胸腺嘧啶T为核酸适配体2倍摩尔浓度的胸腺嘧啶。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述纳米金的粒径为13纳米-15纳米。
12.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在最终的纳米金-DNA片段混合溶液中，巯基修饰的DNA : 10个胸腺嘧啶T : 纳米金的浓度为 1 : 2 : 10000。
13.一种基于纳米金和适配体的小分子探针的试剂盒，所述试剂盒，包括纳米金颗粒，还包括组装在纳米金颗粒上的一种以上巯基修饰DNA片段，一种以上的荧光基团标记的适配体，且所述一种以上适配体至少部分片段与所述的一种以上巯基修饰DNA组互补杂交。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述巯基修饰DNA片段，其3’端为巯基-SH修饰且在该末端有6-10个长度的胸腺嘧啶T作为间隔，其5’端的部分碱基与所述的荧光基团标记的适配体能够互补杂交。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米金的粒径为13纳米-15纳米。
16.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述一种以上的荧光基团标记的适配体，其5’端修饰有不同的荧光基团，为-ROX，-FAM 或-Cy5。
17.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，包括至少下列一对荧光基团标记的适配体及与其互补杂交的组装在纳米金颗粒上的巯基修饰DNA片段：
与腺苷A特异结合的适配体如SEQ ID No.1所示AA:5’-ROX-AGAGA ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巯基修饰的与腺苷A特异性结合的核酸适配体互补的DNA片段如SEQ ID No.4所示PA: 5’-CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’：
与钾离子K+特异结合的适配体如SEQ ID No.2所示AK:5’-FAM-TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巯基修饰的与钾离子K+特异性结合的核酸适配体互补的DNA片段如SEQ ID No.5所示PK: 5’-CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’：
与可卡因特异结合的适配体如SEQ ID No.3所示AC:5’-Cy5-AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巯基修饰的与可卡因特异性结合的核酸适体互补的DNA片段如SEQ ID No.6所示PC: 5’-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3’。
18.基于纳米金和适配体的小分子探针的使用方法，其特征在于，将所述小分子探针加入待测溶液，室温放置1-24小时然后测量荧光信号的变化。
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