CN102439127A - 使用缀合的生物聚合物表面对抗原特异性记忆b细胞的分离 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于提取免疫细胞的材料和方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于提取和分离抗原特异性记忆B细胞的设备。通过使细胞沿缀合了配体的生物聚合物表面流过来分离免疫细胞。配体可沿生物聚合物表面的z轴以浓度梯度分布。展示出对生物聚合物上配体具有特异性的受体的细胞将与所述配体相互作用并且以白细胞滚动的方式沿所述表面滚动。附加的粘附相互作用将导致差异性细胞分离以及最终固定化。

Description

使用缀合的生物聚合物表面对抗原特异性记忆B细胞的分离

相关申请的交叉引用

本专利申请主张2009年3月9日提交的美国临时专利申请No.61/158,649的优先权，该专利申请的全部内容作为参考具体地并入本文。

背景技术

病毒(例如痘病毒、丝状病毒)作为生物武器的潜在应用受到越来越多的关注，特别是对于目前尚无有效对策的人类疾病。治疗性抗体的施用是对暴露于或感染对军事和反生物恐怖工作具有意义的病毒疾病物质的个体进行治疗和/或预防的合适策略。目前，痘苗病毒(vaccina virus，VACV)免疫球蛋白(vaccinia virus immune globulin，VIG)(人血液来源的多克隆Ig产品)是治疗由不良天花接种事件引起的播散性VACV感染的“首选”疗法。另外，交叉反应性mAb制剂可以用作由其它致病性正痘病毒(如猴痘病毒和天花病毒(天花的病原体))所引起感染的治疗剂或预防剂，从而减轻使用这些病毒剂的生物恐怖的威胁。

在VACV基因组中所含的约200个基因中，仅有少量基因编码已知引起中和抗体应答的蛋白质，包括H3、A17、A27、D8、L1和B5¹。第七基因A33R编码引起非中和性抗体应答但仍是保护性的蛋白质。基于历史和初步数据，在动物模型中显示出保护效力的VACV抗原特异性mAb的组合将有可能对人疾病的治疗有效。用于鉴定针对A33R、B5R和L1R的Fab的一个方法是pCOMB3噬菌体展示系统(Scripps Institute)。该方法可能存在问题，例如，由于低文库大小/多样性、低效率克隆以及与第一代pCOMB3系统有关的稳定性问题。

随着2003年对阿达木单抗(Humira)的批准，工业界看到了从嵌合到人源化再到完全人序列的新型抗体治疗的全面变化。工业界的目标是生产与人体中所产生的抗体相同的药物。目前可用的方法具有多种问题，例如，发现和生产基于抗体之药物的成本较高，以及在速度、稳定性、保真度、法规顺应性和产品表达方面的困难。

如单克隆抗体的免疫治疗剂已证明是挽救生命的医用产品并且是诊断和研究工具的重要试剂。在本领域中，仍需要用于鉴定和生产具有所需特异性的完全人源化单克隆抗体的改进的方法和设备。由于将利用人B细胞，因此本发明特别适合于该任务。这些细胞独特地被设计用于表达和分泌抗体。来源于人B细胞的细胞系的遗传学、生物化学以及细胞器组成将精确地并且忠实地产生大多数可能的人治疗性分子。本发明还提供了用于提取(isolation)抗原特异性记忆B细胞的设备。该设备可用于发现和生产新一代免疫治疗剂，以满足如传染病学、肿瘤学、公共卫生和生物防御等领域中的重大需求。

发明内容

可利用提取的抗原特异性克隆来鉴定和生产高效人治疗性单克隆抗体，所述抗原特异性克隆通过使用在缀合了抗原的生物聚合物表面上差异性粘附介导的细胞分离来源于人供体的循环中记忆B细胞池。使用间接亲合磁珠法，可以从接种疫苗的供体人外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cell，PBMC)中提取外源(病毒)抗原特异性记忆B细胞。

在一个实施方案中，本发明提供了通过免疫细胞的受体与配体之间的相互作用分离所述免疫细胞的设备。通常，所述配体固定于设备的功能化表面上，并且该设备适于使免疫细胞流动通过功能化表面。可以使用任何类型的配体，例如，与免疫细胞上存在的受体结合的配体。适合的实例包括(但不限于)免疫细胞特异性的抗原。在一些实施方案中，本发明的设备可以是流通池和/或微流体设备。

本发明的设备可以用于提取任何类型的免疫细胞，例如，中性粒细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞、淋巴细胞和/或单核细胞。在一些实施方案中，使用本发明设备提取的细胞可以是淋巴细胞，例如B细胞、T细胞和/或自然杀伤细胞。在一些实施方案中，提取的细胞可以是B细胞。

在免疫细胞表面上表达的任何受体可用于通过与功能化表面上的受体所结合的一种或多种配体相连接来提取细胞。适合的受体包括B细胞受体，其适合的配体包括(但不限于)具有B细胞表位的抗原。在另一个实施方案中，所述免疫细胞受体可以是T细胞受体，其适合的配体包括(但不限于)具有T细胞表位的抗原。

本领域已知的任何适合的方法可用于对在其上提取免疫细胞的设备表面进行功能化。在一些实施方案中，可通过在表面上沉积聚合物使该表面功能化。在沉积前后，可以将一种或多种配体与聚合物缀合。

本发明提供了通过将包含免疫细胞的溶液与本发明设备相接触来提取免疫细胞的方法。在一些实施方案中，本发明的方法可包括在功能化表面上捕获(即固定)免疫细胞。可通过诱导活化来使得这些免疫细胞增殖。此活化可导致形成免疫细胞集落。在一些方法中，从设备中回收有活力的经活化增殖中免疫细胞集落。可使用本领域已知的任何方法回收集落，例如，可以通过从聚合物上释放配体回收集落和/或可以机械性移除(例如吸取)集落。

在一些实施方案中，本发明可用于通过间接亲合磁珠法从来源于接种疫苗供体的人外周血单个核细胞(PBMC)中分离病毒抗原特异性记忆B细胞。本发明的材料和方法可包括缀合了抗原的生物聚合物表面，其可用于通过差异性滚动粘附介导抗原特异性B细胞分离。在一些实施方案中，本发明提供了用于抗原特异性B细胞分离的缀合了抗原的生物聚合物表面。在用B细胞进行实验之前，使用缀合了抗体的微球进行实验来评价表面梯度、剪切速率和流通池设计。

在一些实施方案中，可以原位活化使用本发明提取的B细胞以用于克隆提取(clone isolation)。例如，可以原位活化生物聚合物表面捕获的抗原特异性B细胞以用于克隆提取。

在一些实施方案中，本发明可用于提取抗原特异性B细胞，然后可以在生物聚合物表面上将其活化，诱导分化为抗体分泌细胞(antibodysecreting cell，ASC)并诱导扩增和形成集落。可以从生物聚合物表面上提取活化的抗原特异性记忆B细胞集落以产生IgG分泌细胞系。因此，本发明提供了可以用于提取、扩增和表征来源于经活化抗原特异性B细胞集落的IgG表达细胞系以及产生克隆抗体分泌细胞系的材料和方法。

附图说明

图1是pcdna3.1zeo:VACV_B5R、pcdna3.1zeo:VACV_A33R和pcdna3.1zeo:VACV_L1R的质粒图。

图2A和2B是循环中VACV特异性抗体和B细胞的抗体效价图。

图3显示了来自Dryvax(LB，DS)或ACAM2000(AM)接种供体的人血清样品对于具有免疫相关性的重组表达VACV蛋白的ELISA测定结果。

图4显示了以1∶1(上图)或1∶5(下图)的载体∶插入物比例的10XL-1blue/pCOMB:HC+LCκ文库克隆中克隆的人LC κcDNA插入物存在性的PCR集落分析结果。

图5显示了对L1和MBP不同轮次淘选的噬菌体ELISA结果。

图6是显示轻链和重链盒的两种可能取向的琼脂糖凝胶图照片以及pcDNAΔ:dhfr:VL:VH质粒图。

图7显示了放射性标记的VACV蛋白与VACV免疫人血清或与哺乳动物细胞表达的全长人mAb的免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。

图8显示了单克隆抗体对BALB/c小鼠的保护。

图9显示了用2×10⁶或2×10⁵PFU痘苗病毒IHD-J株进行i/n攻击后的体重变化。显示了每个处理组的平均体重(n＝5)。

图10显示了12个区的微流体表面设计。每个区可包含矩形金电极以允许对功能化缀合的壳聚糖混合物进行位点特异性寻址。

图11显示了微流体流动室的设计，其详细地示出了用于生物功能化表面电沉积的电极位置以及流路。

图12显示了缀合抗原介导的记忆B细胞分离和可溶性配体活化策略的示意图。

图13显示了来自PBMC解冻物的FACS数据(左图为仅PBS而右图为PBS加PI)。

图14显示了具有多个N和C末端标签的VACV L1变体。

图15显示了下列项的琼脂糖凝胶：(A)L1R胞外域的PCR产物和(B)L1R的六个末端标签变体的PCR产物。

图16显示了Hind III和Not I限制性酶切哺乳动物表达质粒pcdna3.1+zeo:intA:VACVsL1R+His#1的琼脂糖凝胶。

图17显示了含六个L1末端标签变体的Hind III和Not I限制性酶切哺乳动物表达质粒的琼脂糖凝胶。

图18显示了瞬时表达的纯化的L1变体的SDS-PAGE凝胶。

图19显示了瞬时表达的纯化的L1变体的ELISA分析结果。

具体实施方案

本发明人已开发出了用于预防性和治疗性治疗人病原性正痘病毒感染的单克隆抗体混合物。这些感染可来源于不良疫苗接种事件(例如痘苗病毒(VACV)感染)或暴露于其它正痘病毒(如作为天花病原体的天花病毒(variola virus，VARV)或猴痘病毒(monkeypox virus，MPXV)。在生物恐怖和生物战威胁以及公共卫生问题的背景下，这些适应症的有效治疗剂的开发满足了重大而未获满足的医学和国家安全的需求。

