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CN102336812A - 一种具有抑制血管生成活性的多肽 - Google Patents

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CN102336812A CN2010102391622A CN201010239162A CN102336812A CN 102336812 A CN102336812 A CN 102336812A CN 2010102391622 A CN2010102391622 A CN 2010102391622A CN 201010239162 A CN201010239162 A CN 201010239162A CN 102336812 A CN102336812 A CN 102336812A
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Abstract

本发明涉及一种具有抑制血管生成活性的多肽。具体地，本发明涉及源自肝细胞生长因子(HGF)的具有抑制新生血管作用的多肽。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。

Description

一种具有抑制血管生成活性的多肽
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及新的具有抑制新生血管作用的多肽(H-KI系列多肽)。该多肽可抑制体外血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成和可抑制体内鸡胚尿囊膜和小鼠视网膜新生血管。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。
背景技术
血管新生是指在原有毛细血管网的基础上，通过血管内皮细胞增殖、迁移进而形成新生血管的过程。血管新生在体内胚胎发育、损伤修复等生理过程中发挥重要作用，同时也是众多新生血管性疾病，如肿瘤生长与转移、增殖性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、类风湿关节炎等疾病的主要病理变化。因此新生血管抑制剂的研究与应用对于一些难治性新生血管相关疾病具有重要意义。
眼部新生血管与多种眼病都有密切的关系，它常常导致严重的视力损害并最终致盲，例如糖尿病视网膜病变(DR)，年龄相关性黄斑变性(AMD)，角膜新生血管，新生血管性青光眼等。目前临床上的治疗手段主要包括手术、激光和药物。手术需要一定的指征，患者痛苦大，且风险和并发症相对较高；激光治疗亦存在一定的痛苦，可造成局部视野缺损、诱发新生血管，中长期疗效也不甚理想。因此，一种无痛苦、便捷、有效、患者依从性高的药物治疗眼部新生血管的方法成为了近十余年来国内外研究的热点。
血管内皮生长因子(VEGF)是相当重要的血管生长刺激因子，目前临床中已经得到应用或者仍在实验研究中的药物主要是一些针对VEGF或者其受体(VEGFR)的抗新生血管制剂。包括抑制VEGF表达的VEGF反义寡核苷酸；抑制VEGF受体表达的VEGF受体反义寡核苷酸；中和血循环中VEGF的抗VEGF抗体、可溶性VEGF受体、VEGF Trap、抗VEGFR抗体、酪氨酸激酶抑制剂等，这些制剂在肿瘤治疗中应用广泛。
在开发有效的血管新生抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。
第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76.5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。对于眼表给药，药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质，因此只有具备适当脂溶性、低分子量或能与眼表组织内的转运体(如：氨基酸转运体、寡肽转运体等)结合的药物才能到达前房发挥作用。
第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。
第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，可加大给药的浓度。用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。
第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被先后证实，如血管抑素(angiostatin)可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长，但由于其分子量较大且空间构象复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。
正是由于上述种种条件的限制，目前用于治疗眼部新生血管的药物十分有限，比如重组抗人VEGF单克隆抗体Bevacizumab(Avastin，最初用以治疗转移性结肠直肠肿瘤)、重组抗人VEGF单克隆抗体片段Ranibizumab(Lucentis，)等。虽然这几种药物抑制眼部新生血管的作用已经得到肯定，但它们价格高昂，已报道有多种眼部或全身不良反应，且穿透血眼屏障能力低，给药方式受到限制。
多肽类新生血管抑制剂与目前研究广泛的蛋白类新生血管抑制剂相比具有合成方法简单、容易进行化学修饰、免疫原性低、溶解性好、生物利用率高、组织穿透性强、给药途径多样、价格低廉等突出优势。然而，目前尚没有来自肝细胞生长因子(HGF)的、效果令人满意的小分子多肽。
因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的有效安全的小分子新生血管抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一类适于眼球组织的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐
[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18]-[Xaa19]-[Xaa20]-[Xaa21]    (I)
式中，
Xaa0是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
Xaa1是选自下组的氨基酸：Ile，Leu，Val，Met或Ala；
Xaa2是选自下组的氨基酸：Ile，Leu，Val，Met或Ala；
