CN102325898A

CN102325898A - 基于pcr的合成核酸分子的方法

Info

Publication number: CN102325898A
Application number: CN2008801328374A
Authority: CN
Inventors: 李孟皇; J·Y·应; 叶红叶
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2012-01-18
Also published as: JP2012512650A; WO2010071602A1; EP2373807A1; US20120122159A9; US20110250649A1; SG172166A1; EP2373807A4

Abstract

提供了一种合成核酸分子的方法，在一方面，该方法包括通过PCR在PCR反应混合物中装配全长模板核酸分子，该PCR反应混合物含有一组具有第一平均解链温度的装配寡核苷酸，和一组具有低于第一平均解链温度的第二平均解链温度的外部扩增引物，其中所述装配包括使PCR反应混合物经历高于第二平均解链温度的第一退火温度；通过PCR在PCR反应混合物中扩增全长模板核酸分子，其中所述扩增包含使PCR反应混合物经历第二退火温度，该温度可使外部扩增引物对全长模板核酸分子退火。

Description

基于PCR的合成核酸分子的方法

发明领域

本发明涉及合成核酸分子的PCR法。

发明背景

从头基因合成是一种建立和修饰基因的强大分子工具。从头基因合成具有广泛用途，包括蛋白质工程改造(1，2)、人工基因网络的开发(3)、以及合成基因组(4-6)的建立。分子生物学技术例如基因克隆，常常牵涉到产生所需基因的PCR步骤，因此需要DNA模板(12)。然而，天然存在的模板DNA出于许多原因并不总是可得的，包括缺乏相关生物来源、有限的环境或考古学样本以及DNA样本的降解或与天然来源生物有关的危害(4)。由于实验室从头合成基因的实现，科学家不再依赖于天然DNA的可用性和可得性。

从头基因合成也实现了基因的精确操作。通过详细限定核苷酸序列，科学家能轻易引入突变、掺入克隆目的的限制性位点、或改变密码子用法以使其与宿主细胞系统的已知密码子偏好匹配(9，13)。这种操作与使用含有天然存在的基因序列的模板相比，能促进基因功能、结构和表达的研究，和改善蛋白质的表达、定位、检测和纯化(10，16)。

基因的化学合成可通过多个寡核苷酸的装配实现。可通过各种方法将寡核苷酸库装配成较大的DNA分子来构建更大的DNA分子，包括基于从头聚合酶链式反应(PCR)(6，7)或连接酶链式反应(LCR)(4，8)的合成方法。在各类方法中，基于PCR的方法似乎是最高效和经济的(16)。

报道最多的合成长DNA分子方法是基于PCR的方法，其依靠使用重叠寡核苷酸来构建基因。已提出了各种方法来尝试优化长DNA序列的PCR法和提高装配准确度。这些方法包括热力学里外平衡(TBIO)法(9)、连续PCR(10)、双重不对称PCR(DA-PCR)(11)、重叠延伸PCR(OE-PCR)(12，13)、基于PCR的两步DNA合成(10，14，15)、和一步基因合成(16)。

基于PCR的已知基因合成方法通常形成比所需基因产物分子量更大的假产物，从而降低了合成产物的纯度(9-12，16-19)。另外，用基于PCR的已知方法不能精确检测成功的基因合成，因此通常用凝胶电泳验证所需PCR产物的生成。凝胶电泳涉及在荧光显像仪的帮助下通过凝胶电泳人工观察全长PCR产物。该方法涉及了额外的设备，是单调乏味的工作，而且与用于开发自动化基因合成的芯片实验室方法并不能良好相容。另外，凝胶电泳只能提供DNA扩增的终点分析，即只能用来观察存在于PCR方法终点的DNA产物。DNA产物的PCR扩增首先是随机的，其次是呈指数上升，最后停滞(28)。

发明概述

本发明提供了合成双链DNA的单一反应方法，包括用化学方法实际上不能合成的较长DNA分子。该方法涉及通过装配重叠寡核苷酸和PCR扩增装配的产物来合成基因或核酸分子，该PCR是使用不同寡核苷酸和退火温度进行PCR装配和扩增过程的单一PCR反应。

通过使用一组平均解链温度比用于扩增所需基因或核酸分子的外部扩增引物平均解链温度高的装配寡核苷酸，本发明的方法减少了PCR装配和PCR扩增过程之间的竞争，这种竞争可能在常规的基因合成的一步PCR装配法中发生，因此能提供更有效准确的方法用于合成长双链基因。

另外，本发明提供了一种通过实时PCR(RT-PCR)装配全长核酸分子的方法，其可能有利于优化有效和准确合成所需基因产物的反应条件，且可实现能与自动化基因合成系统整合的基因产物的自动验证和定性。

在一方面，提供了一种合成核酸分子的方法，该方法包括通过PCR在PCR反应混合物中装配全长模板核酸分子，该PCR反应混合物含有一组具有第一平均解链温度的装配寡核苷酸，和一组具有低于第一平均解链温度的第二平均解链温度的外部扩增引物，其中所述装配包括使PCR反应混合物经历高于第二平均解链温度的第一退火温度；通过PCR在PCR反应混合物中扩增全长模板核酸分子，其中所述扩增包含使PCR反应混合物经历第二退火温度，该温度允许外部扩增引物对全长模板核酸分子退火。

在一个实施方式中，第二退火温度低于或相当于第二平均解链温度。

在多个实施方式中，第一平均解链温度比第二平均解链温度高不少于5℃，或第一平均解链温度比所述第二平均解链温度高约5-25℃。

在多个实施方式中，PCR反应混合物包含一组浓度为约5nm到约80nm或约10到约60nM的装配寡核苷酸。

在多个实施方式中，PCR反应混合物包含一组浓度为约120nm到约1μm或约200到约800nM的外部扩增引物。

在多个实施方式中，装配包括用第一退火温度进行约5-30轮PCR；装配可包括用第二退火温度进行约10到约35轮PCR。

在一些实施方式中，全长模板约长750个碱基对，所述装配包括在退火阶段用第一退火温度进行约15轮PCR，所述扩增包括用第二退火温度进行约15轮PCR。PCR反应混合物包含浓度约10nm的一组装配寡核苷酸，可包含浓度约400nm的一组外部扩增引物。