工作集中在发现对VACV B5R、A33R和L1R蛋白(其已知能够引起中和应答)具有特异性的mAb克隆上。在pcdna3.1zeo质粒背景中改造得到具有这些VACV基因的质粒以用于产生表达这些锚定在细胞表面上的蛋白的NS0和293T/17细胞系(图1)。另外，构建了编码下列VACV蛋白的带HIS标签的可溶性版本的表达载体：A27L、D8L、A33R、B5L、A17L、A4L、A10L、H3L、F13L和L1R。本领域的技术人员将理解可以在本发明的实践中使用其它抗原，例如中和抗体所识别的抗原。制备了VACV株WR感染的Vero细胞的TRIzol提取物，以用于总RNA提取和cDNA合成。这些cDNA用于扩增如上所述的所有10个病毒基因。改造得到每个基因的可溶性版本，以仅包含带有聚组氨酸标签的胞外域并且由VACV B5信号肽序列所驱动。在CHO-S和293-F FreeStyle细胞(Invitrogen)中尝试了VACV蛋白A33、B5和L1的带HIS标签可溶性版本的表达。根据生产商的说明书转染细胞，并且使之在生长条件下继续生长96小时。对于初始纯化来说，将上清液上样到平衡过的HIS Spin柱(Sigma)上，清洗，然后用100mL含有咪唑的缓冲盐水缓冲液洗脱。如图3所示，CHO-S和293-F细胞均表达sB5-HIS和s-L1-HIS，但两个细胞系表达的sA33-HIS的水平均不显著。sB5-HIS和s-L1-HIS的产量在0.5至34μg/mL上清液的范围内。因此，我们使用CHO-S和/或293-F细胞来产生sB5-HIS和sL1-HIS，使用在含血清培养基中生长的293T/17细胞来产生sA33-HIS。

图1显示了pcdna3.1zeo:VACV_B5R、pcdna3.1zeo:VACV_A33R和pcdna3.1zeo:VACV_L1R的质粒图。将包含大部分pCMV启动子的NheI-NotI片段(包含内含子A)和VACV A33R、B5R或L1R的完整开放读码框克隆到由相同核酸内切酶酶切的pcdna3.1zeo质粒片段中。将所得构建体用于转染293T/17细胞以确认表达，随后产生在细胞表面上表达这些病毒基因的稳定系。

用由VACV免疫的人供体的外周血淋巴细胞(peripheral bloodlymphocate，PBL)所产生的cDNA构建人Fab噬菌体文库。在与体液免疫应答峰值有关的疫苗接种后的第18天从经过加强免疫的供体中提取PBL(参见图2)。用经许可的纽约卫生局(New York Board of Health)VACV疫苗对VACV免疫志愿者进行加强免疫。在接种疫苗后的多个时间，通过ELISA测量循环抗VACV IgG。用埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrnvirus)转化B细胞并将有限稀释液加入到96孔板中。通过对含有细胞克隆的孔进行ELISA，评价了循环中B细胞分泌抗VACV抗体的频率。

在从供体DS构建第一人Fab噬菌体展示文库期间，平行地进行了重组VACV蛋白靶标的表达和纯化。对于这些试剂的可用性，确定了来自供体DS的血清对VACV L1的反应性(重要的特异性)较差。用ACAM2000(Acambis)对第二供体AM进行疫苗接种，并提取了PBL。通过ELISA分析了来自两个供体的血清对一系列重组VACV蛋白靶标的反应性。如下图3所示，所有血清和阳性对照(抗HIS mAb)对sH3-HIS蛋白的反应性均较差。目前，尚不了解缺少显著反应性的原因。有一种可能是尽管纯化并定量了蛋白，但是该蛋白是错误折叠的并且是非反应性的。相反，用抗HIS阳性对照mAb明确地建立了对所有其它蛋白的反应性。另外，如所预期的，7D11仅与sL1-HIS反应，而10F10仅与sA33-HIS反应。来自供体AM的血清对所有抗原均表现出最佳反应性，随后从该供体PBL提取的RNA用于人Fab文库的构建。由于在之前的实验中发现以1∶100的稀释度使用时DS供体血清的反应性较差，因此在VACVsL1R-HIS板上，以1∶10的稀释度使用来自供体“DS sera post”的血清。

使用来源于供体AM的PBMC，用pCOMB3系统(Scripps Institute)产生了κ和λFab噬菌体展示文库²。对细胞进行TRIzol(Invitrogen)处理以提取总RNA。使用RT-PCR(Invitrogen，SuperScript III)将TRIzol制备物用于产生来源于mRNA的cDNA文库。将所得的cDNA文库用作模板以使用广泛覆盖的引物组来通过PCR扩增可变重链(VH)和轻链(VLκ和VLλ)区。为了在开始大规模转化前优化VLκ小规模连接进pCOMB3:VH的效率，汇集来自9个独立VLκcDNA特异性物质的PCR产物，然后用SacI和XbaI酶切。将所得片段克隆到含有人VH的类似酶切的噬粒载体pCOMB3(表示为pCOMB3:VH)中。为了确定文库大小和小规模转化效率，进行了测试连接，然后电穿孔到电感受态大肠杆菌(E.coli)XL-1Blue细胞(Stratagene)中。为了确定pCOMB3:VH载体与VLκ插入物之间的最优比值，使用250ng载体以下列载体∶插入物比例：(1)1∶1、(2)1∶5、(3)1∶10和(4)1∶15进行了四次转化。表1列出了每次转化的效价计算和所得的文库大小。

表1.pCOMB3:VH+VLκ小规模文库效价计算

由于确定pCOMB:VH+VLλ的最佳载体∶插入物比为1∶1，因此用于确定掺入VLκ插入物的克隆的百分比的初始PCR分析集中在1∶1和1∶5比值的连接反应，这是因为VLκ与VLλ在大小和克隆方法上均相同。从LB Carb100板中随机选择1∶1和1∶5的连接反应的10个克隆，并使用人轻链Fab特异性引物(CK2d)和用于扩增9个独立VLκcDNA的9个VLκ寡核苷酸的混合物进行集落PCR分析。通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的PCR产物。约700bp的DNA条带指示了用VLκ寡核苷酸的混合物和CK2d扩增的pCOMB3:HC中克隆的VLλcDNA插入物。如所预期的，阴性对照pUC18未扩增。来自初始VLκPCR扩增的稀释的PCR产物(阳性对照)产生了预期的约700bp的条带。如图4所示，分别从1∶1和1∶5的连接比分析的5/10和4/10的克隆显示出存在轻链κcDNA插入物(约700bp)，这表明对于LCκ插入来说，50％的1∶1比值的板和40％的1∶5比值的板是阳性的。随后，以1∶1的比值进行大规模人VH文库克隆和VLκ插入以实现最大的转化效率和阳性克隆百分比。

在开始双重人链Fabκ和λ文库的大规模连接和转化前，制备辅助噬菌体VCSM13(stratagene)储备物以利于从噬粒pCOMB3主链生产噬菌体，除丝状噬菌体f1的复制起点外，该主链缺少用于噬菌体颗粒复制和组装所必需的基因。通过提供噬粒包装和噬菌体表面上pIII融合Fab蛋白展示所需的复制和组装的必需蛋白，辅助噬菌体VCSM13与噬粒基因组相互作用。以1∶1的比值多次进行了SacI和XbaI酶切的VLλ插入物大规模连接到类似酶切的pCOMB3:VH载体中以及转化以产生达到10⁷-10⁸个单个转化体的所需范围的文库大小并补偿约50％的LCλ插入百分比。用300μL电感受态XL-1 Blue细胞进行六次转化，每次转化使用来自相同连接反应的DNA。在加入10mL SB培养基(20μg/mL的Carb，10μg/mL的四环素)后，将每次转化的10、1和0.1μl等份铺板在LBCarb100琼脂板上来测定转化物的效价。将培养物在37℃振摇孵育1小时。将羧苄西林的浓度调节至50μg/ml，然后在37℃再振摇孵育1小时。用1mL VCSM13辅助噬菌体(约10¹²pfu/ml)超感染培养物，然后将其转移到含有100mL SB(Carb50，Tet10)培养基的烧瓶中并在37℃振摇孵育。2小时后，加入卡那霉素(70μg/ml)，然后过夜孵育。第二天，在4℃将大肠杆菌(E.Coli)细胞通过以3000rpm离心15分钟得到沉淀。收获沉淀以用于随后的DNA制备。将所得的上清液转移到新试管中并加入4％(w/v)的PEG-8000和3％(w/v)的NaCl以沉淀噬菌体。将上清液在冰上孵育30分钟，然后在4℃以9000rpm离心20分钟。将包装的噬粒沉淀再悬浮(2mL TBS/1％BSA)，然后在4℃储存。重复该过程以产生双重链人Fabκ组合噬菌体文库。

