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CN102603695B - 一种氨基酸-荧光团类化合物及其应用 - Google Patents

一种氨基酸-荧光团类化合物及其应用 Download PDF

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CN102603695B CN201210030393.1A CN201210030393A CN102603695B CN 102603695 B CN102603695 B CN 102603695B CN 201210030393 A CN201210030393 A CN 201210030393A CN 102603695 B CN102603695 B CN 102603695B
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Abstract

本发明涉及一种氨基酸-荧光团类化合物及其应用。其结构通式为(I)、(II)、(III)、(IV)或者它们的游离形式，式中：R1为各种氨基酸侧链，优选甲基、丙基、2-甲硫基乙基、苯甲基、苯乙基、2-环己基乙基、4-异丙基苯基、4-二甲氨基苯基；R2为各种荧光团，优选7-羟基香豆素、萘二酰亚胺类荧光团、尼罗红系列和Cy系列荧光团；X为C或者N。该类荧光探针分子可用来检测氨肽酶N的活性(酶水平和细胞水平)，可作为探针工具来检测氨肽酶N的组织分布和进行肿瘤组织成像，可作为各类氨肽酶N异常表达疾病的诊断工具。此外，该类化合物制备方法反应条件温和，原料便宜易得，操作及后处理简单。

Description

一种氨基酸-荧光团类化合物及其应用
技术领域
本发明涉及氨基酸-linker-荧光团类化合物及其作为氨肽酶Ｎ的小分子荧光探针和筛选氨肽酶N抑制剂中的应用，属于药物技术领域。 
背景技术
氨肽酶N(A PN,CD13)广泛表达于肾脏和肠刷状缘细胞、骨髓始祖细胞膜、单核细胞膜、中枢神经系统突触细胞膜、成纤维细胞、内皮细胞膜、胎盘细胞膜表面,能够从蛋白质的N末端降解释放氨基酸。与正常细胞活动相比,该酶在肿瘤细胞表面过度表达,对肿瘤的侵袭、血管生成具有重要作用。另外，该蛋白酶作为许多病毒(如引起新生猪急性胃肠炎的播散性胃肠炎病毒以及引起人上呼吸道感染冠状病毒HCV229E)的受体参与相应的生理反应。它还能够表达于抗原递呈细胞表面，降解多种免疫活性物质,使机体免疫力下降,削弱巨噬细胞和NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力[Zhang,X.P.;Xu,W.F.Aminopeptidase N(APN/CD13)as a target for anti-cancer agent design.Curr Med Chem2008,15,2850-2865]。 
虽然人类对APN的功能已经有了很多了解，但是对于APN活性和组织分布的检测方法并没有太多的研究。现有的方法包括免疫标记法、同位素标记法和荧光法。免疫标记法不能实现活体内的检测，同位素标记法虽然能够实现活体内检测，但是具有放射毒性。相比较而言荧光法具有灵敏度、毒性小、能够实现活体内检测的优点。将荧光团与APN靶向性配体NGR连接，利用NGR的靶向性测定活体内APN的组织分布情况是最近几年的研究方法[(a)von Wallbrunn,A.;Waldeck,J.;Holtke,C.;Zuehlsdorf,M.;Mesters,R.;Heindel,W.;Schafers,M.;Bremer,C.In vivo optical imaging of CD13/APN-expression in tumor xenografts.J Biomed opt2008,13,011007-1--011007-9.(b)Smith,R.A.;Giorgio,T.D.Quantitative measurement of multifunctional quantum dot binding to cellular targets using flow cytometry.Cytometry Part A2009,75A,465-474].然而，这些分子探针的使用由于较强的背景信号而受到限制。因此，设计合成选择性好、灵敏度高、信噪比大、毒性小的APN荧光探针具有重要的意义。 