在多个实施方式中，PCR是实时PCR，PCR反应混合物包含荧光探针，其中荧光强度的增加与全长模板核酸分子的量成线性比例。荧光探针是LCGreen I。该方法还包括根据所检测到的荧光强度优化所述装配。例如，优化包括调节以下之一或更多：(i)变性、退火或延伸的时间或温度；(ii)装配寡核苷酸组或外部扩增引物组的浓度；和(iii)PCR轮数。方法是自动化的。

在另一方面，提供了一种试剂盒，其包含一组可退火形成相邻寡核苷酸对之间具有缺口的长双链DNA的装配寡核苷酸和一组外部扩增引物；其中所述装配寡核苷酸组的平均解链温度比外部扩增引物组的平均解链温度高。

在另一方面，提供了一种合成核酸分子的方法，包括在包含一组装配寡核苷酸的PCR反应混合物中通过实时PCR装配全长模板核酸分子。

如上所述，PCR反应混合物包含荧光探针，其中荧光强度的增加与全长模板核酸分子的量成线性比例。荧光探针是LCGreen I。该方法还包括根据所检测到的荧光强度优化所述装配。例如，优化包括调节以下之一或更多：(i)变性、退火或延伸的时间或温度；(ii)装配寡核苷酸组的浓度；和(iii)PCR轮数。方法是自动化的。

本领域技术人员根据本发明下面特定实施方式的描述以及附图将会明白本发明的其它方面和特征。

附图简要说明

在图中，仅以举例方式说明了本发明的实施方式：

图1。用寡核苷酸解链温度变化的基于PCR方法的基因合成示意图(“自顶至下一步基因合成”)本方法一个实施方式的示意图，称作自顶至下(TD)一步基因合成，在一个反应内联合PCR装配和扩增与设计用于装配和扩增的不同退火温度。在该实施方式中，设计装配寡核苷酸和外部扩增引物的解链温度差大于15℃，以尽可能消除PCR过程中的可能干扰。

图2。一步(共30轮装配/扩增)、TD一步(40轮，20轮装配然后是20轮扩增)和两步(PCA：30轮，PCR：30轮)基因合成的琼脂糖凝胶电泳结果。TD一步法涉及在67℃的退火温度下进行的20轮PCR装配，然后是在49℃的退火温度下进行的20轮PCR扩增，都在同一反应混合物中进行。装配寡核苷酸和外部扩增引物的浓度分别为10nM和400nM。

图3。用1x LCGreenI连续荧光监测实时PCR基因合成。在67℃的退火温度下进行首先的20轮PCR装配，然后在49℃的退火温度下再进行20轮PCR扩增。装配寡核苷酸和外部扩增引物的浓度分别为10nM和400nM。

图4。在成功的基因合成中装配寡核苷酸浓度是关键。合成S100A4(752bp)，用5nM-80nM的各种装配寡核苷酸浓度，前20轮退火温度为67℃，后20轮退火温度为49℃。(a)5nM(◇)、7nM(□)、10nM(△)、13nM(+)、17nM(×)、20nM(○)、40nM(●)、64nM(▲)和80nM(◆)的寡核苷酸浓度下作为PCR轮数函数的荧光。在早期循环和第21到约33轮中荧光强度的斜率分别表示装配和扩增过程的效率。(b)对应琼脂糖凝胶电泳结果。

图5。用60nM到1μM的不同外部扩增引物浓度成功合成了S100A4(752bp)。(a)60nM(◇)、120nM(□)、200nM(△)、300nM(×)、400nM(+)和1μM(○)的外部引物浓度下作为PCR轮数函数的荧光。插图表示前20轮的荧光信号。(b)对应琼脂糖凝胶电泳结果。所需长度的清晰狭窄凝胶条带表明了S100A4的成功合成。

图6。用不同装配轮数(6-20轮)和之后另20轮扩增来合成S100A4。琼脂糖凝胶电泳表明在11轮内实现了全长装配。

图7。用58-70℃的前20轮不同装配退火温度和49℃的后20轮退火温度合成了S100A4(752bp)。(a)58℃(◇)、60℃(□)、62℃(△)、65℃(×)、67℃(+)和70℃(○)的退火温度下作为PCR轮数函数的荧光。插图显示了中间的15轮(13-27)。(b)对应琼脂糖凝胶电泳结果。用严格装配退火温度(＞67℃)获得了较高的合成产率。

图8。SYBR Green I和LCGreen I对S100A4的TD一步实时基因合成的浓度效果(a)0.25x-5x SYBR Green I。在该图中也包括了1x LCGreen I的荧光强度作为比较。SYBR Green I的荧光曲线对PCR轮数不敏感，不能指示基因合成过程中的DNA长度延伸。(b)0.25x-5x LCGreen I。装配和扩增的退火温度分别是58℃和49℃。装配寡核苷酸和外部扩增引物的浓度分别为64nM和400nM。

图9。MgSO₄浓度对于成功基因合成是关键。(a)不同MgSO₄浓度下1xLCGreen I的荧光作为PCR轮次的函数：1.5mM(◇)、2.5mM(□)、3.0mM(△)、3.5mM(×)、4.0mM(●)和5.0mM(○)。(b)对应琼脂糖凝胶电泳结果。通过分别用于装配和扩增的58℃和49℃退火温度、1mM各dNTP、10nM装配寡核苷酸和400nM外部扩增引物进行TD一步基因合成。用4mM MgSO₄的基因合成提供了最佳全长产物得率。

图10。用RT-PCR基因合成产物的分析和解链峰分析。(a)来自一步和两步合成的S100A4的装配产物的解链峰分析；对每组寡核苷酸进行两次测试。用罗氏光循环仪1.5实时热循环机获得装配基因的解链曲线分析结果，其中匀变为72-99℃，0.05℃/秒。(b)装配产物的对应琼脂糖凝胶电泳结果。

表1.装配寡核苷酸数据

表2.一步、两步和TD一步基因合成的PCR条件。

表3.一些报道的最佳基因合成条件。

表4.为S100A4设计的寡核苷酸组。

发明详述

在基因合成的基于PCR的装配方法中，将短寡核苷酸库合并在一起。每个寡核苷酸含有所需核酸序列的有义或反义链的一部分序列。在混合物中，具有重叠互补序列的寡核苷酸退火形成具有双链退火区段和在双链区段一端或两端的单链重叠区段。双链区段的链末端作为延伸引物，而单链区段作为聚合酶反应的模板，产生延伸的双链DNA分子。然后，延伸的DNA分子解链并再次退火，形成新的双/单链DNA分子，然后其又作为新引物/模板，可与其它延伸的互补模板DNA退火，在下一轮PCR循环中形成较长的DNA分子。通过重复该过程，DNA长度逐渐增加，逐步产生所需序列的全长模板。然后通过PCR扩增步骤提高装配的全长模板核酸DNA量。该基因装配PCR法可作为一步法，其在一个反应混合物中使用一组PCR循环来联合PCR装配和PCR扩增，或作为两步法，其涉及装配和扩增阶段的单独反应和PCR循环。一步基因合成法简单快速，因其只需要一次PCR反应，但在同一PCR反应中包含外部扩增寡核苷酸和装配寡核苷酸常常导致低产率，有时还不能生成所需产物。两步法提供了更好的所需产物的产率，但是这类方法需要两次不同的PCR反应，需要介入试剂加入和分离步骤。

