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CN102507671A - 一种多孔硅生物芯片及其制备方法 - Google Patents

一种多孔硅生物芯片及其制备方法 Download PDF

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CN102507671A CN2011103066473A CN201110306647A CN102507671A CN 102507671 A CN102507671 A CN 102507671A CN 2011103066473 A CN2011103066473 A CN 2011103066473A CN 201110306647 A CN201110306647 A CN 201110306647A CN 102507671 A CN102507671 A CN 102507671A
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种多孔硅生物芯片及其制备方法。本发明提供的多孔硅制备方法是采用氧化模式为恒电流电解、电流密度3mA/cm2、电解时间为500～700秒的电化学阳极氧化技术对单面抛光硅片进行腐蚀得到多孔硅，之后利用功能化的硅烷偶联剂对多孔硅表面进行功能化修饰，得到含有活性基团的修饰层，然后以功能化的多孔硅为载体制备多孔硅生物芯片。本发明所述制备方法简便，设备需求少，适宜进行大批量生产。利用本发明所述方法制备得到的多孔硅生物芯片具有灵敏度高，选择性好和重现性佳等优点，可用于生物大分子的相互作用的研究。

Description

一种多孔硅生物芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种多孔硅生物芯片及其制备方法。
背景技术
多孔硅材料是一种通过电化学氧化单晶硅而形成的、具有海绵状结构的新型硅纳米材料，由于其独特的组织结构及量子效应，使其具有高效率的光致发光和电致发光特性，因此，多孔硅被认为是有着巨大应用前景的材料之一。同时，作为硅基材料，多孔硅不但具有优良的物理光电子性能，还具有巨大的比表面积，良好的化学活性和生物相容性，这都为多孔硅应用于生物分子、细胞及组织的换能传感器，无机非金属生物材料及生物医学等方面提供了可能性(硅材料和器件，Silicon-Based Material and Devices，Edited by HariSingh Nalwa，2001，Academic Press)。
目前，在生物传感领域中，根据法布里-珀罗干涉效应制备的多孔硅光学传感器应用最为广泛，其利用多孔硅反射干涉光谱图的变化，可以实现对生物分子、细菌、病毒等的检测(科学，Science，1997，278，840-842；美国化学学会杂志，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，12108-12116；美国化学学会杂志，J.Am.Chem.Soc.，2005，127，11636-11645；分析化学，Anal.Chem.，2007，79，1502-1506；实用新材料，Adv.Funct.Mater.，2010，20，2269-2277；分析化学，Anal.Chem.，2011，83，3282-3289)。
生物芯片是目前基因组学、蛋白组学研究的重要工具，具有高通量、自动化、样品消耗量小等优点。但目前，生物芯片主要以玻璃为载体，因而在检测手段的多样性及与其它高灵敏检测技术的集成方面尚具有一定的缺点。因此，拓展半导体材料在生物芯片载体方面的应用对其发展具有重要意义。将多孔硅半导体材料与生物芯片技术相结合，有助于推动微电子技术和光电子技术在生物芯片领域的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是提供一种选择型好，灵敏度高的多孔硅生物芯片及其制备方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种多孔硅生物芯片的制备方法，包括：
步骤1：将单面抛光硅片的抛光面与电解液接触并通过电解液接阴极电压，背面与导体接触并通过导体接阳极电压，然后进行电化学阳极氧化得到多孔硅，其中，所述氧化模式为恒电流电解、电流密度3mA/cm2、电解时间为500～700秒；