Xaa3是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa4是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa5是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa6是选自下组的氨基酸：Arg，Lys或Gly；
Xaa7是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa8是选自下组的氨基酸：Tyr或Phe；
Xaa9是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa10是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa11是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa12是选自下组的氨基酸：Val，Leu，Ile，Met或Ala；
Xaa13是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa14是选自下组的氨基酸：Ile，Leu，Val，Met或Ala；
Xaa15是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa16是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa17是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa18是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa19是选自下组的氨基酸：Ile，Leu，Val，Met或Ala；
Xaa20是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa21是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的长度为20-26个氨基酸。
在另一优选例中，所述多肽的长度为20-23个氨基酸。
在另一优选例中，Xaa0和/或Xaa21是1-3个氨基酸构成的肽段。更佳地，Xaa0为C、NC、或RNC；和/或Xaa21为C、CQ或CQP。
在另一优选例中，Xaa1是选自下组的氨基酸：Ile或Leu；
Xaa2是选自下组的氨基酸：Ile或Leu；
Xaa3是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa4是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa5是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa6是选自下组的氨基酸：Arg或Lys；
Xaa7是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa8是选自下组的氨基酸：Tyr或Phe；
Xaa9是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa10是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa11是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa12是选自下组的氨基酸：Val或Leu；
Xaa13是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa14是选自下组的氨基酸：Ile或Leu；
Xaa15是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa16是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa17是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa18是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa19是选自下组的氨基酸：Ile或Leu；和/或
Xaa20是选自下组的氨基酸：Lys或Arg。
在另一优选例中，Xaa6为Gly。
在另一优选例中，所述多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQID NO：1所示氨基酸序列经过1-5个(较佳地1-3，更佳地1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了≥70％的SEQID NO：1的所示多肽的抑制血管新生活性。
在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO：1的相同性≥80％，较佳地≥90％；更佳地≥95％。
本发明还提供了抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多肽。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有：
(a)本发明上述的多肽或其药学上可接受的盐；和
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。
在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。
在本发明的第四方面，提供了一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备用于抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述的与血管新生相关疾病的选自下组：新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger’s病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状病等。
在另一优选例中，所述的新生血管性眼病包括累及脉络膜、视网膜、角膜或虹膜，包括老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜血管阻断性疾病、早产儿视网膜病变、角膜感染、新生血管性青光眼等。
在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物血管新生的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的对象是人。