研究表明，基于酶活性的可激活探针自身没有荧光，当其与酶作用后释放出荧光团而产生荧光[Chen,X.Q.;Sun,M.;Ma,H.M.Progress in spectroscopic probes with cleavable active bonds.Curr org chem2006,10,477-489]。因为APN能够从肽链的氨基端逐步降解肽链，如果将APN特异性氨基酸残基与荧光团通过肽键连接合成具有APN选择性的可激活小分子荧光探针，进而测定各种APN高表达动物模型体内的APN活性和组织分布，研究其与肿瘤、血管生成和免疫系统的关系，势必能为肿瘤和免疫系统疾病的早起诊断和预防提供依据。另外，对 氨肽酶N抑制剂的筛选还是以紫外吸收法为主，该方法具有灵敏度低、成本高、测试时间长等缺点。如果我们能够找到一理想的荧光探针进行氨肽酶N的酶活实验，也可为氨肽酶N抑制剂的筛选提供一个平台。 
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种氨基酸-荧光素类化合物及其制备方法和在制药领域的应用。 
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案： 
一种氨基酸-荧光团类化合物及其应用。其结构通式为（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）或（Ⅳ），或它们的游离形式， 
Figure GDA0000485661150000021
式中：R1为甲基、丙基或者2-甲硫基乙基；R2为7-羟基香豆素；X为C或者N。 
优选的，上述化合物，具有如下结构之一： 
Figure GDA0000485661150000022
Figure GDA0000485661150000041
Figure GDA0000485661150000051
Figure GDA0000485661150000061
本发明的化合物作为氨肽酶N的小分子荧光探针的应用。 
本发明的化合物作为参比荧光探针在筛选氨肽酶N抑制剂（包括酶水平和细胞水平），检测氨肽酶Ｎ的组织分布和肿瘤细胞及组织成像的应用。 
本发明的化合物作为参比荧光探针在筛选氨肽酶N抑制剂（包括酶水平和细胞水平）中的应用。 
本发明的化合物作为参比荧光探针在各类氨肽酶Ｎ异常表达疾病诊断中的应用。 
附图说明
图1是具有参比波长性质的探针L1与APN作用的发射波谱图。 
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 
实例一：2-氨基-4甲硫基-N-（4-（2-氧代-2氢-苯并吡喃-7-基氧基）苯基）丁酰胺盐酸盐【L3】的制备 
合成路线1 
Figure GDA0000485661150000071
中间体1的制备： 
将14.9g蛋氨酸溶于110mL1M氢氧化钠溶液，冰浴，缓慢滴加50mL含21.18g碳酸二叔丁基酯的无水THF溶液，同时用1M的氢氧化钠溶液控制反应液pH在9左右，约1h滴加完毕，冰浴条件下搅拌1h，撤去冰浴，室温搅拌15h。整个过程保持体系pH在9左右，反应完毕后蒸除THF，以石油醚洗涤(100mL×3)，水相用饱和柠檬酸溶液调节pH2～3，以乙酸乙酯萃取(100mL×3)，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩得淡黄色油状物20.5g，收率87%。 
中间体2的制备： 
冰浴下，向100mL无水甲醇中滴加8.73mL乙酰氯，冰浴搅拌15分钟，加入5.4g对氨基苯甲酸，冰浴搅拌1小时后回流2小时。浓缩得白色固体，以甲醇-乙醚重结晶得白色粉末6.55g，收率95%。 
中间体3的制备： 
将2.7g中间体1溶于100mL二氯甲烷，加入1.5g HOBT、2.1g EDCI，室温搅拌15min，加入1.9g中间体2和1.4mL三乙胺，室温搅拌6小时。将反应液用饱和柠檬酸（50mL×3）洗、饱和碳酸氢钠（50mL×3）洗，饱和食盐水（50mL×1）洗。无水硫酸镁干燥过夜。浓缩，以乙酸乙酯-正己烷重结晶得白色固体3.1g，产率80%，熔点100-102℃。 
中间体4的制备： 
将0.76g中间体3溶于20mL无水乙醚，冰盐浴下分次加入0.23g四氢铝锂，室温反应1小时。冰浴下，向反应液中加入3mL乙酸乙酯，以2M盐酸调节PH至7。过滤，有机相以饱和食盐水（20mL×3）洗，无水硫酸镁干燥过夜。浓缩，combiflash分离得无色油状物0.34g，收率48%。 
中间体5制备： 
将0.26g中间体4溶于40mL无水THF，冰浴下加入0.3mL三乙胺和0.18mL甲磺酰氯，5℃以下搅拌反应，4小时后反应结束。反应液以0.5M盐酸（20mL×3）洗、饱和食盐水洗（20mL×1），无水硫酸镁干燥。浓缩得黄色油状物0.28g，粗产率80%，无需提纯，直接用于下一步反应。 
中间体6的制备： 
将0.12g7-羟基香豆素溶于10mL DMF，加入0.2g无水碳酸钾，室温搅拌15分钟后，加入0.23g中间体5，反应过夜。将反应液倒入100mL乙酸乙酯中，以饱和碳酸钾溶液（50mL×5）洗，饱和食盐水（50mL×1）洗。浓缩，以乙酸乙酯-正己烷重结晶得白色固体0.12g，收率60%。熔点128-129℃。 
