CN102316898A

CN102316898A - 抗cd147抗体、方法和用途

Info

Publication number: CN102316898A
Application number: CN2009801392784A
Authority: CN
Inventors: M·R·坎宁安; B·斯温基-昂德伍德; Y·唐; L·颜
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2008-09-29
Filing date: 2009-08-19
Publication date: 2012-01-11
Also published as: JP2012506369A; AU2009296937A2; JP5564049B2; US20140079711A1; EP2334330A4; EP2334330A2; WO2010036460A3; WO2010036460A2; AU2009296937B2; AU2009296937A1; US20110200627A1; CA2737519A1; US8618264B2

Abstract

本发明提供对人CD147具有免疫特异性的抗体，所述抗体能够阻断与恶性疾病相关的CD147的生物活性，所述生物活性为例如通过肿瘤细胞对来自成纤维细胞的MMP的刺激、VEGF的释放以及血管生成的促进。本发明的抗体可用于治疗恶性疾病以及CD147活性发挥致病作用的那些疾病，例如眼、肺和心血管系统的疾病。

Description

抗CD147抗体、方法和用途

背景技术

优先权申请

本专利申请要求提交于2008年9月29日的美国专利申请No.61/100,848的优先权，该美国专利申请全文以引用方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及抗CD147抗体和它们作为治疗剂的用途。

相关领域

CD147为免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，其在各种组织中的大量不同细胞上表达。它最初命名为人Basigin(对基础免疫球蛋白超家族的命名)，并在约1991年首次克隆。(Miyauchi等人，《生物化学杂志》(J Biochem)(东京)110：770-774(1991)；Kanekura等人，《细胞结构和功能》(Cell.Struct Funct)16：23-30(1991)；Miyauchi等人，生物化学杂志(J Biochem)(东京)110：770-774(1991))。bsg基因产物CD147，也称为EMMPRIN(“细胞外基质金属蛋白酶诱导因子”)同种型II(NCBI登录号NP_940991)，为长度为269个氨基酸的多肽原(SEQ ID NO：1，图1)，其具有长度为22或24个氨基酸的信号肽，183个氨基酸的胞外域，从第208位残基至第228位残基的跨膜域，以及从第229位残基至第269位残基的胞内域。根据经过审核的NCBI记录，胞外域(ECD)由两个免疫球蛋白样结构域组成：从第22位残基至第103位残基的C2型结构域和从第105位残基至第199位残基的V样结构域(图1)。还报道了多个剪接变体。

CD147为功能多样的分子，其在胎儿发育、视网膜功能以及T细胞成熟中起作用。已显示它为亲环素的细胞表面受体。它表达于组织重构的区域中：肿瘤、子宫内膜、胎盘、皮肤和血管生成区域(参见Iacono等人，2007年，《实验与分子病理学》(Exp Mol.Path)83：283-295)，并且刺激基质金属蛋白酶(MMP)和VEGF的生成。CD147在单核细胞分化时诱导并且表达于人动脉粥样硬化斑块中(Major TC、Liang L、Lu X、Rosebury W、Bocan TM，2002年，《动脉硬化，血栓形成与血管生物学》(ArteriosclerThromb Vasc Biol.)22：1200-1207)。已显示，CD147通过诱导MMP，并且通过癌周间质细胞旁的尿激酶型纤溶酶原激活系统，促进不同肿瘤类型的侵袭和转移。CD147还涉及血管生成、抗失巢凋亡、乳酸外排、多药耐药性以及癌细胞中的细胞增殖。CD147过量表达和/或功能与其他病理过程，例如炎症反应、肺纤维化、类风湿性关节炎、红斑狼疮、心力衰竭、阿尔茨海默病以及淋巴细胞中的人类免疫缺陷病毒和冠状病毒的侵染循环有关。(参见Ruiz等人，J.《生物化学》(Biol.Chem.)，第283(9)卷，5554-5566，2008)。此外，CD147的裂解和CD147片段的脱落可能涉及CD147活性片段的调节或释放(Egawa等人，2006，《生物化学》(J Biol Chem)281(49)：37576-85)。

抗CD147抗体已有报道。鼠抗体IgM Mab，CBL1(Billings等人，《杂交瘤》(Hybridoma)1：303-311，1982；美国专利No.5330896和5643740)在耐类固醇的急性移植物抗宿主病中进行了检测(Heslop等人，《柳叶刀》(The Lancet)346：805-806；Deeg等人，2001《血液》(Blood)98：2052-8)。还开发了在ECD的跨膜域附近结合到与CBL1(aka ABX-CBL)的表位重叠的表位的类似人Mab(US2007048305A1)。(Koch等人(InternatImmunol 11(5)777-786，1999)绘出了与T细胞和B细胞激活相关的CD147表位的图谱，公布按照CD147制备的一组抗体中只有最高亲和力的单克隆抗体(MEM-M6/6)能通过MAB抗CD3、OKT3而有效阻止人T-细胞激活和增殖。已证实肿瘤细胞衍生的人CD147、EIIF4的小鼠抗体(Ellis，1989《癌症研究》(Cancer Res)49：3385-91；Biswas等人，Cancer Research 55，434-439，1995)能够阻断来自人成纤维细胞的肺癌CD147诱导的胶原酶(基质金属蛋白酶-1或MMP-1)活性。在制备缺失N端lg结构域的突变型ECD时，显示出EIIF4抗体与CD147的结合丧失(Biswas，C.等人，《癌症研究》(Cancer Res)55，434-439，1995)。Ku等人(Scan J Immunol 65(5)435-443，2007)鉴别了描述为CD147相关的MMP轴抑制剂的MAB，并且通过使用截短的CD147序列鉴别了CD147 MMP诱导活性相关的N端关键残基(²²A至⁵⁰V)。

因此，虽然CD147的特定抗体和其他拮抗剂是已知的，但包括两个免疫球蛋白结构域的所述蛋白的复杂性如何影响各种生物活性还未彻底阐明。对于治疗与在各种组织上的CD147展示和/或激活相关的各种疾病而言，结构域特异性拮抗剂可能证实为有用的治疗候选剂。例如，能阻断CD147诱导MMP或VEGF活性产生的治疗剂在癌症治疗中可能是有利的。

因此，需要提供向人CD147提供具有特异性的人抗体，以在治疗中使用来减轻或消除CD147依赖性疾病的症状，以及获得优于已知抗体或其片段的改善。

发明内容

本发明提供能够阻断与CD147相关的一个或多个生物活性相关的活性的抗CD147单克隆抗体，所述活性包括但不限于血管生成、VEGF的产生、基质金属蛋白酶的产生(MMP-1、MMP-2和MMP-9)，并且所述抗体在人CD147上具有特异性结合位点。

本发明的一个方面为与人CD147蛋白反应分离的抗体，所述人CD147蛋白具有单克隆抗体的抗原结合能力，所述单克隆抗体具有如在SEQ IDNO：9、11、13和15中所示的轻链互补决定区(CDR)的氨基酸序列，和如在SEQ ID NO：10、12、14和16中所示的重链CDR的氨基酸序列。

本发明的另一个方面为与CD147蛋白表位反应的分离的抗体，CD147蛋白表位位于SEQ ID NO：1表示的CD147蛋白第65-75位残基。

本发明的另一个方面为具有重链CDR1、CDR2和CDR3(Hc-CDR1、Hc-CDR2和Hc-CDR3)氨基酸序列以及轻链CDR3(Lc-CDR3)的分离的抗体，所述氨基酸序列分别选自以SEQ ID NO：10、12和14示出的序列，所述轻链CDR3如化学式(I)所示：

Gln Gln Xaa₁ Tyr Ser Xaa₂ Pro Xaa₃ Thr

(I)其中Xaa₁为Tyr或Asp；Xaa₂为Tyr或Ser；Xaa₃为Phe或Tyr或无；以及Xaa₄为Thr或Phe；以及轻链CDR1(Lc-CDR1)和轻链CDR2(Lc-CDR2)氨基酸序列，所述序列分别选自SEQ ID NO：9和11中所示的序列。

本发明的另一个方面为分离的抗体，其具有Hc-CDR1、Hc-CDR2和Hc-CDR3的以SEQ ID NO：10示出的氨基酸序列，以及以SEQ ID NO：9所示的Lc-CDR1、Lc-CDR2和Lc-CDR3氨基酸序列分离的抗体。

本发明的另一个方面为具有以SEQ ID NO：12显示的Hc-CDR1、Hc-CDR2和Hc-CDR3氨基酸序列以及以SEQ ID NO：11显示的Lc-CDR1、Lc-CDR2和Lc-CDR3氨基酸序列的分离抗体。

本发明的另一个方面为具有以SEQ ID NO：14显示的Hc-CDR1、Hc-CDR2和Hc-CDR3氨基酸序列以及以SEQ ID NO：13显示的具有Lc-CDR1、Lc-CDR2和Lc-CDR3氨基酸序列的分离的抗体。

本发明的另一个方面为具有以SEQ ID NO：16显示的Hc-CDR1、Hc-CDR2和Hc-CDR3氨基酸序列以及以SEQ ID NO：15显示的Lc-CDR1、Lc-CDR2和Lc-CDR3氨基酸序列的分离的抗体。

本发明的另一个方面为编码本发明的抗体的分离的多核苷酸。

在另一方面，本发明涉及这样的抗体：其与抗体4A5和5F6限定的共同表位结合，和/或其与抗体4A5或5F6竞争来结合到CD147，或其具有由抗体4A5和5F6显示的其他功能结合特性，例如避免在SEQ ID NO：1表示的第65-74位残基处发生D2交换)。此类抗体包括例如那些与抗体4A5或5F6竞争，并以解离常数(K_D)10^-7M或更小，例如10^-8M或更小、10^-9M或更小、10^-10M或更小或甚至更低(例如10^-11M或更小))与CD147结合的抗体。

本发明提供特异性结合域，所述特异性结合域衍生自示例性抗体序列，所述抗体序列能够与本文所定义的结合到人CD147，并且阻断与CD147相关的一个或多个生物活性相关的活性，所述活性包括但不限于血管生成、VEGF产生和基质金属蛋白酶产生(MMP-1、MMP-2和/或MMP-9产生)。特异性结合域为那些指定为可变区和CDR残基的结构域，其在SEQ ID NO：9-16中指定。本发明还包括衍生自SEQ ID NO：9-16的抗体，例如人源化或重构抗体或抗体结合域，所述抗体或抗体结合域保留了以KD为10^-7M或更小的亲和力免疫特异性结合到人CD147的能力，并与抗体2H3、4A5、5F6竞争结合到CD147，并阻断CD147的生物活性。

因此，本发明的一个方面涉及人源化抗体，其包含人源化重链和人源化轻链，其中：

(1)人源化重链可变区包含三个来自小鼠2H3、4A5、5F6或2C8重链的互补决定区(CDR)和来自人受体抗体重链的骨架，可任选地具有一个或多个人骨架残基取代；以及

(2)人源化轻链可变区包含三个来自小鼠2H3、4A5、5F6或2C8轻链的互补决定区和来自人受体抗体轻链的骨架，所述骨架可任选地具有一个或多个人骨架残基取代；以及

人源化抗体特异性结合到人CD147。

在另一个实施例中，人源化抗体可由一个或多个CDR组成，所述CDR进一步通过取代或缺失一个或多个残基进行工程化改造，例如与2H3、4A5、5F6或2C8的一个或多个CDR的相似性达到90％、95％、98％或99.5％的那些CDR。

另一个实施例涉及通过向需要此治疗的受试者施用治疗有效量或预防有效量的本发明的一种抗体或本发明的抗体的混合物，来治疗或预防与CD147生物活性相关的病理症状。

在另一个实施例中，提供抗原表位作为疫苗的组分。上述的表位包含SEQ ID NO：1表示的第65-74位残基或仍可被本发明的抗体识别的这些残基的保守性变化，这些表位可用于主动免疫宿主，以激发抗CD147抗体的产生，该抗CD147抗体能抗争或预防与CD147生物活性相关的病理症状。

附图说明

图1示出了人CD147同种型2的结构域图谱和以单字母氨基酸代码表示的前肽序列。

图2为示出了CD147 ECD和如FC构造的亚结构域(N结构域为第19-117位残基，C结构域为第95-204位残基)在NHLF中以浓度依赖方式刺激MMP-1产生的相对活性的曲线图。

图3为示出了CD147 ECD和如FC构造的亚结构域(N结构域为第19-117位残基，C结构域为第95-204位残基)在NHLF中以浓度依赖方式刺激VEGF产生的相对活性的曲线图。

图4示出了Akt-v，即Akt依赖性信号通路抑制剂对用来刺激(A)VEGF或(B)MMP-1分泌的CD147ECD或亚结构域Fc构造的影响。

图5示出了与MDA-MB-231活细胞(A)结合但不与NHLF活细胞(B)结合的鼠抗体(10μg/ml mIgG1)的柱状图。

图6为示出了所选的纯化鼠抗体(mIgG1)阻断NHLF中CD147(CD147)刺激的MMP-1产生的相对能力的曲线图。

图7示出了表明所选鼠抗体(mIgG1)阻断人肿瘤和人成纤维细胞共培养物中MMP-2和MMP-9产生的相对能力的酶谱。

图8为显示通过重组抗CD147抗体2H3(mIgG2a)和5F6(hIgG1)减毒的人肿瘤和人成纤维细胞共培养物中MMP-2释放的酶谱。

图9为示出了抗CD147抗体2H3(mIgG2a)和5F6(hIgG1)抑制来自NHLF的CD147诱导的VEGF的柱状图。

图10为示出了在用PANC-1(人胰腺肿瘤细胞)移植的基质栓中第8天血红蛋白(Hb)含量的柱状图，所述PANC-1得自在第1天和第4天接受10mg/kg Mab腹腔注射后的裸鼠。