为了测定λ组合噬菌体文库的效价，对上述LB Carb100板中出现的集落计数并反推计算出六个转化的整体文库大小。表2列出了每个转化的效价计算和所得文库大小以及组合文库效价。使用人重链Fab特异性引物(CG1d)和pCOMB3特异性引物(VH#2)，对从6个独立LB Carb100板中随机选择的21个克隆进行集落PCR分析。通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的PCR产物。21个克隆中的19个或所分析的90.5％显示出存在重链cDNA插入物(约700bp)。使用用于扩增12个独立VLλcDNA的人轻链Fab引物(CK2d)和12个VLλ寡核苷酸的混合物，对随机选择的20个其它克隆进行集落PCR分析。20个克隆中的18个或所分析的90％含有VLλ插入物(约700bp)。这些合并的结果提供了约81.4％的文库克隆含有相关HC和LCλ插入物的基本确认。因此，修正的文库大小可以等于最初计算效价的81.4％或者为9.418×10⁶个独立克隆。

为了测定κ组合噬菌体文库的效价，对上述LB Carb100板中出现的集落计数并反推计算出六个转化的整体文库大小。表3列出了每个转化的效价计算和所得文库大小以及组合文库效价。使用人重链Fab特异性引物(CG1d)和pCOMB3特异性引物(VH#2)，对从6个独立LB Carb100板中随机选择的22个克隆进行集落PCR分析。通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的PCR产物。22个克隆中的14个或所分析的63.6％显示出存在重链cDNA插入物(约700bp)。使用用于扩增9个独立VLκcDNA的人轻链Fab引物(CK2d)和9个VLκ寡核苷酸的混合物，对随机选择的20个其它克隆进行集落PCR分析。20个克隆中的14个或所分析的70.0％含有VLκ插入物(约700bp)。这些合并的结果提供了约44.5％的文库克隆含有相关HC插入物的基本确认。因此，修正的文库大小可以等于最初计算滴度的44.5％或者为2.370×10⁶个独立克隆。

表2.大规模pCOMB3:VH:VLλ文库效价计算

表3.大规模pCOMB3:VH:VLκ文库效价计算

为了鉴定对具有免疫学意义的VACV蛋白特异性人Fab，针对固定化带his标签的L1淘选双重组合pCOMB3:VH:VLκ文库。针对特异性抗原(如L1)产生特异噬菌体结合物包括对固定在ELISA板上的抗原进行多轮噬菌体混合物淘选(panning)。每轮淘选期间，富集了与所述抗原特异结合的噬菌体克隆，并通过提高清洗的严格度来减少非特异性结合物的量。简要地，将1μg重组可溶性带HIS标签的L1在25μl的0.1M碳酸氢钠(pH8.6)中稀释并在4℃下96半孔ELISA板中孵育过夜。第二天，移除覆盖的溶液后，用150μl TBS中3％(w/v)的BSA溶液封闭孔并在37℃孵育2小时。然后，在移除封闭溶液后，将上述50微升的双重κ噬菌体文库加入到ELISA板中并在37℃孵育。孵育2小时后，取出噬菌体溶液并通过下述步骤清洗孔：加入150μl 0.5％(v/v)的TBS中Tween20溶液，剧烈抽吸5次，然后孵育5分钟。在第一、第二、第三和第四轮淘选期间，该清洗过程分别重复1、5、10和15次。为了洗脱L1特异性结合的噬菌体，将50μL 100mM的甘氨酸-HCl(pH 2.2)加入到孔中，然后在室温下孵育10分钟。剧烈抽吸后，从孔中取出噬菌体并与3μl 2M的Tris碱溶液一起孵育以中和酸性洗脱缓冲液。将中和的噬菌体洗脱液加入到2ml在SB(Tet¹⁰)中生长至A₆₀₀的O.D.＝1.0的XL1-Blue大肠杆菌(E.coli)培养物中，然后在室温下孵育15分钟。测定所得感染培养物的效价，如上所述进行再扩增，并对L1连续淘选沉淀的噬菌体制剂。通过四轮淘选，重复该过程。

为了评价淘选实验的成功，使用抗M13检测试剂通过ELISA测试每轮淘选期间所产生的噬菌体混合物以确定对L1的特异性。图5中显示了淘选实验的结果。如所预期的，每轮淘选的噬菌体制剂类似地与阴性对照抗原MBP反应，其吸光度读数与背景相当。噬菌体制剂还与阳性对照抗原以类似的程度反应，检测表达非特异性Fab的噬菌体，导致获得了1.060至1.218范围内的吸光度值(数据未显示)。噬菌体制剂与靶标抗原VACVL1的特异性结合随淘选轮次而增加，特别是在第三和第四轮淘选期间，这表明选择并扩增了L1特异性结合物。

为了鉴定表达L1特异性Fab的单个克隆，对来自第四轮淘选的上述输出滴度板上的各个集落进行筛选。将接种了单个集落的1毫升培养物在SB/Carb⁵⁰液体培养基中在37℃振摇生长过夜。第二天，将2μl过夜培养物点在LB Carb100板上，并将100μl过夜培养物用于接种对应于相同克隆的5ml SB/Carb50培养物，保存剩余体积的过夜培养物以用于随后的DNA制备。将5ml培养物培养至OD₆₀₀＝约0.6，随后用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导。将诱导的培养物在30℃振摇孵育过夜。第二天，将每个克隆在4℃以2500×g离心20分钟。将细胞沉淀再悬浮于500μl PBS中，然后在干冰/乙醇浴中进行4次5分钟的循环，然后在37℃保持5分钟使细胞裂解。将样品以15000rpm离心以使细胞碎片沉淀。在分析前，将从细胞裂解物中收获的含Fab的上清液转移到新试管中。

在1个月中，通过上述方法对从人κ组合文库中产生的总计1370个克隆进行评价。在所筛选的1370个单个克隆中，仅有165个或12％对非特异性Fab产生是阳性的；并且没有一个对L1具有特异性。可以通过对同时含有HC和LC插入物的克隆的初始过高估计来解释不表达Fab的集落的低百分比；已通过PCR对HC或LC插入物筛选了仅基于20个克隆的理论计算。另外，用于构建该文库的第一代pCOMB3载体含有可能导致所得集落存在稳定性问题的重复lac启动子和pelB前导序列。另外，噬粒启动子和前导序列的重复性有利于发生可导致插入物缺失的重组事件。缺少HC和/或LC插入物的较小噬粒的包装可能比含有这两个插入物的较大噬粒更有效，因此，尽管在淘选期间采用了严格的清洗步骤，但是这些非表达克隆在用于个体集落Fab表达分析的输出滴度板中可能更占优势。多个非表达Fab克隆可能仅含有HC或LC或者两者均不含。因此，表达功能性Fab的克隆的低百分比很可能是由于初始顺序转化期间HC和LC的低插入率与由于pCOMB3载体本身的重复序列所导致的重组事件的高可能性相结合所造成的。

为了解决上述分子克隆问题，将工作转向使用对本发明文库扩增的相同个体VH和VL区构建新型双重人Fab组合文库，而不再进行顺序VH和VL的连接和转化，通过一系列PCR步骤将可变区相连接，从而获得了用于通过单次连接和转化克隆至噬粒主链中的一个最终Fab产物。另外，将第二代pCOMB载体(具体地为pCOMB3X)用作噬粒载体主链。pCOMB3X是比pCOMB3更适合的载体，这是因为噬粒pCOMB3X含有单个lac启动子并且使用了与pCOMB3中更有利于重组事件的双重pelB序列不同的ompA和pelB前导序列的组合。预计使用单次连接/转化步骤并且使用新一代pCOMB3X载体构建新型双重文库能够获得更高百分比的整体克隆，这些克隆同时含有VH和VL插入物并且稳定性提高。

由于pCOMB3X载体主链保持了用于第一代pCOMB3载体的相同VH和VL克隆位点，但掺入了重链和轻链各自的前导序列(分别为pelB和ompA)，因此，最终的文库构建方法是顺序地将VH和VL区克隆到现有一代的pCOMB3X中，而不再作为一个单元进行。预计这将显著减少重链和轻链均受相同pelB前导序列控制的初始文库构建工作期间所发生的重组事件。

要将重链汇集物插入到pCOMB3X:轻链组合文库中，如上所述，用XhoI/SpeI酶切HC PCR产物和pCOMB3X:轻链DNA，将它们连接并转化到XL1-Blue大肠杆菌(E.coli)细胞中。简要地，将140ng的XhoI/SpeI酶切的pCOMB3X:LC的初始测试连接物与类似酶切的HC混合物以以1∶3的载体∶插入物比混合并连接过夜。使用仅含载体的相同反应确定背景百分比。将来自每次转化的100、10和1μL等份铺板在LB Carb100琼脂板上，随后对集落计数，然后反推计算转化效率。不幸地，pCOMB3X:LC+HC反应和仅含有载体的背景板之间的集落总数差异是可忽略的。这种相当的转化效率很可能是由于pCOMB3X:LC载体的不充分酶切所造成的，由于载体的自连接，造成高背景，并且不能成功克隆HC插入物。如所预期的，来自测试连接板的进行集落PCR分析的20/20个克隆对HC插入物是阴性的。

为了解决噬粒载体中缺少HC插入的问题，用XhoI/SpeI对pCOMB3X:LC组合文库酶切8小时，凝胶纯化，然后用XhoI/SpeI再次酶切8小时。pCOMB3X载体在XhoI和SpeI位点之间含有大量填充片段，这应有利于有效的酶切。另外，XhoI和SpeI粘末端位点应允许定向克隆并且不容易自连接。然而，用南极磷酸酶处理XhoI/SpeI双酶切的LC噬粒载体以除去5’磷酸基，防止自连接。如上所示，进行了将HC插入到pCOMB3X:轻链组合文库中的第二轮测试连接和转化。尽管进行了大量防止载体主链自连接的工作，但是pCOMB3X:LC+HC反应和仅含有载体的背景板之间的集落总数的差异仍是可忽略的。在集落PCR分析中，20个克隆中有1个对HC插入是阳性的。由于所遇到的显著克隆障碍以及随后双重人Fab组合文库大小的不足，不再使用pCOMB3技术和方法进行进一步的探索工作。