如上所述。在前述基因合成的基于PCR的一步装配法中，外部扩增引物与装配寡核苷酸一起混合在同一PCR反应混合物中。一般设计装配寡核苷酸和扩增引物具有一致的解链温度，以随着PCR进程平衡在反应混合中的PCR装配和扩增过程。结果，过量存在的外部扩增引物倾向于与已经被装配过程延伸、但还不是全长模板的寡核苷酸退火，导致相当大部分的外部扩增引物参与最初基因装配过程，从而耗竭了能够在装配后扩增全长模板的外部引物供应。此外，脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)的供应也会被耗竭，PCR反应就在未成熟前就已停滞(17，21)。另外，仅能以正常5’-3’方向延伸的内部装配寡核苷酸也会在扩增PCR中抑制全长基因产物的扩增(13)。装配寡核苷酸和外部扩增引物之间的竞争效应降低了全长基因产物的产率，并导致假产物的形成。这种竞争效应对于具有高GC含量或长度的DNA更关键(9，10)，而且在两步PCR法中消除，因为扩增和装配分别进行，但是维持PCR混合物新鲜以及介入试剂加入和分离步骤会产生额外的花费和消耗额外的精力。

本方法部分基于发现解链温度变动可用于控制基于PCR的基因合成单反应法中寡核苷酸装配和全长模板扩增过程的效率。利用设计成在PCR(其包括至少两个不同退火温度)法中具有不同平均解链温度的装配寡核苷酸和外部扩增引物，从时间上分开装配和扩增过程，从而减少了PCR装配和扩增过程在单一基因合成反应中的相互影响。因此，本发明提供了一种基于PCR的单一基因合成反应，其结合了已知一步法的简单节约和已知二步法中分别装配和扩增的效力。

本方法涉及在单一反应混合物中进行聚合酶链式反应(PCR)，该反应混合物含有一组装配寡核苷酸和一组外部扩增引物，所述装配寡核苷酸组比所述外部寡核苷酸引物组具有更高的平均解链温度。PCR反应在至少两个阶段中进行，第一阶段使用的第一退火温度比外部扩增引物组的平均解链温度高且有利于装配寡核苷酸到模板核酸序列。第二阶段使用的第二退火温度能使外部扩增引物对模板核酸序列退火并扩增全长模板核酸序列。

通过装配寡核苷酸和外部扩增引物的策略设计以及相较外部扩增引物选择适合装配寡核苷酸的不同平均解链温度，能进行本方法所述的基于PCR的基因合成装配法。

因此，在一方面，提供了一种合成核酸分子的方法，该方法包括通过PCR在PCR反应混合物中装配全长模板核酸分子，该PCR反应混合物含有一组具有第一平均解链温度的装配寡核苷酸，和一组具有低于第一平均解链温度的第二平均解链温度的外部扩增引物，其中所述装配包括使PCR反应混合物经历高于第二平均解链温度的第一退火温度；通过PCR在PCR反应混合物中扩增全长模板核酸分子，其中所述扩增包含使PCR反应混合物经历第二退火温度，该温度可使外部扩增引物对全长模板核酸分子退火。

图1是本发明单次反应装配和扩增PCR法的一个实施方式的示意性描述。

PCR方法、条件和试剂在本领域已知(参见例如美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188)。一般，PCR扩增在PCR反应混合物中进行，该混合物含有编码要扩增序列的模板核酸分子，设计与模板上具体互补靶位点退火的引物、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)和DNA聚合酶，全部混合在适当缓冲液中，使得引物对模板退火，并提供DNA聚合酶延伸引物得到新DNA产物所需的条件和任何辅助因子或离子。

简要地，PCR包括使PCR反应混合物经历至少一轮温度变化和预定时间的循环，实现变性、退火和延伸阶段。通常PCR循环的变性、退火和延伸阶段各自在不同的特定温度下进行，本领域已知在热循环仪中进行PCR以获得PCR循环各步骤所需温度。通常在最高温度下进行变性，以解链任何双链DNA(模板或先前循环中的扩增产物)，例如在95℃，使用热抗性DNA聚合酶，如Taq聚合酶。退火阶段在寡核苷酸能够与互补DNA链特异性退火的温度下进行，通常选择能促进特异性退火但减少非特异性碱基配对的温度。应理解，选择精确退火温度取决于PCR反应混合物中所包含的寡核苷酸序列。延伸阶段在适合所用特定DNA聚合酶的温度下进行，使DNA聚合酶合成扩增产物。

在涉及基因装配的基于PCR的基因合成法中，通常在PCR开始前PCR混合物中不提供模板核酸分子。相反，在PCR装配阶段中模板形成是通过重叠装配核苷酸库退火和DNA聚合酶重叠延伸，逐渐合成所需模板的较长片段，最终在多次PCR循环后产生全长不间断的模板，PCR循环次数至少部分依赖于全长模板的长度和用于装配模板的重叠寡核苷酸的数目。

因此，在本方法中，应理解PCR反应混合物包括进行PCR的必需成分(包括dNTP、DNA聚合酶和缓冲液)，在起始反应混合物中提供的模板和引物分别作为装配寡核苷酸组和外部扩增引物组，如下所述。还应理解本文所述的PCR装配和扩增都包括变性、退火和延伸步骤。

应理解，术语“寡核苷酸”指包含至少两个核苷酸的单链核酸分子。用于PCR的寡核苷酸的合适长度已知或能够容易确定。在不同的实施方式中，长度可以是约10-约100个核苷酸。本领域技术人员应理解，可购买或用已知标准程序化学合成寡核苷酸。

