CN102559686A - 脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用 - Google Patents
脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102559686A CN102559686A CN2011103801116A CN201110380111A CN102559686A CN 102559686 A CN102559686 A CN 102559686A CN 2011103801116 A CN2011103801116 A CN 2011103801116A CN 201110380111 A CN201110380111 A CN 201110380111A CN 102559686 A CN102559686 A CN 102559686A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- deoxynivalenol
- aptamer
- application
- nucleic acid
- acid aptamer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N deoxynivalenol Chemical compound C([C@@]12[C@@]3(C[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1C=C(C([C@@H](O)[C@@]13CO)=O)C)C)O2 LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N 0.000 title claims abstract description 96
- LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N vomitoxin hydrate Natural products OCC12C(O)C(=O)C(C)=CC1OC1C(O)CC2(C)C11CO1 LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 96
- 229930002954 deoxynivalenol Natural products 0.000 title claims abstract description 95
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 title claims abstract 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 67
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 claims description 2
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 claims description 2
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 claims description 2
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims description 2
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 claims description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 8
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- IDGRYIRJIFKTAN-HTJQZXIKSA-N 15-acetyldeoxynivalenol Chemical compound C([C@@]12[C@]3(C)C[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1C=C(C)C(=O)[C@@H](O)[C@@]13COC(=O)C)O2 IDGRYIRJIFKTAN-HTJQZXIKSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N Ethanolamine Oleate Chemical compound NCCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- MBMQEIFVQACCCH-XVNBXDOJSA-N (S,E)-Zearalenone Chemical compound O=C1OC(C)CCCC(=O)CCC\C=C\C2=CC(O)=CC(O)=C21 MBMQEIFVQACCCH-XVNBXDOJSA-N 0.000 description 1
- RPFLVLIPBDQGAQ-UHFFFAOYSA-N 1,2-diisothiocyanatobenzene Chemical class S=C=NC1=CC=CC=C1N=C=S RPFLVLIPBDQGAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 208000019926 Keshan disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 231100000570 acute poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- 235000011868 grain product Nutrition 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- -1 produce Chemical compound 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 231100000004 severe toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 229930013292 trichothecene Natural products 0.000 description 1
- LZAJKCZTKKKZNT-PMNGPLLRSA-N trichothecene Chemical compound C12([C@@]3(CC[C@H]2OC2C=C(CCC23C)C)C)CO1 LZAJKCZTKKKZNT-PMNGPLLRSA-N 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种与脱氧雪腐镰刀菌烯醇高特异性和高亲和力结合的核酸适体及其应用，该核酸适体可以用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测分析和分离富集，具有特异性好、亲和力高、品质均一、稳定性好、开发周期短、生产成本低、使用方便的特点。本发明还涉及所述核酸适体序列的衍生序列，包括修饰后的序列。
Description
(一)技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及利用分子生物学技术----SELEX技术设计和制备一种与脱氧雪腐镰刀菌烯醇高特异性和高亲和力结合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用。
(二)背景技术：
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又称呕吐毒素，是一种B型单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生，多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，也污染粮食制品。它对谷物污染率和污染水平居于镰刀菌毒素之首，不仅在赤霉病发展过程中具有重要作用，而且对人畜可以产生广泛的毒性效应，属于剧毒或中等毒物，可致呕吐、腹泻、发烧等急性中毒症状，与贫血、免疫抑制、食管癌、克山病也具有密切联系，另外，它还常与其它的霉卤毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互影响。因此监控DON的含量意义重大。
