CN102559599A - Vero-SIAT1细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及构建一种Vero-SIAT1细胞系，并且在此细胞系内繁殖流行性感冒病毒的方法，以及由此方法制备的新型流行性感冒灭活疫苗。特别是公开了一种在Vero-SIAT1细胞内繁殖流行性感冒病毒的方法，将流行性感冒病毒接种Vero-SIAT1细胞，培养、收获病毒液，经灭活、纯化制备单价原液。本发明属于疫苗制备工艺技术领域。

Description

Vero-SIAT1细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及构建一种Vero-SIAT1细胞系，并且在此细胞系内繁殖流行性感冒病毒的方法，以及由此方法制备的新型流行性感冒灭活疫苗。特别是公开了一种在Vero-SIAT1细胞内繁殖流行性感冒病毒的方法，将流行性感冒病毒接种Vero-SIAT1细胞，培养、收获病毒液，经灭活、纯化制备单价原液。本发明属于疫苗制备工艺技术领域。 

背景技术

流行性感冒(简称流感)是由流行性感冒病毒(简称流感病毒)引起的急性呼吸道传染病，临床表现为发热、头痛、肌痛、乏力、鼻炎、咽痛和咳嗽，可有肠胃不适。流感能加重潜在的疾病(心肺疾患)或者引起继发细菌性肺炎或原发流感病毒性肺炎，老年人以及患有各种慢性病或者体质虚弱者患流感后容易出现严重并发症。流感病毒传播迅速、流行广泛，抗原易变异，人群的特异性免疫状况不稳定。 

流感病毒属正粘液病毒科，根据其各自核壳内抗原差异分为甲型、乙型和丙型三种病毒。其中甲型和乙型流感对人类威胁较大。流感流行具有一定的季节性，我国北方地区的流行一般均发生在冬季，南方四季都有病例发生，发病高峰在夏季和冬季。甲型流感病毒在动物(包括猪、马和各种禽类)以及人类中均有发现。虽然出现少数例外，但人类一般感染H1、H2或H3和N1或N2亚型病毒。动物亚型的流感病毒偶尔直接引起人类流感。虽然此类病毒感染人类机率不高，但病死率很高。虽然乙型流感病毒大多与低发病率和轻型流感有关，但偶尔也可引起与甲型流感病毒一样严重的流行。乙型流感病毒只感染人类，主要是儿童期的病原体。乙型流感病毒的抗原性变异程度不如甲型流感病毒。流感病毒由呼吸 道分泌物传播给易感人群，主要因子是由感染者打喷嚏、咳嗽或甚至交谈产生的小颗粒气溶胶。 

流感是由一种极易突变的病毒引起的高传染性疾病。据WHO估计，在爆发性流行时，它可在全世界迅速传播，影响总人口的10％至20％。即使在非爆发性流行的年份，流感每年也造成300万至500万严重病例和25万至50万例死亡。目前唯一可行的流感预防措施是疫苗接种。流感疫苗使用以来已有50多年的历史，国内外普遍使用的是流感灭活疫苗，系将流感病毒在鸡胚中培养后经甲醛或β丙内酯灭活制成。当前的疫苗共有3种类型：①全病毒疫苗，由完整的流感病毒颗粒组成，含有表面抗原和内部抗原，具有良好的免疫原性，但反应原性也较强。病毒包膜中的类脂质属致热原，常引起发热反应。②裂解病毒疫苗，系将流感病毒用裂解剂裂解，纯化后制成。该疫苗去除了病毒核酸和大分子蛋白，但保留HA和NA蛋白以及部分基质M蛋白和核蛋白(NP)，与全病毒疫苗相比，免疫原性和安全性均较好，目前在国内外广泛使用。③亚单位疫苗，流感病毒经裂解和进一步纯化后制备的仅含HA和NA蛋白的疫苗，具有安全有效和不良反应少的特点。后两种疫苗可用于儿童。 

采用鸡胚培养技术生产流感疫苗安全、有效，而且涉及的病毒安全性问题少，但也存在着一定的局限性，如生产过程中细菌污染(内毒素)的问题、有待开发高生长毒株、残留卵清蛋白问题(对鸡蛋过敏者不适用)、潜在的新的禽类外源因子污染问题以及生产规模小、生产时间长、在流感大流行的情况下很难在短时间内购置生产新疫苗所需的数百万只鸡蛋等。因此，许多疫苗生产商都在研究细胞培养法，细胞培养疫苗使人们能够对一年中任何时间发生的流行病或大流行均作出快速应答，并能避免污染的鸡胚(可能影响生物负荷和疫苗内毒素含量)的危险。而且在哺乳动物细胞中生长的流感病毒比鸡胚培养分离的病毒 更接近于临床样本中的病毒，因此可能生产出更有效的疫苗。 