本PCR法涉及在单一PCR反应混合物中使用两类寡核苷酸：装配寡核苷酸和外部扩增引物。

装配寡核苷酸组是任意重叠寡核苷酸组，当一起退火时，产生所需核酸序列或基因的全长模板，但沿模板在交替链上有断裂或缺口，断裂或缺口是在一个核苷酸停止和下一个编码相同链序列的寡核苷酸起始处之间。因此，一般设计装配寡核苷酸组覆盖至少一条双链DNA模板两条链长度，从而当一组完整的装配寡核苷酸都在一起退火时，形成退火的双链断裂模板。每一个装配寡核苷酸与一部分所需核酸序列或基因的有义链或反义链互补，每一个装配寡核苷酸与至少另一个装配寡核苷酸部分杂交，从而在PCR装配阶段组装重叠的装配寡核苷酸，形成所需核酸序列或基因的全长模板。

装配寡核苷酸组可设计成产生具有天然存在基因序列的模板，或者设计成在最终模板中引入突变或限制性位点，或改变密码子以适合模板DNA最终要表达的生物中的密码子使用。同样，装配寡核苷酸组可设计成产生新的DNA序列例如编码新融合蛋白的DNA或者插入标记或DNA靶序列或编码蛋白质标记的序列到模板DNA中。

外部扩增引物组是至少两条寡核苷酸组，其作为引物与装配寡核苷酸组组装的全长完整模板的任一链退火。外部扩增引物组在本方法的扩增阶段促进全部或部分全长模板的PCR扩增。在外部扩增引物组中，至少一个引物与双链全长模板的编码(或上方)链的3’末端区域互补，至少一个外部扩增引物与双链全长模板的互补(或下方)链的3’末端区域互补。当在PCR中与全长模板杂交时，外部扩增引物可促进所需核酸序列或基因的所选部分或全部的PCR扩增。

“平均解链温度”指一组寡核苷酸内寡核苷酸(装配寡核苷酸或外部扩增引物)的解链温度的算术平均数，平均解链温度应用于所述寡核苷酸。因此，通过平均所有装配寡核苷酸的解链温度确定装配寡核苷酸的平均解链温度，而通过平均所有外部扩增引物的解链温度确定外部扩增引物的平均解链温度。本领域技术人员应理解寡核苷酸的解链温度是在该温度下50％相同寡核苷酸群会形成稳定双链螺旋，而另50％将分解成单链分子。

设计装配寡核苷酸和外部扩增引物，使得装配寡核苷酸的平均解链温度比外部扩增引物的平均解链温度高，平均解链温度之间的差异足以在单次基于PCR的基因合成反应中减少PCR装配和PCR扩增之间的竞争。寡核苷酸的解链温度取决于许多因素，包括寡核苷酸长度、寡核苷酸的特定核酸序列，如此各装配寡核苷酸的解链温度应该不同且各外部扩增引物的解链温度也应不同。然而，可设计寡核苷酸以最小化装配寡核苷酸的解链温度偏差以及外部扩增引物的解链温度偏差。

可用已知的公式和已知程序包括市售软件，计算任何给定寡核苷酸的解链温度。使用计算机软件设计寡核苷酸在本领域已知(参见例如美国专利申请出版号2008/0182296，19)。寡核苷酸可设计优化用于提高基因表达，并尽可能减少发夹形成和相似解链温度(9，19)。例如，为了设计各寡核苷酸解链温度之间偏差最小的装配寡核苷酸组，可用一种计算机程序，先将所需核酸序列用标记分成大致相等长度的寡核苷酸，然后用配有Santa Lucia的热力学参数(23)的最近邻模型计算重叠区域中解链温度的平均值和偏差，并用盐和寡核苷酸浓度进行校正。然后，可通过移动标记位置来调节寡核苷酸长度，以使得解链温度的偏差最小化。

不受任何特定理论限制，装配寡核苷酸的平均解链温度和外部扩增引物的平均解链温度的差异似乎防止外部扩增引物和装配寡核苷酸中的错配，而且当使用比外部扩增引物平均解链温度高的退火温度时，有效促进模板装配。平均解链温度中的差异不应太小，否则会消除任何不同平均解链温度带来的益处，同时，如果差异过大，装配效率可能会降低。在设计引物时，为了增强特异性，设计外部扩增引物的平均解链温度高于约50℃具有优势。

在一些实施方式中，装配寡核苷酸的平均解链温度与外部扩增引物的平均解链温度之间的差异不小于约5℃，不小于约6℃，不小于约7℃，不小于约8℃，不小于约9℃，不小于约10℃，不小于约11℃，不小于约12℃，不小于约13℃，不小于约14℃，不小于约15℃，不小于约16℃，不小于约17℃，不小于约18℃，不小于约19℃，不小于约20℃，不小于约21℃，不小于约22℃，不小于约23℃，不小于约24℃或不小于约25℃。在特定实施方式中，装配寡核苷酸的平均解链温度和外部扩增引物的平均解链温度之间的差异为约5-约25℃，约7-约19℃。

本领域技术人员将理解，使用本方法，成功基因合成所需装配寡核苷酸与外部扩增引物之间平均解链温度的差异大小变化取决于退火条件例如PCR混合物的pH和盐浓度，以及特定寡核苷酸。例如，减少非特异性寡核苷酸退火可能性的严格退火条件使得解链温度的差异更小。

PCR如上所述分两阶段进行。第一阶段是装配阶段，包括一个或多个变性、退火和延伸的循环，使用的设计退火温度可组装装配寡核苷酸组，但减少外部扩增引物对任何可能存在的可得互补核酸分子退火。尤其是在装配阶段中，退火温度比外部扩增引物的解链温度高，使得装配寡核苷酸可组装到所需核酸序列的全长模板中，同时减少外部扩增引物在该阶段的退火。

如本文所用，术语“退火温度”指PCR过程中使用的温度，使寡核苷酸与DNA互补链形成特定碱基对。通常选择特定寡核苷酸组的退火温度比平均解链温度稍低，例如低约1℃、约2℃、约3℃或约5℃，虽然在一些情况下可能等于或稍高于特定寡核苷酸组的平均解链温度。

例如，可选择基因合成装配阶段的退火温度比外部扩增引物组的平均解链温度高不小于约5℃，不小于约6℃，不小于约7℃，不小于约8℃，不小于约9℃，不小于约10℃，不小于约11℃，不小于约12℃，不小于约13℃，不小于约14℃，不小于约15℃，不小于约16℃，不小于约17℃，不小于约18℃，不小于约19℃，不小于约20℃，不小于约21℃，不小于约22℃，不小于约23℃，不小于约24℃或不小于约25℃。