DON的检测可用多种不同的方法，如薄层色谱、酶联免疫、气相色谱、液相色谱、近红外光谱分析、荧光极性免疫分析等，其中酶联免疫法(ELISA)以快速、方便、预处理过程简捷占优，但其仍存在一定的问题。ELISA的主要缺点在于DON高效、特异的单抗或多抗制备工艺复杂，所用抗体普遍存在与DON的乙酰化类似物的交叉反应，使其检出值偏高，易出现假阳性；有些检测方法索性用较灵敏的3，5，7-三乙酰化DON免疫产生的抗体替代DON抗体，但这不但要求分析前对提取物进行乙酰化处理，而且检测出的为3一AcDON、15-AcDON和3，15-AcDON混合物的量。可以说，对于DON种毒性小分子，其抗体的制备周期长、生产成本高、技术难度大、批间差异大、克隆株(细胞)难以有效保存等难题，大大限制了酶联免疫吸附法等免疫学检测技术的快速发展。核酸适体(aptamer)是一种比抗体具有更高特异性的配基，甚至能识别单抗所不能区分的靶标分子单个取代基修饰的极细微差别，其作为一种特异性更好、亲和力更高、品质均一、稳定性好的抗体替代品，在检测分析领域中的应用已经被广为认可，并具有开发周期短、生产成本低、使用方便的特点，因此，核酸适体在DON这种拥有复杂结构类似物的毒性小分子的快速检测中具有良好的应用前景。
(三)发明内容：
本发明的目的在于提供一种采用新一代SELEX技术筛选得到的能够与脱氧雪腐镰刀菌烯醇高特异性和高亲和力结合的结构转换信号适体，并提供脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体在脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测分析和样品分离富集中的应用方法，具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适体具许多优势。
本发明的技术方案：一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体，其特征在于为核苷酸序列
GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序所示的DNA分子。
所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的衍生物具有相同功能用途。
所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的衍生物为核苷酸序列进行氨基化或巯基化或同位素化修饰。
所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的衍生物为核苷酸序列结合生物素或酶或地高辛或荧光物质或纳米发光材料。
一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的应用，其特征在于将脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测分析，它包括以下步骤：
(1)竞争板准备：50μg/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷或多聚赖氨酸100μl于4℃包被过夜，交联剂次亚苯基二异硫氰酸盐或戊二醛活化6h，200-2000pmol/ml NH2-引物100μl偶联，0.2mol/L乙醇胺或甘氨酸封闭2h，硼氢化钠还原，1％BSA封闭，PBS洗涤后备用；
(2)检测步骤：
①脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体5-10pmol，94℃ 3min、冰上5min变性；
②与0-100pmol靶标混匀，总体积100μl，加入板中，室温孵育30min；
③吸取50μl加入荧光板中，加入1∶200OliGreen 100μl，作用5min；
④测定荧光值(Ex：485nm，Em：525nm)。
标准曲线：通过6次重复试验，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。
灵敏度计算：通过6次重复试验，检测的标靶含量为0ng/ml±3*STDV。
重复性：标样重复测定5次，计算其测定离散度CV值。
回收率：以玉米甲醇提取物稀释50倍为样品，加入低、中、高浓度标准，重复测定3次，计算其回收率。
DON检测试剂盒：检测灵敏度：0.13ng/ml，重复性：CV＜7％
以玉米匀浆甲醇提取物为样品1∶50稀释，回收率见表：
一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的应用，其特征在于将脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体用于从样品中分离、富集脱氧雪腐镰刀菌烯醇，它包括以下步骤：
(1)将偶联有脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的磁颗粒与待分离的含脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶液充分混合；
(2)用磁分离器富集磁颗粒，并清洗，然后将脱氧雪腐镰刀菌烯醇从偶联有核酸适体的磁颗粒上解离，得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇单组份。
一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的互补序列的应用，其特征在于应用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测分析中，它包括以下步骤：
①脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测层析试纸条，其基本结构组成包括：支撑垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫等；
②胶体金结合垫上含有核酸适体与其互补序列组装的纳米颗粒聚集体(经生物素标记)6μl，硝酸纤维素膜上含有1-10mg/ml链霉亲和素2μl的检测线；
③检测时，将试纸条吸收板端插入待测样品的溶液中，约20s，液体完全湿润连接板并进入膜，取出纸条，放在平台上让液体继续流动，若待测液中无靶标，聚集体较大，不能随液流进入硝酸纤维素膜，不显色，若待测液中有靶标脱氧雪腐镰刀菌烯醇存在，可导致组装的聚集体解离而形成分散的纳米颗粒，分散的纳米颗粒随液流进入纤维素膜，纳米颗粒上的生物素标记物与膜上链霉亲和素结合，显红色，是为阳性结果，且显色程度与靶标浓度呈正比关系。
本发明一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的特性评测：
1、荧光定量PCR法评价脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的活性：
充分洗涤组装(通过其互补序列实现)有脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的磁颗粒，然后用终浓度1μM的脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行竞争，室温反应30min。以竞争反应产物为模板进行荧光定量PCR反应，采用Invitrogen公司的试剂盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG，20μl体系中含模板2μl、引物P1、P2各20pmol，退火温度65℃。同时设置以溶剂甲醇作为竞争物的对照组。
结果：
可见脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体对脱氧雪腐镰刀菌烯醇具有特异性亲和能力。
2、染料法评价脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的活性：
充分洗涤组装(通过其互补序列实现)有脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的磁颗粒，然后用终浓度1μM的脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行竞争，室温反应30min。Oligreen染料用结合缓冲液按1∶200稀释后，等比例加入竞争反应液中，室温避光反应2-5min，用480nm光激发，测定520nm处的发射光。同时设置以甲醇作为竞争物的对照组和结合缓冲液本底对照组。
结果本底对照组未检测到发射光，实验组荧光强度显著高于甲醇对照组，可见脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体对脱氧雪腐镰刀菌烯醇具有特异性亲和能力。
3、经基团修饰的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的活性评价：