在另一优选例中，所述的血管新生是与新生血管性眼病相关的血管新生。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了MTS细胞增殖实验中各组OD值均值。
对照组(control)和VEGF组差异有显著性(P＝0.001)，VEGF组和多肽组差异有显著性(P＜0.001)，加入10nM，100nM，1μM，10μM H-KI20后的OD值，呈递减趋势。星号表示该组与VEGF组之间差异具有统计学意义(F＝7.684，P＜0.001)。(con：H-KI20浓度；1：10nM；2：100nM；3：1μM；4：10μM)。
图2显示了Transwell细胞迁移实验中VEGF组和VEGF+不同浓度多肽组通过多孔膜的细胞数量(条柱图)以及VEGF组和加不同浓度的H-KI20组迁移过多孔膜的细胞情况(彩色照片)。
在条柱图中可以看到，多肽组较VEGF组细胞数目明显减少，且随浓度增加呈递减趋势。组间差异具统计学意义(F＝562.3，P＜0.001)。星号表示该组与VEGF组之间差异具有统计学意义。照片中透明的小圆孔为多孔膜的孔，蓝紫色的细胞是被苏木苏着染的通过小孔迁移过滤膜的细胞。
图3显示了内皮细胞体外管腔形成实验中空白对照组、VEGF组和VEGF+不同浓度多肽组每100倍视野形成管腔的平均总长度(条柱图)，以及空白对照组、VEGF组和VEGF+10μM H-KI20组的内皮细胞管腔形成情况(照片)。
在条柱图中可以看到，VEGF+多肽组较VEGF组管腔形成总长度明显下降，且随浓度增加呈递减趋势。组间差异具统计学意义(F＝294.9，P＜0.001)。星号表示该组与VEGF组之间差异具有统计学意义。(con：H-KI20浓度；1：10nM；2：100nM；3：1μM；4：10μM)。
图4显示了PBS组和多肽组鸡胚尿囊膜(CAM)上血管生长情况(彩色照片)以及评估实验中各组CAM血管计数情况(条柱图)。
照片中白色的圆片为滤纸片，黑色的线圈划定的范围为血管计数范围，橙黄色的血管膜为鸡胚尿囊膜，可以看到加有10μg/μlH-KI20的滤纸片周围的血管数目显著少于PBS组。条柱图中control表示对照组(PBS组)，可以看到5μg/μlH-KI20组以及10μg/μlH-KI20组血管数量较PBS组显著下降，且随浓度增加呈递减趋势。星号表示该组与对照组之间差异具有统计学意义(F＝54.762，P＜0.001)。
图5是视网膜新生血管模型的视网膜铺片、眼球切片照片以及对眼球切片中新生血管管腔数目的统计结果(条柱图)。
在正常氧浓度下饲养的对照组幼鼠视网膜血管发育良好，未见无灌注区和新生血管，通过高氧环境诱导的视网膜新生血管模型组幼鼠的视网膜铺片中央可见大面积无灌注区以及新生血管团(椭圆圈标示)，经过玻璃体腔注射H-KI20干预后的视网膜新生血管模型组幼鼠的视网膜铺片中新生血管团数目明显减少。从眼球切片中可以看到，正常组视网膜前未见新生血管管腔，视网膜新生血管模型幼鼠的视网膜前可以看到较多新生血管管腔(黑色箭头所示)，经H-KI20干预后这些新生血管管腔数目显著减少，星号表示该组与VEGF组之间差异具有统计学意义(F＝79.320，P＜0.001)。(con：H-KI20浓度；1：10mM；2：50mM)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类源自肝细胞生长因子(HGF)的、具有抑制血管新生功能的，分子量小于5kD(如仅约2kD)的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，设计了数个候选序列，采用固相法将其合成后，再经鸡胚尿囊膜血管模型、VEGF诱导的细胞株增殖模型和缺氧诱导小鼠视网膜新生血管模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗血管新生功能的小分子多肽。
本发明的小肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，能穿透血眼屏障、可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。
活性多肽
在本发明中，术语“本发明多肽”、“H-KI20多肽”、“H-KI20小肽”、“短肽H-KI20”或“肽H-KI20”可互换使用，都指具有血管新生抑制活性的肽H-KI20氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制血管新生功能的、SEQID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括H-KI20多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)H-KI20多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。
表I
  最初的残基   代表性的取代   优选的取代
  Ala  (A)   Val；Leu；Ile   Val
  Arg  (R)   Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn  (N)   Gln；His；Lys；Arg   Gln
  Asp  (D)   Glu   Glu
  Cys  (C)   Ser   Ser
  Gln  (Q)   Asn   Asn
  Glu  (E)   Asp   Asp
  Gly  (G)   Pro；Ala   Ala
  His  (H)   Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile  (I)   Leu；Val；Met；Ala；Phe   Leu
  Leu  (L)   Ile；Val；Met；Al a；Phe   Ile
  Lys  (K)   Arg；Gln；Asn   Arg
  Met  (M)   Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe  (F)   Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Leu
  Pro  (P)   Ala   Ala
  Ser  (S)   Thr   Thr
  Thr  (T)   Ser   Ser
  Trp  (W)   Tyr；Phe   Tyr
  Tyr  (Y)   Trp；Phe；Thr；Ser   Phe