基因合成的装配阶段的退火温度可以比装配寡核苷酸的平均解链温度稍高。设置装配退火温度高于装配寡核苷酸组的平均解链温度能提供多种优势，包括：？(i)减少装配和扩增反应之间的可能竞争；(ii)减少截短的寡核苷酸参与装配过程的可能性和产生的错误，(iii)提供了一种选择性更高的退火条件，以减少形成二级结构的可能性，和(iv)提高寡核苷酸杂交的特异性，这些所有都防止错误序列的产生，尤其是在高GC含量的基因情况下。应理解一些DNA聚合酶的延伸效力在72℃最高，将本方法中的装配退火温度设置为高于72℃，可能会降低取决于所用DNA聚合酶的装配寡核苷酸组装效率。

用允许外部扩增引物对装配的全长模板退火的扩增退火温度进行PCR扩增阶段，从而扩增部分或所有全长模板，这取决于外部扩增引物设计与模板的何处退火。一般，相较装配寡核苷酸的平均解链温度，扩增退火温度更接近外部扩增引物的平均解链温度。例如，扩增退火温度可小于或等于外部扩增引物组的平均解链温度。

如上所述，PCR条件在本领域公知。应理解成功PCR所需的反应条件包括例如寡核苷酸浓度、dNTP浓度、循环中各步骤的时间，PCR循环次数、DNA聚合酶类型、PCR混合物的pH和盐浓度，根据反应所用特定寡核苷酸和聚合酶而不同(参见例如美国专利申请公开号2008/0182296)。因此，应理解用本方法实现成功基因合成所需的条件会根据所用的特定装配寡核苷酸和外部扩增引物而不同，而且需要对特定反应进行优化。

适合PCR的DNA聚合酶在本领域已知(2，16，41-43)，包括例如Taq DNA聚合酶、PFU DNA聚合酶、热起动DNA聚合酶和ProofStart^TM DNA聚合酶。在一个特定实施方式中，本方法的PCR使用KOD热起始DNA聚合酶(2，16，41)。

在一些实施方式中，成功基因合成所需的PCR反应混合物中装配寡核苷酸组的浓度为约5nM到约80nM，约5nM，约7nM，约10nM，约13nM，约15nM，约17nM，约20nM，约30nM，约40nM，约50nM，约60nM或约80nM。

在一些实施方式中，PCR混合物中外部扩增引物组的浓度为约120nM到约1μM，约120nM，约300nM，约400nM，约500nM，约750nM或约1μM。

PCR装配阶段所需的循环数至少部分取决于寡核苷酸数量、要装配的模板长度和库中寡核苷酸的均一性。为了从均一寡核苷酸长度(n)和重叠大小(s)构建长度(L)的dsDNA分子，所需循环的最小理论次数(x)如下给出：

2^Xn-(2^X-1)s＞L

在一些实施方式中，组装装配寡核苷酸的PCR循环次数为从约5到约30轮，不少于约5轮，不少于约6轮，不少于约10轮，不少于约11轮，不少于约15轮，不少于约16轮，不少于约20轮，不少于约25轮，或不少于约30轮。

在一些实施方式中，扩增全长模板的扩增阶段中PCR循环次数为从约10到约35轮，不少于约10轮，不少于约15轮，不少于约20轮，不少于约25轮，不少于约30轮，或不少于约35轮。

如需要，PCR法可从“热启动”开始，意味着一些试剂未被加入反应混合物，然后在高温下例如95℃短时间孵育，然后加入缺失的试剂。热启动法通过限制DNA聚合酶活性减少PCR最初设定阶段的非特异性扩增，直到寡核苷酸样品被加热至或高于寡核苷酸解链温度。

同样，如需要，最后可在72℃延长孵育来结束PCR法(参见例如美国专利申请公开号2008/0182296)。

在本发明的一个实施方式中，PCR法包括在PCR反应中提供10nM平均解链温度为约65℃的装配寡核苷酸、400nM平均解链温度为约50-约55℃的外部扩增引物，温度设定如下：95℃初始变性2分钟；然后是15轮的95℃5秒，67-70℃30秒，72℃30秒；然后是15轮的95℃5秒，50-55℃30秒，72℃30秒；最后72℃延伸10分钟。

在另一个实施方式中，在PCR反应的装配阶段提供了90秒退火步骤，从而该PCR反应包括：95℃初始变性2分钟；然后是15轮的95℃5秒，67-70℃90秒，72℃30秒；然后是15轮的95℃5秒，50-55℃30秒，72℃30秒，最后72℃延伸10分钟。

本方法可用于合成所需核酸分子或基因，包括长和短基因以及编码部分基因序列的核苷酸分子。用本方法产生的核酸分子可用于各种目的，包括但不限于构建重组DNA、优化密码子以提高特定宿主中的基因表达，突变启动子或转录终止子，以及产生用于无细胞或体外蛋白质合成的DNA。

本方法合成的核酸分子可用于表达所合成核酸分子编码的多肽或蛋白质。例如，本方法合成的核酸序列可用于重组蛋白质表达、构建融合蛋白和体外诱变。蛋白质在多种领域具有广泛有价值的应用，包括医学、药学、研究和工业。体外蛋白表达的标准方法在本领域已知。例如，一种方法是涉及使用表达载体如质粒或病毒载体的重组蛋白质表达，其含有合成的核酸序列以在合适宿主细胞中实现蛋白质表达。

如上所述，实现基因合成的优化条件随着寡核苷酸不同而不同。因素如退火温度、寡核苷酸浓度和PCR循环数可以影响PCR法的成功，因此需要检测和定量合成产物以优化条件。迄今，还没有方法能准确预测用特定寡核苷酸组基于PCR法实现成功基因装配的条件。验证基于PCR法的基因装配一般是通过凝胶电泳观察最终PCR产物。使用该方法，基因装配的验证被延迟到了PCR终点，不能在各PCR循环后定量测定基因合成的效率。

实时PCR(RT-PCR)是一种已知的技术，涉及在每一轮PCR后使用荧光定量DNA扩增，从而可连续监测整个PCR过程中的PCR产物。(28).通常对于RT-PCR，通过在PCR混合物中加入荧光标记进行PCR反应。每一轮PCR循环后，测定混合物中的荧光水平以定量生成的DNA双链产物量。用于RT-PCR的荧光标记在本领域已知，包括序列特异性RNA或DNA荧光探针以及双链DNA特异性染料(28)。通常用RT-PCR监测模板DNA的基因扩增，例如用于疾病诊断(7-8)。然而迄今为止，RT-PCR尚未用于基因装配。