依荧光定量PCR法评价脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的活性的方法，用荧光定量PCR法分别进行氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、巯基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、同位素化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、生物素标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、HRP标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、AP标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、地高辛标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、TAMRA标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、以及纳米发光材料Y2SiO5:Eu标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的活性评价。
结果：
可见氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、巯基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、同位素化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、生物素标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、HRP标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、AP标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、地高辛标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、TAMRA标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体、以及纳米发光材料Y2SiO5:Eu标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体对脱氧雪腐镰刀菌烯醇均具有特异性亲和能力。
本发明的优点是：1)本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本；2)具有比抗体更高的亲和性和特异性；3)便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；4)重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感；5)核酸适体技术具有良好的应用前景，特别是在检测分析领域。
(四)具体实施方式：
实施例：一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体，其特征在于为核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序所示的DNA分子。
本发明中用于SELEX的单链DNA随机库及引物由Takara公司合成，两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列：5’GCATCACTACAGTCATTACGCATCG-(N35)-ATCGTGTGAAGTGCTGTCCC 3’，库容量为1014以上，引物l：5’GCATCACTACAGTCATTACGCA-3’，引物2：5’GGGACAGCACTTCACACGAT 3’，引物3：5’GCGTAATGACAAAAAAAAAAACAT-C6-NH2 3’，引物4：5’Biotin-GGGACAGCACTTCACACGAT 3’。脱氧雪腐镰刀菌 烯醇购自ALEXIS公司，磁珠购于invitrogen公司，寡核苷酸的纯化试剂购于Qiagen公司，PCR试剂盒和T载体购于普洛麦格(Promega)公司。
一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的筛选制备：
将初始文库通过互补序列偶联于磁颗粒上，以溶剂为反筛分子、脱氧雪腐镰刀菌烯醇为筛选分子进行筛选。在脱氧雪腐镰刀菌烯醇存在下，与其有结合能力的寡核苷酸序列从磁颗粒上解离，经PCR扩增后，采用亲和分离纯化法制备次级文库，重复筛选8轮，克隆测序，获得脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单克隆核酸适体。
一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的应用，其特征在于将脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测分析，它包括以下步骤：
(1)竞争板准备：多聚赖氨酸(50μg/ml，CBS)100μl于4℃包被过夜，戊二醛(2.5％，PBS)活化6h，NH2-引物(2000pmol/ml，PBS)100μl偶联，乙醇胺(0.2mol/L，pH8.0)封闭2h，硼氢化钠还原，BSA(1％，PBS)封闭，PBS洗涤后备用；
(2)检测步骤：
①脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体5-10pmol，94℃ 3min、冰上5min变性；②与靶标(0-100pmol)混匀，总体积100μl，加入板中，室温孵育30min；③吸取50μl加入荧光板中，加入100μl OliGreen(1∶200，TAE)，作用5min；④测定荧光值(Ex：485nm，Em：525nm)。
标准曲线：通过6次重复试验，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。
灵敏度计算：通过6次重复试验，检测的标靶含量为0ng/ml±3*STDV。
重复性：标样重复测定5次，计算其测定离散度CV值。
回收率：以玉米甲醇提取物稀释50倍为样品，加入低、中、高浓度标准，重复测定3次，计算其回收率。
DON检测试剂盒：检测灵敏度：0.13ng/ml，重复性：CV＜7％
以玉米匀浆甲醇提取物为样品1∶50稀释，回收率见表：
一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的应用，其特征在于将脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体用于从样品中分离、富集脱氧雪腐镰刀菌烯醇，它包括以下步骤：
将偶联有脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的磁颗粒与待分离的含脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶液充分混合，用磁分离器富集磁颗粒，并清洗，然后将脱氧雪腐镰刀菌烯醇从偶联有核酸适体的磁颗粒上解离，得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇单组份。
一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的互补序列的应用，其特征在于应用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测分析中，它包括以下步骤：
①脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测层析试纸条，其基本结构组成包括：支撑垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫等；
②胶体金结合垫上含有核酸适体与其互补序列组装的纳米颗粒聚集体(经生物素标记)6μl，硝酸纤维素膜上含有10mg/ml链霉亲和素2μl的检测线；
③检测时，将试纸条吸收板端插入待测样品的溶液中，约20s，液体完全湿润连接板并进入膜，取出纸条，放在平台上让液体继续流动，若待测液中无靶标，聚集体较大，不能随液流进入硝酸纤维素膜，不显色，若待测液中有靶标脱氧雪腐镰刀菌烯醇存在，可导致组装的聚集体解离而形成分散的纳米颗粒，分散的纳米颗粒随液流进入纤维素膜，纳米颗粒上的生物素标记物与膜上链霉亲和素结合，显红色，是为阳性结果，且显色程度与靶标浓度呈正比关系。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>国家纳米技术与工程研究院
<120>脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用
<130>
<140>
<141>
<160>1
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gcatcactac agtcattacg catcgtaggg gggatcgtta aggaagtgcc cggaggcggt