图11示出了在接受效应子阳性同种型(E+)的重组抗CD147抗体2H3(mIgG2a)和5F6(hIgG1)或PBS的小鼠中肿瘤体积随时间的变化。

图12示出了与4A5(顶部)或5F6(底部)结合区络合的Asp19-Asn117构造的简化H/D交换图。

图13以ELISA法示出了2H3 Mab与4A5或5F6竞争结合Asp19-Glu192-Fc构造的竞争性结合分析的曲线图。

序列表简述

具体实施方式

缩写

CDR-互补决定区；HC-重链；GvHD-移植物抗宿主病；LC-轻链；IFN-干扰素(a，α；b，β)；Ig-免疫球蛋白；Mab-单克隆抗体；MMP-基质金属蛋白酶；NHLF-正常人肺成纤维细胞；NHDF-正常人皮肤成纤维细胞；VEGF-血管内皮生长因子；VL-可变轻链；VHx-可变重链

定义

如本文所用，“抗体”包括全抗体和任何抗原结合片段或其单链。因此，抗体包括任何包含这样的分子的蛋白质或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，骨架区(FR)或其任何部分，或可整合进本发明的抗体中的结合蛋白的至少一部分。术语“抗体”还旨在涵盖抗体、其消化片段、特定部分或变体，包括抗体模拟物或包含模拟抗体或其特定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分，包括单链抗体及其片段。功能片段包括针对预选靶标的抗原结合片段。涵盖于抗体的“抗原结合部分”术语中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)《自然》(Nature)341：544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因编码，但它们可用重组方法通过合成的连接肽连接，所述连接肽使得它们可制成单个蛋白质链，其中VL和VH结构域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人，(I 988)《科学》(Science)242：423-426；以及Huston等人，(1988)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad Sci.)USA 85：5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖于抗体的“抗原结合部分”术语中。使用本领域的技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选出效用方式与完整抗体相同的片段。相反地，可用scFv构造库筛选抗原结合力，之后使用常规技术将其与编码人胚系基因序列的其他DNA拼接在一起。此类库的一个例子为“HuCAL：人组合抗体库”(Knappik，A.等人，《生化与分子生物学》(J Mol Biol)(2000)296(1)：57-86)。

术语“CDR”是指抗体的互补决定区或高变区氨基酸残基，负责抗原结合。人lgG亚型抗体的高变区或“CDR”包含来自以下的氨基酸残基：轻链可变区中的第24-34位残基(L1)、第50-56位残基(L2)和第89-97位残基(L3)以及重链可变区中的第31-35位残基(H1)、第50-65位残基(H2)和第95-102位残基(H3)，如Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版国家卫生局公共卫生公署(Public Health Service，NationalInstitutes of Health)，Bethesda，Md.(1991)所描述的，和/或来自高变环的那些残基(即轻链可变区中的第26-32位残基(L1)、第50-52位残基(L2)和第91-96位残基(L3)以及重链可变区中的第26-32位残基(H1)、第53-55位残基(H2)和第96-101位残基(H3)，如Chothia等人，《生化与分子生物学》(J Mol Biol)196：901-917(1987)所描述的。骨架或FR1-4残基为与高变区不同并且支撑高变区的那些可变区残基。最近，已经开发出得到广泛采用的通用编码系统：international ImMunoGeneTics information(IMGT)(LaFranc等人，2005，《核酸研究》(Nucl Acids Res.)33：D593-D597)。本文中，CDR以氨基酸序列以及重链或轻链中的位置来表示。由于CDR在免疫球蛋白可变区的结构中的“位置”在物种之间是保守的，并存在于称为套环的结构中，故通过使用根据结构特征来比对可变区序列的编码系统可易于鉴别CDR和骨架残基。此信息用于将CDR残基从一个物种的免疫球蛋白移植和替换到通常来自人抗体的受体骨架中。

本文所用的术语“EMMPRIN”是指“细胞外基质金属蛋白酶诱导因子”；CD147；人basigin(BSG)基因的产物；人白细胞活化抗原M6；大鼠OX-47、小鼠basigin和鸡HT7分子的物种同源物；肿瘤细胞起源的胶原酶刺激因子；neurothelin，并包括CD147的所有变体、同种型和物种同源物。因此，在某些情况下，本发明的抗体可与来自除了人类外的物种的CD147交叉反应。在其他情况下，抗体对人CD147可以是完全特异的，并不会呈现物种交叉反应或其他类型的交叉反应。

术语“表位”是指能与抗体特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链组成，且通常具有特定的三维结构特征，以及比电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于与前者而不是后者的结合在变性溶剂存在的情况下会丧失。

“人源化”(也称为重构或CDR移植)包括这样的成熟技术：用来降低来自异种来源(通常为啮齿动物)的单克隆抗体的免疫原性以及用来改善亲和力或效应子功能(ADCC、补体活化、C1q结合)的技术。经工程化改造的mAb可使用分子生物学技术、使用噬菌体展示随机序列制备或从头合成。例如，为了构建具有来自非人类物种的整合CDR区的人源化抗体，该设计可包括变型，例如CDR残基中的保守氨基酸取代以及残基从非人类mAb回代入人骨架区(回复突变)。可通过序列比较方法、共有序列分析或可变区三维结构的结构分析来识别或鉴别位置。有能说明并显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序可供使用。对这些显示结果进行检查，可以分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以此种方式或通过简单的序列比对计算法(例如Clustal W)，可从已知的可在此类公共可查的数据库如VBASE或Kabat中找到的抗体序列和优化的共有序列来选择FR(骨架)残基，以便获得所期望的抗体特征，例如对靶抗原的亲和力。随着抗体结构已知参数的数据集的增加，这些技术也日趋改进和完善。人源化的另一个方法为使用存在于人mAb中的最普遍的残基来仅调整啮齿动物序列的表面残基，该方法被称为“表面重塑”或“镶饰”。现在已知有大量的人和非人lg序列，并且本领域的技术人员可免费获得和使用这些序列，例如LeFranc等人开发的名称为IMGT的数据库和工具；美国生物制品中心策划的网站(NCBI)；Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，美国卫生部(1983)现在也大大扩充，并可在线获得，上述每个均以引用方式全文并入本文中。本发明的抗体的人源化或工程化改造可使用任何已知的方法或那些用人免疫球蛋白序列信息开发的方法来进行。此类方法在例如授予Winter的美国专利No.6982361和授予Bowdish等人的WO03/025019中有所教导，所述专利的内容以引用方式并入本文。

如本文所用，K_D是指解离常数，具体地讲，是指抗体对预定抗原的K_D，并且是抗体对特定靶标的亲和力的测量。高亲和力抗体对预定抗原的K_D为10^-8M或更低，更优选10^-9M或更低，并且更优选10^-10M或更低。K_D的倒数是K_A，为缔合常数。如本文所用，术语“k_dis”或“k₂”或“k_d”意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。“K_D”是解离速率(k₂，也称为“解离率(off-rate)(k_off)”)与缔合速率(k₁)或“结合率(on-rate)(k_on)”的比率。因此，K_D等于k₂/k₁或k_off/k_on，且以摩尔浓度(M)表示。它遵循下列原则，即K_D越小，结合越强。因此与10^-9M(或1nM)相比较，10^-6M(或1微摩尔)的K_D表明为弱结合。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物对特定表位呈现出单一的结合特异性和亲和力。该术语也包括“重组抗体”和“重组单克隆抗体”，因为所有抗体都是通过重组方法制备、表达、生产或分离的，例如(a)从动物或杂交瘤分离的抗体，所述抗体通过抗体分泌动物细胞和融合配偶体来制备的；(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离；(c)从重组的、组合的人或其他物种的抗体库分离的抗体以及(d)用任何其他方法制备、表达、生产或分离的抗体，所述方法涉及将免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列拼接。如本文所用，“分离的抗体”意指这样的抗体：基本上不含有其他具有不同抗原特异性的抗体。然而，与人CD147表位、同种型或变体特异性结合的分离的抗体可对其他相关抗原，例如来自其他物种的抗原(例如CD147物种同源物)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。在本发明的一个实施例中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体组合物被混合在成分明确的组合物中。

如本文所用，“特异性结合”、“免疫特异性结合”和“免疫特异性地结合”是指抗体与预定抗原的结合。通常，抗体以10^-7M或更小的解离常数(K_D)结合，并且与预定抗原结合的K_D为其与除预定抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)结合的K_D的至少1/2。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。如本文所用，“高度特异性”结合是指抗体对特定靶表位的相对K_D至少小于该抗体与其他配体结合的K_D的1/10。

如本文所用，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG)。一些抗体种类还包括亚类，所述亚类也是由重链恒定区编码的，并且还在恒定区结构域(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)内的特定残基处用低聚糖修饰，所述恒定区结构域还将生物功能赋予抗体。例如，在人抗体同种型中，IgG1、IgG3以及现存较少的lgG2呈现出与鼠lgG2a抗体一样的效应子功能。

所谓“效应子”功能或“效应子阳性”是指抗体包含与抗原特异性结合域有所区别的结构域，该结构域能与受体或其他血液组分，例如补体相互作用，导致例如巨噬细胞募集，以及引起由抗体的抗原结合域所结合的细胞破坏的事件。抗体具有通过效应分子的结合而介导的几种效应子功能。例如，补体的C1组分结合抗体会激活补体系统。补体的激活对细胞病原体的调理和溶解是重要的。补体的激活会刺激炎症反应，且还可涉及自身免疫性超敏反应。另外，抗体通过Fc区结合细胞，即抗体Fc区上的Fc受体位点结合细胞上的FC受体(FcR)。有许多种对不同类别的抗体有特异性的Fc受体，所述抗体包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)以及IgM(μ受体)。将抗体结合到细胞表面上的Fc受体会引发许多重要的和各式各样的生物反应，包括吞噬和破坏抗体包裹颗粒，清除免疫复合物，杀伤细胞裂解抗体包裹的靶细胞(被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，或ADCC)，释放炎症介质，胎盘转移和调节免疫球蛋白产生。

本发明的抗体

本发明的CD147抗体为抑制、阻断或干扰至少一个CD147活性或结合的抗体，或者为在体外、原位和/或体内抑制、阻断或干扰CD147活性或结合的抗体。合适的抗CD147抗体、特定部分或变体还可任选影响至少一种CD147的活性或功能，例如但不限于RNA、DNA或蛋白质合成、蛋白释放、CD147蛋白受体信号传导、CD147切割、CD147活性、CD147产生和/或合成。

在一个实施例中，抗人CD147抗体具有结合区，所述结合区包含具有如SEQ ID NO：9-16所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或重链可变区(VH)，并且所述抗体或其结合部分免疫特异性地结合CD147。在本发明的另一个实施例中，抗体或其抗原结合部分结合到CD147蛋白，此外，抗体还具有本发明的抗体的特定功能特性，例如：

在ELISA中与人CD147结合；

抑制人CD147结合到MDA-MB-231乳腺癌细胞；

抑制人CD147介导的MMP-1从NHLF释放，其中IC50小于或等于Fab 5F6的IC50；

抑制肿瘤细胞介导的MMP-2从人成纤维细胞释放；

抑制对人CD147介导的VEGF释放的刺激；

以小于100nM(10^-7M)的Kd结合到人CD147；

以小于100nM并更优选小于10nM的K_D结合到食蟹猴CD147；以及

与由SEQ ID NO：1(DALPGQKTEF)表示的第64-75位残基涵盖的人CD147同种型2上的表位结合。

在本发明的另一个方面，使用2H3、5F6或4A5结合域的结构特征来制造结构上相关的人抗CD147抗体，其保留本发明的抗体的至少一个功能特性，例如与CD147结合。更具体地讲，2H3、5F6或4A5(SEQ ID NO：9-14表示的特定残基)的一个或多个CDR区可与已知的人骨架区和CDR通过重组结合在一起，从而制造本发明另外的、重组方式改造的人抗CD147抗体。

由于本领域中熟知抗体重链和轻链CDR结构域在抗体对抗原的结合特异性/亲和力中起着特别重要的作用，因此如上所述制备的本发明的重组抗体优选地包含2H3的轻链和重链CDR3(分别为SEQ ID NO：9和10)。这些抗体还可包含2H3的CDR2。这些抗体还可包含2H3的CDR1。因此，本发明还提供抗CD147抗体，所述抗体包含：(1)人重链骨架区、人重链CDR1区、人重链CDR2区以及人重链CDR3区，其中人重链CDR3区选自如SEQ ID NO：10所示的2H3的CDR3，以及(2)人轻链骨架区、人轻链CDR1区、人轻链CDR2区以及人轻链CDR3区，其中人轻链CDR3区选自如SEQ ID NO：9所示的2H3的CDR3，其中抗体与CD147结合。抗体还可包含2H3的重链CDR2和/或轻链CDR2。抗体还可包含2H3的重链CDR1和/或轻链CDR1。