步骤2：对步骤1制得的多孔硅进行功能化修饰，然后利用生物芯片点样系统均匀滴加生物大分子标准液即得。
本发明采用电化学阳极氧化技术对单面抛光硅片进行腐蚀得到多孔硅。其中，所述单面抛光硅片优选为电阻率为1-10Ω/cm，晶向为<100>单面抛光的p型掺硼单晶硅。
本发明所述电化学阳极氧化的氧化模式为恒电流电解、电流密度3mA/cm2、电解时间为500～700秒。优选为电解时间为600秒。
优选的，本发明所述电化学阳极氧化过程中所述电解液为体积分数为25％的氢氟酸乙醇溶液。
按照本发明，在进行电化学腐蚀之前，需要对硅片进行彻底的清洗，以去除硅片表面原有的氧化层，因此在步骤1之前还包括对所述单面抛光硅片进行表面清洗的步骤。
其中，作为优选，本发明所述硅片表面清洗具体包括：
步骤a：将硅片依次放入丙酮、环己烷、丙酮、无水乙醇中进行超声清洗，每次清洗时间为3分钟，自然晾干；
步骤b：将晾干的硅片放入体积比为3∶1浓硫酸与双氧水的溶液中，至硅片表面不再有气泡产生取出，先用大量冷去离子水冲洗，再用热去离子水冲洗干净；
步骤c：洗净的硅片浸入体积分数为5％的氢氟酸水溶液，浸泡1分钟，然后用去离子水冲洗干净，放入无水乙醇中备用。
本发明所述多孔硅生物芯片的制备方法在制得多孔硅后需要对多孔硅进行功能化修饰，以使多孔硅表面具有与不同生物大分子结合所需的功能化基团。在一些实施例中，本发明所述制备方法步骤3所述功能化修饰为环氧化修饰，以结合糖类物质，制备多孔硅糖芯片。
作为优选，本发明所述环氧化修饰具体为利用硅烷偶联剂在氮气流保护下，120℃，搅拌回流24小时，即得。其中，作为优选，所述硅烷偶联剂为质量分数为1％的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的无水N，N-二甲基甲酰胺溶液。
本发明所述制备方法步骤2在对步骤1制得的多孔硅进行功能化修饰后，利用生物芯片点样系统均匀滴加生物大分子标准液制备得到多孔硅生物芯片。其中，所述生物大分子包括蛋白、核酸、糖类、脂类以及它们相互结合的产物，如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白等。在一些实施例中，本发明所述生物大分子为糖类，即制得的多孔硅生物芯片为糖类生物芯片。在某些实施例中，所述糖类为4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖或4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖，所述点样液还包括：体积分数20％的甘油和pH7.5的含有0.15mol/L氯化钠的0.3mol/L磷酸盐缓冲溶液。点样后，所述多孔硅芯片在25℃、真空环境下，反应12小时，反应后，选用质量分数为0.5％的牛血清白蛋白对未反应的环氧基团进行封闭后即得。
本发明还提供了利用本发明所述制备方法制备的多孔硅生物芯片。
本发明提供的多孔硅制备方法是采用氧化模式为恒电流电解、电流密度3mA/cm2、电解时间为500～700秒的电化学阳极氧化技术对单面抛光硅片进行腐蚀得到多孔硅，之后利用功能化的硅烷偶联剂对多孔硅表面进行功能化修饰，得到含有活性基团的修饰层，然后以功能化的多孔硅为载体，制备多孔硅生物芯片。本发明所述制备方法简便，设备需求少，适宜进行大批量生产。利用本发明所述方法制备得到的多孔硅生物芯片具有灵敏度高，选择性好和重现性佳等优点，可用于生物大分子的相互作用的研究。实验表明，与现有晶芯
Figure BDA0000097837720000031
光学级环氧基片相比，本发明所述多孔硅生物芯片能够提高对单糖和凝集素的检测限两个数量级。
附图说明
图1示用本发明所述方法不同腐蚀时间制得的4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖浓度为50mM的多孔硅糖芯片和晶芯
Figure BDA0000097837720000041
环氧芯片检测蓖麻籽凝集素(RCA120)的标准曲线；其中，a：腐蚀时间500s的多孔硅糖芯片、b：腐蚀时间600s的多孔硅糖芯片、c：腐蚀时间700s的多孔硅糖芯片、d：晶芯
Figure BDA0000097837720000042
环氧芯片；
