CN102316877A - 治疗减数分裂驱动蛋白相关疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供通过给予减数分裂激酶的抑制剂治疗减数分裂激酶(优选减数分裂激酶HSET)相关疾病的方法。优选地，所述疾病与存在超数中心体相关，例如癌症。本发明还提供通过将细胞与减数分裂激酶(优选HSET)的抑制剂接触而抑制肿瘤细胞生长的方法。本发明还提供用于鉴定减数分裂激酶HSET的抑制剂的筛选方法。本发明还提供选择用减数分裂激酶(如HSET)的抑制剂进行治疗的受试者的方法。

Description

治疗减数分裂驱动蛋白相关疾病的方法

背景技术

中心体通过在有丝分裂过程中促进双极纺锤体装配在染色体均等分离(equal segregation)中发挥重要作用(Doxsey，S.(2001)Nat Rev Mol Cell Biol 2：688-698)。对中心体复制的紧密控制以将其限制为每细胞周期一次确保了正常细胞以两个中心体或微管组织中心(MTOC)进入有丝分裂。不能正确控制中心体的数目和功能可导致多极纺锤体、非整倍性、细胞极性的破坏和不对称细胞分裂的故障(Heneen，W.K.(1970)Chromosoma 29：88-117；Nigg，E.A.(2002)Nat Rev Cancer 2：815-825)。 

中心体数目的增加，常常称之为中心体扩增，是实体和血液癌症的常见特征。中心体扩增与肿瘤细胞系、小鼠肿瘤模型和人类肿瘤中的非整倍性和恶性行为相关(D′Assoro，A.B.等人，(2002)Breast Cancer Res Treat 75：25-34；Giehl，S.等人，(2005)Leukemia 19：1192-1197.；Levine，D.S.等人，(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88：6427-6431；Lingle，W.L.等人，(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95：2950-2955；Pihan，G.A.等人，(2003)Cancer Res 63：1398-1404)。多种肿瘤抑制基因或致癌基因的突变或失调与中心体扩增相关(Fukasawa，K.(2007)Nat Rev Cancer 7：911-924)。原则上，中心体扩增可能源于几种类型的细胞分裂错误：中心体过度复制、中心体从头合成、细胞融合或胞质分裂故障(Boveri，T.(1929)The Origin of Malignant Tumors (Baltimore：Williams and Wilkins)；Ganem，NJ.等人，(2007)Curr Opin Genet Dev 17：157-162；Nigg，E.A.(2002)Nat Rev Cancer 2：815-825)。 

超数中心体(supernumerary centrosomes)在肿瘤生物学中的作用很可能是多方面的。尽管多中心体可能通过促进非整倍性和/或破坏细胞极性而促使肿瘤发生，但由于对于多极有丝分裂的潜能，它们也可以对成熟癌的生长造成适合度代价(fitness cost)。为避免这一问题，许多癌细胞看起来具有 抑制多极有丝分裂的机制，研究最多的是超数中心体群集成两组而使得双极有丝分裂成为可能(Brinkley，B.R.(2001)Trends Cell Biol 11：18-21；Nigg，E.A，(2002)Nat Rev Cancer 2：815-825；Ring，D.等人，(1982)J Cell Biol  94：549-556)。 

尚未完全理解肿瘤细胞中的中心体群集，然而，预计其很大程度上依赖于组织纺锤体极的微管相关蛋白(MAP)和马达(Karsenti，E.和Vernos，I.(2001)Science 294：543-547；Nigg，E.A.(2002)Nat Rev Cancer 2：815-825)。例如，最近的工作发现中心体群集中需要胞质动力蛋白(一种朝向负端的微管(MT)马达)和NuMA(一种纺锤体相关MAP)(Quintyne，NJ.等人，(2005)Science 307：127-129)。抑制多极有丝分裂的机制的存在使得新的癌症治疗策略成为可能：干扰中心体群集机制的药物可能对含有多个中心体的肿瘤细胞是致命的，但可能不伤害正常细胞。尽管几种药物，包括紫杉醇，能够促进多极有丝分裂，但没有一种是对带有多中心体的细胞特异性的(Chen，J.G.和Horwitz，S.B.(2002)Cancer Res 62：1935-1938；Rebacz，B.等人，(2007)Cancer Res 67：6342-6350)。 