化合物L3的制备 
将0.06g中间体6溶于3mL饱和氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时后，有大量白色沉淀产生，过滤，干燥得白色粉末0.06g，收率92%。熔点234.2-235.7℃。 
1HNMR(300MHz,D2O)δppm:7.75(d,1H,J=9.3Hz),7.37-7.45(m,5H),6.85(d,1H,J=9.3Hz),6.75(d,1H,J=14.1Hz),6.17(d,1H,J=0.9Hz),5.01(s,2H),4.19(t,1H,J=6.6Hz),2.58(t,2H,J=7.2Hz),2.17-2.41(m,2H),2.01(s,3H)。 
实例二：2-氨基-N-（2-（（2-氧代-2氢-苯并吡喃-7-基氧基）-甲基）苯基）戊酰胺盐酸盐【L38】的制备 
合成路线2 
Figure GDA0000485661150000091
中间体7的制备： 
将1.2g Boc-L-正缬氨酸溶于50mL二氯甲烷，加入0.75g HOBT、1.05g EDCI，室温搅拌15min，加入0.62g邻氨基苄醇，室温搅拌10小时。将反应液用饱和柠檬酸（50mL×3）洗、饱和碳酸氢钠（50mL×3）洗，饱和食盐水（50mL×1）洗。无水硫酸镁干燥过夜。浓缩，以乙酸乙酯-正己烷重结晶得白色固体0.97g，产率60%，熔点110.0-122.3℃。 
中间体8的制备： 
以中间体7为原料，按照中间体5的制备方法得中间体8，棕色油状物，收率80%。 
中间体9制备： 
以中间体8为原料，按照中间体6的制备方法得中间体9，白色固体，收率21%。熔点：158.0-160.1℃。 
化合物L38的制备 
以中间体8为原料，按照L3的制备方法得L38，白色固体，收率95%。熔点：230.7-232.2℃。 
1HNMR(300MHz,D2O)δppm:7.91(d,1H,J=9.6Hz),7.56(d,2H,J=3.0Hz),7.31-7.50(m,3H),6.96(dd,2H,J=9.3Hz,3.0Hz),6.28(d,1H,J=9.6Hz),5.13(d,1H,J=11.1Hz),5.03(d,1H,J=11.1Hz),4.07(t,1H,J=6.3Hz),1.61-1.74(m,2H),1.18-1.31(m,2H),0.57(t,3H,J=7.2Hz)。 
实例三：2-氨基-N-（2-（（2-氧代-2氢-苯并吡喃-7-基氧基）-甲基）吡啶-3-基）丙酰胺盐酸盐【L55】的制备 
合成路线3 
Figure GDA0000485661150000101
中间体10和11的合成参照文献[(a)Beyermann,M.;Bienert,M.;Niedrich,H;Carpino,L.A.;Sadat-Aalaee,D.Rapid continuous peptide synthesis via FMOC amino acid chloride coupling and4-(aminomethyl)piperidine deblocking.J Org Chem,1990,55,721-728.(b)Carpino,L A.;Xia,J.S.;El-Faham,A.3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-5-azabenzo-1,2,3-triazene.J Org Chem,2004,69,54-61.]。 
中间体12的制备： 
将2.67g中间体11和3mL吡啶溶于50mL二氧六环，加入0.63g中间体10，回流1小时后冷却至室温。浓缩，用200mL乙酸乙酯溶解，以饱和碳酸氢钠（50mL×3）洗，饱和食盐水（50mL×1）洗。无水硫酸镁干燥过夜。浓缩，以乙酸乙酯重结晶得白色固体0.44g，产率25.0%，熔点：136.6-138.6℃。 
中间体13的制备： 
以中间体12为原料，按照中间体4的制备方法得中间体13，白色固体，收率17.9%,熔点：166.8-168.7℃。 
中间体14的制备： 
以中间体13为原料，按照中间体5的制备方法得中间体14，白色固体，收率66.6%,熔点：139.3-141.7℃。 
中间体15的制备： 
将0.02g7-羟基香豆素溶于10mL丙酮，加入0.02g无水碳酸钾，室温搅拌30分钟后，加入0.04g中间体14，反应30分钟。将反应液倒入100mL乙酸乙酯中，以饱和碳酸钾溶液（50mL×5）洗，饱和食盐水（50mL×1）洗。无水硫酸镁干燥过夜。浓缩，硅胶柱纯化得白色固体0.03g，收率66%。熔点150.1-151.9℃。 
化合物L55的制备 