图2示用本发明所述方法不同腐蚀时间制得的蓖麻籽凝集素(RCA 120)浓度为100μg/mL的多孔硅糖芯片和晶芯环氧芯片检测4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖的标准曲线；其中，a：腐蚀时间500s的多孔硅糖芯片、b：腐蚀时间600s的多孔硅糖芯片、c：腐蚀时间700s的多孔硅糖芯片、d：晶芯
Figure BDA0000097837720000044
环氧芯片；
图3示用本发明所述方法不同腐蚀时间制得的4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖浓度为50mM的多孔硅糖芯片和晶芯
Figure BDA0000097837720000045
环氧芯片检测伴刀豆球蛋白凝集素(Con A)的标准曲线；其中，a：腐蚀时间500s的多孔硅糖芯片、b：腐蚀时间600s的多孔硅糖芯片、c：腐蚀时间700s的多孔硅糖芯片、d：晶芯
Figure BDA0000097837720000046
环氧芯片；
图4示用本发明所述方法不同腐蚀时间制得的伴刀豆球蛋白凝集素(ConA)浓度为100μg/mL的多孔硅糖芯片和晶芯
Figure BDA0000097837720000047
环氧芯片检测4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖的标准曲线；其中，a：腐蚀时间500s的多孔硅糖芯片、b：腐蚀时间600s的多孔硅糖芯片、c：腐蚀时间700s的多孔硅糖芯片、d：晶芯
Figure BDA0000097837720000048
环氧芯片。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种多孔硅生物芯片及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖的检测
在进行电化学腐蚀之前，要对硅片进行彻底的清洗。清洗的具体步骤如下：将电阻率为1-10Ωcm、晶向为<100>单面抛光的p型掺硼单晶硅硅片依次放入丙酮、环己烷，丙酮，无水乙醇中进行超声清洗，每次清洗时间为3分钟，完毕后取出自然晾干；再将硅片放入浓硫酸双氧水体积比为3∶1的溶液中至硅片表面不再有气泡产生时，取出，先用大量冷去离子水冲洗，再用热去离子水冲洗干净；经以上处理的硅片浸入5％的氢氟酸水溶液，浸泡1分钟去除氧化层，用去离子水冲洗干净，放入无水乙醇中待用。
将清洗好的硅片的抛光面与体积百分比为25％的氢氟酸乙醇溶液接触，背面与铜片接触引出接阳极电压，溶液接阴极电压，以恒电流电解，电流密度3mA/cm2，腐蚀时间分别为500秒，600秒和700秒。制备出的多孔硅立即用去离子水和乙醇清洗，在氮气流下吹干。
将吹干的多孔硅于恒温箱中进行热处理，在150℃保温24小时进行缓慢氧化；氧化后的多孔硅片分别依次放入丙酮、环己烷、丙酮和无水乙醇中进行超声清洗3分钟，完毕后取出自然晾干；清洗后的多孔硅片置于真空干燥箱，100℃真空干燥12小时以上；干燥后，多孔硅片放入三口烧瓶，加入150mL含有质量分数为1％γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的无水N，N-二甲基甲酰胺溶液，氮气流保护下，加热至120℃搅拌回流24小时；反应结束后，硅片依次用无水N，N-二甲基甲酰胺，丙酮、无水乙醇超声清洗3分钟；完毕后置于真空干燥箱，50℃真空干燥1小时，得到环氧基团修饰的多孔硅片，放入冰箱4℃保存待用。
以制备的环氧基团修饰的多孔硅片、北京博奥生物技术有限公司生产的晶芯
Figure BDA0000097837720000051
光学级环氧基片为载体，利用SmartArrayer 48生物芯片点样系统点样，制作浓度梯度为10μM-200mM的4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖单糖芯片，点样量为1nL/点。为了获得良好均匀的阵列点形及保持生物分子的活性，选用的点样液除了4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖溶液还包括：体积分数20％的甘油和pH＝7.5的含有0.15mol/L氯化钠的0.3mol/L磷酸盐缓冲溶液。点样后，在25℃，真空环境下反应12小时，反应后选用质量分数为0.5％的牛血清白蛋白对未反应的环氧基团进行封闭后得到多孔硅糖类生物芯片及晶芯环氧糖类生物芯片。