  Val  (V)   Ile；Leu；Met；Phe；Ala   Leu
发明还提供H-KI20多肽的类似物。这些类似物与天然H-KI20多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。
编码序列
本发明还涉及编码H-KI20多肽的多核苷酸。一种优选的编码序列是atcattggta aaggacgcag ctacaaggga acagtatcta tcactaagag tggcatcaaa  (SEQID NO：3)，它编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，以SEQID NO：1为例，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO：1序列的多肽，但与SEQID NO：3中相应编码区序列有差别的核酸序列。
本发明的H-KI20核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或H-KI20多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
另一方面，本发明还包括对H-KI20DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。
制备方法
本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。
一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF)，在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进-步用分子筛SephadexG10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1，1，3，3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。
在一优选例中，本发明多肽H-KI20，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。
另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的H-KI20多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码H-KI20多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。
药物组合物和施用方法
另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼表、眼周、眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有眼药水、针剂、眼用凝胶和眼药膏。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
例如，眼药水的配制可这样进行：将短肽H-KI20或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，短肽H-KI20或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。此外，短肽H-KI20或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的短肽H-KI20或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为0.1-10wt％，较佳地1-5wt％，每日可2-6次给药，每次1-2滴。
工业应用性
含有本发明多肽或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物，对血管新生有显著的抑制活性。经动物试验证实，本发明多肽不仅可以抑制鸡胚尿囊膜的血管新生，而且可以抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移、趋化及管腔形成，并且可抑制缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明多肽的分子量小，可透过眼组织屏障；
(b)水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；
(c)安全性高，对生物组织毒副作用小；并且眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用；
(d)可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低；
(e)本发明多肽的稳定性好。
因此本发明多肽有望开发成药物，用于治疗新生血管性眼病及相关的新生血管性疾病，如肿瘤新生血管等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
多肽的合成
以人HGF氨基酸序列(SEQID NO：2)为基础，经生物信息学分析和筛选后，选择序列如下的四种T-KI多肽(图1)。
H-KI20：IIGKGRSYKGTVSITKSGIK(SEQ ID NO：1；SEQID NO：2中第129-148位)
H-KA：SEQ ID NO：2中第150-176位；
H-KB：SEQID NO：2中第178-188位；
H-KC：SEQID NO：2中第190-200位；
步骤如下：利用SYMPHONY型12通道多肽合成仪(美国ProteinTechnologies公司)，根据其软件(Version.201版)计算和配制所需要的Fmoc保护氨基酸溶液，缩合试剂和切割试剂。编辑程序，其中树脂溶涨时间为30min；脱保护两次，时间分别为5min和15min；缩合时间为30min；切割时间为2h。开机按照上述程序合成多肽，采用高效液相色谱仪(SHIMADZU公司)纯化多肽，获得纯度＞95％的白色粉末状多肽(每种多肽各制得120mg)，冻干待用。
其中，H-KI20由20个氨基酸残基组成，分子量2093.52D，不含半胱氨酸残基和二硫键。
实施例2H-KI20多肽抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖
(1)人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的体外培养
原代HUVECs(购自ScienCell公司)采用ECM培养基添加ECGS(ScienCell公司)以及5％胎牛血清(ScienCell公司)，培养于37℃、含5％CO2的培养箱中。本发明中所有体外细胞实验均采用第3～8代HUVECs细胞。