构建哺乳动物表达载体pcdnaΔ:dhfr并用作包含人抗体重链和轻链编码序列在内的哺乳动物基因克隆的主链，用于在二氢叶酸还原酶(dhfr)突变体亲本细胞系CHO-DG44中表达。使用该载体，在多克隆位点(mcs)克隆了人IgG1重链恒定区表达盒，并用作人重链可变序列的受体。将该载体命名为pdhfr:Hcassette。产生了对由美国陆军传染病医学研究所(United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases，USAMRIID)的研究人员先前从Fab噬菌体文库中分离的痘病毒包膜蛋白特异性的四个单克隆抗体(mAb)中的每一个表达全长人IgG1重链的四个构建物³。首先将相应的轻链可变序列克隆到含有人轻链恒定区盒(pIEI-light)的杆状病毒表达载体中。随后将整个轻链编码序列克隆到pcdnaΔ:dhfr中。为了构建双重表达载体，使用对pCMV-MIE的5’端和对互补链上的BGH-pA特异性的引物扩增含有pCMV-MIE-轻链-BGHpA的轻链盒，其在两端均含有BglII REN位点。随后，将该片段克隆到每个相应pdhfr:重链构建物中的唯一BglII位点中。所得构建物含有串联克隆的完整人抗体轻链和重链基因。使用双重构建物产生了用于大规模生产mAb的稳定哺乳动物细胞系。产生了四个单克隆抗体的双重表达构建物，并将它们命名为mAb 14、mAb 18、mAb 19和mAb 21以保持与先前术语一致。图6中显示了pcDNAΔ:dhfr表达载体中全长轻和重抗体基因序列的两种可能取向。LC盒克隆到bla基因和pCMV启动子盒之间唯一的BglII位点产生了两种可能取向：LC和HC盒串联或者相反的取向。除了6.5Kb的载体条带外，用BglII酶切构建物产生了1.75Kb的单一插入物条带，其对应于轻链盒。NruI在载体序列中的bla基因和pCMV启动子盒之间将整个构建物切割一次。在pCMV启动子盒中切割一次的NdeI酶切导致产生了两个可能片段：0.8Kb片段表示LC和HC盒以相反取向克隆，如以下的质粒图“A”所示。相反，1.8Kb片段表示mAb基因串联克隆，如质粒图“B”所示。在产生稳定哺乳动物细胞系之前，在人肾内皮细胞(HEK-293T)中瞬时测试了来自所产生的四个双重构建物中每一个的mAb的表达。通过捕获ELISA测定了转染上清液中全长人IgG的存在。还通过USAMRIID的VACV-ELISA测定了上清液的mAb结合特异性。

通过DNA测序确定了抗体轻链和重链的完整编码区。通过与先前确定序列比较这些基因，确认了克隆14和21各自的轻链和重链的正确序列。mAb 14特异地与VACV D8L结合，而mAb 21与A27L结合。克隆18和19获得了具有与先前对这些名称的克隆所确定的那些不同的氨基酸序列的可变域。据推测，克隆18和19对B5R和L1R特异。基于mAb 18和19不能从B5R和L1R表达构建物转染的放射性标记的COS-7L细胞中免疫沉淀出蛋白，因此不再对它们进行研究。图7显示了分别使用mAb14和21的VACV D8L和A27L蛋白的免疫沉淀。用³⁵S-半胱氨酸和-蛋氨酸放射性标记了用表达VACV D8L或A27L蛋白的重组pWRG7077DNA载体转染的COS细胞。在4％的两性洗涤剂裂解缓冲液中制备了细胞裂解物，并使用如前所述的蛋白G琼脂糖珠使放射性标记的蛋白免疫沉淀(Guttieri等人，2003)。A图：使用mAb14(泳道1)和VACV免疫人血清(泳道2，阳性对照)从转染的细胞裂解物中免疫沉淀VACV D8L蛋白。作为阴性对照，使用VACV免疫人血清从空载体pWRG7077(泳道3)转染的放射性标记的细胞裂解物中免疫沉淀蛋白质。B图：使用mAb 21(泳道1和2)和VACV免疫人血清(泳道3，阳性对照)从转染的细胞裂解物中免疫沉淀VACV A27L蛋白。作为阴性对照，使用VACV免疫人血清从空载体pWRG7077(泳道4)转染的放射性标记的细胞裂解物中免疫沉淀蛋白质。每个图的左侧显示了分子量标志物(M)的大小，并且标明了VACV D8L和A27L蛋白。用红色标出了A图中VACV D8L蛋白的位置。

确认了dhfr选择标记的核苷酸序列，并且转染和选择研究表明pcdnaΔ:dhfr中克隆的dhfr基因是功能性的。一旦确认每个构建物的mAb序列，则使用dhfr(-)背景细胞系CHO-DG44产生克隆14和21的稳定哺乳动物细胞系。在不同浓度的选择性抑制剂氨甲蝶呤(MTX)中选择转染物，并且测定了所出现的稳定细胞分离物的人IgG1的比产率。对于每个稳定细胞系，对超过400个孔进行了初始鉴定。将表达显著水平的人IgG1的分离物扩增至较大的孔板，然后至小T型烧瓶，最后至中等T型烧瓶。当细胞在中等T型烧瓶中达到大于70％的汇合时，开始相关克隆的初始比产率(specific productivity rate，SPR)表征。通过SPR鉴定了19个CHO:mAb14和16个CHO:mAb21分离物。对每个系中比产率最好的细胞系进行MTX扩增。对用MTX扩增的4个CHO:mAb14和7个CHO:mAb21细胞系进行第一轮SPR。在CHO-S-SFM II中培养了CHO:mAb14分离物14.4.200和CHO:mAb21分离物21.27.200和21.157.200，如通过比未扩增的对应物更高的产率所确定的，它们似乎经历了MTX扩增。使用该不含血清的培养基来产生少量mAb 14和21以用于IP和中和测定。

为了测试mAb 14和21降低VACV株WR对VeroE6细胞单层感染性的能力，用两种抗体进行了噬菌斑减少中和试验(plaque reductionneutralization test，PRNT)测定，每种抗体纯化自瞬时HEK-293T或稳定CHO培养物。每个测试一式两份地进行，并且结果为每个测试的mAb浓度的所得结果的平均值。基本如Schmaljohn等人(1999)所述，进行了VACV PRNT。在PRNT测定中，mAb 14和21均表现出显著的活性。

随后，对来自CHO-SFM-II中生长的单CHO-DG44:mAb 14和21细胞系的上清液进行蛋白A纯化，以分离少量纯化的mAb用于功能研究。在一轮噬菌斑中和测定中使用了这些纯化的mAb。在噬菌斑减少和中和测定中，mAb 14和21均表现出显著的活性。此外，在PRNT测定中，与在添加血清培养基中的瞬时HEK-293T培养中所产生的相比，在稳定CHO细胞系中产生的和从耗尽的SFM培养中纯化的mAb的表现更好。表4显示了该实验的结果。

从在CHO-SFM中生长的单CHO-DG44:mAb 14和21细胞系中纯化了MAb。对培养上清液进行蛋白A纯化，并洗脱了人IgG，浓缩并通过Bradford测定和人IgG ELISA进行定量。在USAMRIID的标准PRNT测定中使用定量的IgG。纯化的人IgG1购自Sigma并在PRNT测定中用作阴性对照。数据为每个测试条件下两次重复的孔的平均值。表4显示了结果。表4给出了与对照人IgG1相比，使用mAb 14(α-D8L)和21(α-A27L)的VACV噬菌斑中和百分比。

表4

后继研究的目标在于验证保护BALB/c小鼠抵抗致死VACV鼻内攻击的抗体被动转移模型。该研究评价了VACV IHD-J的两个攻击剂量组(2×10⁶和2×10⁵PFU/mL)的存活并比较了两种抗体给药途经(皮下和腹膜内)。所使用的阳性对照为鼠抗VACV(L1特异性)单克隆抗体7D11，在早期研究中已知它能够保护小鼠。通过腹膜内或皮下途径被动施用7D11和阴性对照人无关IgG，并且在24小时后对所有动物用2×10⁵或2×10⁶PFU的痘苗病毒IHD-J株进行鼻内攻击。当小鼠体重低于初始体重的70％时，对小鼠安乐死。图8中的存活曲线数据表明了所有7D11处理组中的完全保护。相比之下，除组3(80％的存活)外，阴性对照组表现出仅有0-20％的存活。具体地，阴性对照组2中0％的存活(无关IgG，皮下/10⁶PFU的攻击)与7D11处理组6中100％的存活(7D11，皮下/10⁶PFU的攻击)相比是高度显著的。图9显示了用2×10⁶或2×10⁵PFU痘苗病毒IHD-J株进行i/n攻击后体重的变化。显示了每个处理组的平均体重(n＝5)。图9中所示的攻击后的体重变化表明与存活数据相关联的4-8天内所有阴性对照组中显著的体重降低。与7D11处理动物中的约11％-22％相比，阴性对照组在第8天的平均体重降低的范围在25％-30％之间。有趣地，在通过皮下或腹膜内途径施用7D11的小鼠中观察到了相似的体重减轻/恢复模式，尽管组6和8中用更大剂量病毒进行攻击后的小鼠在感染后的第4至7天内经历了更大程度的体重减轻。在该中试研究中，通过小鼠7D11 Mab实现了完全保护。下一步工作的目标是在被动转移研究中评价抗VACV病毒单克隆抗体mAb 14和mAb 21保护BALB/c小鼠抵抗致死VACV鼻内攻击的能力。研究组将包括200μg/只动物的单独mAb给药以及研究mAb 14和21组合的协同保护的两个组。