作为非限制性实例，抗体或抗原结合部分或变体可包含至少一个重链CDR3，其具有选自SEQ ID NO：10、12、14或16的本文所述的氨基酸序列；和/或轻链CDR3，其具有SEQ ID NO：9、11、13和15的氨基酸序列。在具体实施例中，抗体或抗原结合片段可以具有抗原结合区，所述抗原结合区包含至少一个重链CDR(即，CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一部分，其具有选自SEQ ID NO：10、12、14或16的本文所述的氨基酸序列。在另一具体实施例中，抗体或抗原结合部分或变体可以具有抗原结合区，所述抗原结合区包含至少一个轻链CDR(即CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一部分，其具有选自SEQ ID NO：9、11、13和15的本文所述的相应CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列。在一个优选的实施例中，抗体或抗原结合片段的三个重链CDR和三个轻链CDR具有本文所述的mAb2H3、5F6、4A5和2C8中至少一种的相应CDR的氨基酸序列。此类抗体可通过如下方法制备：使用常规技术将抗体的各个部分(CDR和构架区)化学连接在一起，使用重组DNA技术的常规技术或通过使用任何其他合适的方法制备并表达编码该抗体的(一种或多种)核酸分子。

在一个实施例中，本发明经工程化改造的抗体具有2H3、5F6、4A5和2C8的CDR1、2和/或3的确切序列；除了经工程化改造的抗体外，所述抗体中CDR移植到例如人抗体骨架中，普通技术人员将会知道，与最初的鼠抗体的确切CDR序列的一些偏差是可能的或者是所需的，同时还保留抗体有效地结合CD147的能力(例如保守取代)。因此，在另一个实施例中，经工程化改造的抗体可由一个或多个CDR组成，其例如与SEQ ID NO：9-16中指定的那些可变区的一个或多个CDR的90％、95％、98％或99.5％相似。除了简单结合CD147外，还可对经工程化改造的抗体，例如上述的那些进行选择，以保留本发明的抗体的其他功能特性，例如导致体内肿瘤细胞的生长抑制的抑制血管生成的能力。

可通过例如标准ELISA测试本发明的人单克隆抗体与CD147的结合。

在另一个实施例中，由本发明的抗体结合的表位，更具体地讲，SEQID NO：1(DALPGQKTEF)表示的第64-75位残基或者因此得到的核酸编码序列，可用来免疫受试者，以便在宿主中直接产生本发明的抗体，达到治疗、预防或缓解与CD147的产生相关的疾病或疾病症状的目的。

抗CD147抗体的生成

本发明的抗CD147抗体可任选地通过多种技术制备，所述技术包括标准体细胞杂交技术(杂交瘤方法)(Kohler和Milstein(1975)《自然》(Nature)256：495)。在杂交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物，例如仓鼠或猕猴，以引起淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能产生将特异性地结合到用于免疫的蛋白的抗体。或者，可将淋巴细胞在体外免疫。然后用适合的融合剂，例如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(美国学术出版社，1986)。

如本文所述和/或本领域中已知的，还可以通过对能产生全套人抗体的转基因动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类动物等等)进行免疫来任选地产生抗CD147抗体。可使用合适的方法，例如本文描述的方法，从这些动物分离产生人抗CD147抗体的细胞，并使其无限增殖化。作为另外一种选择，可将抗体编码序列克隆，导入合适的载体，并用来转染宿主细胞，从而通过本文教导的方法和本领域所知的那些方法表达和分离抗体。

使用在其胚系基因结构中载有人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因小鼠来提供高亲和力的完全人源性单克隆抗体的分离，该抗体指向多个靶点，包括正常人免疫系统对其具有耐受性的人类自身抗原(Lonberg，N.等人，US5569825、US6300129和1994，的、《自然》(Nature)368：856-9；Green，L.等人，1994，《自然·遗传学》(Nature Genet.)7：13-21；Green，L.& Jakobovits，1998，《实验医学》(Exp.Med.)188：483-95；Lonberg，N和Huszar，D.，1995，《国际免疫学评论》(Int.Rev.Immunol.)13：65-93；Kucherlapati等人，US6713610；Bruggemann，M.等人，1991，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)21：1323-1326；Fishwild，D.等人，1996，《自然·生物技术》(Nat.Biotechnol.)14：845-851；Mendez，M.等人，1997，《自然·遗传学》(Nat.Genet.)15：146-156；Green，L.，1999，《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)231：11-23；Yang，X.等人，1999，《癌症研究》(Cancer Res.)59：1236-1243；Brüggemann，M.和Taussig，M J.，《生物技术新见》(Curr.Opin.Biotechnol.)8：455-458，1997；Tomizuka等人，WO02043478)。此类小鼠中的内源免疫球蛋白基因座可以被破坏或缺失，以消除动物产生由内源基因编码的抗体的能力。此外，诸如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和Medarex(San Jose，Calif.)之类的公司可从事使用如上所述的技术提供指向所选抗原的人抗体。

在另一个实施例中，人抗体选自噬菌体库，其中噬菌体包含人免疫球蛋白基因，并且该文库将人抗体结合域表达为例如单链抗体(scFv)，表达为Fab，或一些其他的呈现配对或不配对的抗体可变区的构造(Vaughan等人，《自然·生物技术》(Nature Biotechnology)14：309-314(1996)；Sheets等人，PITAS(USA)95：6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，227：381(1991)；Marks等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，222：581(1991))。本发明的人单克隆抗体也可用噬菌体展示法制备，以用来筛选人免疫球蛋白基因的文库。此类用于分离人抗体的噬菌体展示法在本领域是成熟的。参见例如授予Ladner等人的美国专利No.5,223,409；5,403,484和5,571,698；授予Dower等人的美国专利No.5,427,908和5,580,717；授予McCafferty等人的美国专利No.5,969,108和6,172,197；以及授予Griffiths等人的美国专利No.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。

免疫源性抗原的制备以及单克隆抗体的生成可用任何合适的技术，例如重组蛋白产生来进行。免疫源性抗原可以纯化的蛋白或蛋白混合物的形式施用给动物，所述蛋白或蛋白混合物包含全细胞或细胞提取物或组织提取物，或免疫源性抗原可在动物体内由编码所述抗原或所述抗原的一部分的核酸从头形成。

本发明的分离的核酸可用本领域熟知的(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术或它们的组合进行制备。编码单克隆抗体的DNA易于使用本领域已知的方法来分离和测序，所述已知的方法为例如通过使用能特异性地与编码鼠抗体的重链和轻链的基因结合的寡核苷酸探针。在杂交瘤生成的情况下，此类细胞可用作此类DNA的来源。作为另外一种选择，使用展示技术可简化结合物和核酸的选择，所述展示技术中，编码序列和翻译产物联系在一起，例如噬菌体或核糖体展示库。噬菌体选择后，可分离来自噬菌体的抗体编码区，并用来产生完整抗体，包括人抗体或任何其他所需的抗原结合片段，并且表达在任何所需的宿主内，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。

人源化抗体

本发明还提供结合人CD147的人源化免疫球蛋白(或抗体)。人源化形式的免疫球蛋白具有基本上来自人免疫球蛋白(称为受体免疫球蛋白)的可变骨架区和基本上来自特异结合CD147的非人Mab的CDR。一个或多个恒定区，如果存在，也基本上来自人免疫球蛋白。人源化抗体对CD147呈现出的K_D为至少约10^-6M(1μM)，约10^-7M(100nM)，或更小。人源化抗体的结合亲和力可大于或小于从其衍生的小鼠抗体的结合亲和力。为了影响亲和力的改变，改善对CD147的人源化抗体的亲和力，可在CDR残基或人类残基中进行取代。

结合CD147的人源化抗体的生成的来源优选2H3、4A5、5F6或2C8小鼠抗体，其生成、分离和特征描述于本文所提供的实例中，但也可使用与2H3、4A5、5F6或2C8小鼠抗体竞争性结合CD147的其他小鼠抗体。因此，SEQ ID NO：9-16表示的识别的CDR为人源化过程的起始点。

如果人可变区骨架采取与CDR从其产生的小鼠可变区骨架相同或相似的构象，则将小鼠CDR取代进人可变区骨架很可能导致保持其正确的空间取向。这通过从人抗体获得人可变区来实现，所述人抗体的骨架序列与CDR从其衍生的鼠可变骨架区呈现出高度的序列同一性。重链和轻链可变骨架区可衍生自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可为天然存在的人抗体序列，衍生自人胚系免疫球蛋白序列，或者可为几个人抗体和/或胚系序列的共有序列。

合适的人抗体序列可通过计算机比较小鼠可变区的氨基酸序列和已知人抗体的序列来进行识别。分别进行重链和轻链的比较，但是每种比较的原则是相同的。

在一个实例中，抗CD147mAb的氨基酸序列用来查询从公共抗体序列数据库编辑的人抗体数据库。SEQ ID NO：10、12、14或16的重链可变区可用来找到具有最高序列同一性的人可变区。相似地，SEQ ID NO：9、11、13或15的轻链可变区可用来找到具有最高序列同一性的人可变区。为每个鼠可变区制备替换人可变区的CDR的DNA构造，在该DNA构造中，编码来自鼠Mab供体的一个重链可变区的CDR的区域被转变为所选人重链可变区序列中。

鼠CDR区与人可变骨架区的不自然并列可导致不自然的构象抑制，除非通过特定氨基酸残基的取代来校正，否则不自然的构象抑制将导致结合亲和力的丧失。如上所述，本发明的人源化抗体包含基本上来自人免疫球蛋白的一个或多个可变骨架区，和基本上来自小鼠免疫球蛋白(例如2H3、4A5、5F6或2C8小鼠抗体)的CDR。识别了小鼠抗体的CDR和合适的人受体免疫球蛋白序列后，下一步将确定这些组分中的哪些残基，如果有的化，应被取代以优化所得的人源化抗体的特性。通常，应最小化用鼠取代人氨基酸残基，因为鼠残基的引入增加该抗体在人类中引起HAMA反应的风险。根据氨基酸对CDR构象和/或结合抗原的可能影响来选择用于取代的氨基酸。可通过建模、检查特定位点的氨基酸的特性或实验观察特定氨基酸取代或诱变的效果来对此类可能的影响进行研究。就实验方法而言，已发现它特别便于构建可变序列库，可以根据所需的活性、结合亲和力或特异性来对此可变序列库进行筛选。用于构建此类变体库的一种形式为噬菌体展示载体。作为另外一种选择，可用其他核酸序列变异方法，编译可变区内目标残基来产生变体。

确定是否需要进一步取代以及选择用于取代的氨基酸残基的另一种方法，可使用计算机建模来完成。用来产生免疫球蛋白分子三维图像的计算机硬件和软件可广泛获得。通常，分子模型的生成起始于免疫球蛋白链或其结构域的已解决的结构。将要建模的链与已解算的三维结构的链或结构域进行氨基酸序列相似性的比较，并且选择表现出最高序列相似性的链或结构域作为分子模型构建的起始点。对已解算的起始结构进行修饰，以允许被建模的免疫球蛋白链或结构域中的实际氨基酸与起始结构中的那些实际氨基酸之间的不同。然后将修饰的结构组装进复合免疫球蛋白中。最后，通过能量最小化以及通过证实所有原子彼此处于合适的距离且键长和键角在化学可接受限度内来改良模型。

人源化抗体中的CDR区通常是基本上相同的，并且其与作为其来源的小鼠抗体中的对应CDR区更通常是相同的。虽然通常不是可取的，但有些时候使CDR残基的一个或多个保守氨基酸发生取代而不明显影响所得的人源化免疫球蛋白的结合亲和力是可能的。偶尔，CDR区的取代能增加结合亲和力。

除了上述用于特定氨基酸取代外，人源化免疫球蛋白的骨架区通常是基本上相同的，并且其与作为其来源的人抗体的骨架区更通常是相同的。当然，骨架区中的许多氨基酸对抗体的特异性或亲和力具有很少或没有直接的贡献。因此，在对所得的人源化免疫球蛋白的特异性或亲和力没有明显的改变情况下，骨架残基的许多个别保守取代可以接受。

由于密码的简并性，多种核酸序列将编码每个免疫球蛋白氨基酸序列。所需的核酸序列可通过固相DNA从头合成或通过早期制备的所需多核苷酸的变体的PCR诱变来生成。在本申请中描述的所有编码抗体的核酸明确地包括在本发明中。

如上所述产生的人源化抗体的可变区段通常与人免疫球蛋白恒定区的至少一部分连接。所述抗体将包含轻链和重链恒定区。重链恒定区通常包含CH1、铰链、CH2、CH3结构域，并且有时包含CH4结构域。

人源化抗体可包含来自任何抗体种类，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和来自任何亚类(同种型)，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的任何类型恒定区。当需要人源化抗体呈现细胞毒活性时，恒定区通常为补体结合性恒定区，并且种类通常为IgG₁。当不需要此类细胞毒活性时，恒定区可以是IgG₂类。人源化抗体可包含来自不止一个种类或同种型的序列。

将可任选地与恒定区连接的编码人源化轻链可变区和重链可变区的核酸插入表达载体中。轻链和重链可克隆在相同或不同的表达载体中。将编码免疫球蛋白链的DNA片段可操作地连接到确保免疫球蛋白多肽表达的一个或多个表达载体中的对照序列。此对照序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列(参见Queen等人，《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86，10029(1989)；WO 90/07861；Co等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.)148，1149(1992)，所述文献全文以引用方式并入本文中用于所有目的)。