(2)MTS方法检测H-KI系列多肽抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖
MTS细胞增殖定量检测方法是一种通过四氮唑和电子偶联化合物在代谢旺盛细胞线粒体脱氢酶的作用下，产生水溶性有色产物，作为检测信号来比色定量测定活细胞增殖的方法。
具体实施方法如下：HUVECs生长接近融合后，传代，按照3.5×104/ml的密度接种于96孔板，每孔100μL，37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，更换无血清ECM培养基，细胞饥饿过夜。吸出96孔板内培养基，各组分别加入含有浓度为1nM、10nM、100nM、1μM、10μM H-KI系列多肽药物的无血清培养基50μL，37℃预处理30min后，各孔加入含有VEGF(R&D公司)的无血清培养基，使VEGF的终浓度为10ng/ml。另设空白对照组(无VEGF无H-KI多肽组)和VEGF对照组(无H-KI多肽组)，每个实验组设置5个平行孔。37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h后，各孔中加入20μLMTS溶液(Promega公司)，37℃作用1～4h，酶标仪(Bio-Rad公司)490nm检测各孔的吸光值。
研究结果：与空白对照组(无VEGF无H-KI多肽组)相比，VEGF组各孔OD值明显增加，并且差异具有统计学意义(LSD法，P＜0.01)，表明10ng/mlVEGF能够有效刺激HUVECs增殖。
与VEGF组相比，H-KA和H-KB多肽在高浓度时的OD值较对照组略有下降，但仅在H-KB高浓度时的OD值与对照组相比有统计学意义的差异(LSD法，P＜0.05)，H-KC多肽在1nM～10μM浓度范围内，各孔OD值无明显改变，差异不具有统计学意义(LSD法，P＞0.05)。H-KI20组100nM、1μM、10μM时各孔OD值明显降低，并且差异具有统计学意义(LSD法，P＜0.01)，表明H-KI20多肽在浓度为100nM、1μM、10μM时能够有效抑制VEGF诱导的HUVECs增殖，并且随着H-KI20多肽浓度的增加，抑制作用逐渐增强。
结论：H-KI20多肽能够有效抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖，并且具有良好的剂量依赖性和序列依赖性。H-KA、H-KB、H-KC多肽不具有明显的抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖作用。
实施例3MTS细胞增殖实验
将RF/6A细胞(猴脉络膜视网膜内皮细胞株，ATCC CRL-1780)接种于96孔板(5×104细胞/孔)，RPMI 1640培养基培养24h后，使细胞血清饥饿过夜，实验组加入多肽(H-KI20)，设置浓度梯度(依次为10nM，100nM，1μM，10μM)，阳性对照组加入重组的人VEGF165100ng/ml(rh-VEGF165，Sigma，St.Louis，MO)，空白对照组不加任何试剂。每组每个浓度做6个复孔。作用24h后，每孔加入20μl MTS(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sul phophenyl)-2H-tetrazolium)assay(CellTiter 96AQ；Promega，Madison，WI，USA)，继续孵育4h，酶标仪490nm下测量吸光度(OD值)。
结果：24h时各组平均OD值如下图1所示，VEGF组的OD值较空白组增高，加入多肽H-KI20后，OD值出现回落，且随多肽浓度升高而逐步下降，OD值组间差异具有统计学意义(F＝7.684，P＜0.001，ANOVA)；空白组、VEGF组、VEGF+10nMH-KI20组、VEGF+100nM H-KI20组、VEGF+1μMH-KI20组、VEGF+10μMH-KI20组的OD值分别为0.461±0.026、0.508±0.026、0.477±0.029、0.469±0.022、0.436±0.010、0.429±0.029，各浓度组的OD值随浓度增加而成下降趋势，表明VEGF的促细胞增殖作用受到多肽抑制。
根据国外已发表文献，在细胞增殖实验(接种浓度是1.5×104细胞/ml)中，HDF的K1的抑制细胞增殖活性随浓度增加最快的范围是57nM---116nM，活性增加缓慢的浓度范围是116nM---925nM，之后随浓度继续增加，活性无明显改变。
与之相比，在本实施例的细胞增殖实验中，所用H-KI20浓度从10nM，100nM，1μM到10μM时，抑制细胞增殖活性增加明显。另外，本实施例中的接种浓度更高(5×105细胞/ml)，因此多肽H-KI20抑制增殖活性远高于K1。
实施例4H-KI20多肽抑制内皮细胞迁移
将含有100ng/ml rhVEGF165的无血清RPMI1640培养基加入24孔板下室，将RF/6A细胞加入上室(Transwell小室，多孔膜孔径8μm，Corning公司)，细胞浓度为4×106细胞/ml，实验组在上室中另加入多肽H-KI20，设置浓度梯度：10nM，100nM，1μM，对照组上室中不加多肽，另设置空白对照组(上室为细胞悬液，下室为不含rhVEGF165的无血清培养基)。每个多肽浓度做两个复孔。37℃5％CO2培养箱中培养24h。棉棒擦去Transwell小室滤膜上方细胞，4％多聚甲醛固定20min，苏木素染色，自来水清洗，揭下滤膜，封片。显微镜下每张膜随机选取5个视野(200倍)，计数细胞。实验重复3次。
RF/6A细胞的迁移能力通过计数迁移过Transwell小室多孔膜的细胞数来检测，在这一实验中，细胞从上室通过多孔滤膜向VEGF浓度高的方向(下室)迁移。在本实验中，通过向上室中加入多肽，抑制细胞向下室迁移。
结果如图2所示，随多肽浓度的增加，迁移的细胞数逐渐减少，VEGF组、VEGF+10nM H-KI20组、VEGF+100nM H-KI20组、VEGF+1μMH-KI20组迁移细胞平均数目依次为76.333±5.354、43.333±3.670、16.500±1.517、1.833±1.169，组间差异具有统计学意义(F＝562.3，P＜0.001，ANOVA)。这说明本发明的H-KI20多肽可以显著地抑制内皮细胞迁移。
实施例5H-KI20多肽抑制内皮细胞体外管腔形成
血管内皮细胞管腔形成实验采用Matrigel(BD公司)联合VEGF诱导管腔形成方法。