甲型和乙型流感病毒通过HA蛋白结合宿主细胞表面糖脂或糖蛋白上的唾液酸寡糖。人类流感病毒优先地结合α2，6-唾液酸，但是禽流感病毒主要结合α2，3-唾液酸。人类气管上皮细胞主要包括α2，6-唾液酸，然而鸭肠上皮细胞主要具有α2，3-唾液酸。因此增加α2，6连接受体水平将会增加人流流感病毒和细胞表面的相互作用，进而使流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型在细胞中繁殖具有更高的病毒滴度。 

Vero细胞是WHO允许用于疫苗生产的细胞株，它对多种病毒敏感，对流感病毒也同样敏感。虽然Vero细胞中存在α2，6-唾液酸，但是它的含量没有人气管上皮细胞的量高，导致人类流感病毒在Vero细胞中的繁殖滴度不高。在我们的发明中，稳定地转染Vero细胞用SIAT1的eDNA，进而增加人类流感病毒的受体。Vero-SIAT1细胞系不仅有利于繁殖人类流感病毒，而且有利于流感疫苗的研究。 

发明内容

本发明构建一种Vero-SIAT1细胞系，并且提供了一种新型流行性感冒疫苗的制备方法，以解决目前存在的以鸡胚为培养基质制造流感疫苗的安全性、培养基质来源等问题。 

构建Vero-SIAT1细胞系：稳定地转染Vero细胞用SIAT1的eDNA，它的产物催化糖蛋白上的半乳糖α2，6-唾液酸化作用，进而增加人类流感病毒的受体。Vero细胞被带有SIAT1的cDNA和新霉素抗性基因的质粒转染，并且被G418硫酸盐筛选。稳定转染后，通过Western blot和免疫荧光显微技术证明，在Vero细胞中过表达SIAT1基因。通过SNA和MAA染色方法表明，与亲本的vero细胞相比，稳定转染的vero细胞分别表达7倍高量的α2，6-唾液酸，和3倍低量的α2，3-唾液酸。此外，流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型在Vero-SIAT1细胞中繁殖具有更 高的病毒滴度。 

将流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型分别按1∶10^-1～1∶10^-7接种于以含如下成分病毒培养液的已长至单层的Vero-SIAT1细胞：MEM培养液；0.2～2％牛血清白蛋白；2μg/ml～20μg/ml胰蛋白酶或TPCK处理的胰蛋白酶；使用HEPES或5％～8％碳酸氢钠溶液调整溶液pH值至7.0～8.0；20μg/ml～500μg/ml的新霉素。于33℃～35℃条件下培养至细胞病变(CPE)达到+++～+++++时，收获含流行性感冒病毒的上清液；以此病毒培养液采用如上方法传代，建立新型流行性感冒灭活疫苗生产用原始种子库、主种子库及工作种子库。 

以工作种子库病毒液用如上方法感染Vero-SIAT1细胞，收获病毒液以1∶100～1∶10000甲醛溶液或β-丙内酯灭活；采用DEAE Streamline和/或DEAESepharose FF和/或Sepharose 4FF层析方法进行纯化，获得病毒原液(层析条件：DEAE Streamline和/或DEAE Sepharose FF的基础缓冲液：pH6.8-8.0、0.001-0.2Mol/l PBS缓冲液或Tris缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为0.01-1Mol/l；Sepharose 4FF洗脱缓冲液为pH6.8-8.0、0.001-0.2Mol/l PBS缓冲液、含0.1-0.15Mol/l氯化钠)；用SRID法检测病毒抗原含量(标准抗原及标准抗血清由NIBSC提供)，调节原液的抗原含量，制备流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型单价或多价混合半成品；将半成品进行分装，检定合格后即为成品——流行性感冒疫苗。 

本发明的优点是：本发明第一次通过构建的方法得到稳定表达SIAT1的Vero-SIAT1细胞系，并且提供了利用Vero-SIAT1细胞生产流行性感冒疫苗的生产工艺方法。 

附图说明

图1为本发明pcDNA3.1-SIAT1-cmyc载体构建。我们通过基因合成的方法得到pBluescript-SIAT1载体，然后在SIAT1基因后加上cmyc标签，目的是为了检测方便，最后连接到pcDNA3.1(-)载体上筛选并表达目的基因SIAT1。A.以pBluescript-SIAT1载体为模板，PCR得到SIAT1-cmyc片段；B.将SIAT1-cmyc片段连接到pcDNA3.1(-)载体上得到pcDNA3.1-SIAT1-cmyc；C.用Not I和BamHI双酶切鉴定pcDNA3.1-SIAT1-cmyc，结果正确。 

