CN102399879A - 一种造血嵌合体实时定量pcr检测及其标本收集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种利用荧光染料SYBR green的来检测造血嵌合体的PCR实时定量检测方法，所述包括步骤：收集标本；选择多态性遗传标记设计引物和探针；实时定量PCR检测造血嵌合体；人工合成不同稀释浓度的造血嵌合体；以及进行统计学分析。其中所述收集标本的步骤包括通过临床采集供体和受体移植之前和移植后一个月的血样；以及用常规方法从中直接提取基因组DNA。本发明中介绍了12个可以用于Q-PCR来检测造血嵌合体的特异性多态性遗传标记。另外为了弥补荧光染料SYBR green纳入双链DNA是非特异性的，同时运行熔解曲线来验证PCR产物的特异性。本发明的实时定量PCR方法所需费用便宜，保质期长，且灵敏度，为一种快捷简便而可靠的造血嵌合体的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种造血嵌合体实时定量PCR(Polymerase ChainReaction，聚合酶链式反应)检测方法，特别涉及一种利用荧光染料SYBR green来检测造血嵌合体的PCR检测及其标本收集方法。
背景技术
随着异体造血干细胞用来治疗各种恶性和非恶性的血液疾病，许多病人延长了总的存活时间和无病生存时间。导致治疗失败的主要原因是疾病复发，移植物被排斥，移植物抗宿主病。因此定量分析病人异体干细胞移植后供体嵌合体是用来诊断移植物成活，早期检测和治疗疾病复发，移植物排斥反应的重要工具。异体造血干细胞移植后的嵌合体的监测已成为常规检查手段，特别是在RIC(Reduced IntensityConditioning，降低强度条件)的异体移植，异体干细胞移植后供体嵌合体的结果可用来指导是否进行干预治疗，特别在改变免疫抑制治疗和治疗疾病的复发起到了决定性作用。
造血嵌合体的检测可以利用受体和供体多态性遗传标记或它的产物的不同来测量。目前广泛应用的方法包括细胞遗传学，红细胞分型，限制性片段长度多态性分析和免疫荧光原位杂交(Fluorescence InSitu Hybridization，FISH)技术通过XY染色体探头来测定。但是以上方法或者费时，或者不适用于所有病人。比如免疫荧光原位杂交(FISH)技术是通过XY染色体探头来测定造血嵌合体的，因此只适用于受体和供体是不同性别的异体造血干细胞移植；而红细胞分型方法只适用于不同血型的受体和供体。
近年来用PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)实时定量检测造血嵌合体的方法因其应用的广泛和高灵敏度而越来越多地被使用。目前被接受的分子生物学方法是用PCR方法检测Microsatellite序列--一种短而重复不编码的序列。因为在不同的受体和供体中，此序列的重复数量不同从而造成PCR产物的大小不同。进而用丙烯酰胺凝胶电泳和自动序列分析PCR产物。此方法灵敏度相对较低(1～5％)，而且费时，费力，价格昂贵。
最近一种新的应用TaqMan技术检测单核甘酸多态性(SNP，SingleNucleotide Polymorphisms)的实时定量PCR方法被建立起来。SNP是等位基因变异，广泛表达在人的染色体编码与非编码区。大约每1000个碱基对就有一个单核苷酸多态性发生，因此为嵌合体的分析提供了一个广泛的信息标记库。此TaqMan技术的实时定量PCR方法需要应用特异的TaqMan探头，有价格昂贵而且保质期短的缺点。相比而言，能纳入双链PCR产物的荧光染料SYBR green因其便宜，高灵敏度而被广泛应用于实时定量PCR方法上。
发明内容
本发明的目的是建立了一种利用荧光染料SYBR green来检测造血嵌合体的PCR检测新方法及其标本收集方法，所述PCR检测方法可以提高PCR方法检测的灵敏度，耗时低且节省费用。
为达到本发明的目的，本发明的检测造血嵌合体的实时定量PCR检测方法包括以下步骤：
S1.收集标本；
S2.选择多态性遗传标记设计引物和探针(probe)；
S3.实时定量PCR检测造血嵌合体；
S4.人工合成12个不同稀释浓度的造血嵌合体；以及
S5.统计学分析。
造血嵌合体的检测关键在于选择可以区分受体和供体的特异性多态性遗传标记。本发明中介绍了12个可以用于实时荧光定量PCR(Realtime Q-PCR)来检测造血嵌合体的特异性多态性遗传标记。用此12个多态性遗传标记对37对供体和受体进行筛选，结果表明每个多态性标记的信息性(informativity)在3％至47％之间。12个多态性遗传标记可以区别94％的供体和受体。除一对同卵双胞胎外，所有37对供体和受体都可以找到适合的特异性多态性标记进一步进行定量PCR来检测造血嵌合体。
为了弥补荧光染料SYBR green纳入双链DNA是非特异性的，同时运行熔解曲线(melting curve)可以用来验证PCR产物的特异性。进一步用人工合成12个不同稀释浓度的造血嵌合体(从0.01％至100％)，利用供体DNA来稀释受体DNA或受体DNA来稀释供体DNA，标准的扩增曲线由供体或受体特异的等位基因位点的PCR来扩增以上人工合成的造血嵌合体来作出。供体或受体的阴性等位基因可以用来作为阴性对照。移植后的供体细胞的百分比可以从标准的扩增曲线计算出来。
本申请案的发明人对此方法和TaqMan probe的实时定量PCR进行比较，结果表明其灵敏度及准确度与TaqMan probe的实时定量PCR方法一样高。由于Sybr green价格便宜，保质期长，使其在实际应用上更优于Taqman PCR。本申请案的发明人用此新方法检测了18个病例，检测结果与用传统的Microsatellite/FISH的结果是一致的。但本方法应用广泛，适用于各类异体干细胞移植(包括同性别和不同性别)，且灵敏度远远高于另两种方法。
综上所述，本专利申请所建立的检测造血嵌合体实时定量PCR检测方法是一种快捷简便而可靠的方法。
附图说明
通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中：
图1所示为本发明的检测造血嵌合体的实时定量PCR检测方法的步骤示意图；
图2所示为PCR产物产生的两个等位基因显示出两个明显不同的熔解曲线；
图3所示为由供体或受体特异的等位基因位点的PCR来扩增人工合成的造血嵌合体作出标准扩增曲线。
具体实施方式
如图1所示，根据本发明的目的，本发明的一个实施例建立的一种利用荧光染料SYBR green来检测造血嵌合体的新方法，包括以下步骤：
S1.收集标本：临床采集供体和受体移植之前和移植后一个月的血样，用常规方法从中直接提取genomic DNA(基因组DNA)，用Nanodrop分光光度仪测量DNA浓度，而后存于4℃备用。
S2.选择多态性遗传标记设计引物和探针(probe)：多态性遗传标记的核甘酸序列人类等位基因短的插入/缺失多态性(human biallelicshort insertion/deletion polymorphisms)从Marshfiled Clinic(http://research.marshfieldclinic.org/genetics/Genetic Research)获得。其中，选择标准为：包括含有至少两个以上连续的碱基不同的等位基因多态性，在一般人群中显示高度的杂合性。以此标准选择如表1中所示的12个多态性遗传标记。用软件Prime 3来设计引物，针对每个等位基因多态性标记，需要设计两对引物，一个针对两个等位基因的共同位点，一个针对独特的多态位点。TaqMan probe探针被选定在两个等位基因之间；然后对每个PCR产物进行熔解曲线分析。
表1.用于实时定量PCR的特异标记的特征
表1中，“ND”表示未设计Probe探针；
Informativity(信息性)＝此标记所提供的informative位点数量/所有被筛选的供体-受体对数量
S3.实时定量PCR检测造血嵌合体：
利用SYBR green和TaqMan的实时定量PCR检测，每个反应20微升，在Rotor gene3000荧光定量PCR仪中进行。PCR反应体系如下：
在定量之前，先筛选适用于此供体和受体的多态性标记。以供体和受体移植前的DNA为底物，从12个多态性遗传标记中选择出一个最适合的等位基因位点，阳性等位基因定义为Ct值在20～25之间(Ct值指的是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)，阴性等位基因定义为Ct值＞36。当供体和受体显示出不同的PCR产物时，说明供体和受体具有不同的等位基因，这个标记可以用来作为定量检测造血嵌合体的多态性标记。
其中，PCR条件如下：
为了弥补荧光染料SYBR green纳入双链DNA是非特异性的，同时运行熔解曲线(melting curve)可以用来验证PCR产物的特异性，如图2所示，PCR产物产生的两个等位基因显示出两个明显不同的熔解曲线，一个在78℃，一个在80℃。多态性标记4a和4b在受体中都为阳性，而供体只有4a阳性，因此多态性标记4b被视为一个信息标记(informative mark)。
S4.人工合成12个不同稀释浓度的造血嵌合体：
进一步的，用人工合成12个不同稀释浓度的造血嵌合体(从0.01％至100％)-用供体DNA来稀释受体DNA或受体DNA来稀释供体DNA，标准的扩增曲线由供体或受体特异的等位基因位点的PCR来扩增以上人工合成的造血嵌合体来作出，如图3所示，其中：
A表示SYBR green Q-PCR的定量曲线，X轴表示PCR开始产生荧光信号的循环次数，信号出现越早代表越高的基因拷贝数；
B表示根据受体标记Ct值与受体/供体DNA片段对数量的线性对应关系画出的标准放大曲线，核酸精度相关系数r＝0.997，PCR效率为0.97。
供体或受体的阴性等位基因可以用来作为阴性对照，移植后的供体细胞的百分比可以从标准的扩增曲线计算出来。
S5.统计学分析