具体实施方法如下：将96孔板用基质胶包被(growth factor-reducedMatrigel，BD Biosciences，美国)。多肽组RF/6A细胞与不同浓度的H-KI20(10nM，100nM，1μM，10μM)预处理30分钟后，接种至包被过基质胶的96孔板内，细胞浓度4.5×105细胞/ml。并加入100ng/mlVEGF。另设立空白对照组(不含VEGF和多肽)、VEGF对照组(仅含VEGF)。每组每个浓度设立3个复孔。37℃5％CO2培养箱中培养6h。倒置相差显微镜(Olympus，日本)下观察并拍照。每孔随机取3个视野(100倍)。采用Image-Pro Plus图像分析软件(版本5.1，Media Cybernetics公司，美国)统计每视野下形成管腔的总长度。实验重复3次。
结果如图3所示。100ng/mlVEGF显著刺激RF/6A细胞体外管腔形成。加入浓度逐渐升高的H-KI20后，RF/6A细胞体外管腔形成总长度逐渐下降，表明管腔形成逐渐受到抑制，当H-KI20浓度为10μM时，管腔形成几乎完全被抑制。空白组、VEGF组、VEGF+10nM H-KI20组、VEGF+100nM H-KI20组、VEGF+1μMH-KI20组、VEGF+10μMH-KI20管腔形成平均总长度依次为11.31±1.59mm、23.47±1.18mm、15.66±2.01mm、15.11±0.55mm、10.29±0.92mm、3.78±0.65mm，组间差异具有统计学意义(F＝294.9，P＜0.001，ANOVA)。
该实验结果说明：H-KI20具有抑制血管内皮细胞体外管腔形成的能力，并且具有浓度依赖性。
实施例6H-KI20多肽抑制体内鸡胚尿囊膜新生血管
本实施例采用体内鸡胚尿囊膜(CAM)实验进一步证实H-KI20多肽抑制体内新生血管的作用。
将5ul多肽(实验组，设置浓度梯度25ug/5ul，50ug/5ul)或PBS(对照组)在超净工作台上加至直径5mm的滤纸片(Whatman quant itative filterpapers，Sigma)上并晾干。将受精种蛋清洗消毒后放入孵箱，每日翻动，至胚龄第6日时，将种蛋开窗，并将滤纸片放置于鸡胚尿囊膜上微血管相对稀少的大血管之间，密封开窗口并孵育48小时，显微镜下计数滤纸片周围2.5mm距离的范围内3-5级血管的数目，每组每个浓度设置10只种蛋，统计比较组间差异。
鸡胚尿囊膜(CAM)评估实验是一种评估影响血管生成的小分子物质活性的稳定模型，将含或不含多肽的滤纸片放置于CAM上，孵育48h后拍照计数滤纸片周围小血管数目。
结果如图4所示。PBS组、5ug/ul H-KI20组，10ug/ul H-KI20组血管数目依次为79.430±9.829、48.380±7.308、27.000±9.407。H-KI20多肽组血管数目显著低于对照组，且随多肽浓度增高，血管数目渐降。组间差异具有统计学意义(F＝54.762，P＜0.001，ANOVA)。
上述研究表明：H-KI20多肽能够明显抑制鸡胚尿囊膜毛细血管的生长，并且随着H-KI20多肽剂量的增加，抑制新生血管的作用增强，具有良好的剂量依赖性。
实施例7H-KI20多肽抑制视网膜新生血管的生成
选择鼠龄7天的健康C57BL/6J幼鼠5窝，每窝7-9只(由中国科学院上海实验动物中心提供)。分成5组，每窝为一组。组1：正常对照组，与哺乳母鼠一起在正常空气环境下饲养；组2：氧诱导的视网膜新生血管模型组，组3：PBS注射组；组4与组5为经多肽干预的氧诱导的视网膜新生血管模型组，组2-5与哺乳母鼠一起置于75±2％高氧环境下饲养5天，期间用测氧仪持续监测容器内的氧分压。然后回到正常空气环境下饲养5天以诱导视网膜新生血管的生成。在结束高氧环境饲养的当天，向组2(PBS组)和组3、4(多肽组)的幼鼠左眼行玻璃体腔分别注射PBS和H-KI20(10mM或50mM)，每只眼注射1μl。在鼠龄17天时将各组幼鼠麻醉后行心腔灌注4％多聚甲醛，取出眼球固定，部分眼球用作视网膜铺片以及Alexa Fluor 568 conjugated isolectin B4(Molecular Probes公司)染色以显示视网膜血管，在正置荧光显微镜下拍照用作定性分析；部分眼球用作石蜡切片苏木素伊红染色，在光学显微镜下拍照并统计每张切片中新生血管管腔(定义为生长于视网膜内界膜之前、位于玻璃体腔面的血管腔)的数目。统计分析并比较组间差异。
结果如图5所示。通过对视网膜铺片的定性分析发现，氧诱导的视网膜新生血管模型组较正常环境饲养的对照组有大面积无灌注区以及团状的视网膜新生血管出现(如椭圆圈所示)，注射PBS后无明显变化，而经H-KI20玻璃体腔注射治疗后，新生血管团显著减少。H-KI20治疗组眼球切片中新生血管腔数目较未治疗组明显减少(如箭头所示)，柱状图提示各组的新生血管管腔数目统计结果，组间差异具有统计学意义(F＝79.320，P＜0.001，ANOVA)。
本实验表明：H-KI20能显著抑制氧诱导的视网膜新生血管的生成，并且随着多肽剂量的增加，抑制新生血管作用增强，表明H-KI20具有良好的抑制体内新生血管的作用。
实施例7
眼药水的制备
利用常规技术，混合以下组分，制得1％眼药水，其配方如下：
H-KI20多肽                10mg
羟丙基甲基纤维素          0.03g
无菌水                    加至10ml
调节渗透压至3000sm，酸碱度(pH)至6.8-7.1。
经5位志愿者试用一周，每日3次，每次1滴/眼。结果表明该眼药水可抑制眼部的血管新生。
实施例8
衍生多肽的制备和活性
制备了以下数种衍生多肽，并按实施例2所示的方法，测定各H-KI衍生多肽对VEGF诱导的血管内皮细胞HUVEC的增殖的抑制作用。
衍生多肽1：序列同SEQ ID NO：1，其中第6位Arg被Gly替换
衍生多肽2：序列同SEQ ID NO：1，其中第2位Ile被Leu替换；
衍生多肽3：序列同SEQ ID NO：1，其中第15位Thr被Ser替换；
衍生多肽4：序列同SEQ ID NO：1，其中第4位Lys被Arg替换；
衍生多肽5：序列同SEQ ID NO：1，其中第18位Gly被Ala替换；
衍生多肽6：序列同SEQ ID NO：1，其中在N端的第1位之前添加Cys；
衍生多肽7：序列同SEQID NO：1，其中在C端的第20位之后添加CQP三肽。
结果表明，上述衍生多肽1-7的处理组(100nM)中，HUVEC细胞增殖显著受到抑制。
综上所述，本发明的H-KI20及其衍生多肽均显示良好的抗小鼠角膜病理性新生血管、抗小鼠视网膜病理性新生血管，以及在体外抑制血管内皮细胞增殖、迁移、趋化及管腔形成的作用。因此，具有广泛的应用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure ISA00000208239000011
Figure ISA00000208239000021