因此，仍然需要鉴定涉及肿瘤细胞中的中心体群集机制的成分。 

发明内容

本发明鉴定了肿瘤细胞中中心体群集机制中涉及的关键成分，并通过抑制这一组分证明了中心体去群集(declustering)能够在带有超数中心体的细胞中选择性诱导细胞死亡。这一关键成分，即减数分裂驱动蛋白HSET(驱动蛋白-14家族成员)，在正常细胞中对于有丝分裂并不是必需的，但在本文中证明其对带有额外中心体的肿瘤细胞的存活是必需的。因此，本发明提供了选择性杀死含有额外中心体的细胞(如癌细胞)而避免杀死正常细胞的靶标。 

因而，一方面，本发明涉及治疗减数分裂驱动蛋白相关疾病或病症的方法，所述方法包括向需要该治疗的受试者给予抑制减数分裂驱动蛋白的试剂从而获得对所述疾病或病症的治疗。在一个实施方案中，所述疾病或病症是常染色体疾病或病症。在优选实施方案中，所述疾病或病症是中心 体疾病或病症(例如，以存在超数中心体为特征)。在另一个优选实施方案中，所述疾病或病症是细胞增殖性疾病，如癌症或恶性疾病。优选地，所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族的成员，最优选地是HSET。抑制减数分裂驱动蛋白的适当试剂的例子包括RNAi试剂和小分子。在一个实施方案中，所述试剂抑制所述驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性。在另一个实施方案中，所述试剂抑制所述驱动蛋白的微管结合活性。该试剂可通过例如经口或胃肠外给予。 

另一方面，本发明涉及抑制肿瘤细胞生长的方法，其中细胞增殖与减数分裂驱动蛋白有关，所述方法包括将肿瘤细胞与抑制减数分裂驱动蛋白的试剂接触，从而抑制所述肿瘤细胞的生长。在优选实施方案中，所述肿瘤细胞包含超数中心体。优选地，所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族的成员，最优选地是HSET。抑制减数分裂驱动蛋白的适当试剂的例子包括RNAi试剂和小分子。在一个实施方案中，所述试剂抑制所述驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性。在另一个实施方案中，所述试剂抑制所述驱动蛋白的微管结合活性。所述肿瘤细胞可通过例如与该试剂一起培养该肿瘤细胞或通过直接注射该试剂至含有所述肿瘤细胞的肿瘤中或通过向携带含有所述肿瘤细胞的肿瘤的受试者给予该试剂而与该试剂接触。 

另一方面，本发明涉及抑制细胞增殖的方法，其中细胞增殖与减数分裂驱动蛋白有关，所述方法包括将所述细胞与抑制减数分裂驱动蛋白的试剂接触，从而获得细胞增殖的抑制。在优选实施方案中，所述细胞含有超数中心体。优选地，所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族的成员，最优选地是HSET。抑制减数分裂驱动蛋白的适当试剂的例子包括RNAi试剂和小分子。在一个实施方案中，所述试剂抑制所述驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性。在另一个实施方案中，所述试剂抑制所述驱动蛋白的微管结合活性。 

还有一方面，本发明涉及用于鉴定抑制减数分裂驱动蛋白HSET活性的化合物的方法，该方法包括 

提供包含减数分裂驱动蛋白HSET的指示组合物； 

将所述指示组合物与测试化合物接触；以及 

确定所述减数分裂驱动蛋白HSET在该测试化合物存在下的活性，其中，根据与不存在该测试化合物时该减数分裂驱动蛋白HSET的活性相比，存在该测试化合物时减数分裂驱动蛋白HSET活性的降低，将该测试化合物鉴定为抑制减数分裂驱动蛋白HSET活性的化合物。 

在优选实施方案中，所述指示组合物与测试化合物文库中的各个成员接触并选择所述文库内一种或多种抑制减数分裂驱动蛋白HSET活性的测试化合物。 

在一个实施方案中，所述减数分裂驱动蛋白HSET的活性通过测量该驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性而确定。在另一个实施方案中，所述减数分裂驱动蛋白HSET的活性通过测量该驱动蛋白的微管结合活性而确定。还有一个实施方案中，所述减数分裂驱动蛋白HSET的活性通过测量HSETmRNA或蛋白质的表达而确定。 