使用抗体的方法

如下详细描述的，本发明人将三个分离的单克隆抗体(2H3、4A5、5F6)结合到CD147上重叠的表位，并呈现体外和/或体内CD147抑制活性。显然，MAb的反应性包括减少MMP和VEGF生成并抑制血管生成的能力。

考虑到本发明所述的单克隆抗体的特性，其抗体或其抗原结合片段适合作为治疗剂和预防剂来治疗或预防人和动物中CD147相关的病症。

通常，用途包括向敏感受试者或表现某种病症的受试者施用治疗有效量或预防有效量的本发明的一种或多种单克隆抗体或抗原结合片段，所述某种病症已知CD147活性具有病理后遗症，例如肿瘤生长和转移。可以施用所述抗体的任何活性形式，包括Fab和F(ab′)2片段。

优选地，所用抗体与受者物种相容，使得在受试者中对MAb的免疫反应不会造成不能接受的短循环半衰期或引起对MAb的免疫反应。优选地，施用的MAb呈现一些辅助功能，例如结合到受试者的Fc受体和激活ADCC机制。

个体治疗可包括施用治疗有效量的本发明的抗体。抗体可以如下所述的试剂盒提供。抗体可以例如相等量的混合物形式使用或施用，或可以单独地按序提供或一起施用。在向患者提供能结合CD147的抗体或其片段或者在受试患者中提供能阻断CD147活性的抗体时，施用剂的剂量会根据诸如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况、既往病史等因素而有所不同。

通常，如果施用全身剂量的抗体，希望提供给受者剂量在约1ng/kg-100ng/kg、100ng/kg-500ng/kg、500ng/kg-1μg/kg、1μg/kg-100μg/kg、100μg/kg-500μg/kg、500μg/kg-1mg/kg、1mg/kg-50mg/kg、50mg/kg-100mg/kg、100mg/kg-500mg/kg(受者的体重)范围内的剂量，但也可施用较低或较高的剂量。低至约1.0mg/kg的剂量预期会显示一些功效。优选地，约5mg/kg是可接受的剂量，但高达约50mg/kg的剂量水平也是优选的，尤其是对于治疗用途。作为另外一种选择，可不根据患者的体重来施用特定量的抗体，例如在1μg-100μg、1mg-100mg或1g-100g范围内的量。例如，可通过下列位点特异性施用到体室或体腔中：关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮方式。

可制备CD147抗体组合物用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)施用或任何其他途径施用，特别是以液体溶液剂或混悬剂形式；用于阴道或直肠施用，特别是以半固体形式，例如但不限于乳剂和栓剂；用于口腔或舌下施用，例如但不限于片剂或胶囊剂的形式；或鼻内施用，例如但不限于粉剂、鼻滴剂或气溶胶或某些药剂的形式；或透皮施用，例如但不限于凝胶剂、软膏剂、洗剂、混悬剂或贴剂递送系统，该贴剂递送系统含有化学增强剂，如二甲亚砜，以改变皮肤结构或增加透皮贴剂中的药物浓度(Junginger等人的“Drug Permeation Enhancement”；Hsieh，D.S.编辑，第59-90页(MarcelDekker，Inc.New York 1994，以上文献全文以引用方式并入本文中)，或含有氧化剂，其使得包含蛋白质和肽的制剂能够应用于皮肤上(WO98/53847)，或应用电场以产生瞬间转运途径，例如电穿孔，或增加带电药物通过皮肤的运动性，例如离子电渗疗法，或应用超声，例如透皮吸收超声波(美国专利No.4,309,989和No.4,767,402)(上述出版物和专利以引用方式全文并入本文中)。

在一个相似的方法中，本发明的单克隆抗体的另一个治疗用途为，使用针对本发明的一个单克隆抗体培育的抗独特型抗体来主动免疫患者。用模拟表位结构的抗独特型进行的免疫可引起主动抗CD147反应(Linthicum，D.S.和Farid，N.R.，《抗独特型抗体、受体和分子模拟》(Anti-Idiotypes，Receptors，and Molecular Mimicry)(1988)，第1-5页和第285-300页)。

同样，可通过施用作为疫苗组分的一个或多个抗原表位和/或致免疫表位来引起主动免疫。可口服或非肠道施用一定量的疫苗，该量足够在预防性或治疗性上实现接受者产生对抗此生物功能区的保护性抗体。可用纯化形式的抗原肽/致免疫肽、肽的片段或肽的修饰形式主动免疫宿主。可将不对应初始蛋白序列的一个或多个氨基酸加入初始肽或截短形式的肽的氨基端或羧基端。此类额外的氨基酸可用于将该肽偶联到另一个肽、偶联到大载体蛋白或偶联到支撑物。可用于这些目的的氨基酸包括：酪氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸及其衍生物。可使用替代的蛋白质修饰技术，例如NH2端乙酰化或COOH端酰胺化，以提供另外的将该肽偶联或融合到另一个肽或肽分子或支撑物的方法。

旨在将能够阻断CD147生物活性的抗体以足够实现减轻、治愈或缓解CD147相关症状或病变的量提供给受试者。如果试剂的剂量、给药途径等足以影响此类反应，则认为该量为“实现”症状减轻的足够量或“治疗有效量”。可通过分析受试者的受影响的组织、器官或细胞，如通过成像技术、或通过体外分析组织样品来测定对抗体施用的反应。如果试剂的存在导致受试患者的生理出现可检测的改变，那么该试剂为生理上显著的。

本发明的化合物可根据已知的方法配制，以制备药学上有用的组合物，其中这些材料或其功能衍生物与药用载体以混合物形式组合。合适的载体及其制剂，包括其他人类蛋白质，例如人血清白蛋白，描述于例如的、《雷氏药学大全》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(第16版，Osol，A.编辑，Mack Easton Pa.(1980))。为了形成适于有效施用的药用组合物，此类组合物将包含有效量的上述化合物以及合适量的载体。可使用另外的药学方法控制作用持续时间。可通过使用聚合物络合或吸附化合物来获得控释制剂。另一种通过控释制剂控制作用持续时间的可行方法为将本发明的化合物掺入聚合材料的颗粒中，聚合材料例如为聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯-醋酸乙烯共聚物。作为另外一种选择，代替将这些试剂掺入聚合物颗粒中，可将这些材料装入通过例如界面聚合反应制备的微胶囊或胶态药物递送体系中也是可行的，这些微胶囊分别例如为羟基甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，这些药物递送系统例如为脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒以及毫微囊或大乳液。此类技术公开于《雷氏药学大全》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(1980)。

治疗可以单剂量疗法进行，或优选地以多剂量疗法进行，在多剂量疗法中，最初治疗过程可以为给予1-10次单独的剂量，接着为了维持和/或增强反应，有必要在后续的时间间隔给予其他剂量，例如在1-4个月时给予第二种剂量，并且如果需要，在几个月后给予一种或多种后续的剂量。合适的疗程的例子包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或其他足以引起预期会减轻疾病症状或减轻疾病严重程度的所需反应的疗程。

本发明也提供可用于实施本发明的试剂盒。本发明的试剂盒包括第一容器，其盛装或包装有上述相关抗体。该试剂盒还包括另一容器，其盛装或包装有实施本发明所需的或方便实施本发明的相关溶液。这些容器可由玻璃、塑料或金属薄片制成，并且可以是小瓶、瓶、小袋、管、袋等。该试剂盒还可包括书面资料，例如实施本发明的步骤或分析信息，所述分析信息例如为第一容器装置中盛装的试剂的量。该容器可连同书面资料一起置于另一容器设备中，例如盒子或袋子中。

本发明的另一方面是用于检测生物样品中CD147的试剂盒。该试剂盒包括盛装有一种或多种可结合CD147表位的抗体的容器以及说明书，该说明书描述了如何使用用于结合CD147形成免疫复合物的抗体，以及如何检测免疫复合物的形成，使得免疫复合物存在与否与样品中CD147的存在与否相关。容器的例子包括多孔板，其允许多个样品中同时检测CD147。

治疗应用

可使用本发明的抗-CD147抗体、其抗原结合片段或特定变体在细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人类)中测量或引发效应，以诊断、监测、调节、治疗、缓解、帮助预防由CD147介导、影响或调整的病症的发病率或减轻该病症的症状。此类病症选自但不限于通过细胞迁移和组织重建，例如在组织再生中介导的疾病或症状、肿瘤性疾病、转移性疾病和纤维变性病症。此类疾病或病症尤其包括恶性疾病和神经系统紊乱或疾病，或其他已知的或特定的CD147相关病症，这些病症可能伴有炎症或自身免疫功能紊乱或疾病、心血管障碍或疾病或感染。特别地，抗体可用于治疗下列疾病，所述疾病涉及血管发生，例如眼疾病和肿瘤性疾病，涉及组织重建例如再狭窄，以及涉及某些细胞类型的增殖，特别是上皮和鳞状细胞癌。具体适应症包括在动脉粥样硬化、再狭窄、癌症转移、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病和黄斑变性治疗中的用途。本发明的中和抗体还可用于预防或治疗不希望的骨再吸收或降解，例如如骨质疏松症中所发现的或由某些肿瘤过表达PTHrP而引起的。抗体还可用于治疗多种纤维变性疾病，例如特发性肺纤维变性、糖尿病性肾病、肝炎和肝硬化。

因此，本发明提供了使用至少一种本发明的CD147抗体调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种CD147相关疾病的方法，如本领域已知的或如本文所述的。具体适应症在下文讨论：

肺部疾病

本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的肺部或胸膜疾病的方法，所述肺部或胸膜疾病包括但不限于下列疾病中的至少一种：肺炎；肺脓肿；由粉尘、气体或薄雾形式的介质引起的职业性肺部疾病；哮喘，闭塞性纤维性细支气管炎，呼吸衰竭，包括超敏感性肺炎(外源性变应性肺泡炎)的肺的超敏感性疾病，变应性支气管肺曲霉病，和药物反应；成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，Goodpasture氏综合征，慢性阻塞性气道病症(COPD)，例如特发性肺纤维变性和结节病等特发性间质性肺病，脱屑性间质性肺炎，急性间质性肺炎，呼吸细支气管炎相关性间质性肺病，特发性闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎，淋巴细胞性间质性肺炎，郎格汉斯细胞肉芽肿病，特发性肺含铁血黄素沉积症；急性支气管炎，肺泡蛋白沉积症，支气管扩张，胸膜病症，肺膨胀不全，囊性纤维变性，以及肺肿瘤和肺栓塞。

恶性疾病

本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的恶性疾病的方法，所述恶性疾病包括但不限于下列疾病中的至少一种：白血病，急性白血病，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，B细胞、T细胞或FABALL，急性髓细胞样白血病(AML)，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，毛细胞性白血病，骨髓异常增生综合征(MDS)，淋巴瘤，何杰金病，恶性淋巴瘤，非何杰金淋巴瘤，Burkitt氏淋巴瘤，多发性骨髓瘤，作为原发疾病或转移性疾病的实体肿瘤疾病，卡波西肉瘤，结肠直肠恶性肿瘤，胰腺癌，肾细胞癌，包含间皮瘤的肺癌，乳腺癌，鼻咽癌，恶性组织细胞增多症，恶性肿瘤的肿瘤伴随综合征/高血钙综合征，实体瘤，腺癌，鳞状细胞癌，肉瘤，恶性黑素瘤，特别是转移性黑素瘤，血管瘤，转移性疾病，癌症相关的骨再吸收，癌症相关的骨痛等。

免疫相关疾病

本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中免疫相关疾病的方法，所述免疫相关疾病包括但不限于下列疾病：类风湿性关节炎，幼年类风湿性关节炎，全身发病型幼年类风湿性关节炎，银屑病关节炎，强直性脊柱炎，胃溃疡，血清阴性关节病，骨关节炎，炎性肠疾病，溃疡性结肠炎，系统性红斑狼疮，抗磷脂综合征，虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎，特发性肺纤维变性，系统性血管炎/韦格纳肉芽肿，结节病，睾丸炎/输精管再通术，变应性/特应性疾病，哮喘，变应性鼻炎，湿疹，变应性接触性皮炎，变应性结膜炎，过敏性肺炎，移植，器官移植排斥反应，移植物抗宿主病，全身炎症反应综合征，脓毒症综合征，革兰氏阳性菌败血症，革兰氏阴性菌败血症，血培养阴性败血症，真菌败血症，中性粒细胞减少伴发热，尿脓毒症，脑膜炎球菌血症，创伤/出血，烧伤，电离辐射暴露，急性胰腺炎，成人呼吸窘迫综合症，类风湿关节炎，酒精性肝炎，慢性炎症性疾病，结节病，克隆氏病，镰状细胞性贫血，糖尿病，肾病，特应性疾病，超敏反应，变应性鼻炎，花粉热，常年性鼻炎，结膜炎，子宫内膜异位症，哮喘，荨麻疹，全身性过敏反应，皮炎，恶性贫血，溶血性疾病，血小板减少，任何器官或组织移植排斥反应，肾移植排斥反应，心脏移植排斥反应，肝移植排斥反应，胰腺移植排斥反应，肺移植排斥反应，骨髓移植(BMT)排斥反应，同种异体皮肤移植排斥反应，软骨移植排斥反应，骨移植排斥反应，小肠移植排斥反应，胎儿胸腺移植排斥反应，甲状旁腺移植排斥反应，任何器官或组织的异种移植排斥反应，同种异体移植排斥反应，抗受体超敏反应，格雷夫斯病，雷诺氏病，B型胰岛素抵抗糖尿病，哮喘，重症肌无力，抗体介导的细胞毒性，III型超敏反应，系统性红斑狼疮，POEMS综合征(多发性神经病，脏器肿大，内分泌病，单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变综合征)，抗磷脂综合征，天疱疮，硬皮病，混合性结缔组织病，特发性阿狄森氏病，糖尿病，慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，白癜风，血管炎，心肌梗塞后心切开术综合征，IV型超敏反应，接触性皮炎，过敏性肺炎，同种异体移植排斥反应，胞内生物引起的肉芽肿，药物敏感性，代谢性/特发性威尔森氏病，血色素沉着症，α-1-抗胰蛋白酶缺乏症，糖尿病性视网膜病变，桥本甲状腺炎，骨质疏松症，下丘脑-垂体-肾上腺轴的评价，原发性胆汁性肝硬化，甲状腺炎，脑脊髓炎，恶病质，囊性纤维变性，新生儿慢性肺部疾病，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症，皮肤病，银屑病，脱发，肾病综合症，肾炎，肾小球肾炎，急性肾衰竭，血液透析，尿毒症，中毒症，先兆子痫，OKT3治疗，抗CD3治疗，细胞因子治疗，化学治疗，放射治疗(例如，包括但不限于虚弱，贫血，恶病质等)，慢性水杨酸中毒等。参见，例如《默克手册》(MerckManual)，第12-17版，Merck & Company，Rahway，NJ(1972，1977，1982，1987，1992，1999)，《药物治疗手册》(Pharmacotherapy Handbook)，Wells等人(编辑)，第二版，Appleton和Lange，Stamford，Conn.(1998，2000)，各自全文以引用方式并入。