本发明人发现，在基因装配过程中使用RT-PCR法能优化条件，包括装配循环的次数和长度。因此，在基因合成法中进一步考虑了使用实时PCR(RT-PCR)。

因此，本文提供了一种方法，其包括用RT-PCR在PCR混合物中装配全长模板核酸分子，该混合物含有一组装配寡核苷酸。可选择荧光探针，使得基因装配过程中检测到的荧光强度与长度以及全长DNA模板分子的数量成线性关系。

该方法能优化基于PCR的基因合成法的条件，验证所需核酸分子的合成，或确定合成产物的性质。另外，使用RT-PCR能将这种优化、验证和定性整合入基因合成的自动化方法。

因此，通过监测RT-PCR基因装配反应中的荧光强度，可以确定每轮循环后装配的全长DNA模板量，并看到调节反应循环中变性、退火、延伸温度，变性、退火、延伸部分的长度以及进行的循环轮数的效果。如此，可制得最佳数量的已装配DNA模板。

通过提供具有特定性质的荧光标记和优化这些标记的浓度，RT-PCR可用于监测和定量基于PCR的基因装配合成的产物。在基因合成的RT-PCR中，使用同样结合短和长双链DNA分子的荧光标记使得整个基因装配中检测到的荧光强度与全长装配的DNA模板分子的长度以及数量成线性比例。

RT-PCR通常用双链DNA特异性染料SYBR Green I进行。然而，该染料优选结合长DNA片段(25，26)，而且倾向于从短DNA分子重新分布到更长DNA分子。在基于PCR的基因合成的装配步骤中，PCR混合物含有不同长度的双链DNA分子。因此，在热循环过程中，与较短DNA片段结合的SYBR Green I染料会转移到合成出的较长DNA分子上(27)，因此不反映准确的基因装配法结果。如此，SYBRGreen I在和基于PCR的基因合成法联用时，不是RT-PCR的适当荧光染料。尽管合成的DNA分子长度增加，用SYBR Green I检测到的荧光强度在整个装配步骤的PCR循环中都保持相对不变。因此，先前基因装配技术不能使用RT-PCR。

本发明人发现了可选择RT-PCR的合适荧光标记，其有利于联合RT-PCR定量与基因装配法，以优化基因装配PCR法。用于在基因装配过程中进行RT-PCR的荧光标记对双链DNA的亲和性应高于单链DNA，且在热循环中不从较短DNA分子重新分布到长DNA分子。

用于在基因装配中进行RT-PCR的特定荧光染料可包括例如LCGreen I(24)。

另外，与常规PCR相比，可优化所用荧光标记量以考虑基于PCR的基因合成法中存在的大量起始DNA分子。基于PCR的基因合成法中存在的起始DNA分子数量可以比常规PCR扩增法高6个数量级。可增加用于进行RT-PCR基因合成的荧光染料量，以实现合成DNA分子的检测。例如，可通过提供荧光染料包括LCGreenI进行基因合成，其浓度是标准PCR扩增法中正常提供浓度的两倍。

通过使用RT-PCR进行基因合成的PCR基因装配法，提供了优化基因合成的方法。在整个装配和扩增步骤中连续监测PCR产物有助于确定特定寡核苷酸组的基因合成的最佳条件。例如，用RT-PCR进行的基因装配PCR法可确定完成模板装配所需的最佳循环数，从而能够缩减PCR法，省去可能导致假产物产生(32)的不必需的额外PCR循环。在另一个实施例中，基于RT-PCR的基因装配法可用于确定有效组装装配寡核苷酸的最佳退火温度。另外，RT-PCR基因装配法能够在每一轮PCR循环后验证基因合成产物，因此验证不再需要延迟到完成PCR后。

另外，当用RT-PCR进行基因合成时，可通过DNA解链曲线分析确定合成产物的特征。DNA解链曲线分析联合RT-PCR和DNA解链模拟软件(31，39)可用于估计PCR产物的纯度和数量。进行DNA解链曲线分析的方法在本领域已知(25)，通常涉及检测荧光水平，同时缓慢加热PCR产物，以确定解链温度。由于各双链DNA都具有其特定的解链温度，本领域技术人员应理解使用本方法的成功基因合成将得到具有单一清晰的解链峰的产物，而不完全合成会产生一条宽解链曲线。另外，荧光相对温度的负导数中解链峰的积分面积可确定所需全长产物的数量(38)。

RT-PCR不再需要用人工观察凝胶电泳来验证基因合成和对合成产物定量定性。因此，在基因合成中使用RT-PCR可使用自动化方法来优化基因合成和验证及鉴定合成产物。例如，基因装配步骤中循环次数的优化可以自动化，从而当检测到指示所需序列的全长核酸分子装配的荧光水平时，热循环仪可自动切换到基因合成的扩增步骤。指示特定核酸分子完整装配的荧光水平可预先用RT-PCR确定。在另一个实施例中，RT-PCR的使用实现了解链曲线分析，其可用自动化方法例如计算机程序进行，从而能将合成产物的自动化鉴定整合入自动化基因合成系统，包括例如，芯片实验室法(美国临时申请号60/963,673)。

如上所述，可在基于PCR的本单反应混合物基因合成法中使用RT-PCR。另外，本文所述的RT-PCR法也可用于其它基于PCR的基因合成法。例如，可用RT-PCR优化已知的一步或两步的基于PCR的基因合成法并使其自动化。

还考虑了试剂盒和市售包装，其如上所述组合了一组扩增核苷酸和一组外部扩增引物，外部扩增引物组的平均解链温度比装配寡核苷酸组的平均解链温度低。

本发明的方法用以下非限制性实施例进一步举例说明。

实施例

材料和方法

用于基因合成的寡核苷酸设计

选择人钙结合蛋白A4的启动子基因序列(S100A4，752bp，chrl：1503312036-1503311284)(22)用于经装配PCR合成。从客户开发的程序获得装配寡核苷酸，其首先将给定的序列用标记分成大约相等长度的寡核苷酸，用带Santa Lucia的热力学参数(23)的最近邻模型计算重叠区域中解链温度的平均值和变化，用盐和寡核苷酸浓度校正。然后，通过移动标记位置调节寡核苷酸长度，使得总体重叠解链温度的差异最小。表1显示了装配寡核苷酸组的概况，详细的信息如表4所示。