图2为Western检测Vero细胞中SIAT1蛋白表达。Mock是正常的vero细胞，pcDNA3.1是48h瞬时转染vero细胞的空载体作为阴性对照，SIAT1-cmyc是48h瞬时转染vero细胞的带有目的片段载体作为阳性对照，Vero-SIAT1-cmyc是带有SIAT1-cmyc的稳定转染的vero细胞系。从图中可以看到，与Mock和pcDNA3.1阴性对照相比，Vero-SIAT1-cmyc实验组明显高表达SIAT1目的片段，而且它也比阳性对照组表达量高，说明我们筛选的稳定转染表达SIAT1细胞系能够高表达SIAT1目的基因。 

图3为免疫细胞化学染色的方法检测Vero细胞中SIAT1蛋白表达。与Mock和pcDNA3.1阴性对照相比，Vero-SIAT1-cmyc实验组明显高表达SIAT1目的片段，而且它也明显比阳性对照组表达量高，说明我们筛选的稳定转染表达SIAT1细胞系能够高表达SIAT1目的基因。 

图4为利用western方法，SNA检测α-2，6连接糖苷键，MAA检测α-2，3连接糖苷键。与Mock和pcDNA3.1阴性对照相比，Vero-SIAT1-cmyc实验组的α-2，6连接糖苷键明显增加，而α-2，3连接糖苷键明显减少，说明vero细胞系过表达SIAT1基因后，能够催化α-2，6连接糖苷键的形成，竞争性的减少α-2，3连接糖苷键。阳性对照组变化不明显，可能是因为48h的时间比较短，虽然SIAT1基因已经表达，但是对于催化功能还不是很明显，而且阳性对照组的SIAT1基 因表达量明显低于稳转实验组。 

图5为噬斑实验检测H1N1流感病毒在Vero和Vero稳转细胞中的病毒滴度。与Mock相比，在感染相同量的H1N1流感病毒后，Vero-SIAT1-cmyc实验组细胞的滴定度明显提高，提高4.9倍。 

图6为在Vero和Vero-SIAT1-cmyc细胞中比较人类流感病毒的复制效率。与Vero细胞相比，在感染相同量的H3N2和B型流感病毒后，Vero-SIAT1-cmyc实验组细胞的滴定度明显提高，分别提高4.1和2.8倍。 

优选实施方式 

实施例1 

将流行性感冒病毒A1亚型按1∶10^-4接种于使用HEPES调pH值至7.0的、含1％牛血清白蛋白、5μg/ml胰蛋白酶、200μg/ml的新霉素的MEM病毒培养液的已长至单层的Vero-SIAT1细胞；于35℃条件下培养至细胞病变(CPE)达到+++～+++++时，收获含流行性感冒病毒的上清液。 

实施例2 

将流行性感冒病毒A1业型按1∶10^-7接种于使用5％～8％碳酸氢钠溶液调整溶液pH值至7.5的、含0.2％牛血清白蛋白、20μg/ml胰蛋白酶、20μg/ml的新霉素的MEM病毒培养液的已长至单层的Vero-SIAT1细胞；于35℃条件下培养至细胞病变(CPE)达到+++～+++++时，收获含流行性感冒病毒的上清液。 

实施例3 

将流行性感冒病毒A1亚型按1∶10^-1接种于使用5％～8％碳酸氢钠溶液调整溶液pH值至8.0的、含2％牛血清白蛋白、2μg/ml胰蛋白酶、500μg/ml的新霉素的MEM病毒培养液的已长至单层的Vero-SIAT1细胞；于35℃条件下培养至细胞 病变(CPE)达到+++～+++++时，收获含流行性感冒病毒的上清液。 

实施例4 

采用实施例1-3中任一方法收获流行性感冒病毒A3亚型和B型病毒液。 

实施例5 

采用实施例1-3中任一方法建立新型流行性感冒病毒A1、A3亚型和B型生产用原始种子库、主种子库及工作种子库。 

实施例6 

以流行性感冒病毒A1亚型工作种子库病毒液用实施例1-3中任一方法感染Vero-SIAT1细胞，收获病毒液以1∶100甲醛溶液灭活；采用DEAE Streamlin层析方法进行纯化，层析条件：DEAE Streamline基础缓冲液：pH6.8、0.001Mol/lPBS缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为0.01Mol/l；获得病毒原液；用SRID法检测病毒抗原含量。 