本发明也涉及分离的化合物，该化合物通过本发明的筛选方法鉴定。 

还有一方面，本发明涉及选择患有用抑制减数分裂驱动蛋白的试剂进行治疗的肿瘤的受试者的方法，该方法包括(i)从受试者获得肿瘤细胞样品，以及(ii)确定所述肿瘤细胞样品中的中心体数目，其中该肿瘤细胞样品中存在超数中心体则选择该受试者以用抑制减数分裂驱动蛋白的试剂进行治疗。优选地，所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族的成员，最优选地是HSET。优选地，样品中至少50％的肿瘤细胞含有超数中心体，更优选地，样品中至少75％的肿瘤细胞含有超数中心体，甚至更优选地样品中至少90％的肿瘤细胞含有超数中心体。 

附图说明

图1显示的方案是果蝇S2细胞中基因组范围RNAi筛选以鉴定其敲除导致多极纺锤体(中心体去群集)的基因。 

图2的柱状图是经单独的EGFP或Mad2 RNAi敲除或者EGFP或Mad2的RNAi敲除再加上MG132处理时带有异常纺锤体的S2细胞的百分数。 

图3的柱状图是经拉春库林(Latrunculin，LatA)、细胞松弛素D或伴刀豆球蛋白-A(Con-A)处理时带有异常纺锤体的S2细胞的百分数。 

图4的柱状图是经DMSO、LatA或DCB处理时在MCF-7、MDA-231、MMECS 4N或N1E-115细胞中带有多极纺锤体的细胞的百分数。 

图5的蛋白质印迹显示在MDA-231和MCF-7细胞中siRNA三天后HSET的耗损。 

图6的蛋白质印迹显示在MDA-231和MCF-7细胞中siRNA三天后Myo10的耗损。 

图7的柱状图显示经HSET或Myo10的siRNA处理在MCF-7或MDA-231细胞中带有多极纺锤体的细胞的百分数。 

图8的柱状图显示经HSET或Myo10的siRNA处理(都具有(+)或不具有(-)LatA)时带有多极纺锤体的有丝分裂细胞的百分数。 

图9的柱状图显示HSET siRNA处理6天后N1E-115细胞的细胞存活力损失和集落形成的抑制。 

图10的柱状图显示在各种癌细胞系中与带有额外中心体的细胞的份数成比例的HSET RNAi诱导的细胞死亡。 

具体实施方式

本发明鉴定了涉及肿瘤细胞中的中心体群集机制的关键成分。本发明还证明了中心体去群集能够在带有超数中心体的细胞中选择性地诱导细胞死亡。在至少一个实施方案中，本发明至少部分地基于下述发现：减数分裂驱动蛋白HSET(一种通常是非必需的驱动蛋白马达)对于含有额外中心体的细胞的存活力是必需的。肿瘤细胞中的多个中心体产生了多极分裂的可能，这可以导致非整倍性和细胞死亡。然而，许多肿瘤细胞由于抑制多极有丝分裂的机制而成功地分裂。果蝇S2细胞中基因组范围的RNAi筛选和癌细胞中的进一步分析明确了抑制多极有丝分裂的机制。特别地，现已证明减数分裂驱动蛋白HSET对于某些含有额外中心体的肿瘤细胞的存活力是必需的，抑制HSET导致细胞存活力的抑制(参见特别是本文的实 施例6和8)。因而，本文描述的发现，即朝向负端的马达HSET对群集额外中心体是必需的，提供了新的治疗策略：阻断中心体群集并促进多极有丝分裂以在带有高比例的含有多个中心体细胞的肿瘤中选择性地诱导死亡。本发明提供鉴定调节减数分裂驱动蛋白(如HSET)活性的试剂的方法，也提供治疗与减数分裂驱动蛋白活性相关的疾病或病症的方法，以及提供选择用减数分裂驱动蛋白抑制剂进行治疗的受试者的方法。 

为了更容易理解本发明，首先对一些术语进行定义。 

术语“驱动蛋白(kinesin)”是指在真核细胞中发现的一类马达蛋白，其能够通过水解ATP得到动力而沿微管运动。术语“减数分裂驱动蛋白”是指涉及减数分裂的细胞功能并且是减数分裂的细胞功能必需的驱动蛋白。 