60
atcgtgtgaa gtgctgtccc
80
Claims (6)
1.一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体，其特征在于为核苷酸序列
GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序列所示的DNA分子。
2.根据权利要求1所述一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体，其特征在于与所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体具有相同功能用途的衍生物为核苷酸序列进行氨基化或巯基化或同位素化修饰。
3.根据权利要求1所述一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体，其特征在于与所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体具有相同功能用途的衍生物为核苷酸序列结合生物素或酶或地高辛或荧光物质或纳米发光材料。
4.一种权利要求1所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的应用，其特征在于用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测分析。
5.一种权利要求1所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的应用，其特征在于用于从样品中分离、富集脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
6.一种权利要求2或3所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体衍生物的应用，其特征在于应用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测分析和分离富集中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011103801116A CN102559686A (zh) | 2011-11-25 | 2011-11-25 | 脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011103801116A CN102559686A (zh) | 2011-11-25 | 2011-11-25 | 脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102559686A true CN102559686A (zh) | 2012-07-11 |
Family
ID=46406292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011103801116A Pending CN102559686A (zh) | 2011-11-25 | 2011-11-25 | 脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102559686A (zh) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105695473A (zh) * | 2016-03-09 | 2016-06-22 | 湖南科技大学 | 真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法及检测试剂盒 |
| CN106645344A (zh) * | 2016-11-08 | 2017-05-10 | 湖南科技大学 | 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的制备方法及其应用 |
| CN107262074A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-10-20 | 北京美正生物科技有限公司 | 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇适配体亲和柱及其制备方法和用途 |
| CN107807034A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-16 | 北京农业质量标准与检测技术研究中心 | 一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱及其制备方法与应用 |
| CN109833648A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-06-04 | 北京农业质量标准与检测技术研究中心 | 呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱及其制备方法与应用 |
| CN110885827A (zh) * | 2019-11-26 | 2020-03-17 | 昆明理工大学 | 与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体、制备方法及应用 |
| CN110923238A (zh) * | 2019-11-26 | 2020-03-27 | 昆明理工大学 | 与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体、制备方法及应用 |
| CN113774063A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-12-10 | 北京农业质量标准与检测技术研究中心 | 呕吐毒素特异性核酸适配体及应用 |
| CN115165807A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-10-11 | 江苏科技大学 | 基于AuNPs多聚体的FOLSPR适配体传感器及其制备方法与应用 |
| CN116466068A (zh) * | 2023-03-31 | 2023-07-21 | 上海市农业科学院 | 一种用于检测don的荧光生物传感器及其制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008141351A1 (de) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Erber Aktiengesellschaft | Verfahren zur quantitativen bestimmung von analyten mit einem testelement sowie testsystem und verwendung desselben |
| CN101915830A (zh) * | 2010-07-19 | 2010-12-15 | 江南大学 | 一种赭曲霉毒素a荧光检测试纸条及其应用 |
-
2011
- 2011-11-25 CN CN2011103801116A patent/CN102559686A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008141351A1 (de) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Erber Aktiengesellschaft | Verfahren zur quantitativen bestimmung von analyten mit einem testelement sowie testsystem und verwendung desselben |
| CN101915830A (zh) * | 2010-07-19 | 2010-12-15 | 江南大学 | 一种赭曲霉毒素a荧光检测试纸条及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 冯香玲: "采用SELEX技术筛选脱氧雪腐镰刀菌烯醇适配子的初步研究", 《万方数据库硕士学位论文》 * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105695473B (zh) * | 2016-03-09 | 2020-02-21 | 湖南科技大学 | 真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法及检测试剂盒 |