心血管疾病

本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中心血管疾病的方法，所述心血管疾病包括但不限于下列疾病中的至少一种：心肌顿抑综合征，心肌梗塞，充血性心力衰竭，中风，缺血性中风，出血，动脉硬化，动脉粥样硬化，再狭窄，糖尿病性动脉硬化疾病，高血压，动脉高血压，肾血管性高血压，晕厥，休克，心血管系统梅毒，心力衰竭，肺心病，原发性肺动脉高压，心律失常，心房异位搏动，心房扑动，心房颤动(持续或阵发性)，灌注后综合征，体外循环后炎症反应，紊乱性或多源性房性心动过速，规则的窄QRS波心动过速，特殊心律失常，心室颤动，希氏束心律失常，房室传导阻滞，束支传导阻滞，心肌缺血性疾病，冠状动脉疾病，心绞痛，心肌梗塞，心肌病，扩张性充血性心肌病，限制型心肌病，心瓣膜病，心内膜炎，心包疾病，心脏肿瘤，主动脉瘤和外周动脉瘤，主动脉夹层，主动脉炎，腹主动脉及其分支闭塞，外周血管疾病，闭塞性动脉疾病，外周动脉硬化性疾病，血栓闭塞性脉管炎，功能性外周动脉疾病，雷诺现象和疾病，手足发绀，红斑性肢痛症，静脉疾病，静脉血栓形成，静脉曲张，动静脉瘘，淋巴水肿，脂肪水肿，不稳定型心绞痛，再灌注损伤，泵后综合征，缺血再灌注损伤等。

神经疾病

本发明还提供用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中神经疾病的方法，所述神经疾病包括但不限于下列疾病中的至少一种：神经退行性疾病；多发性硬化症；偏头痛；艾滋病痴呆综合征；脱髓鞘疾病，例如多发性硬化症和急性横贯性脊髓炎；锥体外系和小脑疾病，例如皮质脊髓系统的病变；基底神经节疾病或小脑失调；过动症，例如亨廷顿舞蹈病和老年性舞蹈病；药物引起的运动障碍，例如那些由阻断中枢神经系统多巴胺受体的药物引起的运动障碍；运动功能减退疾病，例如帕金森氏病；进行性核上性麻痹；小脑结构病变；脊髓小脑退变，例如脊髓共济失调，弗里德里希共济失调，小脑皮质退化症，多系统退化症(Mencel、Dejerine-Thomas、Shi-Drager和Machado-Joseph)；系统性疾病(Refsum疾病，无β-脂蛋白血症(abetalipoprotemia)，共济失调，毛细血管扩张症，以及线粒体多系统疾病)；局灶性脱髓鞘疾病，例如多发性硬化症，急性横贯性脊髓炎；以及运动单位障碍，例如神经性肌肉萎缩(前角细胞退变，例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症，婴儿型脊髓性肌萎缩症和少年型脊髓性肌萎缩症)；阿尔茨海默氏病；中年期唐氏综合征；弥漫性路易体病；路易体型老年性痴呆；韦尼克-科尔萨科夫综合征；慢性酒精中毒；克雅氏病；亚急性硬化性全脑炎，哈勒沃登-施帕茨病以及拳击员痴呆等等。此类方法可以任选包括给需要此类调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者施用有效量的包含至少一种TNF抗体或特定部分或变体的组合物或药物组合物。参见，例如MerckManual，第16版，Merck & Company，Rahway，NJ(1992)。

抗CD147抗体的其他治疗用途

除了上述病症和疾病之外，本发明还提供了用于调节或治疗各种病因的纤维变性病症的方法，例如肝纤维变性(包括但不限于酒精诱发的肝硬化、病毒诱发的肝硬化、自身免疫诱发的肝炎)；肺纤维变性(包括但不限于硬皮病、特发性肺纤维变性)；肾纤维变性(包括但不限于硬皮病、糖尿病性肾炎、肾小球肾炎、狼疮肾炎)；皮肤纤维变性(包括但不限于硬皮病、肥大性和瘢痕疙瘩性瘢痕形成、灼伤)；骨髓纤维变性；神经纤维瘤病；纤维瘤；肠纤维变性；和由外科手术操作引起的纤维变性粘连。

本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中传染病的方法，所述传染病包括但不限于下列疾病中的至少一种：急性或慢性细菌感染，急性和慢性寄生或传染过程，包括细菌、病毒和真菌感染，HIV感染/HIV神经病，脑膜炎，肝炎(甲型、乙型或丙型等)，脓毒性关节炎，腹膜炎，肺炎，会厌炎，大肠杆菌感染，溶血尿毒症综合征，疟疾，登革出血热，利什曼病，麻风病，中毒性休克综合征，链球菌性肌炎，气性环疽，结核分枝杆菌感染，细胞内鸟分枝杆菌感染，卡氏肺囊虫性肺炎，骨盆炎症性疾病，睾丸炎/附睾炎，军团杆菌感染，莱姆氏病，a型流行性感冒，EB病毒感染，病毒相关性噬血细胞综合征，病毒性脑炎/无菌性脑膜炎等。

本专利申请中所有引用的参考文献的内容(包括参考文献、公布的专利、公布的专利申请以及共同未决的专利申请)在此明确地以引用方式并入。

本发明的其他特征将在下面的示例性实施例的描述过程中变得显而易见，给出的所述示例性实施例是出于对本发明进行举例说明的目的，而不是意图对其进行限制。

实例1：CD147试剂和方法

为了产生和测试抗CD147单克隆抗体，构建代表CD147的所有或部分胞外域的特定蛋白构造。可制备CD147多肽和突变形式、截短形式或缺失形式的CD147或融合蛋白，以用于多种用途，包括但不限于抗体的生成，如诊断检测分析中的试剂，如用于筛选可用来治疗或预防例如HIV-1感染、AIDS、RA和癌症的治疗性化合物的检测分析中的试剂，以及如可用于治疗例如HIV-1感染、AIDS和AIDS相关疾病、RA和癌症的药剂。

被称为CD147同种型II(NCBI登录号NP_940991，SEQ ID NO：1)的bsg基因产物为长度为269个氨基酸的多肽原，其包含信号序列、胞外域、跨膜域和胞内域。

图1示意性地示出了CD147的信号肽、胞外域(ECD或ECD-FL)、跨膜域(TM)和胞内域(ICD)，其中胞外域包含N端lg结构域(N端结构域，从第22位至103位残基的C2型结构域)和C端lg结构域(C端结构域，从第105位至199位残基的V样结构域)。对应于CD147的一个或多个这些结构域的肽以及融合蛋白通过本领域的技术人员已知的重组方法构建，并且由哺乳动物细胞培养物表达和纯化，所述CD147的这些域中的一个或多个其他区域或结构域已删除，所述融合蛋白中，全长ECD或者一个或其他lg样结构域与不相关蛋白(例如GST、FLAG、hex-HIS和Fc融合蛋白)融合。此类人CD147-Fc嵌合体包含与人lgG1的羧基端hexa-His标记的Fc区融合的SEQ ID NO：1表示的第24-205位残基，也可从R&D Systems，Inc.商购获得。

编码人CD147同种型2的cDNA得自ATCC IMAGE克隆3867352或MGC-17700(NCBI登录号BC009040，1622bp，完整的编码序列)并且使用该克隆作为模板生成三个表达构造。

i)3364号构造：人CD147 ECD _1-192

为了生成表达载体3364，将编码第1-192位氨基酸的核酸序列按照C端FLAG标记的(3364)形式亚克隆进表达载体3XFLAG-CMV-14(Sigma)中，所述氨基酸包含人CD147的内源信号肽和胞外域(ECD_1-192)。多肽单体会含有作为C端FLAG标记蛋白的人CD147 ECD，其中Met 1至Gly 192氨基酸融合到FLAG肽(Brizzard等人，《生物技术》(Biotechniques)，1994年4月，16(4)：730-5)。

ii)3128号构造：人CD147 N结构域

为了生成表达载体3128，通过使用

Ig1.FC.正向引物5′TCGAGGTACCGCCACCATGGCGGC 3′(SEQ ID NO：2)和

Ig1.FC.反向引物5′TGCAGCGGCCGCCGTTGATGTGTTCTGACG 3′(SEQID NO：3)，

将编码第1-117位氨基酸的核苷酸序列按照C端Fc融合的形式(3128)亚克隆进pcDNA 3.1(+)，所述氨基酸包含人CD147的内源信号肽和第一lg样结构域(N结构域)。当在ER中成熟并分泌时，发现N端为Asp19，其表示在通常编码A的前导密码子中的突变。除了Fc融合构造Asp19-Asn117-IgG₁-Fc之外，还用CD147 N结构域Asp19-Asn119构造成标记的Asp19-Asn117-hexahis种类。

iii)3129号构造：人CD147 C结构域

为了生成表达载体3129，通过使用5′CAAGAGGGATCCGCCGGCACGGCC 3′；Ig2.FC.(SEQ ID NO：4)作为正向引物，并且使用5′TGCAGCGGCCGCTGCGCACGCGG 3′(SEQ ID NO：5)作为反向引物，将编码人生长激素信号肽和第95-203位氨基酸的核苷酸序列按照C端Fc融合蛋白Ig2.FC.的形式亚克隆进pcDNA 3.1(+)，所述氨基酸中包含人CD147的第二Ig样结构域(C结构域)。当在哺乳动物宿主细胞中表达、在ER中成熟以及分泌时，该蛋白将形成同型二聚体，其表示融合人Fc支架(IgG1的铰链、CH2和CH3结构域)的gly 95至ser204氨基酸残基(3129号构造)。除了Fc融合构造外，还可使用gly 95至ser204来构造标记的hexahis种类。

在用阳离子脂质试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染后，这三个构造瞬时表达于无血清条件下(SFMII)的HEK 293细胞中。转染4天后收集细胞上清液，并在抗FLAG(ECD-FLAG)或蛋白A树脂(N & C结构域Fc融合蛋白)上纯化。通过SDS-PAGE以及通过N端氨基酸测序来检测纯度。

以相似的方式构建、表达和纯化代表ECD-FL(具有SEQ ID NO：1表示的Asp19-192)、N端lg结构域(Asp19至Asp 117)以及C端lg结构域(Glu95至Ser204)的Hexa-His标记的试剂。

实例2：CD147衍生构造的生物检测分析和表征

直接结合到CD147 ECD或亚结构域

用酶免疫测定法(EIAs)检测杂交瘤细胞上清液中是否存在抗人CD147Mab。简而言之，板(Nunc-Maxisorp)用1mg/mL溶于PBS的人CD147(ECD，N & C结构域蛋白)包被过夜。用含有0.02％(w/v)吐温20的0.15M盐水洗涤之后，用1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)PBS溶液在37℃下封闭测试孔1小时。将未稀释的杂交瘤上清液置于包被的板上，并在37℃下温育1小时。将板清洗干净，然后用以1∶10,000稀释于1％BSA/PBS中的HRP标记的山羊抗鼠IgG，Fc特异性(Sigma)，在37℃下温育30分钟。再将板清洗干净，然后在室温下用100mL/孔的柠檬酸盐-磷酸盐底物溶液(0.1M柠檬酸钠和0.2M磷酸钠、0.01％过氧化氢和1mg/mL的邻苯二胺盐酸盐)温育15分钟。通过加入25mL/孔的4N硫酸终止底物显色，并通过自动酶标仪测量490nm下的吸光度。

活细胞结合的检测分析法

在整个这些研究中，使用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC HTB-26)作为CD147阳性细胞。简而言之，96孔板的每孔中接种50,000个MDA-MB-231细胞。过夜生长后，轻轻地用200μl冰冷DMEM洗涤细胞三次，并在室温下温育30分钟时用200μl 10％FBS-DMEM将细胞封闭。将板清洗干净后加入100μl未稀释的抗体上清液，然后在室温下温育1小时，并再将板清洗干净。以1∶5000稀释比加入HRP标记的二抗，接着在室温下温育1小时，洗涤，并在室温下加入50μl/孔的显色缓冲液，显色15分钟。通过加入25μl/孔的4N硫酸终止底物显色，并通过自动酶标仪测量490nm下的吸光度。