非竞争性一步实时基因合成

用罗氏光循环仪1.5实时热循环机进行实时PCR，优化非竞争性一步法，其中温度转变为20℃/s。用20μl反应混合物进行实时基因合成，该混合物包含1x PCR缓冲液(Novagen)、1μl 0.25x-5x SYBR Green I(1x＝1/20,000稀释度；Invitrogen)或LCGreen I(Idaho Technology Inc.)、4mM的MgSO₄、1mM各dNTP(Stratagene)、500μg/ml牛血清白蛋白(BSA)、5-80nM装配寡核苷酸、60nM-1μM外部扩增引物和1U KOD Hot Start(Novagen)。用以下条件进行PCR：95℃起始变性2分钟；20轮的95℃5秒，58-70℃30秒，72℃30秒；然后是20轮的95℃5秒，49℃30秒，72℃30秒；最后72℃延伸10分钟。脱盐寡核苷酸购自Research Biolabs(新加坡)和Proligo(新加坡)，不经额外纯化。

一步和两步基于PCR的基因合成

通过PCR进行常规基因合成，用将PCR装配和扩增联合在单一阶段中的一步法，或用装配和扩增为独立阶段的两步法。全部PCR反应，不论是装配或扩增都以0.2ml标准PCR试管进行，使用市售热循环仪(DNA引擎PCT-200，Bio-Rad)，使用与非竞争性一步PCR相同的装配寡核苷酸组和外部扩增引物。用50μl反应混合物进行一步法，该混合物其包括1x PCR缓冲液(Novagen)、4mM MgSO₄、1mM各dNTP(Stratagene)、500μg/ml BSA、10nM装配寡核苷酸、400nM外部扩增引物和1U KOD Hot Start(Novagen)。用以下条件进行一步PCR：95℃起始变性2分钟；30轮的95℃5秒，58℃30秒，72℃30秒；最后72℃延伸10分钟。除了寡核苷酸的浓度和退火温度，两步法的PCR方案基本与一步法相同。对于PCR装配，使用10nM装配寡核苷酸，不加入扩增引物。对于基因扩增，将2μl装配产物稀释于25μl扩增反应混合物中，其中外部扩增引物浓度为各400nM，使用49℃的退火温度。三类基因合成的PCR条件如表2所概括。表3列出了一些报道的最佳基因合成条件。

琼脂糖凝胶电泳

通过1.5％琼脂糖凝胶(NuSieve

GTGCambrex公司)分析合成产物，用溴乙锭(Bio-Rad实验室)或SYBR Green(Invitrogen)染色，用Typhoon 9410可变显像仪(Amersham Biosciences)观察。在100V下以100bp梯度(新英格兰)和5μlDNA样品进行凝胶电泳45分钟。

结果

TD一步基因合成的表现

用TD一步法和常规两步法成功实现了基因合成，而用常规一步PCR法未获得明显的全长基因产物，如凝胶电泳所示(图2)。TD一步法用67℃的退火温度(Tah)(装配寡核苷酸的平均Tm＝66℃)进行前20轮，然后用49℃的退火温度(外部扩增引物的平均Tm＝50.1℃)再进行20轮。连续荧光监测揭示了基因合成过程的效率(图3)。与PCR扩增的指数性质不同，装配效率本质上更象线性。

用实时基因合成的基因合成表现

研究了两种插入荧光染料(SYBR Green I和LCGreen I)的实时基因合成(图8)。LCGreenI(24)更适合研究实时基因合成。LCGreenI的荧光光谱与实时PCR中常用的SYBR GreenI相似，对大部分实时热循环仪兼容。SYBR GreenI优选结合长DNA片段(25，26)，并在热循环过程中从短DNA分子重新分布到长DNA分子(27)。这使得分析荧光信号较难，因为PCA混合物含有不同长度的dsDNA。如图8(a)所示，PCR过程中荧光强度保持不变。相反，使用LCGreen I提供了荧光强度曲线，其显示了随着装配反应进行，合成的DNA分子数量增加长度延伸(见图8(b))。

DNA分子在PCA混合物中的起始数量比标准PCR扩增(＜106个拷贝的模板DNA)大很多(约6pmol；10nM x 20μl x 30寡核苷酸)，＞6个数量级(28)。对该因素调节了实时PCR条件。研究了LCGreen I的最佳浓度，标准PCR中使用的浓度增加到2倍(图8)。dNTP浓度从标准PCR的各0.2mM调节到各1mM，以防止dNTP耗竭。基于dNTP浓度经验优化Mg²⁺离子(MgSO₄)浓度，前者可与Mg²⁺螯合，并影响聚合酶活性(29，30)。？(图9)。对于使用0.2mM各dNTP的标准PCR，厂商的推荐Mg²⁺离子浓度为1.5mM。

实时基因合成的分析

机械合成基因分几个阶段发生，如PCR循环轮数中的斜率变化所示(图4)。该现象在装配寡核苷酸浓度为10-20nM时很明显。在PCA的早期循环中，大部分配对寡核苷酸之间的退火形成可延伸二倍体，其可通过聚合酶延伸(阶段1，循环＜7)。荧光信号揭示了每一轮DNA长度延伸的线性增加。与Wu等(16)和Lee等(21)报道的相反，装配效率随着进一步的PCR循环(阶段2；循环7-14)增加。我们猜测随着全长片段出现，装配过程倾向全长模板扩增，且由过量外部引物促进。然后，PCA反应到达第一个平台(阶段3；循环15-20)，其中升高的退火条件(Tah-Tm＝15℃)限制了外部引物。在第21轮，退火温度降低到49℃以匹配引物的Tm(阶段4，循环21-29)。指数扩增增强，导致荧光信号的突然提高。最终，过程到达第二个平台，这可能是由于外部引物耗尽或非特异性产物退火(阶段5)。由于寡核苷酸装配效率低导致的低寡核苷酸浓度(＜7nM)，该平台阶段可能会延迟或完全缺失。

对于装配寡核苷酸大于64nM的基因合成，PCR法在15轮内到达平台。额外的循环最可能倾向非特异性PCR，导致在凝胶电泳中产生假条带并形成高分子量的产物(图4b)，如大部分报道的基因合成结果所示(9-12，16-19)。一致的凝胶结果和实时PCR曲线提示，TD基因合成的最佳装配寡核苷酸浓度是10-20nM，其与一步(16，17)和两步(18)法都一致。