将0.03g中间体15溶于8mL20%哌啶-DMF溶液，室温搅拌一小时，减压蒸除哌啶和DMF。残留物用100mL乙酸乙酯溶解，以水（50mL×3）洗，饱和食盐水（50mL×1）洗。无水硫酸镁干燥过夜。浓缩，硅胶柱纯化得白色固体0.015g，收率83%。熔点59.0-61.3℃。 
1H-NMR(DMSO,600MHz):δ8.39(d,1H,J=6Hz),8.34(d,1H,J=6Hz),7.99(d,1H,J=12Hz),7.64(d,1H,J=12Hz),7.44(dd,1H,J=12Hz,6Hz),7.13(d,1H,J=6Hz),7.07(dd,1H,J=12Hz,6Hz),6.31(d,1H,J=12Hz),5.38(s,2H),3.45(q,1H,J=6Hz),1.24(d,3H,J=6Hz). 
实例四：动力学法检测探针化合物对APN的亲和力。 
参照文献[Huang,H.Z.;Tanaka,H.;Hammock,B.D.;Morisseau,c.Novel and highly sensitive fluorescent assay for leucine aminopeptidases.Anal biochem2009,391,11-16]，测定L1，L2，L3对APN的动力学参数，结果如下表。 
Figure GDA0000485661150000111
Figure GDA0000485661150000112
注：参比底物亮氨酰对硝基苯胺对APN的Km和LOD分别为423μM,0.125U/mL，Km值越小说明化合物对APN的亲和力越强。LOD指产生的检测信号强度大于等于背景信号的三倍时的APN的用量。 
结果显示受试化合物对APN有较好的动力学性质和亲和力。 
实例五：检测探针化合物的参比波长性质 
向探针化合物（200μM）加入APN(0.01U)，用λ=330nm激发波长激发，每分钟一次。根据其图谱判断是否具有参比波长性质，图1是具有参比波长性质的探针L1与APN作用的发射波谱图。 
结果显示受试化合物是一类能被APN识别并且具有参比波长性质的荧光探针。 
实例六：目标化合物在APN抑制剂筛选中的应用（酶水平） 
参照文献[Chen,L.Z.;Mou,J.J.;Xun,Y.Y.;Fan,H.;Xu,W.F.Design,synthesis and activity study of aminopeptidase N targeted3-amino-2-hydroxy-4-phenyl-butanoic acid derivatives.Drug Discov Ther.2011,5,61-65]，将化合物L1作为APN底物，以上市药物bestatin作为APN抑制剂，测定bestatin的IC50，考查目标化合物在APN抑制剂筛选中的应用。结果如下表。 
化合物 [S]/μM [E]/mIU IC50/μM
L1 22.5 1 0.35±0.05
Leu-p-nitroanilide 400 10 2.3±0.07
结果显示使用受试化合物测试得到的IC50与传统的Leu-p-nitroanilide相近，说明其可以在APN抑制剂筛选中使用。而且使用这个底物测试所用的酶量较少，大大降低了测试成本，为APN抑制剂的高通量筛选提供了一个有效的方法。 
实例七：目标化合物在APN抑制剂筛选中的应用（细胞水平） 
参比荧光探针受环境影响小，可以PBS和培养基中测定上市APN抑制剂乌苯美司对ES-2细胞（APN高表达）表面酶活的抑制活性，测试方法与实例六类似，结果如下表所示。 
化合物 测试体系 [S]/μM Cell/104 IC50/μM
L1 Medium 25 5 105.4±10.8
L1 PBS 25 5 39.1±1.5
Leu-p-nitroanilide PBS 320 20 20±1.7
结果表明，受试探针可以在培养基中准确地测定APN抑制剂的IC50。由于细胞在培养基中的存活时间远远大于缓冲盐溶液，比起传统的测试方法（PBS体系），该探针能够更加准确地在细胞水平筛选APN抑制剂。 

Claims (4)

1.一种氨基酸-荧光团类化合物，其结构通式为（Ⅰ）或（Ⅱ），或它们的游离形式， 
Figure FDA0000472558410000011
式中：R1为甲基、丙基或者2-甲硫基乙基；R2为7-羟基香豆素；X为C或者N。 
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，具有如下结构之一： 
Figure FDA0000472558410000012
。
3.如权利要求1-2任一项所述的化合物作为氨肽酶N的小分子荧光探针的应用。 
4.如权利要求1-2任一项所述的化合物作为参比荧光探针在筛选氨肽酶N抑制剂中的应用。 
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