| CN105695473A (zh) * | 2016-03-09 | 2016-06-22 | 湖南科技大学 | 真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法及检测试剂盒 |
| CN106645344A (zh) * | 2016-11-08 | 2017-05-10 | 湖南科技大学 | 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的制备方法及其应用 |
| CN106645344B (zh) * | 2016-11-08 | 2018-07-17 | 湖南科技大学 | 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的制备方法及其应用 |
| CN107262074A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-10-20 | 北京美正生物科技有限公司 | 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇适配体亲和柱及其制备方法和用途 |
| CN107807034A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-16 | 北京农业质量标准与检测技术研究中心 | 一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱及其制备方法与应用 |
| CN109833648A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-06-04 | 北京农业质量标准与检测技术研究中心 | 呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱及其制备方法与应用 |
| CN109833648B (zh) * | 2019-01-15 | 2021-02-26 | 北京农业质量标准与检测技术研究中心 | 呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱及其制备方法与应用 |
| CN110885827A (zh) * | 2019-11-26 | 2020-03-17 | 昆明理工大学 | 与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体、制备方法及应用 |
| CN110923238A (zh) * | 2019-11-26 | 2020-03-27 | 昆明理工大学 | 与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体、制备方法及应用 |
| CN113774063A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-12-10 | 北京农业质量标准与检测技术研究中心 | 呕吐毒素特异性核酸适配体及应用 |
| CN115165807A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-10-11 | 江苏科技大学 | 基于AuNPs多聚体的FOLSPR适配体传感器及其制备方法与应用 |
| CN115165807B (zh) * | 2022-06-28 | 2025-01-24 | 江苏科技大学 | 基于AuNPs多聚体的FOLSPR适配体传感器及其制备方法与应用 |
| CN116466068A (zh) * | 2023-03-31 | 2023-07-21 | 上海市农业科学院 | 一种用于检测don的荧光生物传感器及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102559686A (zh) | 脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用 | |
| CN102517289A (zh) | 黄曲霉毒素b1核酸适体及其应用 | |
| CN102517288A (zh) | 赭曲霉毒素a核酸适体及其应用 | |
| CN103852460B (zh) | 基于适配体的磁纳米荧光传感器检测抗生素多残留的方法 | |
| CN102443585A (zh) | 玉米赤霉烯酮核酸适体及其应用 | |
| Wang et al. | Label-free colorimetric aptasensor for sensitive detection of ochratoxin A utilizing hybridization chain reaction | |
| Pal et al. | Sensitivity and specificity performance of a direct-charge transfer biosensor for detecting Bacillus cereus in selected food matrices | |
| Li et al. | Rapid detection of Escherichia coli O157: H7 by a fluorescent microsphere-based immunochromatographic assay and immunomagnetic separation | |
| Lv et al. | A simple and sensitive approach for ochratoxin A detection using a label-free fluorescent aptasensor | |
| CN107121402B (zh) | 一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法 | |
| CN102703453B (zh) | 特异性识别链霉素的dna适配体及其应用 | |
| CN105548109A (zh) | 一种重金属镉的荧光检测体系以及检测方法 | |
| CN107446929B (zh) | 特异识别赭曲霉毒素a的核酸适配体及其制备方法 | |
| Ni et al. | Fluorescent aptasensor for 17β-estradiol determination based on gold nanoparticles quenching the fluorescence of Rhodamine B | |
| CN101892294A (zh) | 基于磁珠电化学发光基因传感器检测汞离子的方法及应用 | |
| CN101963615A (zh) | 用于光谱分析的试剂和方法 | |
| Xia et al. | Screening and identification of an aptamer as novel recognition molecule in the test strip and its application for visual detection of ethyl carbamate in liquor | |
| CN104458684A (zh) | 基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法 | |
| CN107389919A (zh) | 一种免标记荧光适配体传感器及其制备方法和应用 | |
| CN101358963A (zh) | 一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法 | |
| Chen et al. | A microchip electrophoresis-based assay for ratiometric detection of kanamycin by R-shape probe and exonuclease-assisted signal amplification | |
| CN103013999B (zh) | 一组特异识别伏马菌素b1的寡核苷酸适配子 | |
| Li et al. | Simultaneous detection of three zoonotic pathogens based on phage display peptide and multicolor quantum dots | |
| CN107119054A (zh) | 基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒及其应用 | |
| CN110031441A (zh) | 一种赭曲霉毒素的检测试剂盒及其检测赭曲霉毒素的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120711 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |