CN102399866A - 用于扩增的通用缓冲液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在单独的反应容器中扩增第一种和第二种靶核酸的方法，其中所述反应容器包含溶液，该溶液包含扩增剂和对所述第一种或所述第二种靶核酸特异性的寡核苷酸，其中所述溶液与用于扩增所述第一种靶核酸和所述第二种靶核酸的溶液相同。
Description
背景技术
本发明涉及核酸扩增方法。这样的方法通常用于研究以及体外诊断测试。
在核酸研究和分子诊断领域，从许多来源扩增核酸已经具有相当的重要性。核酸扩增和检测的诊断应用的实例是诸如人乳头瘤病毒(HPV)、西尼罗病毒(WNV)等病毒的检测或献血中人免疫缺陷病毒
(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)和/或丙型肝炎病毒(HCV)的存在的常规筛选。此外，所述扩增技术适用于细菌靶标（诸如分枝杆菌或沙眼衣原体和淋病奈瑟球菌），或肿瘤学标志物的分析。
最突出的且广泛使用的扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。其它扩增反应包括：连接酶链式反应、聚合酶连接酶链式反应、Gap-LCR、修复链式反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和Qβ-扩增，以及其它。
现有的可商业得到的实验（尤其是用于诊断）包括为每个实验优化以得到良好测试效率的试剂。
本发明提供了用于测试不同类型的参数的改良的方法、系统、工艺、试剂盒和试剂。
发明内容
本发明涉及用于扩增可能存在于至少一个流体样品中的至少第一种和第二种靶核酸的方法。所述方法包括，分别在至少2个反应容器中在一定条件下温育所述核酸和溶液一段时间，所述溶液包含扩增剂和对所述第一种或第二种靶核酸特异性的寡核苷酸，其中所述扩增剂包含具有逆转录酶活性的聚合酶，所述时间和条件适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录。在第一次温育以后，分别在至少2个反应容器中在一定条件下温育所述靶核酸和溶液一段时间，所述溶液包含扩增剂和对所述第一种或第二种靶核酸特异性的寡核苷酸，所述时间和条件足以发生扩增反应，所述扩增反应指示所述第一种和第二种靶核酸存在与否。
在所述方法中，在第一个和在第二个反应容器中的溶液包含相同比例的扩增剂。第一种靶核酸的寡核苷酸存在于至少2个反应容器的第一个中，且在至少2个反应容器的第二个中不存在，第二种靶核酸的寡核苷酸存在于至少2个反应容器的第二个中，且在至少2个反应容器的第一个中不存在。
本发明也涉及用于分离和扩增至少2种不同核酸的系统，所述核酸可以存在于至少一个样品中。所述系统包括：
- 分离站（separation station），其构造和安排成将所述核酸与其它物质分离，
- 试剂盒，其包含至少一个容器，所述至少一个容器包含含有扩增剂的溶液，
- 第一种溶液，其包含用于扩增第一种靶核酸的寡核苷酸，
- 第二种溶液，其包含用于扩增第二种靶核酸的寡核苷酸，
- 扩增站，其包含反应容器，
组合包含扩增剂的溶液和包含寡核苷酸的第一种或第二种溶液，使得所述反应容器包含扩增剂、分离的靶核酸和寡核苷酸，其中在包含用于扩增第一种靶核酸的寡核苷酸的反应容器中和在包含用于扩增第二种靶核酸的寡核苷酸的反应容器中，扩增剂的比例是相同的。
本发明另外涉及用于在分离的反应容器中分别逆转录和扩增至少第一种和第二种靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个容器，其中所述容器包含溶液，所述溶液含有具有逆转录酶活性的聚合酶，且缺少寡核苷酸。
此外，本发明涉及用于分别扩增至少2种不同靶核酸的方法，所述靶核酸可能存在于至少一个流体样品中。所述方法包括，提供至少一个容器，所述容器包含溶液，所述溶液用于扩增靶核酸，且缺少寡核苷酸。将一定体积的所述溶液转移至至少2个容器，并将特异性地用于扩增第一种靶核酸的寡核苷酸加入到第一个所述容器中，并将特异性地用于扩增第二种靶核酸的寡核苷酸加入到第二个所述容器中。也可以在加入溶液之前，将寡核苷酸转移至容器中。然后混合容器的内容物。然后，将第一个和第二个容器装载进用于自动化扩增所述第一种和第二种靶核酸的自动化分析仪中。在该分析仪中，将第一种靶核酸与第一个反应容器中的第一个容器的一定体积的混合的内容物相组合，并将第二种靶核酸与第二个反应容器中的第二个容器的一定体积的混合的内容物相组合。该步骤以后，在一定条件下温育反应容器的内容物一段时间，所述条件和时间足以发生扩增反应，所述扩增反应指示所述第一种和第二种靶核酸存在与否。
附图说明
图1: 在本发明的实施方案中使用的样品制备工作流程的示意描述。
图2: 如实施例1所述在LightCycler480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE)上进行的源自HIV、HBV和CT的靶核酸的扩增的生长曲线。在y-轴上指示的“信号”是标准化的荧光信号。x-轴显示了各个PCR周期的数目。
沿着对应的内部对照核酸的生长曲线，显示了HIV和HBV的生长曲线。用直线表示各个靶核酸曲线，用虚线表示对照核酸曲线。
图2a: 定性HIV试验，在用于检测靶探针的通道中测得。
图2b: 定性HIV试验，在用于检测对照探针的通道中测得。
图2c: 定量HIV试验，在用于检测靶探针的通道中测得。
图2d: 定量HIV试验，在用于检测对照探针的通道中测得。
图2e: 定量HBV试验，在用于检测靶探针的通道中测得。
图2f: 定量HBV试验，在用于检测对照探针的通道中测得。
图2g: CT试验，在用于检测靶探针的通道中测得。
图3: 分析系统
图4: 具有控制单元的分析系统
图5: 包含试剂盒的系统，所述试剂盒具有含有溶液的容器
图6：根据本发明的系统和方法的一个实施方案
具体实施方式。
本发明涉及用于扩增可能存在于至少一个流体样品中的至少第一种和第二种靶核酸的方法。所述方法包括，分别在至少2个反应容器中在一定条件下温育所述核酸和溶液一段时间，所述溶液包含扩增剂和对所述第一种或第二种靶核酸特异性的寡核苷酸，其中所述扩增剂包含具有逆转录酶活性的聚合酶，所述时间和条件适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录。在第一次温育以后，分别在至少2个反应容器中在一定条件下温育所述靶核酸和溶液一段时间，所述溶液包含扩增剂和对所述第一种或第二种靶核酸特异性的寡核苷酸，所述时间和条件足以发生扩增反应，所述扩增反应指示所述第一种和第二种靶核酸存在与否。
在所述方法中，在第一个和在第二个反应容器中的溶液包含相同比例的扩增剂。第一种靶核酸的寡核苷酸存在于至少2个反应容器的第一个中，且在至少2个反应容器的第二个中不存在，第二种靶核酸的寡核苷酸存在于至少2个反应容器的第二个中，且在至少2个反应容器的第一个中不存在。
本发明的一个优点是，单个溶液可以用于以足够的效率扩增不同的核酸。这简化了试验开发，因为只需要优化核酸(即寡核苷酸和/或对照核酸)。优化应当理解为包括顺序优化、核酸修饰的优化和/或试验中浓度的优化。
核酸扩增的一种方法是聚合酶链式反应(PCR)，其公开在美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188以及其它参考文献中。PCR通常采用2种或更多种结合选择的核酸模板(例如 DNA或RNA)的寡核苷酸引物。可用于核酸分析的引物包括这样的寡核苷酸，其能够作为靶核酸的核酸序列内的核酸合成的起点。通过常规方法，可以从限制酶切消化纯化引物，或可以合成地生产它。为了扩增的最大效率，引物通常是单链的，但是引物可以是双链的。首先使双链引物变性（即，处理），以分离链。变性双链核酸的一种方法是通过加热。“热稳定的聚合酶”是耐热的聚合酶，即，它是这样的酶，该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，且当处于高温实现双链模板核酸的变性所必需的时间时，不会不可逆地变性。通常，合成是在每个引物的3’末端处开始，并在5’至3’方向沿着模板链前进。热稳定的聚合酶已经分离自例如黄栖热菌（Thermus flavus）、红栖热菌（T. ruber）、嗜热栖热菌（T. thermophilus）、水生栖热菌（T. aquaticus）、乳栖热菌（T.
lacteus）、红色栖热菌（T. rubens）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus
stearothermophilus）、炽热甲烷嗜热菌（Methanothermus
fervidus）。尽管如此，不耐热的聚合酶也可以用于PCR试验中，只要该酶被再补足（replenished）。
如果模板核酸是双链的，在它可以用作PCR的模板之前，必须分离2个链。通过任意合适的变性方法，包括物理的、化学的或酶的方法，可以实现链分离。一种分离核酸链的方法包括：热处理核酸，直到它大部分变性(例如，大于50%、60%、70%、80%、90%或95%变性)。变性模板核酸必需的加热条件取决于，例如，缓冲盐浓度和要变性的核酸的长度和核苷酸组成，但是通常是在约90℃至约105℃的范围内一定时间，所述时间取决于诸如温度和核酸长度等反应特征。变性通常进行约5秒至9 min。为了不使各个聚合酶（如例如Z05 DNA聚合酶）暴露于这样的高温太长时间并从而冒损失功能酶的风险，通常使用短的变性步骤。
在本发明的一个实施方案中，变性步骤是最多30秒、最多20秒、最多10秒、最多5秒、或约5秒。
如果通过热来变性双链模板核酸，将反应混合物冷却至这样的温度，该温度促进每种引物与它在靶核酸上的靶序列对合。
用于退火的温度是约35℃至约70℃、或约45℃至约65℃；或约50℃至约60℃、或约55℃至约58℃。退火时间可以是约10秒至约1 min (例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。在该背景下，可以有利地使用不同的退火温度，以便增加各个试验的包容性（inclusivity）。简而言之，这意味着，在相对低的退火温度，引物也可以结合具有单个错配的靶物，所以也可以扩增某些序列的变体。这可能是合乎需要的，例如如果特定生物体具有也应当被检测出的已知的或未知的遗传变体。另一方面，相对高的退火温度具有提供更高特异性的优点，因为向着更高的温度，引物结合不精确匹配的靶序列的可能性连续降低。为了从两种现象获益，在本发明的有些实施方案中，上述的方法有利地包括在不同的温度退火，或首先在低温，然后在高温。例如，如果第一次温育在55℃进行约5个循环，可以(预-)扩增非精确匹配靶序列。这之后可以在58℃进行例如约45个循环，在实验的主要部分中提供更高的特异性。以此方式，不会错过潜在重要的遗传变体，同时特异性保持相对较高。
然后将反应混合物调整至能提高或优化聚合酶活性的温度，即足以从退火的引物延伸产生与要分析的核酸互补的产物的温度。该温度应当足以从与核酸模板退火的每种引物合成延伸产物，但不应高到使延伸产物与其互补模板变性(如，延伸温度通常为约40℃至80℃(例如，约50℃至约70℃；约60℃)。延伸时间可以是约10秒至约5 min、或约15秒至2 min、或约20秒至约1 min、或约25秒至约35秒。新合成的链形成可用于后续反应步骤的双链分子。可根据需要重复链分离、退火和延伸的步骤，以产生所需量的与靶核酸对应的扩增产物。反应的限制因素是反应中存在的引物、热稳定性酶和核苷三磷酸的量。循环步骤(即变性、退火和延伸)重复至少一次。用于检测时，循环步骤的数量取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则需要更多个循环步骤来扩增足够检测的靶序列。通常，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多至40次、60次或甚至100次。
在本发明的范围内，可以进行PCR，其中退火和延伸步骤在相同的步骤中进行(单步PCR)，或如上所述，在分离的步骤中进行(两步PCR)。使用合适的酶（例如，Z05 DNA聚合酶）一起进行退火和延伸（且因而在相同的物理和化学条件下），具有节省每个循环中的额外步骤的时间的优点，且也消除了退火和延伸之间额外的温度调节的需要。因而，单步PCR会减少各个试验的总复杂性。
一般而言，更短的总扩增时间是更好的，因为减少了等待结果时间（time-to-result），并导致可能更早的诊断。
要用于本发明的背景中的其它核酸扩增方法包括连接酶链式反应(LCR; Wu D. Y.和Wallace R. B., Genomics 4 (1989) 560-69;和Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991)189-193);聚合酶连接酶链式反应(Barany F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16);
Gap-LCR (WO 90/01069); 修复链式反应(EP 0439182 A2),
3SR (Kwoh D.Y. 等人, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli J.C., 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; WO
92/08808),和NASBA (US 5,130,238)。此外，存在链置换扩增 (SDA)、转录介导的扩增
(TMA)、包括实时TMA和Qβ-扩增 (综述参见例如 Whelen A. C.和Persing
D. H., Annu. Rev. Microbiol. 50(1996) 349-373; Abramson R. D.和Myers T. W., Curr Opin Biotechnol 4 (1993) 41-47)。
合适的核酸检测方法是本领域专家所已知的，且描述在标准教科书中，如Sambrook J. 等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989和Ausubel F. 等人:
Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley和Sons, NY。在进行核酸检测步骤之前，也可以存在其它纯化步骤，例如沉淀步骤。检测方法可以包括、但不限于，特定染料如溴化乙锭的结合或嵌入，所述溴化乙锭嵌入双链DNA中，且此后改变它的荧光。通过电泳方法，也可以分离纯化的核酸，任选地在限制酶切消化以后，并在此后显影。也存在基于探针的试验，其利用对特定序列的寡核苷酸杂交，并随后检测杂合体。
在扩增反应过程中或之后，可以检测扩增的靶核酸，以便评价分析结果。具体地，对于实时检测，有利地使用核酸探针。
通过使用可商业得到的实时PCR仪器(例如，LightCycler™或TaqMan®),
可将PCR扩增和扩增产物的检测合并在单个封闭的试管（cuvette）中进行，从而显著缩短循环时间。由于检测与扩增同时进行，该实时PCR方法不需要操作扩增产物，并且消除了扩增产物之间交叉污染的风险。实时PCR极大缩短了周转(turn-around)时间，是非常吸引人的临床实验室中的常规PCR技术的替代方式。但是，也可以使用技术人员已知的其它检测方法。
“第一种靶核酸”和“第二种靶核酸”是不同的核酸。
本文使用的术语“流体样品”包括可以进行靶向核酸的诊断试验的任何流体物质，且通常源自生物源。在有些实施方案中，所述流体样品源自人，且是体液。在本发明的一个实施方案中，所述流体样品是人血、尿、痰、汗、拭子、可吸量的粪便或脊髓液。
本文使用的术语“反应容器” 涉及、但不限于试管或平板的孔，诸如微孔（microwell）、深孔（deepwell）或其它类型的多孔板，在其中进行分析流体样品的反应，例如逆转录或聚合酶链式反应。这样的容器的外边界或壁是化学惰性的，使得它们不干扰在其中发生的分析反应。上述的核酸分离也在多孔板中进行。
在该背景下，在分析系统中的多孔板允许平行分离和分析或储存多个样品。可以为最大液体摄取或为最大热转移，优化多孔板。优化用于本发明背景中的多孔板的一个实施方案，以在自动化分析仪中温育或分离分析物。另一个多孔板被构造和安排成接触磁装置和/或加热装置。在下文中进一步描述了多孔板的实施方案。
“核酸”以及“靶核酸”是本领域技术专家已知的核苷酸的聚合化合物。“靶核酸”在本文中用于表示样品中有待分析的核酸，即要测定其在样品中的存在、不存在和/或量。
根据本发明，“寡聚的化合物”是由“单体单元”组成的化合物，所述单体单元可以是单独的核苷酸或非天然化合物(参见下面)，更具体地是单独的修饰的核苷酸(或核苷酸类似物)或非核苷酸化合物或其组合。
“寡核苷酸”和“修饰的寡核苷酸” (或“寡核苷酸类似物”)是寡聚化合物的亚群。在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”表示从多个核苷酸（作为它们的单体单元）形成的组分。通常提及磷酸基形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的正常连接或主链是3'至5'磷酸二酯连接。原则上可以如本领域所述和本领域专家已知的，合成可用于本发明中的寡核苷酸和修饰的寡核苷酸(参见下面)。制备特定序列的寡聚化合物的方法是本领域已知的，包括，例如，适当序列和直接化学合成的克隆和限制性酶切。化学合成方法可以包括，例如，Narang
S. A. 等人, Methods in Enzymology 68 (1979) 90-98中所述的磷酸三酯方法，Brown E. L., 等人,
Methods in Enzymology 68 (1979) 109-151公开的磷酸二酯方法，在Beaucage
等人, Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859中公开的亚磷酰胺方法，在Garegg 等人,
Chem. Scr. 25 (1985) 280-282中公开的H-膦酸酯方法，和在US 4,458,066中公开的固体支持物方法。
在根据本发明的方法中，可以化学地修饰寡核苷酸，即引物和/或探针包括修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。所述探针或引物则是修饰的寡核苷酸。
本文使用的术语“扩增剂”涉及能够扩增核酸的化学或生化组分。这样的试剂包括、但不限于，核酸聚合酶、缓冲剂、单核苷酸诸如核苷三磷酸、寡核苷酸诸如寡核苷酸引物、盐和它们各自的溶液、检测探针、染料和更多。
在一个实施方案中，在第一个和在第二个反应容器中的溶液包含相同浓度的扩增剂。在一个实施方案中，在本文所述的方法中，与其它靶核酸同时扩增任一种靶核酸。这是有利的，因为可以平行地分析多个靶物，增加弹性和处理量。在一个实施方案中，通过前文所述的方法，有效地扩增任一种靶核酸。这使得增加诊断测试的处理量和弹性成为可能。
在本发明的意义上，“同时地”是指，2个动作（诸如扩增第一种和第二种或更多种核酸）同时地且在相同的物理条件下进行。在一个实施方案中，在一个容器中同时扩增至少第一种和第二种靶核酸。在另一个实施方案中，同时且在相同的物理条件（尤其关于温度和温育时间）下，同时扩增用在一个容器中的至少一种核酸和在第二个容器中的至少第二种核酸进行。
因而，在一个实施方案中，上述方法提供了1-100 cp/ml或0.5-50 IU/ml的LOD，或1-75 cp/ml或0.5-30
IU/ml的LOD，或1-25
cp/ml或1-20 IU/ml的LOD。这样的LOD是具有足以用于诊断目的的灵敏测试所必需的。
“检测限”或“LOD”是指样品中核酸的最低可检测量或浓度。低“LOD”对应着高灵敏度，反之亦然。“LOD”通常通过单位“cp/ml”来表示，具体地如果核酸是病毒核酸，或表示为IU/ml。“Cp/ml”是指“每毫升的拷贝数”，其中“拷贝”是各个核酸的拷贝。IU/ml 代表“国际单位/ml”，是指WHO标准。
广泛使用的计算LOD的方法是“概率单位分析”，它是一种分析刺激(剂量)和量子(全或无)应答之间的关系的方法。在典型的量子应答实验中，给动物组施用不同剂量的药物。记录在每个剂量水平的垂死百分比。然后可以使用概率单位分析，分析这些数据。概率单位模型假定，应答百分比与对数剂量有关，成累积正态分布。也就是说，对数剂量可以用作解读来自累积正态的垂死百分比的变量。使用正态分布（而不是其它概率分布），会影响在可能剂量的高和低末端的预测应答率，但是在中间附近几乎没有影响。
可以在不同的“命中率”，应用概率单位分析。如本领域已知的，通常用百分比[%]表示“命中率”，并指示在分析物的特定浓度时的阳性结果的百分比。因而，例如，可以在95%命中率测定LOD，这意味着，为其中95%的有效结果是阳性的场合，计算LOD。
关于来自某些病毒的可能靶核酸的一些实施例，在一个实施方案中，根据本发明的方法会提供下述的LOD:
• HIV：最多60
cp/ml、或最多50 cp/ml、或最多40
cp/ml、或最多30 cp/ml、或最多20
cp/ml、或最多15 cp/ml
• HBV：最多10
IU/ml、或最多7.5 IU/ml、或最多5
IU/ml
• HCV：最多10
IU/ml、或最多7.5 IU/ml、或最多5
IU/ml
• WNV I：最多20
cp/ml、或最多15 cp/ml、或最多10
cp/ml
• WNV II：最多20
cp/ml、或最多15 cp/ml、或最多10
cp/ml、或最多5 cp/ml
• JEV：最多100
cp/ml、或最多75 cp/ml、或最多50
cp/ml、或最多30 cp/ml
• SLEV：最多100
cp/ml、或最多75 cp/ml、或最多50
cp/ml、或最多25 cp/ml、或最多10
cp/ml。
前文所述的具有LOD的试验具有下述优点，即它们可以用于体外诊断实验。更高的LOD不够灵敏。因而，本发明的一个特殊优点是，可以提供适合体外诊断的简化的靶核酸扩增方法，该方法包括通用溶液，所述溶液可以用于扩增具有上文所述LOD的本文所述的不同靶核酸。
在一个实施方案中，所述靶核酸是RNA。RNA包括、但不限于，病毒RNA。本文公开了非限制性实例。
在另一个实施方案中，所述靶核酸是DNA。DNA包括病毒或细菌DNA。本文描述了非限制性实例。
在一个实施方案中，所述第一种和所述第二种靶核酸被富集。
本文使用的术语“富集”涉及处理包含靶核酸的样品的任意方法，该方法允许将所述靶核酸与样品中存在的至少一部分其它物质分离。“富集”因而可以理解为生产比其它物质更高量的靶核酸。
存在几种纯化核酸的方法:
- 序列-依赖性的或生物特异性的方法，例如:
• 亲和色谱法
• 与固定化的探针的杂交
- 序列-依赖性的或物理化学方法，例如:
• 使用例如苯酚-氯仿的液-液萃取法
• 使用例如纯乙醇的沉淀法
• 使用滤纸的萃取法
• 使用微团形成剂（如鲸蜡基-三甲基-溴化铵）的萃取法
• 结合固定化的嵌入染料，例如吖啶衍生物
• 吸附到硅胶或硅藻土上
• 在高离液序列条件下，吸附到磁性玻璃颗粒(MGP)或有机-硅烷颗粒上
富集靶核酸的一种方法是使用可从Qiagen (例如定单号158389) 商业得到的Puregene-试剂盒进行富集。
“具有逆转录酶活性的聚合酶”是能够基于RNA模板合成DNA的核酸聚合酶。在RNA已经逆转录成单链cDNA以后，它也能形成双链DNA。在本发明的一个实施方案中，具有逆转录酶活性的聚合酶是热稳定的。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括，在至少所有4种天然的或修饰的脱氧核糖核苷三磷酸存在下，在适当缓冲液（包括缓冲pH和金属离子浓度的金属离子缓冲液）中，使含有RNA模板的样品和与所述RNA模板充分互补的寡核苷酸引物一起温育，以与后者和（在一个实施方案中）热稳定的DNA聚合酶杂交。在足以使所述引物与所述RNA模板和所述DNA聚合酶杂交的温度，进行该温育，以催化所述脱氧核糖核苷三磷酸的聚合，形成与所述RNA模板的序列互补的cDNA序列。
本文使用的术语“cDNA”表示使用核糖核酸链(RNA)作为模板合成的互补DNA分子。所述RNA可以是例如mRNA、tRNA、rRNA或其它形式的RNA，诸如病毒RNA。所述cDNA可以是单链、双链，或可以与互补的RNA分子氢键合，如在RNA/cDNA杂合体中。
适合与RNA模板退火的引物也可以适用于PCR扩增。对于PCR，与逆转录的cDNA链互补的第二种引物会提供合成延伸产物的起始位点。
在DNA聚合酶对RNA分子的扩增中，第一个延伸反应是使用RNA模板的逆转录，并生成DNA链。使用DNA模板的第二个延伸反应生成双链DNA分子。因而，DNA聚合酶从RNA模板合成互补的DNA链会提供扩增原料。
热稳定的DNA聚合酶可以用于偶联的单酶逆转录/扩增反应。在该背景下，术语“均质的”表示用于逆转录和扩增RNA靶物的两步单添加反应。均质的是指，在逆转录(RT)步骤以后，不需要在扩增步骤之前打开反应容器或以其它方式调节反应组分。在非均质的RT/PCR 反应中，在逆转录之后和在扩增一种或更多种反应组分之前，例如调节、添加或稀释扩增剂等，为此必须打开反应容器，或至少必须操纵它的内容物。尽管均质的和非均质的实施方案都包含在本发明的范围内，RT/PCR的均质形式是有利的。
逆转录是RT/PCR中的一个重要步骤。例如，本领域已知，RNA模板会表现出形成第二种结构的倾向，所述第二种结构可能阻碍引物结合和/或各个逆转录酶对cDNA 链的延伸。因而，在转录效率方面，相对高的RT反应温度是有利的。另一方面，升高温育温度也暗示更高的特异性，即RT引物不会退火至表现出与预期的一个或多个序列的错配的序列。具体地，在多个不同靶RNA的情况下，可能也希望转录和随后扩增和检测具有单个错配的序列，例如在流体样品中可能存在生物体的未知的或罕见的亚系或亚种的情况下。
为了从上述优点（即第二种结构的减少和具有错配的模板的逆转录）获益，本发明的一个方面是，在超过一种不同的温度进行RT温育。
因此，本发明的一个方面是，上述的方法，其中在步骤d)中，具有逆转录酶活性的聚合酶的温育是在30℃-75℃或45℃-70℃或55℃-65℃的不同温度进行。
作为逆转录的另一个重要方面，长的RT步骤可以破坏在流体样品中可能存在的DNA模板。如果流体样品含有RNA和DNA物质，因而有利地保持RT步骤的持续时间尽可能短，但是同时确保合成足够量的cDNA用于以后的扩增和任选的扩增物检测。
因而，本发明的一个方面是，上述的方法，其中在步骤d)中，所述时间段是最多30分钟、20分钟、15分钟、12.5分钟、10分钟、5分钟或1分钟。
本发明的另一个方面是，上述的方法，其中所述具有逆转录酶活性且包含突变的聚合酶选自：
a. CS5 DNA聚合酶
b. CS6 DNA聚合酶
c. 海栖热袍菌（Thermotoga maritima）DNA聚合酶
d. 水生栖热菌DNA聚合酶
e. 嗜热栖热菌DNA聚合酶
f. 黄栖热菌DNA聚合酶
g. 丝状栖热菌（Thermus filiformis）DNA聚合酶
h. 栖热菌属物种sps17 DNA聚合酶
i. 栖热菌属物种Z05 DNA聚合酶
j. 那不勒斯栖热袍菌（Thermotoga neapolitana）DNA聚合酶
k. 非洲栖热腔菌（Termosipho africanus）DNA聚合酶
l. Thermus caldophilus DNA聚合酶
特别适合这些要求的是携带在聚合酶结构域中的突变的酶，其在更快的延伸速率的方面增强它们的逆转录效率。
因此，本发明的一个方面是，上述的方法，其中所述具有逆转录酶活性的聚合酶是这样的聚合酶，其包含与各个野生型聚合酶相比赋予提高的核酸延伸速率和/或提高的逆转录酶活性的突变。
在一个实施方案中，在上述的方法中，具有逆转录酶活性的聚合酶是这样的聚合酶，其包含与各个野生型聚合酶相比赋予提高的逆转录酶活性的突变。
在WO 2008/046612中，公开了携带点突变的聚合酶，所述点突变使它们在本发明的上下文中是特别有用的。要在本发明的上下文中使用的有利的聚合酶是突变的DNA聚合酶，其在聚合酶结构域中至少包含下述基序：
T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N；其中Xb7是选自S或T的氨基酸，且其中Xb8是选自G、T、R、K或L的氨基酸，其中所述聚合酶包含3’-5’外切核酸酶活性，且与野生型DNA聚合酶相比具有提高的核酸延伸速率和/或提高的逆转录效率，其中在所述野生型 DNA聚合酶中，Xb8是选自D、E或N的氨基酸。
一个实施例是来自栖热菌属物种 Z05的热稳定的DNA聚合酶的突变体(例如描述在US 5,455,170中)，所述突变体与各个野生型酶Z05相比，在聚合酶结构域中包含突变。根据本发明的方法的一种突变体是突变型Z05 DNA聚合酶，其中在位置580处的氨基酸选自：G、T、R、K和L。
由于将RNA靶核酸逆转录成cDNA，同时保留DNA靶核酸，使得cDNA和DNA都可以用于以后的扩增，是在本发明的范围内，根据本发明的方法对于同时扩增源自具有RNA的生物体或具有DNA基因组的生物体的靶核酸是特别有用的。该优点显著增加在相同的物理条件下可以分析的不同生物体（尤其是病原体）的范围。
因此，本发明的一个方面是，上述的方法，其中所述至少2种靶核酸包括RNA和DNA。
特别地，由于适宜的最适温度，如Tth聚合酶等酶或上述的突变型Z05 DNA聚合酶适合进行扩增靶核酸的后续步骤。采用相同的酶进行逆转录和扩增，会促进实现该方法的容易度，并促进它的自动化，因为在RT和扩增步骤之间不需要操作流体样品。
因此，在一个实施方案中，在上述方法中，相同的具有逆转录酶活性的聚合酶被用于步骤d)和步骤e)中。在一个实施方案中，所述酶是上述的突变型Z05
DNA聚合酶。
为了不使在本发明的上下文中中使用的反应混合物的聚合酶或其它组分暴露于高温比必需更长的时间，在一个实施方案中，在90℃以上的步骤的长度是最多20秒、或最多15秒、或最多10秒、或最多5秒和/或5秒。这也会减少等待结果时间，并减少试验所需的总时间。
在这样的均质方案（setup）中，在开始RT和扩增之前，可以非常有利地密封反应容器，从而减少污染的风险。例如，可以如下实现密封：通过施加透明的箔材、帽，或将油加入反应容器中，并形成亲脂相，作为在流体顶部的密封层。
因而，本发明的一个方面是，上述的方法，其在步骤c)和步骤d)之间另外包含密封至少2个反应容器的步骤。
扩增步骤的靶物可以是RNA/DNA杂种分子。所述靶物可以是单链或双链核酸。尽管最广泛使用的PCR方法使用双链靶物，这不是必要的。在单链DNA靶物的第一个扩增周期以后，反应混合物含有由单链靶物和新合成的互补链组成的双链DNA分子。类似地，在RNA/cDNA靶物的第一个扩增周期以后，反应混合物含有双链cDNA分子。在该点，如上所述进行连续的扩增循环。
由于核酸扩增（特别是但不仅在PCR的情况下）如果作为循环反应来进行是非常有效的，本发明的一个方面是，上述的方法，其中在步骤e)中的扩增反应由多个循环步骤组成。
在裂解步骤之后的样品制备步骤中，进一步富集目标组分。如果非蛋白性的目标组分是例如核酸，通常在它们用于基于探针的试验之前，从复杂的裂解混合物中提取它们。
在一个实施方案中，在前文所述的方法中，在步骤e)和d)之前存在下述步骤。提供多个容器，所述容器含有不同类型的流体样品。在一定条件下，将固体支持物与容器中多种不同类型的流体样品组合到一起一段时间，所述条件和时间足以允许包含靶核酸的核酸固定化在固体支持物上。然后在分离站中，将固体支持物与流体样品中存在的其它物质分离开，并如下在分离站中纯化核酸：通过使流体样品与固体支持物分离，并用洗涤缓冲液洗涤固体支持物一次或更多次。对于多种不同类型的流体样品中的任一种，组合固体支持物和多种不同类型的流体样品的物理条件和时间段是相同的。
在本发明的意义上，核酸的“纯化”、“分离”或“提取”涉及下述的：在可以在诊断试验（例如通过扩增）中分析核酸之前，它们通常必须从含有不同组分的复杂混合物的生物样品中纯化、分离或提取出来。对于第一个步骤，可以使用允许核酸富集的方法。本文描述了这样的富集方法。
“洗涤缓冲液”是用于去除不希望的组分的液体，特别是在纯化操作中。这样的缓冲液是本领域众所周知的。在核酸纯化的上下文中，洗涤缓冲液适合洗涤固体支持物，以便分离固定化的核酸和任意不希望的组分。洗涤缓冲液可以例如含有在缓冲的溶液中的乙醇和/或离液剂（chaotropic agent），或是没有上述乙醇和/或离液剂的具有酸性pH的溶液。洗涤溶液或其它溶液经常提供为储备溶液，它们在使用之前必须稀释。
在根据本发明的方法中的洗涤要求固体支持物和固定化在其上面的核酸或高或低强度地接触洗涤缓冲液。不同的方法可能实现该目的，例如沿着各个容器或多个容器或在其中，与固体支持物一起摇动洗涤缓冲液。另一种有利的方法是，抽吸和分配悬浮液一次或更多次，所述悬浮液包含洗涤缓冲液和固体支持物。在一个实施方案中，使用吸量管进行该方法，其中所述吸量管包括一次用弃的吸量管尖，其中吸入所述悬浮液，并从它再次分配。这样的吸量管尖在被抛弃和更换之前可以使用几次。可用于本发明中的一次用弃的吸量管尖具有至少10 µl、或至少15 µl、或至少100 µl、或至少500 µl、或至少1 ml、或约1 ml的容积。在本发明的上下文中使用的吸量管也可以是吸量针。
因而，本发明的一个方面是，上述的方法，其中在步骤c中的所述洗涤包括，抽吸和分配包含固体支持物的洗涤缓冲液。
具体地，但是不仅对于具有高样品处理量的临床实验室，为从多个不同类型的流体样品中快速地、容易地且可靠地同时分离多种靶核酸而提供这样的改良的方法，是非常有利的。
包含上述自动化步骤的方法表现出各种优点。
首先，根据本发明的样品制备方法与例如RNA的逆转录和靶核酸的扩增的自动化方式的组合，会显著减少手工干预的需要，并从而减少潜在的污染风险。
此外，提供了单个过程的可能性，其中多种不同的样品（即不同的核酸来源）显著促进核酸诊断的总复杂性的降低。例如，如果必须将不同的方法施用于每类流体样品，如现有技术中的情况，样品制备是远远更复杂的、耗时的和资源密集的。最主要的是，必须采用不同的试剂，这导致增加的成本，并阻碍快速且不复杂的自动化溶液的开发。
根据本发明的样品制备表现出适当的弹性和工作流程，以处理多种不同的样品类型，它们含有不同类型的核酸，例如 DNA和RNA。
• 根据本发明的方法需要明显更少的实际操作（hands-on）时间，且进行的测试比在现有技术中使用的样品制备方法更简单。根据本发明的方法会在例如临床病毒学中提供主要优点，因为它允许平行的样品制备和在平行的实验中下游扩增几种病毒。
因此，本发明的一个方面是上述的方法，其中步骤a另外包括：通过裂解在多个不同的流体样品中潜在存在的细胞和/或病毒衣壳，从它们的细胞和/或病毒环境中释放出核酸。
为了释放细胞或病毒颗粒的内容物，可以用酶或化学试剂处理它们，以溶解、降解或变性细胞壁或病毒颗粒。该过程通常称作裂解。得到的含有这样的裂解的物质的溶液称作裂解物。
经常，要分析的核酸不是游离于目标流体样品内的溶液中，而是位于密闭的结构（例如细胞或病毒）中。在诊断试验中，目的经常是具体地鉴别流体样品（诸如临床样品）中的病原性细胞或病毒。这样的病原体可以包括，例如：RNA病毒如人免疫缺陷病毒 (HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、西尼罗病毒 (WNV)、人乳头瘤病毒 (HPV)、日本脑炎病毒 (JEV)、圣路易脑炎病毒 (SLEV)和其它RNA病毒，或DNA病毒如乙型肝炎病毒 (HBC), 巨细胞病毒 (CMV)和其它DNA病毒，或细菌如沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟球菌 (NG)和其它细菌。根据本发明的方法可用于从上述以及其它生物体提取核酸。
适合裂解细胞和/或病毒衣壳或类似结构的试剂通常提供在裂解缓冲液内。因此，在本发明的一个实施方案中，上述方法另外包括，在步骤a中，将裂解缓冲液加入多个不同的流体样品中。
由于根据本发明的方法在高处理量、效率和并行化方面是特别有利的，本发明的一个方面是，上述的方法，其中对于所述多个不同类型的流体样品的成员，所述裂解缓冲液是相同的。
以此方式，进一步降低了样品制备操作的复杂性，因为不需要为要处理的不同样品单独提供不同的裂解试剂。此外，当用单一裂解缓冲液进行时，可以更容易地控制该过程。例如，可以用多吸量管从单个容器抽吸裂解缓冲液，并随后同时地分配进不同的样品中。
在本发明的一个实施方案中，在上述方法中的裂解缓冲液包含一种或更多种选自下述的组分：
• 离液剂
• 缓冲物质
• 醇
• 还原剂。
离液剂（其通常扰乱溶液中水分子的有序结构以及分子内和分子之间的非共价结合力）可以对样品制备过程做出几个贡献。具体地，但不限于，它们可以作为RNA酶抑制剂来施用，通过扰乱核酸酶的三级结构。通常，不需要将其它的RNA酶抑制剂施用于裂解缓冲液。此外，离液剂会促进生物膜（诸如质膜或细胞器的膜，如果存在的话）的破坏。另外，它们可以在核酸与玻璃等表面的粘附结合中起重要作用(参见下文)。在本发明的上下文中，离液剂是胍盐（如硫氰酸胍或盐酸胍或胍氯化物或异硫氰酸胍）、脲、高氯酸盐（诸如高氯酸钾）、其它硫氰酸盐或碘化钾。但是，其它离液剂也可以用于本发明的范围内。
对于维持溶液的特定pH 值或pH范围，缓冲物质通常是重要的。这是大多数生物系统的必要条件，且也是大多数体外反应所需要的。对于本发明的方法，也可以是有利的。在裂解缓冲液的上下文中，缓冲液是柠檬酸盐缓冲液诸如柠檬酸钠，以及Tris
(三-(羟甲基)-氨基甲烷)缓冲液诸如Tris HCl、磷酸盐、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-(2-乙磺酸) (HEPES), 乙酸盐缓冲液，而且其它缓冲液可以用于本发明的上下文中。
在裂解缓冲液中的醇用于核酸制备的应用也可以是有利的，如本领域技术人员已知的。使用的一种醇是聚多卡醇（polidocanol），而其它醇也可以用于上述的裂解缓冲液中。在例如EP 1 932 913中，已经描述了聚多卡醇用于制备核酸的应用。
还原剂也可以促进不希望的组分（诸如上述的RNA酶A）的变性。具体地，如本领域广泛已知的，还原剂会切割分子间和分子内二硫键，所述二硫键对于许多蛋白的三级结构是特别重要的。在本发明的上下文中，实施方案是还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)，但是本领域已知的其它还原剂（诸如2-巯基乙醇）也可以有利地用于本发明的上下文中。
考虑到前述内容，本发明的一个方面是，上述的方法，其中所述裂解缓冲液包含下述组分:
• 硫氰酸胍,
• 柠檬酸钠,
• 聚多卡醇,
• DTT。
在本发明的一个实施方案中，裂解缓冲液的上述组分的浓度如下：
• 硫氰酸胍: 4 M
• 柠檬酸钠: 50 mM
• 聚多卡醇: 5%w/v
• DTT: 2%w/v。
上述裂解缓冲液的pH不限于特定pH值。但是，在一个实施方案中，所述裂解缓冲液具有酸性pH，或5.5至6.5、或约5.8的pH。
用于上述这样的裂解或样品制备方法中的酶是切割蛋白底物中的酰胺键并归类为蛋白酶或(互换地)肽酶的酶(参见Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman
and Company, San Francisco, 第3章)。在现有技术中使用的蛋白酶包括碱性蛋白酶(WO
98/04730)或酸性蛋白酶(US 5,386,024)。在现有技术中已经在核酸分离中广泛用于样品制备的蛋白酶是来自Tritirachium album的蛋白水解酶K (参见例如 Sambrook J. 等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)，它在中性pH附近是有活性的，且属于本领域技术人员已知为枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶家族。在上述裂解或样品制备方法中有用的是酶
esperase，即一种在高碱性和在高温保留它的活性的强力蛋白酶。
对于纯化目的而言特别感兴趣的是核酸向玻璃表面的吸附，尽管其它表面是可能的。近年来已经提出许多从它们的天然环境分离核酸的方法，其中利用它们对玻璃表面的结合行为。如果未修饰的核酸是靶物，核酸与具有二氧化硅表面的材料的直接结合是有利的，因为除了其它原因以外，核酸不必进行修饰，且甚至可以结合天然核酸。这些方法详细描述在各种文件中。例如，在Vogelstein
B. 等人, Proc. Natl. Acad. USA 76 (1979) 615-9中，提出了在有碘化钠存在下使来自琼脂糖凝胶的核酸结合到磨碎的火石玻璃上的方法。
在Marko M. A. 等人, Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387中，描述了在有高氯酸钠存在下，从玻璃粉上细菌纯化质粒DNA。在DE-A
37 34 442中，描述了在玻璃纤维滤器上的单链M13噬菌体DNA的分离，其中使用醋酸沉淀噬菌体颗粒，并用高氯酸盐裂解噬菌体颗粒。洗涤结合到玻璃纤维滤器上的核酸，然后用含有甲醇的Tris/EDTA缓冲液洗脱。在Jakobi R. 等人,
Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201中，描述了从λ噬菌体纯化DNA的类似方法。该方法需要在高离液序列的盐溶液中使核酸选择性地结合到玻璃表面上，并使核酸与污染物（诸如琼脂糖、蛋白或细胞残余物）分离。为了使玻璃颗粒与污染物分离，可以离心颗粒，或通过玻璃纤维滤器抽出液体。这是一个限制步骤，但是，其会阻止该方法被用于处理大量样品。磁性的多孔玻璃也是可商业得到的，其含有在多孔的特殊玻璃基质中的磁性颗粒，且被覆盖含有抗生蛋白链菌素的层。该产物可以用于分离生物材料，例如，蛋白或核酸，如果它们在复杂的制备步骤中被修饰，使得它们共价地结合生物素。经证实，可磁化的（magnetizable）特殊吸附剂对于自动化样品制备是非常有效的和合适的。亚铁磁性和铁磁性以及超顺磁性色素被用于该目的。磁性玻璃颗粒和使用它们的方法是描述在WO
01/37291中的那些。
通过适应在所述方法中使用的各个流体样品的体积，可以进一步提高根据本发明的方法的弹性。该实施方案聚焦于不同类型的流体样品的多样性和在它们中可能存在的生物体和核酸的类型。例如，在全血样品中的某些病毒可能需要比其它样品更多的原料，如果已知在这些特定情况下通常仅存在低拷贝数。
因而，本发明的一个方面是，上述的方法，其中所述多个不同的流体样品中的至少一个流体样品具有不同于其它流体样品的体积。
在一个实施方案中，可替换地或附加地，将不同体积的裂解缓冲液加入所述多个不同的流体样品中。
在另一个实施方案中，当所述多个不同的流体样品中的至少一个流体样品具有不同于其它流体样品的体积时，将裂解缓冲液加入样品中，使得所有样品在加入以后具有相同的体积。
在该实施方案中，甚至更方便地，在不同样品上同时地进行自动化过程。其优点是，能够选择适当的起始体积（取决于样品类型）和具有相同的体积（用于进行分离），并任选地在该方案中组合例如扩增和检测。
术语“固体支持物”包括与核酸的固定化有关的任一种上述固体材料，例如磁性玻璃颗粒、玻璃纤维、玻璃纤维滤器、滤纸等，同时固体支持物不限于这些材料。
本发明的一个方面是，上述的方法，其中所述固体支持物包括核酸结合颗粒，或选自二氧化硅、金属、金属氧化物、塑料、聚合物和核酸的一种或更多种材料。在本发明的一个实施方案中，所述固体支持物是磁性玻璃颗粒。
在本发明的上下文中，“固定化”是指以可逆或不可逆的方式捕获对象，诸如核酸。具体地，“固定化在固体支持物上”是指，为了它们与任何周围的介质分离的目的，使单种或多种对象与固体支持物结合，且可以回收，例如通过在更后的时点与固体支持物分离。在该背景下，“固定化”可以包括例如，将核酸吸附到玻璃或上述固体材料的其它合适的表面上。此外，通过结合捕获探针，可以特异性地“固定化”核酸，其中所述核酸通过碱基配对，结合连接在固体支持物上的基本上互补的核酸。在后一种情况下，这样的特异性的固定化导致靶核酸的显著结合。
在前文所述方法的一个实施方案中，步骤d)包括：
在至少2个反应容器中，使纯化的核酸接触所述扩增剂，所述扩增剂包含具有逆转录酶活性的聚合酶，其中至少第一个反应容器至少包含所述第一种靶核酸，且至少第二个反应容器至少包含所述第二种靶核酸；
在所述反应容器中，将所述纯化的核酸与所述扩增剂一起在一定条件下温育一段时间，所述条件和时间适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录。
在前文所述的方法的一个实施方案中，对于在第一个和第二个反应容器中包含的至少第一种和第二种靶核酸，在步骤d)和e)中的转录和扩增的条件是相同的。
在本发明的一个方面，所述第一种和所述第二种核酸存在于至少2个流体样品中。
在本发明的另一个方面，同时地扩增所述第一种和第二种靶核酸。
在本发明的一个方面，用于扩增所述第一种靶核酸的反应混合物包含优化浓度的对所述第一种靶核酸特异性的所述寡核苷酸，且用于扩增所述第二种靶核酸的反应混合物包含优化浓度的对所述第二种靶核酸特异性的所述寡核苷酸。
在本文所述方法的一个方面，在用于扩增所述第一种靶核酸的反应混合物中的对所述第一种靶核酸特异性的寡核苷酸的浓度，与在用于扩增所述第二种靶核酸的反应混合物中的对所述第二种靶核酸特异性的寡核苷酸的浓度基本上相同。
在本文所述发明的一个方面，所述扩增剂也包含内部对照(IC)和/或内部定量标准(QS)。在一个实施方案中，所述IC和/或QS被包含在含有用于扩增的酶的溶液中。在本发明的一个实施方案中，用于扩增内部对照(IC)和/或内部定量标准(QS)的寡核苷酸也包含在所述溶液中。在本发明的另一个实施方案中，还个别地优化所述内部对照(IC)和/或内部定量标准(QS)的浓度。在一个实施方案中，对于至少第一种和第二种靶核酸，或对于超过2种靶核酸，内部对照和/或内部定量标准的序列是相同的。在另一个实施方案中，IC和IQS的序列是相同的。该通用内部对照(IC)和/或内部定量标准(QS)允许开发在多个参数和/或核酸类型上的同时试验，同时对于所述不同的参数和/或核酸类型，使用相同的内部对照核酸序列。因此，它有助于在不同的水平减少对应实验的总复杂性：例如，仅需要设计一个内部对照核酸序列，并加入到各个扩增混合物中，从而节省设计和合成或购买多种对照核酸序列的时间和成本。可以使单个或多个试验流线化，并减少操作错误的风险。另外，在一个试验中或在相同条件下同时进行的平行试验中采用的不同对照核酸序列越多，它可能导致调节各个条件的复杂性越高。此外，使用适合检测多个靶核酸的单个对照，所述对照可以从单个来源分配到例如含有所述不同靶核酸的不同容器中。在本发明的范围内，单个对照核酸序列也可以用作定性和定量对照。内部对照序列选自包含Seq
ID No. 45 -48的组。
作为上述对照的另一个优点，在加入不同的内部对照核酸的情况下，在可能的后续实验中检测特定生物样品的其它核酸，不需要包括其它样品制备操作，因为在本发明中使用的对照可以用于控制不同核酸的扩增。因而，加入内部对照核酸以后，可以在相同条件下在相同样品中测试其它参数。
内部对照核酸可以是竞争性的、非竞争性的、或部分竞争性的。
竞争性的内部对照核酸携带与靶物基本上相同的引物结合位点，因而与靶物竞争相同的引物。尽管该原理允许良好地模仿各个靶核酸（由于它们的类似的结构），它可以降低单种或多种靶核酸的扩增效率，从而产生更低灵敏度的试验。
非竞争性的内部对照核酸具有与靶物不同的引物结合位点，因而结合不同的引物。这样的方案的优点包括，反应混合物中的不同核酸的单个扩增事件可以没有任何竞争效应地彼此独立地发生的事实，以及其它优点。因而，在试验的检测限方面，没有不良作用发生，而在竞争性方案中可以发生该情况。
最后，在使用部分竞争性方案的扩增中，各种对照核酸和至少一种靶核酸竞争相同的引物，同时至少一种其它的靶核酸结合不同的引物。
上述方法包括每种所述靶核酸和所述内部对照核酸的不同引物集合的事实，使得该方法具有相当大的弹性。在该非竞争性方案中，不一定象竞争性方案的情况中一样向对照核酸中引入靶物特异性的结合位点，避免了上述竞争性方案的缺点。在非竞争性方案中，内部对照核酸具有不同于任何靶序列的序列，以便不竞争它们的引物和/或探针。在一个实施方案中，内部对照核酸的序列不同于流体样品中的其它核酸序列。作为一个实例，如果流体样品源自人，则内部对照核酸不具有也在人类中内源地产生的序列。序列的差异因而至少是足够显著的，不允许引物和/或探针在严谨条件下结合各种内源核酸（单种或多种），从而使得该方案是竞争性的。为了避免这种干扰，在一个实施方案中，在本发明中使用的内部对照核酸的序列源自不同于流体样品起源的来源。在一个实施方案中，它源自天然存在的基因组。在一个实施方案中，它源自植物基因组，在另一个实施方案中，它源自葡萄基因组。在一个实施方案中，源自天然存在的基因组的核酸是杂乱的(scrambled)。如本领域已知的，“杂乱”是指在某种程度上在序列中引入碱基突变。在一个实施方案中，与它来源的天然存在的基因相比，在本发明中使用的内部对照核酸的序列存在实质改变。这具有下述优点，即极大地减少了引物和探针与流体样品中的核酸的交叉反应性。
在一个实施方案中，所述IC/IQS是DNA。如果靶核酸是RNA，则IC/IQS是RNA。如果要在上述方法中分析RNA和DNA，则内部对照核酸是RNA，因为该内部对照核酸会模仿包含多种靶物的试验的最灵敏的靶物，且RNA靶物通常必须被更紧密地控制。由于RNA比DNA更易于降解（由于诸如碱性pH、核糖核酸酶等的影响），在一个实施方案中，由RNA制成的内部对照核酸被提供为披甲的（armored
）颗粒。在例如EP910643中描述了披甲的颗粒，例如特殊的披甲的RNA。简而言之，将RNA至少部分地包裹在病毒外壳蛋白中，所述RNA可以化学地生产，或在一个实施方案中，由例如细菌（例如大肠杆菌）异源地生产。后者赋予RNA对外部影响（尤其是核糖核酸酶）的抗性。必须理解，内部对照DNA也可以提供为披甲的颗粒。披甲的RNA和DNA都可以用作在本发明的上下文中的内部对照核酸。在一个实施方案中，在大肠杆菌中给RNA对照核酸披被MS2 外壳蛋白。在另一个实施方案中，使用λ噬菌体GT11，给DNA对照核酸披甲。
包括上述自动化步骤的方法也显示出不同的其它优点：
在现有技术中，在单个反应容器中在多路试验中进行的不同靶核酸的数目受到适当标记的数目的限制，这已经成为一个挑战。在实时PCR试验中，例如，荧光染料波谱的潜在重叠对试验性能具有极大影响(假阳性结果的风险、更低精确度等)。因此，必须小心地选择各个荧光团，且在波谱上较好地分离，以便确保诊断实验的预期性能。通常，不同的可用荧光团的数目对应着单位(single-digit)数目的PCR仪器荧光通道。
相反，在上述方法中，内部控制的至少第一种和第二种靶核酸的扩增发生在至少2个不同的反应容器中，允许同时扩增更高数目的不同的靶核酸，因为不同反应容器中的信号可以彼此独立地检出。这意味着，在第一个容器（而非第二个容器）中扩增第一种靶核酸，在第二个容器（而非第一个容器）中扩增第二种靶核酸。另外，在本发明的范围内，包括这样的实施方案，其中在多个反应容器中的一个或更多个中，进行多路反应，从而增加在相同条件下可以同时扩增的靶物的数目。在这样的实施方案中，内部对照核酸用作容器内不同靶核酸以及不同容器中不同靶核酸的对照。
因而，本发明的一个方面涉及上述的方法，其中在相同的反应容器中扩增至少2种靶核酸。
在其它情况下，可以方便地在第一个反应容器中扩增第一种、而非第二种靶核酸，例如取决于样品和/或目标靶核酸（一种或多种）。
因此，本发明的一个实施方案是，上述的方法，其中在第一个反应容器中不存在所述第二种靶核酸。
具体地，如果流体样品疑似含有来自不同生物体的靶核酸，或甚至不同的生物体本身，或如果不清楚在所述样品中可能存在哪种不同的核酸或生物体，本发明的一个实施方案是，上述的方法，其中所述第一种靶核酸和第二种靶核酸来自不同的生物体。
如前所述，上述方法可用于定性地或定量地控制至少第一种和第二种靶核酸的扩增。
生物样品中核酸的定性检测，对于例如识别个体的感染而言是重要的。因此，检测微生物感染的试验的一个重要的要求是，避免假阴性或假阳性结果，因为这样的结果几乎不可避免地在各个患者的治疗方面导致严重后果。因而，特别是在基于PCR的方法中，将定性内部对照核酸加入检测混合物中。所述对照对于证实实验结果的有效性是特别重要的：至少在关于各个靶核酸的阴性结果的情况下，在给定的场合内定性内部对照反应必须是表现为反应性的，即必须检测出定性内部对照，否则实验本身被视作无效的。但是，在定性方案中，在阳性结果的情况下，不一定必须检测出所述定性内部对照。对于定性实验，特别重要的是，确保并因此严格控制反应的灵敏度。结果，定性内部对照的浓度必须相对较低，使得即使在例如轻微抑制的情况下，不会检测到定性内部对照，因此实验被无效化。
因而，本发明的一个方面是，上述的方法，其中所述内部对照核酸的扩增产物的存在，指示在反应混合物中发生的扩增，即使不存在一种或更多种所述靶核酸的扩增产物。
在另一方面，除了仅仅检测样品中核酸的存在与否以外，测定所述核酸的量经常是重要的。作为一个实例，基于病毒载量，可以评估病毒病的阶段和严重性。此外，任意治疗的监测需要关于在个体中存在的病原体的量的信息，以便评价治疗的成功。对于定量试验，必须引入定量标准核酸，用作测定靶核酸的绝对量的参照。通过参照外部校准，或通过执行内部定量标准，可以实现定量。
在外部校准的情况下，使用已知量的相同的或相当的核酸，在单独的反应中建立标准曲线。随后，通过将用分析的样品得到的结果与所述标准函数进行对比，确定靶核酸的绝对量。但是，外部校准具有下述缺点，即在对照中未反映可能的提取操作、它的变化的效能和可能的且经常不可预测的抑制扩增和/或检测反应的试剂的存在。
该情况适用于任何样品有关的效应。因此，它可能是这样的情况，其中由于不成功的提取操作或其它基于样品的因素，样品被判读为阴性，然而要检测和定量的靶核酸实际上存在于样品中。
出于这些和其它原因，加入实验反应本身中的内部对照核酸具有优点。当用作定量标准时，所述内部对照核酸在定量实验中至少具有下述两种功能：
i) 它监测反应的有效性。
ii) 它用作效价计算的参照，从而补偿抑制效应，并控制制备和扩增过程，以实现更准确的定量。
因此，不同于定性实验中的定性内部对照核酸（其仅在靶物阴性的反应中必须是阳性的），定量实验中的定量对照核酸具有两种功能：反应控制和反应校准。因此，在靶物阴性的和靶物阳性的反应中，它必须是阳性的和有效的。
它还必须适合提供可靠的参照值，用于计算高核酸浓度。因而，内部定量对照核酸的浓度需要相对较高。
在本发明的一个实施方案中，该方法被自动化。
本发明也涉及用于分离和扩增至少2种不同核酸的分析系统，所述核酸可能存在于至少一个样品中，所述分析系统包含：
- 分离站，其构造和安排成将所述核酸与其它物质分离，
- 试剂盒，其包含至少一个容器(container)，所述至少一个容器包含含有扩增剂的溶液，
- 第一种溶液，其包含用于扩增第一种靶核酸的寡核苷酸，
- 第二种溶液，其包含用于扩增第二种靶核酸的寡核苷酸，
- 扩增站，其包含反应容器(vessel)，
其中组合包含扩增剂的所述溶液和包含寡核苷酸的第一种或第二种溶液，使得所述反应容器包含扩增剂、分离的靶核酸和寡核苷酸，其中在包含用于扩增第一种靶核酸的寡核苷酸的反应容器中和在包含用于扩增第二种靶核酸的寡核苷酸的反应容器中，扩增剂的比例是相同的。
在上文中和在下文中描述了所述系统的实施方案。图5 显示了一个示例性的系统(1020)。所述系统包含试剂盒(1021)，所述试剂盒包含容器(container)(1022)和(1023)，所述容器包含溶液(1028)和(1029)。容器(1024)包含溶液(1025)，它是含有寡核苷酸的溶液(1025)。将来自容器(1022)和/或(1023)的溶液与溶液(1025)相组合。这可以如下实现：通过将溶液(1025)加入容器(1022)或(1023)中，然后组合所有溶液，或通过将溶液(1028)和/或(1029)加入反应容器(vessel)(1026)中，然后加入溶液(1025)。应当理解，仅将来自容器(1022)、(1023)、(1024)的必要体积加入反应容器(1026)中，并非所有它们的内容物。在将适当体积加入反应容器(1026)以后，在扩增站(403)中温育反应容器(1026)。溶液、容器（container）和容器（vessel）的实施方案如本文所述。
本发明的系统的一个优点是，不需要象在现有技术中一样生产不同的包含扩增剂的总体溶液，所述扩增剂用于有效地扩增不同的靶核酸，具有本文所述的LOD。相反，从相同的总体溶液（单种或多种），在一个实施方案中，从第一种溶液和第二种溶液，准备任一种靶核酸的所有扩增反应。组合的反应溶液包含所有必要的扩增剂，但是不包含寡核苷酸。然后可以为反应溶液中的最佳性能优化寡核苷酸。优化可以包括：设计寡核苷酸序列，修饰以提高寡核苷酸的性能，和/或优化寡核苷酸的浓度，以在通用的反应溶液中得到良好性能。因而，优化包括技术人员众所周知获得方法。但是，也可以制备已经包含优化的寡核苷酸浓度的溶液。
如图5所示，在本发明的一个方面，试剂盒(1021)至少包含：含有第一种溶液的第一个容器(1022)和含有第二种溶液的第二个容器(1023)。所述试剂盒也可以包含含有其它溶液的其它容器。所述溶液是浓缩的储备溶液，当与包含寡核苷酸和靶核酸的溶液相混合时，其包含扩增所述靶核酸必需的所有试剂。
本发明的一个方面也涉及至少包含第一种溶液和第二种溶液的储备溶液，其中通过混合所述第一种和第二种溶液得到的终浓度适用于扩增任一种靶核酸，具有本文公开的LOD。
在一个实施方案中，所述第一种和第二种溶液被用于制备反应混合物，分别用于在分离的反应容器中检测不同的靶核酸，其中通过加入对各个靶核酸特异性的寡核苷酸。
在一个实施方案中，所述第一种溶液包含Mn2+，有或没有Mg2+存在。在一个实施方案中，所述第一种溶液包含Mn2+，没有Mg2+存在。在一个实施方案中，所述第一种溶液由MnOAc和无活性的补充成分组成。无活性的补充成分被理解为实验性能非必需的成分。这样的成分是例如起防腐剂作用的成分。一种无活性的补充成分是NaN3。在该实施方案中，不存在Mg2+离子。终浓度是从1、或从2、或从3至5、或至4、或至3.5 mM Mn2+。在一个实施方案中，Mn2+是MnOAc的形式。
在一个实施方案中，所述储备溶液包含含有N-三(羟甲基)甲基甘氨酸（Tricine）的第二种溶液。对于3 1/3x浓缩的第二种溶液，N-三(羟甲基)甲基甘氨酸的浓度是从100 mM、或从150
mM至300 mM、或至250
mM。在一个实施方案中，所述浓度是200 mM。对于浓缩度更高或更低的储备溶液，相应地调节3 1/3x浓缩的储备溶液的浓度。在一个实施方案中，所述第二种溶液不包含Tris。
在一个实施方案中，所述储备溶液另外包含钾离子。3 1/3 x浓缩的储备溶液的浓度是从300
mM、或从350 mM至500
mM、或至450 mM。在一个实施方案中，钾离子的浓度是400
mM。对于浓缩度更高或更低的储备溶液，相应地调节3 1/3x浓缩的储备溶液的浓度。在一个实施方案中，使用乙酸钾来提供钾离子。
在一个实施方案中，所述第二种溶液另外包含甘油。3 1/3 x浓缩的储备溶液的浓度是从2%、或从5%、或从7%至20%、或至17%、或至15%、或至12%。在一个实施方案中，所述甘油浓度是10%。对于浓缩度更高或更低的储备溶液，相应地调节3
1/3x浓缩的储备溶液的浓度。
在一个实施方案中，所述第二种溶液另外包含DMSO。3 1/3
x浓缩的储备溶液的浓度是从5%、或从10%、或从12%、或从17%至30%、或至25%、或至20%。在一个实施方案中，所述浓度是18%。对于浓缩度更高或更低的储备溶液，相应地调节3 1/3x浓缩的储备溶液的浓度。
在一个实施方案中，所述第二种溶液另外包含表面活性剂。在一个实施方案中，所述表面活性剂是吐温或吐温20。3 1/3 x浓缩的储备溶液的浓度是从0.01%、或从0.025%至0.1%、或至0.075%。在一个实施方案中，所述浓度是0.05%。对于浓缩度更高或更低的储备溶液，相应地调节3 1/3x浓缩的储备溶液的浓度。
第二种溶液也可以包含NaN3，其在适合保存溶液的浓度。3 1/3 x浓缩的储备溶液的浓度是从0.01%、或从0.025%至0.1%、或至0.075%。在一个实施方案中，所述浓度是0.09%。对于浓缩度更高或更低的储备溶液，相应地调节3
1/3x浓缩的储备溶液的浓度。
在一个实施方案中，所述第二种溶液另外包含适体。3 1/3 x浓缩的储备溶液的浓度是从0.1
uM、或从0.25 uM、或从0.5
uM至1 uM、或至0.8 uM、或至0.75 uM。在一个实施方案中，浓度是0.74 uM。对于浓缩度更高或更低的储备溶液，相应地调节3 1/3x浓缩的储备溶液的浓度。
在一个实施方案中，3 1/3 x浓缩的第二种溶液的pH是从7.0、或从7.5、或从8.0至9.0、或至8.5、或至8.2。在一个实施方案中，pH是8.1。对于浓缩度更高或更低的储备溶液，相应地调节pH。
在本发明的一个方面，第二种溶液包含扩增必需的核苷酸。在一个实施方案中，所述核苷酸是脱氧核苷酸(dNTP)。在一个实施方案中，所述核苷酸包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP或dUTP，或dATP、dGTP、dCTP和dUTP。在3 1/3 x 储备溶液中的浓度是从5 mM、或从4 mM、或从3 mM至0.5mM、或至1mM、或至2 mM。在一个实施方案中，dATP、dGTP和dCTP的浓度是1333.33 uM，对于dUTP，是2666.67 uM。对于浓缩度更高或更低的储备溶液，相应地调节3 1/3x浓缩的储备溶液的浓度。
在本发明的一个方面，第二种溶液另外包含用于扩增核酸的聚合酶。本文公开了聚合酶的实施方案。3 1/3 x浓缩的储备溶液的浓度是从1000 KU/l、或从2000
KU/l或从2500 KU/l至6000
KU/l、或至5000 KU/l、或至4000
KU/l。一种浓度是3000 KU/l。对于浓缩度更高或更低的储备溶液，相应地调节3
1/3x浓缩的储备溶液的浓度。
在本发明的一个方面，第二种溶液另外包含UNG。3 1/3
x浓缩的储备溶液的浓度是从450 KU/l、或从500 KU/l、或从600 KU/l至1000 KU/l、或至800 KU/l、或至700 KU/l。一种浓度是670 KU/l UNG。对于浓缩度更高或更低的储备溶液，相应地调节3 1/3x浓缩的储备溶液的浓度。
在本发明的一个方面，第二种溶液另外包含EDTA。包含EDTA的优点是，在组合第一种和第二种溶液之前，EDTA会促进在第二种溶液中包含的酶的无活性状态，这通过络合和灭活可能促进酶活性的污染来实现。EDTA的浓度是从1uM、或从10uM、或从40 uM至200 uM、或至100 uM、或至50 uM、或44 uM。
储备溶液的浓缩度可以是从2 x、或从3 x、或从4 x至20 x、或至10 x、或至5 x。在一个实施方案中，所述储备溶液的浓缩度是3 1/3 x或5 x。不同储备溶液的浓缩x倍也可以是不同的。
第二种溶液也可以分入一份或更多份其它储备溶液中。但是，储备溶液必须提供上文所述的成分浓度。
在一个实施方案中，第一种和第二种溶液和任选的其它溶液的组合由锰2+、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、钾离子、甘油、DMSO、吐温、叠氮化钠、dNTP、聚合酶、UNG和适体组成。因而，在任一种储备溶液中不存在其它成分。
在组合不同的储备溶液和任选的寡核苷酸以后，下述盐浓度存在于最终的PCR反应混合物的一个实施方案中：
Mn2+具有从1 mM、或从2 mM、或从2.5 mM至5 mM、或至4 mM、或至3.5 mM的终浓度。一个终浓度是3.3 mM。
甘油具有从1%、或从2%、或从2.5%至5%、或至4.5%、或至4%或3.5%的终浓度。甘油的一个浓度是3%。%应当理解为%(v/v)。
N-三(羟甲基)甲基甘氨酸具有从30 mM、或从40 mM、或从45 mM或50 mM至70 mM、或至65 mM、或至60 mM的终浓度。一个浓度是60 mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸。
DMSO具有从0%、或从1%、或从2%或3%至6.5%、或至6%、或至5.5%的终浓度。一个实施方案是5.4%的DMSO 终浓度。%应当理解为%(v/v)。
K+具有从80 mM、或从90 mM、或从100 mM或110 mM至150 mM、或至145 mM、或至135 mM或125 mM的终浓度。一个K+终浓度是120 mM。一个实施方案是120 mM KOAc的终浓度。
如果选择在溶液中包含吐温20，则终浓度是从0%、或从0.005%、或从0.015%至0.03%、或至0.025%、或至0.02%。一种吐温20浓度是0.015%。%应当理解为%(v/v)。
反应混合物中UNG的含量是每个反应从2 U、或从5 U、或从7 U或8 U至20 U、或至15 U、或至12 U。在一个实施方案中，包含10 U/反应的UNG。在一个实施方案中，反应混合物的体积是50 ul。从中可以计算其它浓度。
在一个实施方案中，在最终反应物中的Z05D聚合酶含量是每个反应从25 U、或从30 U、或从35 U或40 U至55 U、或至50 U、或至45 U。在一个实施方案中，所述含量是45 U/反应。反应混合物的一个实施方案的体积是50 ul。从中可以计算其它浓度。
最终的反应液可以另外包含非活性成分，它们例如适合保存储备溶液，且因而也存在于最终的反应混合物中。这样的非活性成分是，例如，NaN3。
本发明也涉及本文所述的储备溶液，其另外包含寡核苷酸。寡核苷酸在3 1/3 x 储备溶液中的浓度是从0.1 uM、或从0.2667
uM至5 uM、或至4 uM。在一个方面，第二种溶液包含优化的浓度的寡核苷酸，其用于扩增靶物和对照核酸。在另一个方面，第二种溶液包含0.1
uM-4 uM 的用于扩增和检测靶核酸的任一种寡核苷酸。在一个实施方案中，所述寡核苷酸浓度是0.05
uM至0.5 uM，或0.3
uM。在一个实施方案中，任一种寡核苷酸的使用浓度是相同的。因而，在一个实施方案中，使用0.3
uM的任一种寡核苷酸。在其它实施方案中，单个地优化寡核苷酸浓度，且在0.025 uM至0.75 uM、或0.05 uM至0.5 uM的范围内。如果第二种溶液另外包含寡核苷酸，可以将低浓度的其它成分引入溶液中，诸如浓度低于1 mM、或低于0.5 mM、或等于或小于0.3 mM的Tris。可以引入浓度小于5 uM、或小于2.5 uM或小于1 uM的EDTA。如果与寡核苷酸一起引入N-三(羟甲基)甲基甘氨酸或钾离子，则第二种溶液的浓度最初可以与本文所述的浓度相差10%至15%，或包含寡核苷酸的最终储备溶液可以相差10%至15%。技术人员会知道如何优化要在本发明的溶液中使用的每种寡核苷酸的浓度。
在本发明的一个方面，第二种溶液另外包含用于检测内部对照核酸的寡核苷酸。在本文中公开了对照核酸和寡核苷酸的实施方案。如前文所述，优化用于检测内部对照的所述寡核苷酸的浓度。前文公开了浓度。在一个实施方案中，所述第二种溶液包含用于检测内部对照核酸的寡核苷酸，其在没有寡核苷酸存在下用于检测靶核酸。
在前文所述试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒另外至少包含一个容器，所述容器含有对照核酸。本文公开了所述对照核酸的实施方案。在一个实施方案中，所述试剂盒包含：一个容器，该容器含有包含DNA的对照核酸，和另一个容器，该容器含有包含RNA的对照核酸。该试剂盒特别适用于同时测试RNA和DNA靶核酸。
在前文所述系统的一个方面，在所有反应容器中，所述扩增剂的浓度是相同的。相同是指，包括20%或15%或10%的差异性。
“分离站”是允许将固体支持物与在流体样品中存在的其它物质分离的装置或分析系统组件。这样的分离站可以包含，例如，但不限于，离心机、具有过滤管的支架、磁体或其它适当的组件。在本发明的一个实施方案中，所述分离站包含一个或更多个磁体。在一个实施方案中，一个或更多个磁体被用于分离磁性颗粒，例如磁性玻璃颗粒，作为固体支持物。例如，如果将流体样品和固体支持物一起组合在多孔板的孔中，则通过将磁体引入孔中，可以使分离站所包含的一个或更多个磁体例如接触流体样品本身，或可以使所述一个或更多个磁体接近孔的外壁，以便吸引磁性颗粒，并随后使它们与周围的液体分离。
在本发明和所述分离站的上下文中，还有用的是，分离和纯化核酸的方法。该方法包括，在多孔板的容器中，使核酸结合磁性颗粒的步骤。所述容器包含顶部开口、中央部分和底部部分。然后当液体的主要部分位于容器的圆锥部分被具有矩形形状的中央部分替换的界面以上时，如下使结合的物质与液体中含有的未结合的物质分离：将磁体从第二个位置移动到第一个位置 ，且在所述第一个位置，将磁场施加于中央部分，并任选地，另外将磁场施加于所述容器的底部部分。任选地，可以用洗涤溶液洗涤磁性颗粒。通过选择性地施加磁场于所述容器的底部部分，使小体积的液体与所述磁性颗粒分离，其中大部分液体位于容器的圆锥部分被具有矩形形状的中央部分替换的界面以下。
“扩增站” (403)包括用于温育至少2个反应容器的内容物的控温培养箱。它另外包含多个反应容器，如试管或平板，在其中发生分析样品的反应，诸如PCR。这样的容器的外边界或壁是化学惰性的，使得它们不会干扰在其中进行的扩增反应。为了容易操作和促进自动化，至少2个反应容器是在一个整体排列中，使得它们可以被一起操作。
结果，本发明的一个方面是，上述的分析系统，其中至少2个反应容器被组合在一个整体排列中。
整体排列可以是例如可逆地或不可逆地彼此相连或排列在支架中的管形瓶或试管。在一个实施方案中，所述整体排列是多孔板。
在本发明的一个方面，所述系统另外包含用于扩增所述靶核酸的多孔板。
在本发明的一个方面，所述系统另外包含用于分离所述靶核酸的多孔板。
在一个实施方案中，在所述系统的各站之间运输在整体排列中组合的至少2个反应容器。
在第二个实施方案中，将纯化的靶核酸从所述分离站转移至所述扩增站。在一个实施方案中，使用移液器（其包含具有连接的吸量管尖的吸量管）转移包含纯化的核酸的液体。
在第三个实施方案中，将纯化的核酸从所述分离站转移至保留在容纳站中的整体排列的反应容器中。在一个实施方案中，然后将整体排列中的所述反应容器从所述容纳站转移至所述扩增站。
在一个实施方案中，根据本发明的分析系统另外包含吸量单元。所述吸量单元包含至少一个吸量管或多个吸量管。在一个实施方案中，在一个或更多个整体排列中组合所述多个吸量管，其中所述吸量管可以单个地操作。在本发明的上下文中使用的吸量管是包含本文所述的吸量管尖的吸量管。在另一个实施方案中，所述吸量管是吸量针。
或者，在分离站的样品制备中使用的且含有包含纯化的靶核酸的液体的反应容器或反应容器排列，可以从分离站转移至扩增站。
为此目的，在一个实施方案中，根据本发明的分析系统另外包含转移单元。在一个实施方案中，所述转移单元另外包含机器人装置。在一个方面，所述装置另外包含操纵器。
为了在根据本发明的方法的上下文中在上面阐述的原因，下面是本发明的其它方面：
• 上述的分析系统 (440)，其中至少一个反应容器包含RNA靶核酸和DNA靶核酸。
• 上述的分析系统 (440)，其中至少一个反应容器包含RNA 靶核酸，且至少一个其它反应容器包含DNA靶核酸。
在一个方面，上述的分析系统(440)另外包含一个或更多个选自下述的元件：
• 检测模块(403)，用于检测由分析物引起的信号
• 密封器(410)
• 试剂和/或可抛弃物的储存模块(1008)。
• 控制单元(1006)，用于控制系统组件。
示例性的系统如图3和4所示。“检测模块” (403)可以是例如光学检测单元，其用于检测扩增操作的结果或效应。光学检测单元可以包含光源，例如 氙灯, 光学器件（诸如反光镜、透镜、滤光器、用于引导和过滤光的光纤）、一个或更多个参照通道、或CCD照相机或不同的照相机。
“密封器” (410)被构造和安排成密封与根据本发明的分析系统联合使用的任意容器。这样的密封器可以是，例如，具有适当帽子的密封试管，或具有箔或其它合适的密封材料的多孔板。
“储存模块” (1008)储存必要的试剂，以实现对于流体样品的分析而言重要的化学或生化反应。它也可以包含可用于本发明方法中的其它组分，例如可抛弃物，诸如要用作分离站和/或扩增站内的反应容器的吸量管尖或容器。
在一个方面，根据本发明的分析系统另外包含用于控制系统组件的控制单元 (图4)。
这样的“控制单元” (1006)可以包括软件，其用于确保所述分析系统的不同组件在正确的时机正确地工作和交互作用，例如以协调的方式移动和操纵组件，诸如吸量管。控制单元也可以包含运行实时操作系统(RTOS)的处理器，所述RTOS是预期用于实时用途的多任务处理操作系统。换而言之，所述系统处理器能够管理实时约束，即从事件至系统响应的运转期限，无论系统负载。它实时控制在所述系统内的不同单元根据给出的指令正确地运转和响应。
显示在图3中的示例性的系统表现出下述特征：它包含分析仪(400)，所述分析仪具有用于制备样品的模块(402)、用于处理样品的模块(401)、用于扩增的模块(403)和转移模块(404)。它另外包含液体处理模块(500)。用于制备样品的模块(402)包含容纳站(470)。用于处理样品的模块(401)包含容纳(holding)站(470)、处理站或分离站(201、230)、容纳站(330)、加热装置(128)和密封站(128)。用于扩增的模块(403)包含培养箱(405)。所述分析仪(400)另外包含在模块(401)和模块(403)之间的气塞(460)。这些特征中的一些也显示在图4所示的示例性的系统中。在图4中，用于制备样品的模块(402)另外包含用于容纳尖支架(70)的托架(1007)，所述尖支架容纳吸量管尖头(3,4)。它另外包含用于容纳深孔板(101)的托架(1007)，所述深孔板包含可以向其中加入液体样品(1011)的贮器（receptcle）(103)。它也包含支架(1002)的托架(1003)，所述支架包含含有液体样品(1010)的第一个贮器(1001)。用于制备样品的模块(402)另外包含第一种吸量装置(700)，其受第一种处理器(1004)控制。用于处理样品的模块(401)包含分离站(201)或加热装置(128)，其包含处理平板(101)。处理平板(101)包含贮器(103)。它也包含容纳站(470)，其容纳包含吸量管尖头(3、4)的吸量管尖头支架(470)。用于处理样品的模块(401)另外包含吸量装置(35)，其受第二个处理器(1005)控制。分析系统(440)包含分析仪(400)和控制单元(1006)，所述控制单元控制第一个处理器(1004)和第二个处理器(1005)。此外，所述分析仪(400)包含转移系统(480)。
在一个方面，本发明涉及用于分别扩增至少2种靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个容器，其中所述容器包含用于分别扩增至少2种不同靶核酸中的任一种的溶液。
容器(1022、1023、1024)是用于容纳液体的任意类型的储存容器。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含至少2个容器，其中第一个容器含有第一种溶液，第二个容器含有第二种溶液，它们用于制备组合溶液，用于分别扩增至少2种靶核酸中的任一种。
在一个实施方案中，所述第一种溶液包含至少一种扩增核酸必需的盐，所述第二种溶液至少包含用于扩增核酸和dNTP的酶。
本发明也涉及包含第一个容器(1022)和第二个容器(1023)的试剂盒(1021)，所述第一个容器含有Mn2+离子或MnAc的溶液，所述第二个容器含有用于扩增核酸的酶。在一个方面，所述第二个容器另外包含dNTP。
溶液的其它实施方案如前文所述。
在另一个方面，本发明涉及扩增可能存在于至少一个流体样品中的至少一个靶核酸的方法，所述方法包括：
提供至少一个容器，该容器含有用于扩增所述靶核酸的溶液，
向所述溶液中，加入特异性地扩增所述靶核酸的寡核苷酸，
将所述靶核酸与所述溶液和所述寡核苷酸相组合，
在一定条件下，在反应容器中温育所述靶核酸、所述溶液和所述寡核苷酸一段时间，所述条件和时间足以发生指示所述靶核酸存在与否的扩增反应。
在一个方面，第一个容器含有第一种溶液，该溶液包含至少一种扩增核酸必需的盐，且其中第二个容器含有第二种溶液，该溶液包含扩增核酸必需的酶和脱氧核苷酸，其中在所述反应容器中组合所述第一种和所述第二种溶液，以得到所述溶液。
根据本发明的系统和方法的一个实施方案如图6所示。包含在容器(1022)和/或(1023)中的第一种和/或第二种溶液(1028、1029)包含扩增必需的所有试剂，但是不包含寡核苷酸。将溶液(1028)和/或(1029)与寡核苷酸溶液(1025)相组合，后者包含在容器(1024)中。在容器(1026)中组合溶液，从而组成溶液(1027)。然后将溶液(1027)转移至容器(1030)。该容器设计成装载进分析仪(400)中。在本方法中，将容器(1030)装载进分析仪(400)中。
所述溶液的其它实施方案如前文所述。
现在，使用下面的非限制性实施例来例证本发明：
实施例。
根据各个生产商的说明书，使用在下表中列出的仪器：
| 仪器 | 生产商 |
| Hamilton Star | Hamilton Medical AG (Bonaduz, CH) |
| Light Cycler 480 | Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, DE) |
| Chameleon密封器 | K biosystems (Essex, UK) |
| 压缩机 | K biosystems (Essex, UK) |
样品制备
本实施例描述了使用单种通用的内部对照核酸分离并同时扩增至少第一种和第二种靶核酸的方法。
简而言之，在描述的实施方案中，在包含细菌(沙眼衣原体、CT)以及DNA病毒(HBV)和RNA病毒(HIV)的几种不同靶物的组上，同时地在相同条件下进行实时PCR。
制备下述样品，并随后分析：
| 试剂 | 生产商: |
| HIV-1M 二级标准, 50'000 cp/ML | Roche |
| HBV 二级标准, 400 IU/ML | Roche |
| CT (DNA POS CTL pCHL-1) | Roche |
技术人员可以得到合适的标准品或其它类型的靶物。
对于样品制备，使用下述的试剂作为稀释剂:
| 试剂 | 生产商: |
| K3 EDTA 血浆, PCR阴性 | Roche |
预先制备下述的稀释液，并储存过夜(血浆稀释液，在-60至-90℃):
将每个各个样品(500ul)和每个各个样本稀释剂(350ul)手工地吸量进深孔板中，其中将每个样品加入3个不同的孔中，进行一式三份分析。向每个含有HIV或HBV样品的孔中，手工地加入50 ul内部对照核酸。对于定性HIV试验，加入用作定性对照的RNA(100个披甲的颗粒/样品)。对于定量HIV试验，加入用作定量标准品的RNA (500个披甲的颗粒/样品)。对于定量HBV试验，加入用作定量标准品的DNA(1E4个拷贝/样品)。在所有情况下，所述对照核酸的序列是相同的，并选自SEQ ID NO 45-48。
根据图1描绘的方案，按照工作流程，在Hamilton Star
(Hamilton, Bonaduz, CH)上进行样品制备。
在最后一步以后，Hamilton Star仪器的加工头（process
head）将含有扩增剂的各个主混合物 (MMx)加入每个孔中，将含有分离的核酸的液体与MMx相混合，并将每种得到的混合物转移至微孔板的对应孔，在其中进行扩增。
扩增和检测
对于扩增，制备2种储备溶液R1和R2，分别用于单独的靶核酸 (R1-HBV和R2-HBV，R1-HCV和R2-HCV，R1-HIV和R2-HIV)，或作为下述浓度的通用溶液R1- HxV和R2-HxV，总体积为50 ul:
R1-HBV: 2.5 mM MnOAc, pH 6.1, 2.5 mM MgOAc pH 6.1和0.02%叠氮化钠 pH 7.0。
R2-HBV:
0.03%叠氮化钠 pH 7.0, 25.2 mM KOH, 121.8 mM KOAc pH
7.0, 5%甘油, 0.03%吐温20,
40 mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸 pH 7.7, 0.2325 uM 适体, 2 U
UNG, 0.42 mM dGTP, 0.42 mM dATP, 0.42 mM dCTP, 0.84 mM dUTP, 35U Z05D-聚合酶, 1.2 uM HBV正向引物 (Seq
ID 36), 0.1 uM HBV有义探针 (Seq ID 38),
1.2 uM HBV 反向引物 (Seq ID 37); 0.6 uM对照正向引物 (Seq ID 42), 0.6 uM对照反向引物 (Seq
ID 43), 0.15 uM对照探针 (Seq ID 44)。
R1-HCV:
2.5 mM MnOAc, pH 6.1,和0.02%叠氮化钠 pH 7.0。
R2-HCV:
0.03%叠氮化钠 pH 7.0, 4%DMSO, 110 mM KOAc pH 7.0, 4%甘油, 0.02%Igepal, 50 mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸 pH 8.0,
2.08%v/v的TRIS (10 mM), pH 8.0, 0.2222 uM 适体, 10 U UNG, 0.5 mM dGTP, 0.5 mM dATP, 0.5 mM dCTP, 1.0 mM
dUTP, 30U Z05D-聚合酶, 2.25%v/v探针储存缓冲液JA270, 0.1 uM HCV正向引物, 0.1
uM HCV 反向引物, 0.1 uM HCV探针1, 0.1 uM HCV探针2;
0.3 uM对照正向引物, 0.3 uM对照反向引物, 0.1
uM对照探针。
R1-HIV:
3.5 mM MnOAc, pH 6.1,和0.02%叠氮化钠 pH 7.0。
R2-HIV:
0.03%叠氮化钠 pH 7.0, 1%DMSO, 110 mM KOAc pH 7.0,
4.5%甘油, 45 mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸 pH 7.7, 60 mM
Tris pH 7.7, 0.3 uM 适体, 10 U UNG, 1.75
mM dGTP, 1.75 mM dATP, 1.75 mM dCTP, 1.75 mM dUTP, 40U Z05D-聚合酶, 0.3 uM HIV-GAG正向引物, 0.3
uM HIV-GAG 反向引物, 0.1 uM HIV-GAG探针, 0.1 uM HIV-LTR正向引物 1,
0.1 uM HIV-LTR正向引物 2, 0.1 uM HIV-LTR 反向引物 1, 0.1 uM HIV-LTR 反向引物 2;
0.1 uM HIV-LTR探针, 0.3 uM对照正向引物, 0.3
uM对照反向引物, 0.1 uM对照探针。
R1-HxV:
3.3 mM MnOAc, pH 6.1,和0.02%叠氮化钠 pH 7.0。
用于HBV的R2-HxV: 0.03%叠氮化钠 pH 7.0, 5.4%DMSO, 120 mM KOAc pH 7.0, 3%甘油, 0.02%吐温20, 60 mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸 pH 8.0, 0.2222 uM 适体, 10
U UNG, 0.4 mM dGTP, 0.4 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.8 mM dUTP, 45 U Z05D聚合酶, 1.2 uM HBV正向引物, 0.1
uM HBV有义探针, 1.2 uM HBV 反向引物; 0.6 uM对照正向引物, 0.6 uM对照反向引物, 0.15 uM对照探针。
用于HCV的R2-HxV: 0.03%叠氮化钠 pH 7.0, 5.4%DMSO, 120 mM KOAc pH 7.0, 3%甘油, 0.02%吐温20, 60 mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸 pH 8.0, 0.2222 uM 适体, 10
U UNG, 0.4 mM dGTP, 0.4 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.8 mM dUTP, 45 U Z05D聚合酶, 0.1 uM HCV正向引物, 0.1
uM HCV 反向引物 1, 0.1 uM HCV 反向引物 2, 0.1 uM HCV探针1,
0.1 uM HCV探针2; 0.3 uM对照正向引物, 0.3
uM对照反向引物, 0.1 uM对照探针。
用于HIV的R2-HxV: 0.03%叠氮化钠 pH 7.0, 5.4%DMSO, 120 mM KOAc pH 7.0, 3%甘油, 0.02%吐温20, 60 mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸 pH 8.0, 0.2222 uM 适体, 10
U UNG, 0.4 mM dGTP, 0.4 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.8 mM dUTP, 45 U Z05D聚合酶, 0.3 uM HIV-GAG正向引物, 0.3
uM HIV-GAG 反向引物, 0.1 uM HIV-GAG探针, 0.1 uM HIV-LTR正向引物 1,
0.1 uM HIV-LTR正向引物 2, 0.1 uM HIV-LTR 反向引物 1, 0.1 uM HIV-LTR 反向引物 2;
0.1 uM HIV-LTR探针, 0.3 uM对照正向引物, 0.3
uM对照反向引物, 0.1 uM对照探针。
在下表中显示了扩增剂的终浓度:
表1
寡核苷酸序列选自Seq ID No. 1 – 16（对于HIV-1-GAG正向或反向引物）和17-21（对于HIV-1-GAG探针）、Seq ID No. 22-29（对于HIV-1-LTR正向或反向引物）、Seq ID No. 33或34（对于HIV-1-LTR探针）、Seq ID No. 30-32（对于HIV-2正向或反向引物）、Seq ID 35（对于HIV-2探针）、Seq ID No. 36-37（对于HBV正向和反向引物）、Seq ID No. 38（对于HBV探针）、Seq ID No. 42-44（对于内部对照）、Seq ID No. 49-63（对于HCV正向）、Seq ID No. 64-92（对于反向引物或探针）。
对于扩增和检测，使用自动化的平板密封器(参见上面)密封微孔板，并将平板转移至LightCycler 480 (参见上面)。
使用下面的PCR分布:
表2
热循环分布
检测形式(手工)
Pre-PCR程序包括最初的变性和在55℃、60℃和65℃温育，以逆转录RNA模板。在3个温度温育，会组合下述的有利效应：即在更低的温度，也转录轻微错配的靶序列(诸如生物体的遗传变体)，而在更高的温度，RNA二级结构的形成被抑制，从而导致更有效的转录。
PCR循环被分成2个测量，其中两个测量都应用单步方案(组合退火和延伸)。在55℃的前5个循环通过预先扩增轻微错配的靶序列，实现增加的包容性，而第二个测量的45个循环使用58℃的退火/延伸温度，提供增加的特异性。
在上述微孔板所包含的所有样品上使用该分布，在所有样品中实现了扩增和检测，如图2所示。这表明，在扩增之前的样品制备也成功地进行。
为了清楚，在图2中分别描绘了定性和定量HIV内部对照和定量HBV内部对照的结果。可以看出，在所有情况下，也成功地扩增了对照。通过与用作定量标准品的内部对照核酸相对比，计算定量方案中HIV和HBV靶物的定量。
对比结果显示如下：
表3: LOD 研究:
表4: 包容性:
表6:
表7显示了在50 ul的PCR反应物中从在本发明的方法中使用的第二种溶液储备液得到的终浓度的另一个实施例。
表7
序列表
<110> Roche Diagnostics
F. HOFFMANN- LA ROCHE AG
<120> 用于扩增的通用缓冲液
<130> 26769 EP
<160> 92
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 1
agtgggggga catcaagcag
ccatgcaaa 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 2
agtgggggga catcaagcag
ccatgcaaat 30
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 3
gctttcagcc cagaagtaat acc
23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 4
ggacacatca agcagccatg caaat 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 5
agagaaccaa ggggaagtga
20
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 6
ataatccacc tatcccagta
ggagaaat 28
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 7
agtgggggga caccaggcag
caatgcaaa 29
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 8
catagcagga actactagta
20
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 9
ggtactagta gttcctgcta
tgtcacttcc 30
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 10
ctatgtcact tccccttggt tctct 25
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 11
ggtactagta gttcctgcta
tatcacttcc 30
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 12
tccttgtctt atgtccagaa
20
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 13
tttggtcctt gtcttatgtc
cagaatgc 28
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 14
tactagtagt tcctgctatg
tcacttcc 28
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 15
tgtgttatga tggtgtttaa atc
23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 16
actctaaagg gttcctttgg
20
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 17
tctgcagctt cctcattgat ggtatctttt
aac 33
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 18
tcagcattat cagaaggagc caccccaca 29
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 19
tctgcagctt cctcattgag gtatctttta
ac 32
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 20
atcctgggat taaataaaat agtaagaatg
tatagcccta c 41
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 21
accatcaatg agggaagctg
cagaatggg 29
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 22
tgactctggt aactagagat ccctca 26
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 23
tgttcaaccc tggtatctag
agatccctca 30
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 24
ggctaactag ggacccactg
20
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 25
actagggaac ccactgct
18
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 26
tcagcaagcc gagtcctgcg tcgaga 26
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 27
ccgctaagcc gagccctttg
cgtcgga 27
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 28
ggtctgaggg atctcta 17
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 29
ctgctagaga ttttccacac tgac
24
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 30
ggctccacgc ttgcttgctt aaa
23
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 31
ggctccacgc ttgcttgc
18
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 32
ttcccaaagc aagaagggtc ctaacagacc
a 31
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 33
tctctagcag tggcgcccga
acagggac 28
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 34
accagagtca cacaacagac gggcacacac
tact 34
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 35
tcctagtcgc cgcctggtca ttcggtgttc
a 31
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 36
catgcaactt tttcacctct gccta 25
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 37
aactccacag tagctccaaa
ttcttta 27
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 38
ccaagctgtg ccttgggtgg ctttggggca
tgg 33
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 39
gggattcctg taacaacaag tca
23
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 40
tcttccccag aacaataaga acac 24
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 41
ggcttgcaga gttctatagt gctatg 26
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 42
ttgatagcaa tcggctatcg actaa 25
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 43
gcttcgatac tcagtcatct
cggtataa 28
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 44
tctctcgcca tctcctaccg
cattggc 27
<210> 45
<211> 269
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内部对照核酸
<400> 45
aattcaagct tagatctagc tttgcctgct
tgatagcaat cggctatcga ctaatgactg 60
tcctggcggt ctctcgccat ctcctaccgc
attggctcat aggtaagctc gctgtcaccc 120
agtacggagg tgccagtaga ttattagaga
cagtcgccaa tcgatcgtta taccgagatg 180
actgagtatc gaagctacat tgtagccgca
cataggacca cccatcttca tgttgaaaca 240
tgaggattac ccatgtggat
ccaagcttg
269
<210> 46
<211> 235
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内部对照核酸
<400> 46
gggctgcagg tcgactctag attctaagaa
tttgatgggc tttttctact aattactatt 60
agtatattgc catctttaac acttagaccg
aagtgtgctg aagttccagt ggccggccca 120
gacctgggaa gttgcaagga cttaaacgaa
tgcaagcgat catatcttga aaaattataa 180
ccagaggatc gatgaaaaaa atttcttaga
gctttggatc cccgggcgag ctccc 235
<210> 47
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内部对照核酸
<400> 47
cgactctaga tgaagggagc cttagaacgg
ggctgcgcta gctggcatca aagtccgtca 60
gagctcaacc ctccaacgag gattcctgaa
tactcgaaag tcagtgtgca gttactaaca 120
acagctgctc gacctcgggg tctcgaacaa
tccatacctg ctatcgctgc cttcagacat 180
acggatgggc taggaggcaa gagctacctg
tctcaacgaa ctatcggagt gggacccgat 240
gaagctgtca gcgccacttc cggcggtaag
gctttaaaac gcgcccgccg gttatcacgc 300
gcggggagca cagcgcggac tgacgtgctg
ggaagcaccg gttaaggatc 350
<210> 48
<211> 470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内部对照核酸
<400> 48
cgactctaga aactgggtag taactgcggg
ggcgaatgat gcaggcttca gaaattaaac 60
tcaatagtat ccggtgtctc aatctttttc
gggccaggcg gcggtggacg acagacaatt 120
ttacgatttt ggttccggtc acaaccgcgc
catacatgtc aagaatgaag tgggcgaacg 180
ctagaaaact gacgccagca attaagtgag
tcggggcgtg gtgactccca cgtaaaaagc 240
ccctaccccg caccgttacg aagtatcaaa
acgggacgcg cacgaaccga cgattggtac 300
tgtataagcg gcccgacgaa ctcaaaatcc
caagtgaatc tatgaaatct acatcgcgtt 360
tataatctac ggggtgtaaa cggatgagaa
ttggccaaac ggaggcacac acgcgtgcaa 420
tgcgccgacc ctgagaaaag tatcatgtgc
gtcggccaca ggatccccgg 470
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 49
ccaagcttca ccatagatca ct 22
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 50