存在一些机会来改善当前发现和生产治疗性mAb的方法。我们之前的结果强烈表明来自免疫供体的外周血单个核细胞(PBMC)的使用可以，对于记忆B细胞来说提供表达B细胞受体(BCR)的B细胞克隆源，或者对于中和病毒的抗体分泌细胞来说分泌IgG。在Fab噬菌体展示发现策略中目前存在的问题是与核酸序列扩增和操作以及噬菌体展示系统的固有不稳定性有关的问题。另一种替代方法保留了使用人供体B细胞的优点但避免与基因操作有关的问题，其直接提取目的特异性B细胞。抗原特异性记忆B细胞的循环混合物还可提供在迟发适应性免疫应答期间所发生的天然亲合成熟过程的附加价值^4-9。这些循环抗原特异性记忆B细胞可以提供具有最高亲合力和效力的抗体。另外，导致通过无限增殖化过程产生直接来源于原始人抗原特异性记忆B细胞的细胞系的方法可以提供显著的优势，其包括细胞系稳定性、抗体质量/保真度、减少去就诊的时间和治疗剂开发成本较低^10-13。通过使用生物聚合物支架来提供抗原和受控的微流体，可以捕获所关心的B细胞，通过亲合力分离，激活并在单个设备中培养。作为额外的益处，这种平台在人免疫应答的研究中可以是有用的。

本发明提供了本领域技术人员设计、开发和鉴定用于提取抗原特异性记忆B细胞之设备的材料和方法，抗原特异性记忆B细胞的提取用于发现和生产治疗性单克隆抗体。

对于相关领域的常规技术人员来说，显而易见的是对本发明所述方法和应用的其它适合的修改和改变是明显的并且可以在不背离本发明或其任何实施方案的范围的情况下进行。现已详细说明了本发明，参考下列实施例将更清楚地理解本发明，本文所包括的实施例仅用于举例说明而不意欲限制本发明。

设计实验以证明使用重组L1抗原从相同ACAM2000接种的供体中提取VACV L1-特异性记忆B细胞，其用于产生Fab噬菌体展示文库。约6个月前对供体接种疫苗，并且根据最近的研究¹⁴，供体目前应保持约1％数量级的总IgG⁺循环记忆B细胞中VACV特异性循环记忆B细胞。现已确定IgG⁺记忆B细胞包含10-15％的外周B细胞池¹⁵。还确定所有B细胞包含约10％的循环PBMC¹⁶。因此，VACV特异性IgG⁺循环记忆B细胞的数目为总PBMC的约0.01％。假定1×10⁶个PBMC/mL全血，则VACV特异性IgG⁺循环记忆B细胞的总数/mL全血为约100。如果我们假设VACV L1特异性记忆B细胞占细胞总数的1-10％，那么我们可以预计每毫升全血中有约1-10个细胞。因此，可以处理100mL ACAM2000接种的供体血液以提取100-1000个VACV L1特异性记忆B细胞。

实施例

实施例1

最近的工作已表明壳聚糖(通过对几丁质部分去乙酰化所产生的线性b-1，4-连接的多糖)的独特性质及其在功能性生物制造中的用途^19-23。这种生物聚合物的两个主要性质包括其pH依赖的溶解性以及它的胺基在酶促缀合中的反应性。前一种性质使壳聚糖能够利用阴极表面上分布的pH梯度通过电沉积进行空间定向组装。研究已表明稳定薄膜中功能化缀合的壳聚糖在微流体设备中的微图案金电极上的组装²⁴。后一种性质允许功能化缀合的壳聚糖进行酶促组装。2008年，Wu等人描述了通过酪氨酸酶介导的酪氨酸五肽标记的修饰蛋白G在电沉积的壳聚糖生物聚合物表面上的缀合，以及荧光标记的IgG抗体自组装到该功能化表面²⁵。生物聚合物壳聚糖应用的其它实例包括预包装的功能性代谢途径酶在微流体可重复使用的bioMEMS设备中的可编程组装²⁶和多通道微流体设备内微图案金电极上绿色荧光蛋白(GFP)的原位活化和组装²⁷。尽管壳聚糖是优选的聚合物，但是可以使用其它适合的聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺等。

白细胞(如中性粒细胞)向炎症位点的募集是通过受体-配体相互作用介导的。循环中的中性粒细胞的归巢是通过被称为细胞滚动(cellrolling)的生理过程所起始的。如选择素的糖蛋白受体允许白细胞和活化的血管内皮之间瞬时粘附结合²⁸。这些结合具有高离解率并且对剪切应力敏感^29-30。已经在体外研究了这种细胞滚动现象，以允许细胞的分离和二维纳米力学控制^31-32。Chang等人证明了微流体设备中固定的E-选择素所介导的细胞系混合物的分级分离³³。已通过L-选择素基底上的差别滚动粘附完成了干细胞和祖细胞群体与其它成熟骨髓细胞的分离³⁴。使用平行板流动室中的IgG涂覆微球的研究将微球分离的临界剪切速率的提高与配体表面浓度的提高相关联³⁵。

本发明包括将基于BCR亲合力差异性分离抗原特异性B细胞的微流体设备。如图10中所示，本发明的微流体设备可以包括多个区并且每个区可以由矩形金电极或电极阵列组成以允许功能化缀合的壳聚糖混合物的位点特异性寻址。设计了设备的流动室并将其制造以包括密封流路以允许无菌操作。可以将电极集成到流动室中以允许功能化缀合的壳聚糖或其它聚合物电沉积。图11详细显示了流动室的设计。

通过将酪氨酸五肽标记或谷氨酸五肽加入到C末端来修饰如上所述的带His标签的可溶性痘苗病毒抗原L1。可以将该抗原直接或通过如本发明所述的接头(tether)缀合到壳聚糖或其它聚合物上。可以构建微流体设备以允许溶液、培养基和B细胞流动通过功能化表面。可以用VACVL1抗原或其它抗原缀合的壳聚糖或其它聚合物的梯度电沉积该表面。在一些实施方案中，可以沿设备的z轴在薄膜中以阶梯梯度电沉积抗原缀合的壳聚糖或其它聚合物。功能化表面设计成容纳100-1000个抗原特异性记忆B细胞的空间分布组。可以通过细胞培养基的层流将细胞引入到设备和生物聚合物的表面。展示对壳聚糖锚定的L1上表位有特异性之BCR的记忆B细胞与抗原相互作用并且以白细胞滚动的方式沿该表面滚动。由于L1抗原沿z轴的表面浓度可以是梯度的，因此该相互作用是加成性的，细胞滚动减慢，一组抗原特异性B细胞将被捕获在功能化表面上(参见图12)。作为额外的益处，可以通过该差异性粘附介导的分离筛选BCR和所得分泌的mAb的亲合力。可以通过分泌的mAb的表面等离子共振测量(即Biacore分析)测定作为迁移距离函数的抗体亲合力。灌注/吸取注射泵(Kent Scientific Corp.)可用于控制培养基进入流动室内的流速，借此精确地控制整个抗原结合的壳聚糖表面的剪切应力。要制备缀合的壳聚糖或其它聚合物的浓度表面梯度，可将两个或更多个注射泵连接到通向流动室的共同入口管上。在一些实施方案中，电沉积表面可以由在流动表面上从入口至出口堆叠的多个分开的电极组成(参见图10)。电极数将决定梯度的连续性(例如电极越多，梯度越连续)。注射泵控制每个区的抗原浓度。该过程可以是自动的。可以使用在其表面上结合不同抗L1 mAb的微球进行初始研究。

可以通过将标记的抗L1抗体在缀合L1的生物聚合物表面上流过来完成梯度电沉积的确认。最初成功的标准是证明抗L1IgG缀合微球混合物的差异性迁移。这表明流体流动所引起的剪切力使得BCR-抗原之间的结合能够结合和解离，并造成B细胞沿抗原结合的生物聚合物表面滚动。这些微球实验设置了免疫细胞分离的初始剪切应力范围和L1浓度梯度。如果微球不迁移，向流动相中加入竞争性抗原特异性mAb或Fab可以导致滚动发生。另一个替代方法是从抗原结合的表面对微球的静态捕获开始的。然后，在流动相中起始竞争性抗原特异性mAb或Fab梯度以引起更高解离率的mAb结合微球的分离。梯度结束时，将仅保留解离率最低和亲合力最高的微球。使用多克隆竞争性抗原特异性mAb或Fab，将微球实验的替代方法转换为免疫细胞(例如，B细胞)实验。另一个替代方法是将选择素缀合到壳聚糖上，将其加入到梯度中，并降低L1抗原的表面浓度或将抗原置于下游以设置“捕获区”。这将非特异地开始滚动过程，但是捕获了抗原特异性细胞³⁶。

实施例2

可以活化缀合了抗原的壳聚糖或其它聚合物表面上捕获的细胞以诱导向抗体分泌细胞(ASC)的分化和克隆性扩增。最近以及先前的研究已鉴定了可溶性免疫细胞(例如B细胞)的活化物^37-45。已表明与BCR发出的信号协同的TNF家族(BAFF)的B细胞活化因子能够刺激B细胞存活、类别转换DNA重组和抗体生产⁴⁶。与IL-10协同，包括含有CpG的寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)和细菌DNA的微生物来源产物可以通过打开TLR9通路来活化人B细胞^47-49。可以加入重组CD40L、IL-4、IL-5、IL-6、IL-15、IL-21或其它添加剂以增加mAb同种型(即IgG)的活化、分化、增殖和选择。一旦开始进行活化和扩增，B细胞将形成ASC集落。本领域技术人员已知的其它适合的活化物均可用于激活B细胞以外的其它系的免疫细胞。