成纤维细胞中MMP-1的产生

众多证据已证实，人成纤维细胞在与人CD147蛋白接触时分泌多种基质型金属蛋白酶(MMPs)(Kataoka，H.等人，1993《癌症研究》(Cancer Res)53，3154-3158；Sameshima，T.等人，2000《癌症通讯》(Cancer Lett)157，177-184：Guo，H.等人，1997《生物化学杂志》(J Biol Chem)272，24-27)。在实例1中产生的重组人CD147构造：人CD147的ECD、N结构域和C结构域可用来刺激人成纤维细胞。根据产品手册(R&D Systems，Minneapolis，MN)，使用MMP-1活性检测分析法来定量测定在无血清的成纤维细胞条件培养基中的MMP-1活性，所述成纤维细胞使用不同量的重组CD147蛋白处理。操作时，该检测分析法测量了包含于150μl标准品或样品中的MMP-1。MMP-1被固定在检测孔底部上的抗MMP-1抗体所捕获。随后，用乙酸-4-氨基苯汞(APMA)活化捕获的MMP-1。加入每孔中的MMP底物被活化的MMP-1裂解，所得的荧光通过采用320nm激发波长和405nm发射波长的SpectraFluor Plus Plate Reader(TECAN，Research Triangle Park，NC)来测定。

结果(图2)表明，ECD-Fc构造在诱导MMP表达过程中保持了最高水平的活性，并且在N结构域中保留了高比例的活性残基。C结构域构造在诱导培养的成纤维细胞表达MMP方面相对较弱。

肿瘤-成纤维细胞共培养MMP-2和MMP-9释放测试

将MDA-MB-231细胞培养于含有10％FBS的DMEM中，并置于补加10％CO2的潮湿细胞培养箱中。将NHDF细胞培养于供应商推荐的条件下。简而言之，细胞在含有1μg/ml hFGF、5μg/ml胰岛素、50μg/ml庆大霉素和50μg/ml两性霉素的成纤维细胞生长培养基中培养。在亚汇合时，分别使MDA-MB-231细胞和NHDF细胞胰蛋白酶化，并悬浮于新培养基(含有10％FBS的DMEM)中。将100,000个NHDF细胞与100,000个MDA-MB-231乳腺癌细胞在6孔板中共培养24小时。用PBS轻轻冲洗细胞共培养物，用新鲜无血清DMEM培养基更换生长培养基，并加入100μl测试抗体上清液。3天后，再次用1.5ml无血清DMEM培养基更换该培养基，并加入相同量的抗体上清液。两天后收集条件培养基用于分析活性。根据有所修改的前述方法进行SDS底物酶谱电泳(Tang，Y.等人，《分子癌症研究》(MolCancer Res)2，73-80，2004；Tang，Y.等人，《癌症研究》(Cancer Res)65，3193-3199，2005)。将含有20mg蛋白的条件培养基的样品与非还原性SDS样品缓冲液混合，并在含有0.1％明胶的10％聚丙烯酰胺凝胶上分离。电泳后，用2.5％Triton X-100洗涤凝胶30分钟。通过将凝胶在37℃下置于含有5mM CaCl2、1mM ZnCl2、1％Triton X-100和0.02％NaN3的50mM Tris-HCl(pH7.6)中温育24小时进行底物消化。用0.1％考马斯亮蓝R250将凝胶染色，并以均匀蓝染色背景中清晰的条带检测作为明胶活性的位置。使用MMP标准品来标识具有明胶酶活性的条带的位置。

促进VEGF分泌

VEGF的产生通过成纤维细胞中的重组CD147刺激。以前已证实，重组CD147能刺激VEGF在成纤维细胞中产生(Tang等人，《分子癌症研究》(Mol.Cancer Res.)20064：371-377)。对由实例1中的三个不同CD147构造(CD147的N端结构域或C端结构域，或全长ECD)所刺激的VEGF分泌进行比较。

使用购自R&D System的Quantikine ELISA试剂盒进行条件培养基中人VEGF浓度的定量。包含于200μl标准品或样品中的VEGF被固定于检测孔底部的抗VEGF抗体捕获，所述抗VEGF抗体用标记的二抗检测。使用VersaMax Tunable MicoPlate Reader在450nm处进行ELISA数据的采集。使用Softmax Pro 3.1软件分析数据。结果(图3)表明，ECD构造是VEGF表达最有力的诱导子，并且大部分活性都存在于N结构域中。C结构域对VEGF诱导具有相对较小的贡献。

CD147信号传导

CD147能通过PI-3K-Akt信号通路刺激MMP-1和VEGF的产生。成纤维细胞中Akt磷酸化用作CD147信号转导测量的基础。Akt是激酶，也称为蛋白激酶B。通过Akt磷酸化的蛋白一般会促进细胞存活。重组CD147能刺激成纤维细胞中的Akt磷酸化(Tang等人，2006，《分子癌症研究》(Mol.Cancer Res.)4(2006)，第371-377页)。使用截短的ECD结构域、N结构域或C结构域代替全长ECD(ECD-FL)的实验表明，如果使用N结构域则产生大部分活性，并且在仅存在含C结构域的反应蛋白的情况下发生相对较少的信号传导。

为了进一步理解该信号通路并区分不同结构域蛋白的作用，测试了NHLF细胞中特异性Akt抑制剂Akt V对CD147刺激的MMP-1和VEGF产生的影响(图4)。结果表明Akt V抑制CD147结构域蛋白诱导的VEGF表达，见图4A，但不抑制CD147结构域蛋白诱导的MMP-1表达，见图4B。

也有报道NF-k_b可调控VEGF表达，并是Akt信号通路的下游靶点。为了检测NF-kb信号传导是否与CD147结构域蛋白诱导的MMP和VEGF的产生相关，在用不同CD147蛋白(未示出)刺激后，用NF-kb抑制剂Bay11-7082处理NHLF细胞，就以下方面而言，用NF-kb抑制剂Bay11-7082处理NHLF细胞与用于Akt抑制剂的NHLF细胞相似：Bay11-7082抑制CD147 ECD诱导的VEGF表达但不抑制CD147 ECD诱导的MMP-1表达，并且N结构域而非C结构域呈现VEGF诱导活性的大部分活性。

实例3：抗CD147抗体的生成

鼠抗人CD147通过Kohler和Milstein的杂交瘤方法生成。此外，也生成鼠CD147的替代抗体。

三只12-14周龄的Balb/c小鼠得自Charles River Laboratories。在第0天，选取其中两只小鼠，使每只小鼠接受真皮内和腹膜内组合注射溶于75mL PBS中，用等量的弗氏完全佐剂乳化的25mg重组人CD147 ECD_25-205-Fc(R&D Systems)，每个部位用量12.5mg。在第14、28和51天，给它们注射溶于75mL PBS中，用等量的弗氏不完全佐剂乳化的25mg ECD。使第3只小鼠接受初始注射，在其尾根部皮下(sc)施用溶于100ml PBS中的25mg人ECD+0.33×105U鼠IFNa+0.33×10⁵U鼠IFNb(Biosource)。在第2和第3天，使该小鼠接受额外注射，在其尾根部皮下施用溶于100mL PBS中的0.33×10⁵U IFNa+0.33×10⁵U IFNb。几周后，在小鼠尾根部皮下施用25mgCD147加强免疫。在整个免疫计划中的各时间点给小鼠采血。通过眼眶穿刺进行血液采集，并收集血清用于通过固相EIA进行滴度测定。一旦达到滴度平台，将小鼠静脉(IV)给予溶于PBS中的25mg ECD，使其接受最后的加强免疫。三天后，将小鼠通过CO2窒息实施安死术，将脾无菌取出并浸于含有100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和0.25mg/mL两性霉素B(PBS/PSA)的10mL冷PBS中。将淋巴细胞无菌通过浸于冷PBS/PSA中的丝网筛来收集。用冷PSA/PBS洗涤细胞一次，用台盼蓝染料排除法计数细胞，并将细胞重悬浮于10mL PBS中。将非分泌小鼠骨髓瘤融合配偶体细胞系FO维持在培养对数期，直到融合。用PBS洗涤FO细胞，计数，并在融合前通过台盼蓝染料排除法确定细胞活力(＞95％)。一共进行三次融合。脾细胞以1∶1的比率与FO细胞融合。简而言之，脾细胞和骨髓瘤细胞混合在一起并形成细胞团，用50mL的PBS洗涤两次。细胞团用2mL的融合溶液(5ml分子量为3000的PEG、5mL H2O(pH 7.0)、0.5ml DMSO)在37℃下重悬浮1分钟。然后将细胞/融合混合物浸于37℃水浴中约90秒，并轻轻搅拌。通过加入37℃的PBS终止融合反应，在最初的30秒中缓慢增加1ml，在接下来的30秒缓慢增加3ml，在接下来的60秒缓慢增加16ml。然后以1000rpm将融合细胞离心5分钟。将细胞重悬浮于融合介质中，并以200mL/孔接种于20个96孔平底板中。然后将融合板置于含有6％CO₂的37℃潮湿培养箱中，并保持7-10天不间断。

鼠CD147的中和单克隆抗体通过用小鼠CD147的胞外域免疫大鼠生成。在免疫和融合后，筛选可结合小鼠CD147的杂交瘤，然后分析体外活性。抗体，指定为C947，不与人CD147交叉反应，抑制由NIH3T3细胞(小鼠成纤维细胞)产生的小鼠CD147诱导的MMP-1的表达，并且在未加外源小鼠CD147的情况下，在NIH3T3和MISA(小鼠肿瘤细胞系)共培养细胞中抑制MMP-2的表达。C947杂交瘤的V区克隆产生单个重链和轻链序列，其在重组表达时具有C947的初始活性。

实例4：抗CD147 MAB的表征

在固相(EIA)检测分析形式中筛选可结合CD147的杂交瘤上清液。此筛选产生52个阳性克隆物。

使用活细胞结合检测分析法进一步筛选这52个克隆物。此筛选产生13个阳性克隆物。

这13个阳性克隆物进一步用MMP-1检测分析法测试。在用MMP-1检测分析法筛选后，鉴别10个阳性克隆物。

最后，10个克隆物的活性用共培养检测分析法来表征。此筛选产生7个阳性克隆物，从这些克隆物中纯化Mab用于进一步表征，并将其标示为2H3、5F6、2C8、4D12、4G1、5A9和4A5。

实例5：MAR的生物活性

分析由实例2中描述的筛选所识别的7个MAB在CD147的胞外域中的结合特异性和亲和力。使用编码N结构域(SEQ ID NO：1表示的Asp19至Asp117)或C结构域(Glu95至Ser204)的蛋白的数据表明，所有7个MAB特异性结合到N结构域而不是C结构域。

根据对CD147阳性MDA-MB-231乳腺癌细胞的活细胞结合以及与CD147阴性NHLF的活细胞结合来再次筛选7个Mab(图5)。所有7个抗体均识别出MDA-MB-231细胞，其在肿瘤细胞表面上表达天然的CD147抗原。相比之下，这些抗体没有一个可检测到与CD147表达呈阴性的人成纤维细胞的结合。

mAb的结合亲和力通过固相结合检测分析法估计。与测试的7个Mab的RDI-CD147相比，2C8(mIgG1)、2H3(mIgG1)、5F6(mIgG1)和4D12(mIgG1)这4个中和抗体呈现出与重组CD147结合的最高亲和力。

为了评估Mab阻断MMP-1产生的能力，用1μg/ml的重组ECD-Flag构造处理NHLF。响应CD147刺激的MMP-1产生用MMP-1活性检测分析法来测定。所有7个纯化的抗CD147抗体均包括在该检测分析法中，以便分析其抑制活性。4个mAb显示出对MMP-1产生的显著抑制。2H3(mIgG1)、2C8(mIgG1)和5F6(mIgG1)mAb是最有力的抗体，当以40μg/ml使用时，可将MMP-1的产生抑制到最低水平(图6)。

根据抑制共培养物中CD147诱导的MMP-2或MMP-9产生的能力来筛选抗体。在此检测分析法中，从7个mAb中筛选出3个mAb，即2H3(mIgG1)、2C8(mIgG1)、5F6(mIgG1)，它们在共培养物中抑制了MMP-2和MMP-9的产生(图7)。4D12(mIgG1)在此检测分析法中没有呈现出明显的抑制活性。5A9(mIgG1)表现出抑制性，但是其抑制活性不具有剂量依赖性(图7)。

还通过表面等离子体共振(Biacore)测量了对CD147 ECD的亲和力。使用BIACORE 3000(BIAcore，Inc.)表面等离子体共振(SPR)设备在25℃进行动力学研究。山羊抗小鼠Fcy特异性抗体(Jackson Immunoresearch laboratories产品编号115-005-071)与羧甲基葡聚糖包被的金表面(CM-5芯片，Biacore)共价连接。葡聚糖的羧甲基用N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。Ab在pH 4.5、10mM的醋酸钠中连接。表面上任何剩余的活性位点通过与乙醇胺反应封闭。