Claims (10)

1.一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐
[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18]-[Xaa19]-[Xaa20]-[Xaa21]    (I)
式中，
Xaa0是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
Xaa1是选自下组的氨基酸：Ile，Leu，Val，Met或Ala；
Xaa2是选自下组的氨基酸：Il e，Leu，Val，Met或Ala；
Xaa3是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa4是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa5是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa6是选自下组的氨基酸：Arg，Lys或Gly；
Xaa7是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa8是选自下组的氨基酸：Tyr或Phe；
Xaa9是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa10是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa11是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa12是选自下组的氨基酸：Val，Leu，Ile，Met或Ala；
Xaa13是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa14是选自下组的氨基酸：Ile，Leu，Val，Met或Ala；
Xaa15是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa16是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa17是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa18是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa19是选自下组的氨基酸：Ile，Leu，Val，Met或Ala；
Xaa20是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa21是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的长度为20-26个氨基酸。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaa0和/或Xaa21是1-3个氨基酸构成的肽段。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaa1是选自下组的氨基酸：Ile或Leu；
Xaa2是选自下组的氨基酸：Ile或Leu；
Xaa3是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa4是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa5是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa6是选自下组的氨基酸：Arg或Lys；
Xaa7是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa8是选自下组的氨基酸：Tyr或Phe；
Xaa9是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa10是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa11是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa12是选自下组的氨基酸：Val或Leu；
Xaa13是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa14是选自下组的氨基酸：Ile或Leu；
Xaa15是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa16是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa17是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa18是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；
Xaa19是选自下组的氨基酸：Ile或Leu；和/或
Xaa20是选自下组的氨基酸：Lys或Arg。
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组：
(a)具有SEQID NO：1所示氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
5.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(a)权利要求1所述多肽或其药学上可接受的盐；和
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂、眼用凝胶或眼药膏。
8.如权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备用于抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与血管新生相关疾病的选自下组：新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger’s病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症和肉瘤状病。
10.一种抑制哺乳动物血管新生的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
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