荧光标记多孔硅糖类生物芯片：将制作好的浓度梯度为10μM-200mM的4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖单糖芯片分别与10ng/mL-200ug/mL的荧光素标记的蓖麻籽凝集素(FITC-RCA 120)反应，反应温度为30℃、时间1小时。完毕后依次用含有0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液，去离子水清洗干净并离心甩干，得到荧光标记的糖类生物芯片。
荧光检测多孔硅糖类生物芯片：将得到的荧光标记的糖类生物芯片放入微阵列扫描仪(LuxScan-10K/A型，北京博奥生物技术有限公司)检测，得到糖类生物芯片的荧光信号，荧光检测的标准曲线见图1。
按照本发明所述方法以蓖麻籽凝集素作为样品，利用SmartArrayer 48生物芯片点样系统制作不同浓度梯度的蓖麻籽凝集素芯片，然后与凝集素标记的不同浓度的4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖反应，微阵列扫描仪检测荧光信号荧光检测的标准曲线见图2。
实施例2：4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖的检测
将电阻率为1-10Ωcm、晶向为<100>单面抛光的p型掺硼单晶硅硅片依次放入丙酮、环己烷，丙酮，无水乙醇中进行超声清洗，每次清洗时间为3分钟，完毕后取出自然晾干；再将硅片放入浓硫酸双氧水体积比为3∶1的溶液中至硅片表面不再有气泡产生时，取出，先用大量冷去离子水冲洗，再用热去离子水冲洗干净；经以上处理的硅片浸入5％的氢氟酸水溶液，浸泡1分钟去除氧化层，用去离子水冲洗干净，放入无水乙醇中待用。
将清洗好的硅片的抛光面与体积百分比为25％的氢氟酸乙醇溶液接触，背面与铜片接触引出接阳极电压，溶液接阴极电压，以恒电流电解，电流密度3mA/cm2，腐蚀时间分别为500秒，600秒和700秒。制备出的多孔硅立即用去离子水和乙醇清洗，在氮气流下吹干。
将吹干的多孔硅于恒温箱中进行热处理，在150℃保温24小时进行缓慢氧化；氧化后的多孔硅片分别依次放入丙酮、环己烷、丙酮和无水乙醇中进行超声清洗3分钟，完毕后取出自然晾干；清洗后的多孔硅片置于真空干燥箱，100℃真空干燥12小时以上；干燥后，多孔硅片放入三口烧瓶，加入150mL含有质量分数为1％γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的无水N，N-二甲基甲酰胺溶液，氮气流保护下，加热至120℃搅拌回流24小时；反应结束后，硅片依次用无水N，N-二甲基甲酰胺，丙酮、无水乙醇超声清洗3分钟；完毕后置于真空干燥箱，50℃真空干燥1小时，得到环氧基团修饰的多孔硅片，放入冰箱4℃保存待用。
以制备的环氧基团修饰的多孔硅片、北京博奥生物技术有限公司生产的晶芯
Figure BDA0000097837720000071
光学级环氧基片为载体，利用SmartArrayer 48生物芯片点样系统点样，制作浓度梯度为10μM-100mM的4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖单糖芯片，点样量为1nL/点。为了获得良好均匀的阵列点形及保持生物分子的活性，选用的点样液除了4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖溶液还包括：体积分数20％的甘油和pH＝7.5的含有0.15mol/L氯化钠的0.3mol/L磷酸盐缓冲溶液。点样后，在25℃，真空环境下反应12小时，反应后选用质量分数为0.5％的牛血清白蛋白对未反应的环氧基团进行封闭后得到多孔硅糖类生物芯片及晶芯
Figure BDA0000097837720000072
环氧糖类生物芯片。
荧光标记多孔硅糖类生物芯片：将制作好的浓度梯度为10μM-100mM的4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖单糖芯片分别与的荧光素标记的伴刀豆球蛋白凝集素(FITC-Con A)反应，反应温度为30℃、时间1小时。完毕后依次用含有0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液，去离子水清洗干净并离心甩干，得到荧光标记的糖类生物芯片。
荧光检测多孔硅糖类生物芯片：将得到的荧光标记的糖类生物芯片放入微阵列扫描仪(LuxScan-10K/A型，北京博奥生物技术有限公司)检测，得到糖类生物芯片的荧光信号，荧光检测的标准曲线见图3。