就动力学结合测量而言，用抗小鼠Fcy特异性抗体以30μL/min的流速捕获抗CD147mAb。Ab捕获后，接着以60μL/min的流速注射浓度介于75和300nM之间的CD147-FL-ECD或N结构域或C结构域片段(如实例1中所述)。收集2分钟的缔合数据，然后进行10分钟的解离。以30μL/min的速度加入15μL的100mM H3PO4，接着加入15μL的50mM NaOH，使表面再生。所有样品用含有3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20的D-PBS配制。报告的数据为含有捕获抗体的流通池和没有捕获抗体的参比池之间的SPR信号差值。设备对信号的额外贡献通过如下方式消除：从扣除参比值的信号中减去得自空白注射的数据。使用BIA评估软件(BIAcore，Inc.)通过拟合所有浓度的缔合和解离相来分析数据。

数据表明，2H3(mIgG1)、5F6(mIgG1)和2C8(mIgG1)这3个mAb对CD147具有nM水平的亲和力，并且结合到N结构域而不是C结构域。

这些Mab活性的总结示于表1中(见下)，其中共培养抑制用于对MMP-2和MMP-9产生的检测分析。

表1

基于对ECD的N端结构域具有最高结合亲和力(最低结合Kd)和特异性的克隆物2H3、4A5和5F6，选择这些克隆物进行大量克隆和表达，以用于进一步的研究。

实例6：抗CD147 MAB的克隆

用于2H3、2C8、5F6和4A5的重链和轻链的V区核酸序列克隆自杂交瘤。氨基酸序列在下文中示出，CDR加有标注。

为了从杂交瘤克隆物C1164A(2H3)、C1170(2C8)、C1171A(5F6)、C1171A(4A5)克隆鼠抗体链，使用总RNA(3μg，根据Invitrogen方案使用Trizol分离得到)以寡聚dT启动逆转录进行5’RACE(GeneRacer kit，Invitrogen)。每个获得的cDNA在两个各自的PCR反应(每个反应1μl)中用作模板，以扩增抗体的重链或轻链可变区。为了扩增HC的可变区，使用GeneRacer 5’引物与大鼠HC1(#641)引物进行PCR扩增。重链PCR产物为大约700bp的单个条带。使用Platinum TAQ DNA高保真性聚合酶进行PCR，并且进行PCR扩增的退火温度是65℃(94℃30秒、65℃30秒、72℃1分钟)。为了扩增LC的可变区，首先使用GeneRacer 5’引物与大鼠LC1(#644)引物，然后接着使用GeneRacer 5’巢式引物和大鼠LC2(#645)引物进行巢式PCR。PCR条件如上所述，并且轻链PCR产物产生大约600bp的条带。将600bp条带从琼脂糖凝胶中纯化作为LC PCR产物。为了获得V区序列，将PCR产物克隆进pCR4-TOPO载体(用于测序的TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen)中。使用M13正向或反向寡核苷酸序列(30ng)启动序列反应。对于一种抗体5F6而言，通过测序鉴别出一个HC和两个LC的V区序列。使用不依赖连接酶的克隆方法将HC和LC克隆进各种表达载体中。PCR引物定义如下。

表2

用于扩增和克隆CD147鼠mAb V区的PCR引物

引物	序列	SEQ ID NO：
			大鼠HC-1	5’-TGGGCTACGYTGCAGGTGAC	6
大鼠LC-1	5’-CTCATGCTGTACGTGCTGTC	7
			大鼠LC-2	5’-CTTGACATTGATGTCTTTGG	8

每个抗体重链和轻链的克隆V区的翻译产物如下所示。

2H3

2H3-Vk(SEQ ID NO：9)

DIVMSQSPSS LAVSVGEKVT MSCKSSQSLL YNNNQKNYLAWYQQKPGQSP KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLTISSVKAEDLA VYYCQQYYSY PFTFGSGTKL EIK

2H3-VH(SEQ ID NO：10)

QVQLQQSGAE LAKPGASVKL SCKASGYTFT SYWMHWVKQRPGQGLEWIGY INPGSGYTKY

NQTFKDKATL TADKSSSTAY MQLSSLTYED SAVYYCARVE GYRTTRYFDV WGTGTTVTVSS

4A5

4A5-Vk(SEQ ID NO：11)

DIVMSQSPSS LAVSVGEKVT MSCKSSQSLL YSSNQKNYLAWYQQKPGQSP KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLTISSVKAEDLA VYYCQQYYSY PTFGAGTKLELK

4A5-VH(SEQ ID NO：12)

EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYYMNWVKQSHGKSLEWIGG INPNNGGTSY NQKFKGKATL TVDKSSSTAYMELRSLTSED SAVYYCARND GYRGYAMDYW GQGTSVTVSS

5F6

5F6-Vk-2(SEQ ID NO：13)

SIVMTQTPKF LLVSAGDRVT ITCKASQSVS NDVAWYQQKPGQSPKLLIYY ASNRYTGVPD RFTGSGYGTD FTFTISTVQAEDLAVYFCQQ DYSSPYTFGG GTKLEIK

5F6-VH(SEQ ID NO：14)

EMKLEESGGG LVQPGGSMKL SCVASGFTFS NYWMNWVRQSPEKGLEWVA QIRLKSYNYAT HYAESVKGRF TISRDDSKSSVYLQMNNLRA EDTGIYYCTP DGSDYWGQGT TLTVSS

2C8

2C8-Vk(SEQ ID NO：15)

MDMMVLAQFL AFLLLWFPGA RCDILMTQSP SSMSVSLGDTVSITCHASQGISSSIGWLQQ

KPGKSFKGLI YHGTNLEDGV PSRFTGSGSG ADYSLTISSLESEDFADYYC VQYAQFPYTF

GGGTKLEIK

2C8-VH(SEQ ID NO：16)

MDLRLSCAFI IVLLKGVQSE MKLEESGGGL VQPGGSMKLSCVASGFTFSN YRMNWVRQSP EKGLEWVAQI RLKSYNYATHYAESVKGRFT ISRDDSKSSV YLQMNNLRAE DTGIYYCTPD GSDYWGQGTT LTVSS

实例7：重组MAB的生物活性

源自鼠抗体的结合域阻断与诸如肿瘤组织生长和转移扩散等疾病相关的CD147的特定生物活性的能力，使用表达为鼠mAb(mIgG1)的完整抗体或V区与人IgG1或鼠IgG2a恒定区的嵌合体进行评估，所述恒定区在体内检测分析中促成抗体效应子功能。构建此类嵌合体的方法为本领域所熟知。在一些检测分析中，将可商购的CD147中和抗体RDI-CD147(R&D Systems)用作比较器。

在单独培养的NHLF中CD147诱导的MMP-1释放的抑制

此检测分析如实例4所述进行。为了测定抗CD147抗体的抑制活性，在细胞用重组CD147(ECD19-205-Fc构造)刺激15分钟后，向细胞培养物中加入1、5、10和20μg/ml的Mab 2H3(mIgG2a)和5F6(hIgG1)。数据(表3)显示出，成纤维细胞中CD147刺激的MMP-1产生被重组抗CD147 Mab2H3(mIgG2a)和5F6(hIgG1)以剂量依赖性的方式抑制。

表3

共培养物中MMP-2产生的抑制

该检测分析法如实例4所述，在存在或不存在两个重组抗CD147抗体5F6(hIgG1)和4A5(mIgG2a)的情况下对MDA-MB-231和NHDF进行共培养检测分析。两个抗体都以剂量依赖方式抑制MDA-MB-231和NHDF产生MMP-2(图8)。

VEGF产生的抑制

为了测定抗CD147抗体的抑制活性，将抗体加入NHLF细胞培养物中，并用重组CD147刺激细胞15分钟。在48小时收集条件培养基。数据(图9)表明，2H3(mIgG2a)和5F6(hIgG1)Mab两者都能抑制用10μg/ml重组CD147刺激48小时的正常人肺成纤维细胞(NHLF)产生VEGF。

由于CD147在肿瘤细胞上的表达影响肿瘤细胞和成纤维细胞共培养物中VEGF的表达，因此对重组抗CD147mab，即2H3(mIgG2a)和5F6(hIgG1)抑制产生CD147介导的肿瘤基质VEGF的能力进行测试。该检测分析如实例4所述进行，但进行了以下更改。将测试的mAb加入共培养物中。3天后，再次用1.0ml无血清DMEM培养基和mAb更换该培养基。2天后收集条件培养基，用于VEGF浓度的分析。数据显示两种重组抗CD147Mab，即2H3(mIgG2a)和5F6(hIgG1)在浓度为20μg/ml时都抑制肿瘤细胞和成纤维细胞的共培养物中产生超过40％的VEGF。

实例8：体内活性

血管生成的抑制

MATRIGEL^TM是从Engel-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤提取的溶解基底膜制剂，所述小鼠肉瘤是富含细胞外基质蛋白的肿瘤。虽然主要组分是层粘连蛋白，但是MATRIGEL也包含痕量的成纤维细胞生长因子、TGF-β、组织型纤溶酶原激活剂和其他天然存在于EHS肿瘤中的生长因子。MATRIGEL是几种类型的肿瘤细胞侵袭检测分析的基础，并且为血管生成研究提供必需的基质。MATRIGEL在皮下注入小鼠或大鼠中时形成软凝胶塞，并且在补加血管生成因子时支持强烈的血管反应。

实验1

用MATRIGEL胶塞检测分析法评估抗从杂交瘤上清液纯化的CD147抗体重组子2H3和5F6、4D12以及大鼠抗小鼠CD147抗体(C947)的抗血管生成效应。在该研究的第1天，将50只裸鼠随机分成10组(n＝5/组)，如下所示。将小鼠称重，并用氯胺酮/甲苯噻嗪(90/10mg/kg，腹腔注射)麻醉。在两个部位注射小鼠，每侧注射0.5ml的Matrigel(每ml MATRIGEL含有50万个细胞)。在第1天和第4天以10mg/kg的剂量腹腔注射每种治疗剂的测检物。在第1天，如下表4所述，植入MATRIGEL胶塞之前3小时注射治疗剂。将抗CD147抗体2H3(mIgG2a)、5F6(hIgG1)、4D12(mIgG1)、C947(大鼠IgG1)和cVam(并将非特异性Mab用作对照物)稀释到合适的浓度，使得每20g体重腹腔施用每种mAb的总体积为0.5ml。需要指出的是，试剂在注射前以1∶1混合在一起。

表4

组编号	Matrigel(M)含量	处理
			1	M+DMEM	PBS
2	M+Panc-1	PBS
			3	M+Panc-1	CVaM+PBS
4	M+Panc-1	2H3(mIgG2a)+PBS
			5	M+Panc-1	2H3(mIgG2a)+C947(大鼠IgG1)
6	M+Panc-1	5F6(hIgG1)+PBS
			7	M+Panc-1	5F6(hIgG1)+C947(大鼠IgG1)
8	M+Panc-1	4D12(mIgG1)+PBS
			9	M+Panc-1	4D12(mIgG1)+C947(大鼠IgG1)

在第8天，将所有小鼠通过CO2窒息实施安死术。通过手术取出胶塞，并以盲的方式称重。分析1个胶塞/动物(右侧)的血红蛋白含量，其用作血管生成反应的间接指标。处理其他胶塞来用于总体图像分析。

数据(图10)表明，重组抗CD147 Mab，即2H3(mIgG2a)和5F6(hIgG1)单独或者与抗鼠CD147(c947)Mab组合使用时，显著抑制了体内血管生成。

实验2

为了评价并比较抗CD147 Mab(4A5，5F6)对PANC-1癌细胞衍生的CD147所刺激的血管生成的抑制效果，PANC-1癌细胞包埋在MATRIGEL胶塞中，并将MATRIGEL胶塞植入雌性SCID小鼠中。

MATRIGEL购自Becton Dickinson，Inc.，并且在11.1mg/ml浓度下使用。PANC-1人胰腺肿瘤细胞以无血清DMEM形式提供。

抗体使用鼠恒定区制备，以便效应子功能阳性同种型(E+mIgG2a)和效应子阴性同种型(E-mIgG1)都能代表每对可变结构域。

将得自Charles Rivers(Raleigh，N.C.)的42只雌性SCID小鼠(6周龄)群居饲养(7只/笼)在顶部通风的塑料笼中，并提供给可自由采食的蒸汽灭菌的食物和水。研究的第0天，将42只SCID小鼠剃毛，并随机分成6组(n＝7只/组)。在第1天，在植入matrigel胶塞前3小时，腹腔注射0.2mL/20g体重(10mg/kg)的测检物，然后在第5天重复该操作。

将小鼠称重，并用氯胺酮/甲苯噻嗪(90/10mg/kg，腹腔注射)麻醉。除了一组外，其他小组在两个部位注射0.5ml的MATRIGEL。

在第9天，使所有小鼠安乐死，通过手术取出胶塞，并以盲的方式称重。分析胶塞的血红蛋白含量，作为血管生成反应的间接指标。

进行血红蛋白水平的分析，每只小鼠平均测量两次。

表5

以上数据表(表5)按组显示了血红蛋白的估计平均值和标准误差以及置信区间。含有未处理的MATRIGEL和Panc-1细胞的胶塞具有最高的血红蛋白水平：25.10±15.06mg/g。E+5F6(CNTO 7603)组具有最低的血红蛋白水平：0.26±0.21mg/gm。