通过外部扩增引物的浓度从60nM-1μM变化而装配寡核苷酸浓度维持在10nM来进一步研究外部扩增引物的效力。用400nM外部扩增引物获得最高全长数量(图5)，这与一步(16)和两步(18)法中观察到的一致。由荧光增加的斜率表示的装配效率在早期循环中是不变的(＜循环7)，尽管外部扩增引物浓度变了16倍(图5a中的插图)。这证明了TD法的非干扰性质，其中外部扩增引物不影响装配过程。随着全长产物的出现，装配效率在第8轮循环左右开始偏移，倾向全长模板扩增。与主导装配反应并对成功基因合成有关键影响的装配寡核苷酸浓度不同，外部扩增引物的浓度并不太关键。它可能控制后期扩增过程和所需DNA的数量。？最佳PCR循环取决于最初装配寡核苷酸浓度和靶基因长度。对装配寡核苷酸浓度的试验清楚证明了这一点(图4)。随着装配寡核苷酸浓度从20nM增加到80nM，全长条带逐渐消失，变得越来越宽。

重叠装配是平行过程。完成装配仅需要相对较少的PCR循环。为了从均一寡核苷酸长度(n)和重叠大小(s)构建长度为(L)的dsDNA分子，所需循环的最小理论次数(x)如下给出：

2^Xn-(2^X-1)s＞L

理论上6轮PCA足以从40聚寡核苷酸(具有20个核苷酸重叠)库装配S100A4(752bp)。为了确定过量循环对基因装配是否必要，在先前试验中确定的最佳条件用于6-20轮不同PCA循环，然后是20轮扩增循环。基因合成相当有效。实际上，在11轮PCA循环内实现了全长装配(图6)。

如凝胶结果和荧光信号中观察到的，基因合成对装配退火温度(Tah)从58-70℃的变化不明显(图7)。荧光强度曲线在装配阶段(起始的13轮循环)对退火温度不加区别，仅在第一阶段后开始偏离(见图7a中的插图)。前13轮循环中荧光强度不变提示外部扩增引物不影响装配反应。设计外部扩增引物的平均Tm为50.9℃，意味着引物在PCA过程中面临的退火严格为7.1-19.9℃(Tah-Tm)。这表示解链温度窗口(引物和寡核苷酸的ΔTm)可以减少到7.1℃，确保TD基因合成法的非竞争特性。有趣的是，用比装配寡核苷酸平均Tm(66℃)高的严格退火温度(＞67℃)获得更高产率的所需DNA。

合成的DNA分子的解链曲线分析

对常规一步和两步基于PCR的基因合成装配法中用RT-PCR合成的产物进行解链曲线分析(图10)。成功合成在解链曲线中产生单一的尖解链峰，其对应二步法在凝胶电泳中的明显条带。相反，对于一步法，解链曲线较宽，表明产物是具有中间长度的DNA分子混合物，如模糊的凝胶电泳所示。一步产物主要是长度约200-300个碱基对的不完整产物。

本说明书引用的所有出版物和专利申请以引用的方式并入本文中，就如各出版物或专利申请特定和单独地以引用的方式并入本文中。任何出版物的引用针对提交日之前的公开且不应解释为承认本发明通过先前的发明不具有先于这些出版物的权利。

本说明书中以百分比形式提供的浓度，包括重量/重量(w/w)、重量/体积/v)和体积/体积(v/v)。

如本说明书和所附权利要求书所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文中另有明显表示。如本说明书和所附权利要求书所用，术语“包含”“含有”“包括”以及这些术语的其他形式意味着非限制性包含的意义，即，包括具体引用的元素或成分，但不排除任何其它元素或成分。除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。

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Claims

1.一种合成核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括：

通过PCR在PCR反应混合物中装配全长模板核酸分子，该PCR反应混合物含有一组具有第一平均解链温度的装配寡核苷酸，和一组具有低于第一平均解链温度的第二平均解链温度的外部扩增引物，其中所述装配包括使PCR反应混合物经历高于第二平均解链温度的第一退火温度；

通过PCR在PCR反应混合物中扩增全长模板核酸分子，其中所述扩增包括使PCR反应混合物经历第二退火温度，该温度可使外部扩增引物对全长模板核酸分子退火。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二退火温度低于或等于所述第二平均解链温度。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一平均解链温度比第二平均解链温度高不低于5℃。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一平均解链温度比所述第二平均解链温度高约5-约25℃。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR反应混合物包含一组浓度为约5nm到约80nm的装配寡核苷酸。

6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR反应混合物包含一组浓度为约10nm到约60nm的装配寡核苷酸。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR反应混合物包含一组浓度为约120nm到约1μm的外部扩增引物。

8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR反应混合物包含一组浓度为约200nm到约800nm的外部扩增引物。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述装配包括用第一退火温度进行约5到约30轮PCR。

10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增包括用第二退火温度进行约10到约35轮PCR。

11.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述全长模板约长750个碱基对，所述装配包括在退火阶段用第一退火温度进行约15轮PCR，所述扩增包括用第二退火温度进行约15轮PCR。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述PCR反应混合物包含浓度约10nm的一组装配寡核苷酸。

13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述PCR反应混合物包含浓度约400nm的一组外部扩增引物。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR是实时PCR。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述PCR反应混合物包含荧光探针，其中荧光强度的增加与全长模板核酸分子的量成线性比例。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述荧光探针是LCGreen I。

17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括根据所检测到的荧光强度优化所述装配。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述优化包括调节以下之一或更多：

a.变性、退火或延伸的时间或温度；

b.装配寡核苷酸组或外部扩增引物组的浓度；和

c.PCR轮数。

19.如权利要求14-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是自动化的。

20.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含一组可退火形成相邻寡核苷酸对之间具有缺口的长双链DNA的装配寡核苷酸和一组外部扩增引物；其中所述装配寡核苷酸组的平均解链温度比所述外部扩增引物组的平均解链温度高。

21.一种合成核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括在包含一组装配寡核苷酸的PCR反应混合物中通过实时PCR装配全长模板核酸分子。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述PCR反应混合物包含荧光探针，其中荧光强度的增加与全长模板核酸分子的量成线性比例。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述荧光探针是LCGreen I。

24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括根据所检测到的荧光强度优化所述装配。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述优化包括调节以下之一或更多：

a.变性、退火或延伸的时间或温度；

b.装配寡核苷酸组的浓度；和

c.PCR轮数。

26.如权利要求21-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是自动化的。