在流动室中进行实验前，可以在磁珠分离的抗原特异性记忆B细胞上测试活化培养基的配方。可以进行提取并在96孔细胞培养板上接种细胞。可以使用如淋巴细胞生长培养基-3(Lonza)的市售人免疫细胞培养基来培养B细胞。可以使用以上引用的激活添加剂的组合进行基质实验，并且该实验包括可溶性重组抗原L1的加入。初始成功的标准包括如分别由IgG的分泌和细胞集落形成所指示的记忆B细胞的活化和扩增。一旦实现，可以将活化过程转换到流动室中。细胞培养方面的考虑(例如氧传质)可要求对流动室的修改以允许B细胞活化和扩增期间的气体交换。

实施例3

设计了用于分离、活化和定殖B细胞的流动室以允许通过显微镜可视化地观察集落并且有利于在无菌环境中使用显微操作器转移集落。可以将这些集落转移到96孔板中进行另外的扩增并通过ELISA法对上清液筛选抗原特异性mAb。可以通过表面等离子共振(Biacore)进一步鉴定这些上清液中mAb的抗原结合/亲合力以确定作为B细胞迁移距离函数的抗体亲合力的相关性。

可以在功能上测试流动室设计的无菌性、集落的可视化和转移。在细胞培养实验前，可以用不含抗生素的培养基和无菌保持步骤进行这些测试。如果不可能在微流体设备中活化和培养某些抗原特异性B细胞，捕获后细胞的分离以及向板的转移可能是必需的。这一替代方法将要求有提取个体mAb的额外有限稀释克隆步骤。

实施例4

使用EZ-Link Micro NHS-PEO₄-生物素化试剂盒(Pierce)对重组可溶性VACV L1进行生物素化。通过ELISA分析生物素化的L1对L1特异性IgG(mAb 7D11和mAb 10F5)的反应性。与非生物素化的L1相比，生物素化的试剂对mAb 7D11和mAb 10F5的OD信号分别减小了34％和28％。然后，分析生物素化的L1试剂以确定结合至每个L1分子上的生物素分子的平均数目。这是通过Pierce生物素定量试剂盒(产品号No.28005)进行的，其在竞争反应中使用了HABA(4′-羟基偶氮苯-2-羧酸)和抗生物素蛋白。实验结果表明每个L1分子结合了平均2.2个生物素分子。

在另一个表征实验中，证明了对抗L1和抗生物素抗体同时具有反应性。简要地，通过用抗L1mAb(7D11)涂覆96孔板设计了L1捕获ELISA。孵育过夜后，清洗并封闭板。除去封闭缓冲液并将生物素化和非生物素化的L1的连续稀释样品加入到孔中。使用不含蛋白的封闭缓冲液作为阴性对照以确定背景信号。孵育板，然后清洗。将抗生物素mAb的第二试剂加入到所有孔中。该试剂来源于Miltenyi Biotec(产品号No.130-090-857)。孵育并清洗后，加入兔抗小鼠IgG1。孵育并清洗后，加入缀合了HRP的山羊抗兔IgG试剂。在最终孵育和清洗后，用ABTS底物溶液使板显影并在405nm下在读板器上读数。生物素化L1的孔的信号(光密度，OD)比非生物素化的孔和阴性(背景)孔高约10倍。非生物素化和阴性孔的信号相当。这些结果表明生物素化的L1试剂可以同时结合抗L1mAb和抗生物素mAb并且应适合于B细胞捕获实验。

实施例5

在09年7月7日接种ACAM 2000天花疫苗前，对健康人志愿者(供体BB)取血以用于血清和循环中淋巴细胞提取。将约20mL血液抽取至Vacutainer速凝收集管(BD，参考号3678230)中。以1000×g对内容物离心20分钟。吸出血清级分，以500μL等分至冷冻管中，并保存在液氮汽相真空瓶中。将约75mL血液抽取至具有肝素钠的Vacutainer收集管(BD，参考号367874)中。将15mL Histopaque-1077加入到5个50mL锥形管的每一个中。小心地将15mL全血放置到每个Histopaque-1077等份上。将试管以400×g离心30分钟，并吸取外周血单个核细胞(PBMC)层。以5∶1的PBS∶PBMC比，将PBMC与PBS混合。将溶液离心，弃去上清液，将PBMC在总体积10mL的冷冻媒介(90％的FBS/10％的DMSO)中再悬浮。将细胞以500μL等分至冷冻管中并在液氮汽相真空瓶中储存。在总体积约11.5mL中，1.136×10⁷个活细胞/mL的细胞计数表明根据供体BB最近的CBC分析，回收了约20％的PBMC。

为了确定PBMC对流式细胞仪分析的适合性和存活性，将一等份PBMC快速融化并将细胞以1∶10稀释至PBS或PBS加0.5μg/mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)中。在BD FACSVantage仪上运行这些样品。如图13所示，PI染色的细胞显示出几乎100％的存活。如上所述地，在接种疫苗的时间点后21天从供体BB中分离PBMC。另外，将使用B细胞特异性荧光标记的Ab来分析和富集特异性B细胞池。

实施例6

设计并产生了VACV L1R抗原基因的几种变体。具体地，改造得到了L1R胞外域的带谷氨酰胺和酪氨酸标签的版本，并进行PCR组装。这些变体中的每一个均包含3′(C-端)6-组氨酸标签以便于纯化。在研究中使用Tyr和Gln标签以分别将蛋白直接地和通过肽接头间接地缀合至壳聚糖。壳聚糖或其它生物聚合物将薄层电沉积到微流体芯片上。一旦VACV L1抗原缀合至壳聚糖或聚合物表面上，将使用模式细胞系和人供体循环淋巴细胞混合物来研究抗原特异性B细胞的捕获。这些L1变体中每一个的基因将组装并克隆到哺乳动物表达质粒中。使用小规模瞬时转染和亲合纯化来大量产生每种蛋白以用于通过ELISA的分析和缀合研究。

设计并合成了引物，并将其用于产生具有多种末端标签的6种PCR产物(参见图14)。以两个步骤进行PCR组装。首先，通过PCR从先前的构建物pcdna3.1+zeo:intA:VACVsL1R+His#1扩增L1胞外域。第二，将凝胶纯化的PCR产物用作使用表5中引物组的通用模板以产生所有6种L1变体。

表5.用于6种带末端标签的VACV L1变体的PCR组装的引物

用下划线表示限制性酶切位点并将其在引物后的括号中列出。用斜体表示Gln和Tyr标记。用粗体和斜体表示His标记。

图15显示了成功的两步PCR组装。切下图15B中以框表示的PCR产物条带并进行凝胶纯化。用Hind III和Not I限制性酶切初始的哺乳动物表达质粒pcdna3.1+zeo:intA:VACVsL1R+His#1并进行大规模凝胶纯化以除去未修饰的L1胞外域，为6个变体中的每一个提供受体载体(参见图16)。同样地，用Hind III和Not I限制性酶切凝胶纯化的L1变体，然后将其连接到受体载体上。用这些质粒转化TOP10感受态大肠杆菌(Invitrogen)并在Carb100 LB琼脂上铺板(100μg/mL的羧苄西林)。对于6个变体中的每一个，挑取3个集落，并在3mL的Carb50LB液体培养基中在37℃振摇扩增7小时。收获1.5ml培养物，并使用QiagenQIAprep Spin Miniprep试剂盒纯化质粒。将0.5ml的每种培养物与等体积的50％的甘油溶液混合并在冷冻至-80℃。通过使用Hind III和Not I的限制性内切酶(REN)分析质粒制备物。图17中加框表示的质粒是使用与质粒中插入物侧翼区域互补的引物所确认的DNA序列。所有序列均是100％准确的。

以中等规模制备了6个构建物中的每一个以用于瞬时转染和表达。简要地，对于每种构建物，用转化的大肠杆菌的单个集落接种30mL Carb50LB液体培养基。将培养物在37℃振摇孵育过夜。第二天，收获培养物并使用Qiagen质粒Midi试剂盒纯化质粒。在T-75烧瓶中的下列生长培养基中扩增HEK 293T/17细胞：DMEM-高葡萄糖(Invitrogen，产品号No.11995-040)、10％FBS-Certified(INVG，产品号No.16000-069)、2mMGlutaMAx(INVG，产品号No.35050-061)和1×NEAA(INVG，产品号No.11140-050)。在第11代时，对细胞计数并以15mL生长培养基中3×10⁶个活细胞在10cm细胞培养盘中接种。将细胞孵育两天并达到约90％的汇合。在转染当天，用15mL新鲜生长培养基替换培养基。对于每次转染，将24μg质粒DNA在1.5mL OptiMEM-I SFM培养基(INVG，产品号No.31985-062)中稀释并且将60μL Lipofectamine 2000(INVG，产品号No.11668-027)在1.5mL OptiMEM-I中稀释。轻轻混合溶液并在室温下孵育20分钟。将反应滴加至每个10cm细胞培养盘中，并允许转染进行5.5天。吸出上清液并通过离心和0.22μm的过滤进行澄清。