按照本发明所述方法以伴刀豆球蛋白凝集素作为样品，利用SmartArrayer48生物芯片点样系统制作不同浓度梯度的伴刀豆球蛋白凝集素芯片，然后与凝集素标记的不同浓度的4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖反应，微阵列扫描仪检测荧光信号荧光检测的标准曲线见图4。
实施例3：
统计本发明实施例1和实施例2提供的方法制备的多孔硅芯片和现有的晶芯
Figure BDA0000097837720000081
环氧芯片检测半乳糖(Gal-β)、蓖麻籽凝集素(RCA 120)、甘露糖(Man-α)、伴刀豆球蛋白凝集素(Con A)的检测结果见表1。
表1.多孔硅糖芯片与晶芯环氧芯片的线性范围与检测限
Figure BDA0000097837720000083
由表1结果可见，利用本发明实施例1和实施例2提供的氧化时间分别为500秒、600秒、700秒的制备方法制备的多孔硅芯片检测，半乳糖检测限为100～500μM、蓖麻籽凝集素的检测限为300ng/mL～5μg/mL、甘露糖检测限为100～500μM、伴刀豆球蛋白凝集素的检测限为500ng/mL～5μg/mL。而利用现有的晶芯
Figure BDA0000097837720000084
环氧芯片检测，半乳糖检测限为5mM、蓖麻籽凝集素的检测限为5μg/mL、甘露糖检测限为5mM、伴刀豆球蛋白凝集素的检测限为5μg/mL。表明本发明所述制备方法制备的多孔硅生物芯片灵敏度高，选择性好。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种多孔硅生物芯片的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：将单面抛光硅片的抛光面与电解液接触并通过电解液接阴极电压，背面与导体接触并通过导体接阳极电压，然后进行电化学阳极氧化得到多孔硅，其中，所述氧化模式为恒电流电解、电流密度3mA/cm2、电解时间为500～700秒；
步骤2：对步骤1制得的多孔硅进行功能化修饰，然后利用生物芯片点样系统均匀滴加生物大分子标准液即得。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述硅片为电阻率为1-10Ω/cm，晶向为<100>单面抛光的p型掺硼单晶硅。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述电解液为体积分数为25％的氢氟酸乙醇溶液。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1之前还包括对所述单面抛光硅片进行表面清洗的步骤，具体包括：
步骤a：将单面抛光硅片依次放入丙酮、环己烷、丙酮、无水乙醇中进行超声清洗，每次清洗时间为3分钟，自然晾干；
步骤b：将晾干的硅片放入体积比为3∶1浓硫酸与双氧水的溶液中，至硅片表面不再有气泡产生取出，先用大量冷去离子水冲洗，再用热去离子水冲洗干净；
步骤c：洗净的硅片浸入体积分数为5％的氢氟酸水溶液，浸泡1分钟，然后用去离子水冲洗干净，放入无水乙醇中备用。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1所述电解时间为600秒。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2所述功能化修饰为环氧化修饰。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述环氧化修饰为利用硅烷偶联剂在氮气流保护下，120℃，搅拌回流24小时，即得。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂为质量分数为1％的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的无水N，N-二甲基甲酰胺溶液。
9.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤2所述生物大分子为糖类。
10.权利要求1～9任意一项所述制备方法制备的多孔硅生物芯片。
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