我们对利用此方法和TaqMan probe的实时定量PCR进行比较，其比较结果如下表2；我们用此新方法检测了18个病例，检测结果与用传统的Microsatellite/FISH的结果是一致的(如表3所示，其中，“NA”表示不适用；“ND”表示未做；病例1-9是性别不匹配的移植，与FISH结果进行比较；病例10-18是同性别的移植，与Microsatelliteanalysis结果进行比较。)
表2.SYBR green和TaqMan probe的实时定量PCR结果的比较
| 供体细胞(％) | SYBR green based Q-PCR | TaqMan probe based Q-PCR |
| 0.03 | 0.03±0.003 | 0.03±0.005 |
| 0.3 | 0.22±0.06 | 0.21±0.04 |
| 1.5 | 1.48±0.11(0.9-2.2) | 1.46±0.13(0.9-2.2) |
| 15 | 16.70±1.19(9.1-25.2) | 17.80±1.59(10.7-24.4) |
| 30 | 33.36±1.98(21.6-45.5) | 35.30±1.92(19.9-45.4) |
| 50 | 53.61±3.79(37.8-74.3) | 59.24±2.15(49.0-70.7) |
| 70 | 83.95±5.40(55.6-100) | 64.61±6.23(51.9-87.2)* |
| 85 | 100.41±7.57(55-100) | 82.63±4.41(58.7-100)* |
Values are the mean±SE，n＝12.*，P＜0.05，
SYBR green based Q-PCR：基于荧光染料SYBR green的实时荧光定量；
TaqMan probe based Q-PCR：基于TaqMan探针的实时荧光定量。
表3.SYBR green实时定量PCR方法与Microsatellite/FISH的结果的比较
由上述的对比结果表明，本发明的方法的灵敏度及准确度与TaqMan probe的实时定量PCR方法一样高。由于Sybr green价格便宜，保质期长，使其在实际应用上更优于Taqman PCR。但本方法应用广泛，适用于各类异体干细胞移植(包括同性别和不同性别)，且灵敏度远远高于现有技术的另两种方法。综上所述，本发明所建立的检测造血嵌合体的方法是一种快捷简便而可靠的方法。
本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
Claims (6)
1.一种利用荧光染料SYBR green来进行造血嵌合体的实时定量PCR检测的标本收集方法，包括以下步骤：
通过临床采集供体和受体移植之前和移植后一个月的血样；
用常规方法从中直接提取基因组DNA；以及
用分光光度仪测量DNA浓度，而后存于4℃备用。
2.一种利用荧光染料SYBR green来进行造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其包括：
S1.根据权利要求1所述的方法收集标本；
S2.选择多态性遗传标记设计引物和探针；
S3.实时定量PCR检测造血嵌合体；
S4.人工合成不同稀释浓度的造血嵌合体；以及
S5.统计学分析。
3.如权利要求2所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，所述步骤S2中，选择多态性遗传标记设计引物和探针的选择标准为：包括含有至少两个以上连续的碱基不同的等位基因多态性。
4.如权利要求2所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，所述步骤S4中，是利用供体DNA来稀释受体DNA或受体DNA来稀释供体DNA进行人工合成12个不同稀释浓度的造血嵌合体。
5.如权利要求4所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，所述人工合成12个不同稀释浓度的造血嵌合体的浓度从0.01％至100％。
6.如权利要求4所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，还包括同时运行熔解曲线验证PCR产物的特异性。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Jin Xingliang Inventor after: Bai Lijun Inventor after: Chang Jing Inventor before: Yu Qiang |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: YU QIANG TO: JIN XINGLIANG BAI LIJUN CHANG JING |
|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120404 |