使用树脂床层体积3mL并且采用旋转纯化规程的HisPur纯化试剂盒(Pierce，产品号No.90092)纯化瞬时表达的L1变体。使用包含的洗脱缓冲液(50mM磷酸钠、300mM氯化钠、150mM咪唑；pH7.4)将带His标签的蛋白质洗脱进两个3mL的级分。将总计26μL的每个级分上样至还原样品缓冲液(NuPAGE Novex 10％Bis-Tris凝胶1.0mm，10孔，INVG，产品号No.NP0301)中的SDS-PAGE凝胶上。以恒定200V的电压运行凝胶45分钟并用考马斯亮蓝(SimplyBlue SafeStain，INVG，产品号No.LC6065)染色。图18中显示了染色的SDS-PAGE凝胶。加框表示的主要条带为25881-27234Da(平均值＝26601Da)，通过密度测定法分析确定的纯度为62-83％。将每个蛋白的级分1和2混合，通过A280定量，以0.22μm无菌过滤，并在-20℃储存。

通过ELISA分析蛋白质的对mAb c7D11(α-VACV L1嵌合单克隆)的抗体结合。该分析将确定构象表位是否是保守的，从而表明蛋白折叠正确(有关中和抗体7D11对痘病毒L1蛋白结合的结构基础，参见Su等人，Virology，2007，368(2)：331-41)。临冷冻之前，以PBS中100ng/孔，将混合的最终纯化蛋白用于涂覆96孔ELISA板。在A-F行中，每行的12个孔涂覆一种蛋白。作为阳性对照，将初始可溶性L1(仅带His标签)以PBS中100ng/孔涂覆到G行的12个孔中。作为阴性对照，将可溶性VACVA33亚单位蛋白以PBS中100ng/孔涂覆到H行的12个孔中。将板在4℃孵育过夜。清洗板并用PBS中5％的脱脂奶粉(NFDM)、0.1％的吐温20和0.01％的硫柳汞(thymerisol)在室温下振摇封闭45分钟。从3000ng/mL的浓度开始，在封闭缓冲液中以1∶2的系列稀释纯化的c7D11mAb，稀释10次。从ELISA板中弃去封闭缓冲液，将c7D11标准曲线稀释系列加入到板的每一行中(100μL/孔)，保留每一行的最后两个孔以用于仅含封闭缓冲液(缓冲液阴性对照)的情况。将板在室温下振摇孵育45分钟。弃去样品，清洗ELISA板。在封闭缓冲液中以1∶20000稀释第二抗体(抗人IgG[Fab特异性]过氧化物酶，在山羊中产生的抗体，Sigma，产品号No.A0293-1ML)，并将其加入到每个孔中(100μL)。将板在室温下振摇孵育45分钟。弃去第二抗体，清洗ELISA板。用TMB液体底物系统(Sigma，产品号No.T0440-100ML，100μL/孔)使板显影。每孔加入100μL 0.5M的H₂SO₄以终止反应。在450nm读取ELISA板。图19显示了每行涂覆蛋白(L1变体、sL1原始和VACV A33)所产生的信号曲线。如图所示，所有L1变体表现出与mAb c7D11稀释类似的信号应答并且与仅带有His标签的初始sL1的信号强度相当或更高。在A33或缓冲液阴性对照孔中未观察到信号。这表明mAb c7D11识别的构象表位是保守的。

实施例7

可以根据功能和设计标准选择各个L1变体，将其缀合至壳聚糖或其它聚合物并在芯片上分析功能性。可以通过在HCl的水溶液(1％v/v)中溶解壳聚糖片并用1M的NaOH将pH调节至5.6来制备壳聚糖溶液(1％w/v)。可以通过在20mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH6.5)中溶解明胶来制备明胶储液(5％)。两种溶液均可以在121℃高压灭菌15分钟。可以使用通过以标准微加工将金电极布置在硅片上所制备的芯片来进行蛋白质组装。要电沉积壳聚糖，可以将芯片部分浸没在壳聚糖溶液(5mL，1％w/v，pH5.6)中，并且在5A/m²的受控电流密度下将电极偏斜以用作阴极1分钟(通常电压小于2.5V)。沉积后，可以将电极与电源断开，用去离子水清洗芯片并在PBS(pH7.4)中浸泡30分钟。

为了将明胶接头接枝到电沉积的壳聚糖膜上，可以将芯片在含有酪氨酸酶(50U/mL)和明胶(0.5-4％)的3mL 20mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中孵育。接枝后，可以用含有0.1％Triton X-100的10mL 20mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)清洗芯片三次。可以通过将芯片在含有微生物转谷氨酰胺酶(mTG；1U/mL)和带gln标签的L1(1.3μM)的3mL 20mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中孵育从而将带谷氨酰胺标签的L1变体组装到接头上。可以在室温下反应过夜。

为证明抗L1单克隆抗体(mAb)的特异性结合，可以将芯片浸没在含有mAb c7D11(α-VACV L1嵌合单克隆)的溶液中。可以清洗该芯片并将其浸没在抗人IgG(Fc-特异性)荧光标记的第二抗体中。清洗后，可以使用荧光显微镜(Leica；MZFL III)观察电极地址发出的荧光。可以使用连接到荧光显微镜上的数字式相机(Spot 32，DiagnosticInstruments)获得芯片的荧光显微照片。可以使用Image J软件分析显微照片的荧光特征谱。

实施例8

可以通过下列改变，如上所述地完成抗原特异性T细胞的捕获和扩增：1)缀合至设备中功能化表面的抗原可以是具有T细胞表位的肽；2)在引入用于分离的设备之前，可以对T细胞富集人PBL(即，磁珠或流式细胞法)；和3)在T细胞分离和捕获在流动室中功能化表面上之后，可以通过加入含有已知T细胞活化因子的T细胞激活培养基来活化T细胞。形成克隆T细胞集落后，通过显微操作器将其取出，放置在96孔细胞培养板上并进一步扩增。

参考文献

1.Schmaljohn C，Cui Y，Kerby S，Pennock D.，and Spik K.Production and characterization ofhuman monoclonal antibody Fab fragments to vaccinia virus from a phage-display combinatoriallibrary.Virology.1999；258：189-200.

2.Barbas CF，Kang AS，Lerner RA，and Benkovic SJ.Assembly of combinatorial antibodylibraries on phage surfaces：The gene III site.PNAS.1991；88：7978-82.

3.Guttieri MC，Sinha T，Bookwalter C，Liang M，and Schmaljohn CS.Cassette vectors forconversion of Fab fragments into full-length human IgG1 monoclonal antibodies by expression instably transformed insect cells.Hybrid Hybridomics.2003；22：135-45.

4.Franklin A and Blanden RV.Potential inhibition of somatic hypermutation by nucleosideanalogues.Mol.Immun.2007；44：666-9.

5.Guay HM，Panarey L，Reed AJ，and Caton AJ.Specificity-based negative selection ofautoreactive B cells during memory formation.J.Immunol.2004；173：5485-94.

6.Low NM，Holliger P，and Winter G.Mimicking somatic hypermutation：Affinity maturation ofantibodies displayed on bateriophage using a bacterial mutator strain.J.Mol.Biol.1996；260：359-68.

7.Steele EJ.Reflections on the state of play in somatic hypermutation.Mol.Immunol.2008；45：2723-6.

8.Steidl A，Ratsch O，Brocks B，Dürr M，and Thomassen-Wolf E.In vitro affinity maturation ofhuman GM-CSF antibodies by targeted CDR-diversification.Mol.Immun.2008；46：135-44.

9.Thompson J，Pope T，Tung J-S，Chan C，Hollis G，Mark G，and Johnson KS.Affinitymaturation of a high-affinity human monoclonal antibody against the third hypervariable loop ofhuman immuno deficiency virus：Use of phage display to improve affinity and broaden strainreactivity.J.Mol.Biol.1996；256：77-88.

10.Kvell K，Nguyen TH，Salmon P，Glauser F，Werner-Favre C，Barnet M，Schneider P，Trono D，and Zubler RH.Transduction of CpG DNA-stimulated primary human B cells with bicistroniclentivectors.Mol.Immun.2008；46：135-44.

11.Lanzavecchia A，Bernasconi N，Traggiai E，Ruprecht CR，Corti D，and Sallusto F.Understanding and making use of human memory B cells.Immunol.Rev.2006；211：303-9.

12.Li J，Sai T，Berger M，Chao Q，Davidson D，Deshmukh G，Drozdowski B，Ebel W，Harley S，Henry M，Jacob S，Kline B，Lazo E，Rotella F，Routhier E，Rudolph K，Sage J，Simon P，Yao J，Zhou Y，Kavuru M，Bonfield T，Thormassen MJ，Sass PM，Nicolaides NC，and Grasso L.Humanantibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybridoma technology.PNAS.2006；103：3557-62.

13.Weisner M，Zentz C，Mayr C，Wimmer R，Hammerschmidt W，Zeidler R，and Moosmann A.Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.PLoS ONE 2008；1：1-13.

14.Crotty S，Felgner P，Davies H，Glidewell J，Villarreal L，and Ahmed R.Cutting edge：Long-term B cell memory in humans after smallpox vaccination.J.Imm.2003；171：4969-73.

15.Klein U，Rajewsky K，and Kuppers R.Human immunoglobulin(Ig)M+IgD+peripheral bloodB cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes：CD27 as a general marker for somatically mutated(memory)B cells.J.Exp.Med.1998；188：1679-89.

16.Marti GE，Magruder L，Patrick K，Vail M，Schuette W，Keller R，Muirhead K，Horan P，andGralnick HR.Normal human blood density gradient lymphocyte subset analysis：Anlnterlaboratory flow cytometric comparison of 85 normal adults.Amer.J.Hema.1985；20：41-52.