ggcgacactc caccatagat cact
24
<210> 51
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 51
ccaagcttag atcactcccc tgtgaggaac
t 31
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 52
ccaagcttca cgcagaaagc
gtctagccat 30
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 53
gcagaaagcg tctagccatg gcgt
24
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 54
acgcagaaag cgtctagcca tggcgt 26
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 55
cctccaggac cccccctccc
gggagagcca 30
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 56
gagtacaccg gaattgccag
gacgacc 27
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 57
acccgctcaa tgcctggaga t
21
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 58
cgaagcttgc tagccgagta gt
22
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 59
ccgcaagact gctagccgag tagt
24
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 60
gttgggtcgc gaaaggcctt gtggt 25
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 61
ggtgcttgcg agtgccccgg gaggtctcgt 30
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 62
gacttccgag cggtcgcaac ctcg
24
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 63
gcagaaagcg tctagccatg gcgtta 26
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 64
gcaagcaccc tataggcagt accac 25
<210> 65
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 65
gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt
gag 33
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 66
cccaacacta ctcggctagc agtct 25
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 67
aaggcctttc gcgacccaac actact 26
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 68
cacaaggcct ttcgcgaccc aacact 26
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 69
ctcgcaagca ccctatcagg cagt
24
<210> 70
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 70
ccgggagagc catagtggtc tgcggaaccg
gtg 33
<210> 71
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 71
caccggttcc gcagaccact atggctctcc
cgg 33
<210> 72
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 72
cactcgcaag caccctatca ggcagt 26
<210> 73
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 73
gggaattcgc aagcacccta
tcaggcagt 29
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 74
cgaggttgcg accgctcgga agt
23
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 75
aggttgcgac cgctcggaag t
21
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 76
caccggttcc gcagaccact atggctctcc
cgg 33
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 77
aatgccatag aggggccaag g
21
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 78
attgccatag aggggccaag g
21
<210> 79
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 79
cagaattcat tgccatagag gggccaagga
t 31
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 80
cagaattcgc cctcattgcc at
22
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 81
ctcgcaagca ccctatcagg caga
24
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 82
cccaccccaa gccctcattg ccat
24
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 83
ttgccggaaa gactgggtcc tttc 24
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 84
caaaagaaac acaaaccgcc gccc
24
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 85
ccagcccatc ccgaaagatc ggcg
24
<210> 86
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 86
tgtccggtca tttgggcg
18
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 87
aaacccactc tatgtccggt c
21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 88
gtacgccgga attgccggaa a 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 89
cctcaaagaa aaaccaaaag a
21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 90
tggcgtctcc cacgcggctg g
21
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 91
ctttccccag gacctgccgg t
21
<210> 92
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/探针
<400> 92
catagtggtc
tgcggaaccg gtgagt 26
Claims (14)
1.一种用于扩增可能存在于至少一个流体样品中的至少第一种和第二种靶核酸的自动化的方法，所述方法包括下述步骤：
d) 分别在至少2个反应容器中在一定条件下温育所述核酸和溶液一段时间，所述溶液包含扩增剂和对所述第一种或第二种靶核酸特异性的寡核苷酸，其中所述扩增剂包含具有逆转录酶活性的聚合酶，所述时间和条件适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录，
e) 分别在所述至少2个反应容器中在一定条件下温育所述靶核酸和所述溶液一段时间，所述溶液包含扩增剂和对所述第一种或第二种靶核酸特异性的寡核苷酸，所述时间和条件足以发生扩增反应，所述扩增反应指示所述第一种和第二种靶核酸存在与否，
其中在所述第一个和在所述第二个反应容器中的所述溶液包含相同比例的扩增剂，且其中用于所述第一种靶核酸的寡核苷酸存在于所述至少2个反应容器的第一个中，且在所述至少2个反应容器的第二个中不存在，用于所述第二种靶核酸的寡核苷酸存在于所述至少2个反应容器的第二个中，且在所述至少2个反应容器的第一个中不存在。
2.如权利要求1所述的自动化的方法，其中在所述第一个和在所述第二个反应容器中的所述溶液包含相同浓度的扩增剂。
3.如权利要求1或2所述的自动化的方法，其中所述靶核酸是RNA。
4.如权利要求1或2所述的自动化的方法，其中所述靶核酸是DNA。
5.如权利要求1-4中任一项所述的自动化的方法，其中在步骤e)和d)之前存在下述步骤:
a1. 提供多个容器，所述容器包含不同类型的流体样品，
a2. 在一定条件下，将固体支持物与所述多个容器中所述多种不同类型的流体样品组合到一起一段时间，所述条件和时间足以允许包含靶核酸的核酸固定化在固体支持物上，
b. 在分离站中，将固体支持物与流体样品中存在的其它物质分离开，
c. 如下在分离站中纯化核酸：通过使流体样品与固体支持物分离，并用洗涤缓冲液洗涤固体支持物一次或更多次，
其中对于多种不同类型的流体样品中的任一种，在步骤a2中的条件和时间段是相同的。
6.如权利要求4-5中任一项所述的方法，其中对于在所述第一个和第二个反应容器中包含的至少第一种和第二种靶核酸，在步骤d)和e)中的转录和扩增的条件是相同的。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在分离的容器中同时扩增所述第一种和第二种靶核酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中用于扩增所述第一种靶核酸的反应混合物包含优化浓度的对所述第一种靶核酸特异性的所述寡核苷酸，且用于扩增所述第二种靶核酸的反应混合物包含优化浓度的对所述第二种靶核酸特异性的所述寡核苷酸。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在用于扩增所述第一种靶核酸的反应混合物中的对所述第一种靶核酸特异性的寡核苷酸的浓度，与在用于扩增所述第二种靶核酸的反应混合物中的对所述第二种靶核酸特异性的寡核苷酸的浓度基本上相同。
10.用于分离和扩增至少2种不同核酸的分析系统，所述核酸可能存在于至少一个样品中，所述分析系统包含：
- 分离站，其构造和安排成将所述核酸与其它物质分离，
- 试剂盒，其包含至少一个容器，所述至少一个容器包含含有扩增剂的溶液，
- 第一种溶液，其包含用于扩增第一种靶核酸的寡核苷酸，
- 第二种溶液，其包含用于扩增第二种靶核酸的寡核苷酸，
- 扩增站，其包含反应容器，
其中组合包含扩增剂的所述溶液和包含寡核苷酸的所述第一种或第二种溶液，使得所述反应容器包含扩增剂、分离的靶核酸和寡核苷酸，其中在包含用于扩增第一种靶核酸的寡核苷酸的反应容器中和在包含用于扩增第二种靶核酸的寡核苷酸的反应容器中，扩增剂的比例是相同的。
11.如权利要求10所述的系统，其中所有反应容器中所述扩增剂的浓度是相同的。
12.用于在分离的反应容器中分别逆转录和扩增至少第一种和第二种靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个容器，其中所述容器包含溶液，所述溶液含有具有逆转录酶活性的聚合酶，且缺少寡核苷酸。
13.用于分别扩增至少2种不同靶核酸的方法，所述靶核酸可能存在于至少一个流体样品中，所述方法包括，
a) 提供至少一个容器，所述容器包含溶液，所述溶液用于扩增靶核酸，且缺少寡核苷酸，
b) 将一定体积的所述溶液转移至至少2个容器，
c) 将特异性地用于扩增第一种靶核酸的寡核苷酸加入到第一个所述容器中，并将特异性地用于扩增第二种靶核酸的寡核苷酸加入到第二个所述容器中，
d) 混合所述容器的内容物，
e) 将所述第一个和第二个容器装载进用于自动化扩增所述第一种靶核酸的自动化分析仪中，
f) 将所述第一种靶核酸与第一个反应容器的所述第一个容器中的一定体积的所述混合的内容物相组合，并将所述第二种靶核酸与第二个反应容器中的所述第二个容器的一定体积的所述混合的内容物相组合，
g) 在步骤f)以后，在一定条件下温育所述第一个和第二个反应容器的内容物一段时间，所述条件和时间足以发生扩增反应，所述扩增反应指示所述第一种或第二种靶核酸存在与否，
其中在步骤c)之前或之后进行步骤b)。
14.如权利要求13所述的方法，另外包括，在步骤d)之后，将所述第一个容器的混合的内容物转移至第一个试剂容器，并将所述第二个容器的混合的内容物转移至第二个试剂容器，且在步骤f)中，将包含第一个和第二个容器的混合的内容物的所述第一个和第二个试剂容器装载进所述自动化分析仪中。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120404 |