实施例7 

以流行性感冒病毒A1亚型工作种子库病毒液用实施例1-3中任一方法感染Vero-SIAT1细胞，收获病毒液以1∶1000β-丙内酯灭活；采用DEAE Sepharose FF层析方法进行纯化，层析条件：DEAE Sepharose FF的基础缓冲液：pH8.0、0.2Mol/l Tris缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为1Mol/l；获得病毒原液；用SRID法检测病毒抗原含量 

实施例8 

以流行性感冒病毒A1亚型工作种子库病毒液用实施例1-3中任一方法感染Vero-SIAT1细胞，收获病毒液以1∶10000甲醛溶液灭活，采用Sepharose 4FF层析方法进行纯化，Sepharose 4FF洗脱缓冲液为pH7.5、0.1Mol/l PBS缓冲液、含0.1Mol/l氯化钠；获得病毒原液；用SRID法检测病毒抗原含量。 

实施例9 

采用实施例7-9方法获得流行性感冒病毒A3亚型及B型病毒原液。 

实施例10 

分别调节流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型病毒原液的抗原含量，制备流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型单价灭活疫苗半成品。 

实施例11 

调节原液的抗原含量，混合流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型病毒原液，制备三价流行性感冒灭活疫苗半成品。 

实施例12 

将半成品进行分装，检定合格后即为成品——流行性感冒灭活疫苗。 

Claims (7)

1.构建一种Vero-SIAT1细胞系，该细胞系可作为制备新型流行性感冒疫苗的基质。其特征在于：

稳定地转染Vero细胞用人类α2，6-唾液酸转移酶(SIAT1)的cDNA，它的产物催化糖蛋白上的半乳糖α2，6-唾液酸化作用，进而增加人类流感病毒的受体。Vero细胞被带有SIAT1的cDNA和新霉素抗性基因的质粒转染，并且被G418硫酸盐筛选。稳定转染后，通过Western blot和免疫荧光显微技术证明，在Vero细胞中过表达SIAT1基因。通过SNA和MAA染色方法表明，与亲本的vero细胞相比，稳定转染的vero细胞分别表达7倍高量的α2，6-唾液酸，和3倍低量的α2，3-唾液酸。此外，流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型在Vero-SIAT1细胞中繁殖具有更高的病毒滴度。Vero-SIAT1细胞系不仅有利于繁殖人类流感病毒，而且有利于流感疫苗的研究。

2.利用Vero-SIAT1细胞系制备新型流行性感冒灭活疫苗的方法，其特征在于：

1)分别将流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型经病毒培养液稀释后以1∶10^-1～1∶10^-7接种已长至单层的Vero-SIAT1细胞，于33℃～35℃条件下培养至细胞病变(CPE)达到+++～+++++时，分别收获含流行性感冒病毒的上清液；

2)选择步骤1)得到的上清液，分别建立新型流行性感冒灭活疫苗生产用原始种子库、主种子库及工作种子库；

3)分别使用工作种子库病毒液采用步骤1)的方法感染Vero-SIAT1细胞，将所获病毒液进行灭活；

4)已灭活的病毒抗原采用层析方法进行分别纯化，获得各病毒原液；

5)检测各病毒原液的抗原含量，

6)分别调节流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型病毒原液的抗原含量，制备流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型单价灭活疫苗半成品；或调节各原液的抗原含量，混合流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型病毒原液，制备三价流行性感冒灭活疫苗半成品。

3.权利要求2所述方法，其中流行性感冒病毒感染Vero-SIAT1细胞的条件：

病毒培养液的成份：

MEM培养液；

0.2～2％牛血清白蛋白；

2μg/ml～20μg/ml胰蛋白酶或TPCK处理的胰蛋白酶；

使用HEPES或5％～8％碳酸氢钠溶液调整溶液pH值至7.0～8.0；

20μg/ml～500μg/ml的新霉素。

4.权利要求2所述方法，其中灭活病毒所用试剂包括1∶100～1∶10000甲醛溶液及β-丙内酯。

5.权利要求2所述方法，其中提纯病毒用层析介质包括DEAEStreamline，DEAE Sepharose FF，Sepharose 4FF。

6.权利要求2所述方法，层析条件是：DEAE Streamline和/或DEAESepharose FF的基础缓冲液：pH6.8-8.0、0.001-0.2Mol/l PBS缓冲液或Tris缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为0.01-1Mol/l；Sepharose 4FF洗脱缓冲液为pH6.8-8.0、0.001-0.2Mol/l PBS缓冲液、含0.1-0.15Mol/l氯化钠。

7.权利要求1所述产品，为制备的流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型的单价或各亚型的多价混合物。

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