17.Babcook JS，Leslie KB，Olsen OA，Salmon RA，and Schrader JW.A novel strategy forgenerating monoclonal antibodies from single，isolated lymphocytes producing antibodies ofdefined specificities.PNAS.1996；93：7843-8.

18.Guan Y，Sajadi MM，Kamin-Lewis R，Fouts TR，Dimitrov A，Zhang Z，Redfield RR，DeVicoAL，Gallo RC，and Lewis GK.Discordant memory B cell and circulating anti-Env antibodyresponses in HIV-1 infection.PNAS.2009；epub ahead of print.

19.Yi H，Wu L-Q，Bentley WE，Ghodssi R，Rubloff GW，Culver JN，and Payne GF.Biofabrication with chitosan.Macromolecules.2005；6：2881-94.

20.Payne GF and Raghavan SR.Chitosan：a soft interconnect for hierarchical assembly of nano-scale components.Soft Matter.2007；3：521-7.

21.Lewandowski AT，Bentley WE，Yi H，Rubloff GW，Payne GF，and Ghodssi R.Towards area-based in vitro metabolic engineering：Assembly of Pfs enzyme onto patterned microfabricatedchips.Biotech.Prog.2008；24：1042-51.

22.Shi X-W，Yang X，Gaskell KJ，Liu Y，Kobatake E，Bentley WE，and Payne GF.Reagentlessprotein assembly triggered by localized electrical signals.Adv.Mat.2009；21：984-8.

23.Yang X，Shi X-W，Liu Y，Bentley WE，and Payne GF.Orthogonal enzymatic reactions for theassembly of proteins at electrode addresses.Langmuir.2009；25：338-44.

24.Park JJ，Luo X，Yi H，Valentine TM，Payne GF，Bentley WE，Ghodssi R，and Rubloff GW.Chitosan-mediated in situ biomolecule assembly in completely packaged microfluidic devices.LabChip.2006；6：1315-21.

25.Wu H-C，Shi X-W，Tsao C-Y，Lewandowski AT，Fernandes R，Hung C-W，DeShong P，Kobatake E，Valdes JJ，Payne GF，and Bentley WE.Biofabrication of antibodies and antigens viaIgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag.Biotech.Bioeng.2009；epub ahead of print.

26.Luo X，Lewandowski AT，Yi H，Payne GF，Ghodssi R，Bentley WE，and Rubloff GW.Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMSdevice.Lab Chip.2008；8：420-30.

27.Lewandowski AT，Yi H，Luo X，Payne GF，Ghodssi R，Rubloff GF，and Bentley WE.Proteinassembly onto patterned microfabricated devices through enzymatic activation of fusion pro-tag.Biotech.Bioeng.2008；99：499-507.

28.Janeway CA，Travers P，Walport M，and Shlomchik MJ.Immunobiology：The immune systemin health and disease，6th Ed.New York：Garland Science，2005.

29.Dong C and Lei XX.Biomechanics of cell rolling：Shear fow，cell-surface adhesion，and celldeformability.J.Biomech.2000；33：35-43.

30.Fritz J，Katopodis AG，Kolbinger F，and Anselmetti D.Force-mediated kinetics of single P-selectin/ligand complexes observed by atomic force microscopy.PNAS.1998；95：12283-8.

31.Charles N，Liesveld JL，and King MR.Investigating the feasibility of stem cell enrichmentmediated by immobilized selectins.Biotech.Prog.2007；23：1463-72.

32.Karnik R，Hong S，Zhang H，Mei Y，Anderson DG，Karp JM，and Langer R.Nanomechanicalcontrol of cell rolling in two dimensions through surface patterning of receptors.Nano Lett.2008；8：1153-8.

33.Chang WC，Lee LP，and Liepmann D.Biomimetic technique for adhesion-based collection andseparation of cells in a microfluidic channel.Lab Chip.2005；5：64-73.

34.Greenberg AW and Hammer DA.Cell separation mediated by differential rolling adhesion.Biotech.Bioeng.2001；73：111-24.

35.Gao B and Jin G.Study of interaction force between antigen and antibody using flow chambermethod.Proc.of IEEE EMB 27th Ann.Conf.2005；7584-7.

36.Hong S，Lee D，Zhang H，Zhang JQ，Resvick JN，Khademhosseini A，King MR，Langer R，andKarp JM.Covalent immobilization of P-selectin enhances cell rolling.Langmuir.2007；23：12261-8.

37.Bagley KC，Abdelwahab SF，Tuskan RG，and Lewis GK.Cholera toxin indirectly activateshuman monocyte-derived dendritic cells in vitro through the production of soluble factors，including prostaglandin E2 and nitric oxide.Clinical and Vaccine Immunology 2006；13：106-15.

38.Bagley KC，Abdelwahab SF，Tuskan RG，and Lewis GK.Pasteurella multocida toxin activateshuman monocyte-derived and murine bone marrow-derived dendritic cells in vitro but suppressesantibody production in vivo.Infection and Immunity 2005；73：413-21.

39.Bagley KC，Abdelwahab SF，Tuskan RG，and Lewis GK.Calcium signaling throughphospholipase C activates dendritic cells to mature and is necessary for the activation andmaturation of dendritic cells induced by diverse agonists.Clinical and Diagnostic LaboratoryImmunology 2004；11：77-82.

40.Bagley KC，Abdelwahab SF，Tuskan RG，Fouts TR，and Lewis GK.Pertussis toxin and theadenylate cyclase toxin from Bordetella pertussis activate human monocyte-derived dendritic cellsand dominantly inhibit cytokine production through a cAMP-dependent pathway.J.LeukocyteBiol.2002；72：962-9.

41.Brunswick M，June CH，Finkelman FD，Dintzis HM，Inman JK and Mond JJ.Surfaceimmunoglobulin-mediated B-cell activation in the absence of detectable elevations in intracellularionized calcium：A model for T-cell independence B-cell activation.PNAS 1989；86：6724-8.

42.Hebeis BJ，Klenovsek K，Rohwer P，Ritter U，Schneider A，Mach M，and Winkler TH.Activation of virus-specific memory B cells in the absence of T cell help.J.Exp.Med.2004；199：593-602.

43.Klaus SJ，Pinchuk LM，Ochs HD，Law C-L，Fanslow WC，Armitage RJ，and Clark EA.Costimulation through CD28 enhances T cell-dependent B cell activation via CD40-CD40Linteraction.J.Immun.1994；152：5643-52.

44.Li W.Synergistic antibody induction by antigen-CD40 ligand fusion protein as improvedimmunogen.Immun.2005；115：215-22.

45.Li X，Vanitha DJ，Joo HM，He Y，Rouse BT，and Sangster MY.A strategy for selective，CD4+T cell-independent activation of virus-specific memory B cells for limiting dilution analysis.J.Immun.Meth.2006；313：110-8.

46.Schneider P，MacKay F，Steiner V，Hofmann K，Bodmer JL，Holler N，Ambrose C，Lawton P，Bixler S，and Acha-Orbea S.BAFF，a novel ligand of the tumor necrosis factor family，stimulatesB cell growth.J.Exp.Med.1999.189：1747.

47.He B，Qiao X，and Cerutti A.CpG DNA induces IgG class switch DNA recombination byactivating human B cells through an innate pathway that requires TLR9 and cooperates with IL-10.J.Immun.2004；173：4479-91.

48.Huggins J，Pellegrin T，Felgar RE，Wei C，Brown M，Zheng B，Milner ECB，Bernstein SH，Sanz I，and Zand MS.CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27-

humand B cells.Blood.2007；109：1611-9

49.Richard K，Pierce SK，and Song W.The agonists of TLR4 and 9 are sufficient to activatememory B cells to differentiate into plasma cells in vitro but not in vivo.J.Immunol.2008；181：1746-52.

尽管出于清楚和理解的目的详细地描述了上述发明，但是通过阅读本发明公开本领域技术人员将理解可以在不背离本发明和所附权利要求的真实范围的情况下在形式和细节方面进行各种改变。本文所引用的所有专利和出版物作为参考完全并入本文。

Claims (14)

1.用于通过免疫细胞受体与配体的相互作用分离所述免疫细胞的设备，其中所述配体固定在所述设备的功能化表面上并且所述设备适于使所述免疫细胞流动通过所述功能化表面。

2.根据权利要求1所述的设备，其中所述设备是流通池或微流体设备。

3.根据权利要求1所述的设备，其中所述免疫细胞是B细胞。

4.根据权利要求1所述的设备，其中所述免疫细胞受体是B细胞受体。

5.根据权利要求1所述的设备，其中所述配体是具有B细胞表位的抗原。

6.根据权利要求1所述的设备，其中所述免疫细胞是T细胞。

7.根据权利要求1所述的设备，其中所述免疫细胞受体是T细胞受体。

8.根据权利要求1所述的设备，其中所述配体是具有T细胞表位的抗原。

9.根据权利要求1所述的设备，其中所述功能化表面是与所述配体缀合的聚合物。

10.用于提取免疫细胞的方法，其包括：

将包含所述免疫细胞的溶液与根据权利要求1的设备相接触。

11.根据权利要求10的方法，其中所述免疫细胞被捕获在所述功能化表面上，并且通过诱导活化使其增殖。

12.根据权利要求11的方法，其中从所述设备回收有活力的经活化且增殖中的免疫细胞集落。

13.根据权利要求12的方法，其中通过从所述聚合物上释放所述配体来回收集落。

14.根据权利要求12的方法，其中机械性移除所述集落。

Images