总体F检验P值＜为0.001。这证实在组之间具有显著的统计学差异。在组之间都进行两两比较。不含细胞的胶塞的PBS处理组显著小于含有Panc-1细胞的未处理(PBS)组、E-425(CNTO7709)组以及E-5F6(CNTO 8261)组(p值分别为＜0.001、＜0.001和0.002)。不含细胞的胶塞的PBS处理组与E+组(即，E+4A5(CNTO8261)和E+5F6(CNTO7603))之间没有检测到统计学差异。

当用E+Mab处理的含有细胞的MATRIGEL组与含有细胞的PBS组相比较时，检测到血红蛋白含量明显减少。E+4A5(CNTO 9633)比具有含细胞的MATRIGEL的PBS组小97％±3％(p值＜0.001)，E+5F6(CNTO7603)比具有含细胞的MATRIGEL的PBS组小99％±1％(p值＜0.001)。在具有含细胞的MATRIGEL的PBS组与E-5F6(CNTO8261)处理组之间的血红蛋白差异几乎达到统计学显著性(p值＝0.072)。在具有含细胞的MATRIGEL的PBS组与E-4A5(CNTO7709)组之间只检测到23％±66％的差异(p值＝0.753)。

在比较两个4A5组时，E+(CNTO9633)的血红蛋白水平显著小于E-(CNTO7709)的血红蛋白水平。估计差异为99％±3％(p-值＜0.001)。在比较两个5F6组时，E+(CNTO7603)的血红蛋白含量显著小于E-(CNTO8261)的血红蛋白含量。估计差异为95％±5％(p值＝0.004)。

在两个E+(CNTO9633与CNTO7603)组之间或在两个E-组(CNTO7709与CNTO8261)之间没有检测到显著的差异。在比较两个4A5组时，E+4A5的血红蛋白含量显著低于E-4A5的血红蛋白含量。在比较5F6组时，E+5F6的血红蛋白含量显著低于E-5F6的血红蛋白含量。在E+组之间或在两个E-组之间没有检测到显著的差异。数据表明，E+而不是E-、5F6和4A5在Panc-1 matrigel胶塞模型中抑制肿瘤血管生成。

MDA-MB-231原位异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长的抑制

为了确定抗CD147功能阻断抗体对肿瘤进展的抗癌效果，用E+4A5(MuIgG2a)或E+5F6(MuIgG2a)处理移植有MDA-MB-231人乳腺癌细胞的SCID米色突变小鼠。

在第0天，用氯胺酮/甲苯噻嗪(90/10mg/kg腹腔注射)麻醉40只雌性SCID米色突变小鼠。在动物的右腋下第二或第三乳腺脂肪垫中原位植入0.05ml(2.5×10⁶细胞)的MDA-MB-231细胞悬浮液。

所有动物在研究开始时和在整个研究过程中每周一次进行称重。当平均肿瘤体积介于60-70mm3之间时，将动物分为三组，每组8个动物，在研究的剩余时间(共50天)对每一组每周两次分别施用1mg/Kg的仅PBS、E+5A6或E+4A5。每周用卡尺在两个维度(长度和宽度)测量肿瘤生长(mm)，并基于公式[长度×宽度×宽度]/2计算肿瘤体积(mm3)。

在研究结束时，将小鼠通过CO2窒息实施安死术。切除原发性肿瘤并在数字天平上称重。取出肺并称重，用墨汁灌注肺转移瘤，并置于Fekete’s溶液中以盲的方式计数癌细胞转移。

结果

对于肿瘤体积，将重复的测量模型对假定一阶自相关协方差结构的数据进行拟合。使用天然样条以模拟时间曲线中的趋势曲率。在每个时间点上进行组内的成对比较。通过R软件环境进行计算。

应用经典ANOVA以及耐抗和稳健的ANOVA对肺癌细胞转移进行计数，并比较两种方法的结果。两种分析得出的结论是相同的，然而，组内等方差性的假设和从正态分布抽样对于实施耐抗和稳健分析而言更为合理。

示出了原发性肿瘤生长曲线(图11)。在启动处理后第7天开始，E+4A5(muIgG2a)组和E+5F6(muIgG2a)组中的肿瘤生长与PBS对照组相比表现出显著抑制(对于所有成对比较，p＜0.001；如需详细统计数据，可参见附录1)。此差异随着天数的增加而增大。用E+4A5(muIgG2a)处理导致在第7天至第28天比E+5F6(muIgG2a)显著更小的肿瘤体积。

E+5F6(muIgG2a)和E+4A5(muIgG2a)两者相对于PBS组都显著增加(即延迟)肿瘤体积达到1500mm³的时间的平均时间(两者p值＝＜0.001)。E+4A5(muIgG2a)与E+5F6(muIgG2a)相比也显著增加达到1500mm3阈值的天数(18％±6％；p值＝0.004)。

此数据表明E+抗EMMPRIN抗体在此剂量能抑制原发性肿瘤生长。

PBS组中小鼠的所有肺都含有许多肺转移瘤(平均值±标准偏差＝122±14.0)，而E+4A5(muIgG2a)和E+5F6(muIgG2a)抗体处理组的肺中的转移病灶的数量显著减少(分别为17.8±12.1和17.5±13.7)，总的P值＜为0.001。在E+5F6(muIgG2a)和E+4A5(muIgG2a)处理组之间没有检测出肺转移瘤数量的显著差异(p值＝0.970)。在分别经E+5F6(muIgG2a)和E+4A5(muIgG2a)处理的两个组中，小鼠都明显无肺转移瘤(每组1只小鼠)。这些结果表明EMMPRIN中和可抑制来自原发性MDA-MB-231原位肿瘤的肺转移瘤的形成，或延迟来自原发性MDA-MB-231原位肿瘤的肺转移瘤的生长。

实例9：表位绘图

在人CD147上的4A5和5F6 MAB的结合位点通过抗体竞争结合分析、H/D交换和单点诱变的组合来定义，并在已公布的和内部产生的人EMMPRIN片段结构的背景下进行解释。结果表明，抗体结合到CD147的胞外域中的相似表位。

对于H/D交换，将重组CD147 ECD N结构域(Asp19至Asn117-hexahis)在重水溶液中温育预定的时间，从而导致在可互换的氢原子位点结合氘。在含有固定的4A5 Fab(用具有C端His标签的大肠杆菌(E.coli)表达)或5F6mAb的柱子上捕集含重氢的EMMPRIN，然后用含水缓冲液洗涤。将反向交换的CD147结构域蛋白从柱子洗脱，并用蛋白酶消化和质谱分析确定含氘片段的位置。推断与抗体结合的区域为相对保护不被交换的那些位点，因此这些区域与不络合抗体的CD147相比含有较高比率的氘。Asp19至Asn117-hexahis的H/D交换扰动示于图12。

4A5的H/D交换数据涉及两个片段(Leu90-Asn98＞Asp65-Phe74)。然而，这两个片段位于N结构域试剂的三维构象的两个相对面，因此抗体与这两者都结合是不可能的。据观察，第90-98位残基缔合形成二聚体结构。在此区域中，在抗体之间观察到的H/D差异可能是由于4A5结合导致的结构(变构)稳定性所造成的。因此，Leu90-Asn98被排除，Asp65-Phe74为可能的表位区。用5F6抗体结合进行的H/D交换研究表明，抗体结合到Asp65-Phe74肽，并可能结合到Val30至Thr40区。这两个片段结构上相近，因此两者可能都是表位的部分。

人CD147的N端结构域的单点突变作为用双功能混合蛋白(BHP)展示技术绘制4A5抗体的表位的第二个独立的方法进行，所述双功能混合蛋白(BHP)展示技术来自Progenosis(Liège，Belgium)(Chevigne等人，2007，《免疫学方法杂志》(J Immunol Methods)，30：81-93)。D45、G69和Q70这三个单点突变显著降低了与4A5mAb的结合。H/D交换鉴别出这些残基中的G69和Q70两者位于Asp65-Phe74片段中。第三个残基D45位于邻近69GQ70的柔性环中。这表明了每个结合域与靶CD147蛋白的接合方式的相似性，以及表位位于₆₅DALPGQKTEF₇₄肽中，但是₃₀VEDLGSKILLT₄₀区域也可能有助于5F6结合表位。

在用CD147 Asp19-Asn117-Fc融合蛋白包被的微滴板上开展竞争ELISA，以评估对2H3、4A4和5F6mAb的结合特异性。标记的2H3mAb在室温下与不同浓度的mAb预温育30分钟。然后将这些混合物加入抗原包被的微孔中。在37℃下温育2小时后，彻底洗涤微滴板，并检测结合的2H3。结果显示4A5和5F6两者都与2H3mA竞争(图13)。该数据表明2C8与2H3和5F6两者相比竞争优势明显(IC50为约30nM)，但是2H3和5F6相互竞争表现不佳(IC50为约1μM)。这些数据表明2H3和5F6具有不同的表位，并且两者接近2C8结合位点或与2C8结合位点重叠。

总而言之，这些结果将4A5的表位定位于Asp65-Phe 74区域中，和中心靠近Asp45的环区域(40-50)中。5F6mAb的结合位点也定位于Asp65-Phe74以及Val30-Thr40。

Claims

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其竞争结合到CD147上的表位，所述CD147上的表位被选自2H3、4A5和5F6的单克隆抗体结合，所述2H3、4A5和5F6具有SEQ ID NO：9、11和13中的一个表示的轻链互补决定区(CDR)的氨基酸序列和SEQ ID NO：10、12和14中的一个表示的重链CDR的氨基酸序列。

2.一种分离的抗体，其包含重链CDR1、CDR2和CDR3(Hc-CDR1、Hc-CDR2和Hc-CDR3)氨基酸序列和轻链CDR3(Lc-CDR3)，所述氨基酸序列分别选自以SEQ ID NO：10、12和14示出的序列，所述轻链CDR3如化学式(I)中所示：

Gln Gln Xaa₁ Tyr Ser Xaa₂ Pro Xaa₃ Thr

(I)

其中Xaa₁为Tyr或Asp；Xaa₂为Tyr或Ser；Xaa₃为Phe或Tyr或无；以及Xaa₄为Thr或Phe；以及轻链CDR1(Lc-CDR1)和轻链CDR2(Lc-CDR2)氨基酸序列，所述序列分别选自SEQ ID NO：9和11中所示的序列。

3.一种分离的抗体，其具有SEQ ID NO：10所示的Hc-CDR1氨基酸序列、Hc-CDR2氨基酸序列和Hc-CDR3氨基酸序列以及SEQ ID NO：9所示的Lc-CDR1氨基酸序列、Lc-CDR2氨基酸序列和Lc-CDR3氨基酸序列。

4.一种分离的抗体，其具有SEQ ID NO：12所示的Hc-CDR1氨基酸序列、Hc-CDR2氨基酸序列和Hc-CDR3氨基酸序列以及SEQ ID NO：11所示的Lc-CDR1氨基酸序列、Lc-CDR2氨基酸序列和Lc-CDR3氨基酸序列。

5.一种分离的抗体，其具有SEQ ID NO：14所示的Hc-CDR1氨基酸序列、Hc-CDR2氨基酸序列和Hc-CDR3氨基酸序列以及SEQ ID NO：13所示的Lc-CDR1氨基酸序列、Lc-CDR2氨基酸序列和Lc-CDR3氨基酸序列。

6.一种分离的抗体，其具有SEQ ID NO：16所示的Hc-CDR1氨基酸序列、Hc-CDR2氨基酸序列和Hc-CDR3氨基酸序列以及SEQ ID NO：15所示的Lc-CDR1氨基酸序列、Lc-CDR2氨基酸序列和Lc-CDR3氨基酸序列。

7.一种分离的重组抗CD147抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含人恒定区，其中所述抗体或抗原结合片段(i)具有与4A5Mab相同的表位特异性，所述表位特异性如在CD147上通过H/D交换来确定，包括SEQ ID NO：11和12，以及(ii)以至少1×10^-7M的K_D与人CD147的所述表位结合。

8.一种人源化抗体，其包含人源化重链和人源化轻链，其中：

a)所述人源化重链可变区包含来自所述小鼠4A5重链(SEQ ID NO：12)的三个互补决定区(CDR)和来自人受体抗体重链的骨架，以及

b)所述人源化轻链可变区包含来自所述小鼠4A5轻链(SEQ ID NO：11)的三个互补决定区和来自人受体抗体轻链的骨架；以及

c)其中所述人源化抗体特异性地结合到MDA-MB-231细胞表面上的CD147抗原。

9.根据权利要求1-8中任何一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与人CD147的所述结合抑制人CD147的病理活性。

10.一种抑制肿瘤生长的方法，其包括使肿瘤与有效量的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分接触，所述单克隆抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO：1表示的第64-75位氨基酸的表位结合，并且所述单克隆抗体或其抗原结合部分在存在人MDA-MB-231细胞的情况下抑制从人成纤维细胞中产生MMP-2。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述肿瘤选自结肠癌、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、鳞状上皮细胞癌和肺癌。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分被全身施用。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体被位点特异性地施用。

14.一种抑制血管生成的方法，其包括使组织与有效量的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分接触，所述单克隆抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO：1(DALPGQKTEF)表示的第64-75位氨基酸的表位结合，并且所述单克隆抗体或其抗原结合部分在存在人MDA-MB-231细胞的情况下抑制从人成纤维细胞产生MMP-2。

15.一种免疫易感染与病理CD147生物活性相关的病症的受试者的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO：1(DALPGQKTEF)表示的第64-75位残基的多肽。

16.一种制品，其包含药用制剂，所述药用制剂包含权利要求1-8中任一项所述的抗体。