术语“驱动蛋白-14家族成员”是指为驱动蛋白-14家族成员的驱动蛋白，该家族共有与其它驱动蛋白不同的共同的C末端马达结构域。驱动蛋白-14家族在本领域中也称为C末端驱动蛋白。驱动蛋白-14家族成员的非限制性例子包括人类蛋白HSET、CHO2、KIFC2和KIFC3，小鼠蛋白HSET和KIFC2，果蝇蛋白Ncd和酿酒酵母蛋白Kar3。 

术语“HSET”是指在本领域中也称为KIFC1(驱动蛋白家族成员C1)的驱动蛋白-14家族成员。人类HSET的mRNA和蛋白序列可分别通过Genbank登录号NM_002263和NP_002254获得。小鼠HSET的mRNA和蛋白序列可分别通过Genbank登录号NM_053173和NP_444403获得。人类HSET序列可例如通过具有保守突变或在非保守区的突变与Genbank登录号NP_002254的人类HSET不同，并且该HSET具有与Genbank登录号NP_002254的人类HSET基本相同的生物功能。特定人类HSET序列一般与人类HSET氨基酸序列(如Genbank登录号NP_002254)至少90％一致，并含有当与其它物种(如小鼠)HSET氨基酸序列比较时确认氨基酸序列为人类的氨基酸残基。在一些情况下，人类HSET在氨基酸序列上可以与如Genbank登录号NP_002254的人类HSET是至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％一致。在一些实施方案中，人类HSET序列将显示与如Genbank登录号NP_002254的人类HSET的不超过10个氨基酸的差异。 在一些实施方案中，人类HSET可以显示与如Genbank登录号NP_002254的人类HSET序列不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个的氨基酸差异。 

术语“减数分裂驱动蛋白相关疾病或病症”意指其发病机理需要已知在减数分裂中发挥功能的驱动蛋白活性的疾病或病症。 

术语“常染色体疾病或病症”意指其发病机理与非性染色体相关的疾病或病症。 

术语“中心体疾病或病症”意指其发病机理与中心体数目或活性改变相关的疾病或病症。 

术语“超数中心体”意指多于细胞中通常或规定数目的中心体，一般多于细胞中通常两个中心体的数目。 

术语“细胞增殖性疾病或病症”意指其发病机理与改变的或异常的细胞增殖相关的疾病或病症。 

用于本文中时，“抑制减数分裂驱动蛋白(如HSET)的活性”的试剂或化合物意指减少，或降低，或减轻减数分裂驱动蛋白活性的试剂或化合物，该抑制可以是部分的或完全的，并且其中这种“活性”可以是，例如，细胞中编码所述驱动蛋白的mRNA的表达、细胞中所述驱动蛋白的蛋白表达水平或所述驱动蛋白的酶活性或其它生物活性的表达，所述酶活性和其它生物活性的例子包括但不限于三磷酸腺苷酶活性和微管结合活性。 

术语“试剂”包括任何物质、分子、元素、化合物、实体或其组合。其包括但不限于，例如，蛋白质、寡肽、小的有机分子、多糖、多核苷酸等等。其可以是自然产物、合成化合物、或化学化合物、或两种或更多种物质的组合。除非另有说明，术语“试剂”、“物质”和“化合物”可相互替换地使用。 

用于本文中时，“反义”核酸包含与编码蛋白质的“正义”核酸互补的核苷酸序列，例如，与双链cDNA分子的编码链互补，与mRNA序列互补或与基因的编码链互补。因此，反义核酸可氢键连接至正义核酸。 

用于本文中时，“RNAi试剂”是指介导RNA干扰的试剂，如核酸分 子。RNA干扰(RNAi)是转录后的靶向基因沉默技术，其使用双链RNA(dsRNA)降解含有与该dsRNA相同序列的信使RNA(mRNA)(参见例如，Sharp，P.A.和Zamore，P.D.(2000)Science 287：2431-2432；Zamore，P.D.等人，(2000)Cell 101：25-33；Tuschl，T.等人，(1999)Genes Dev.13：3191-3197；Cottrell T.R.和Doering T.L.(2003)Trends Microbiol.11：37-43；Bushman F.(2003)Mol Therapy 7：9-10；McManus M.T.和Sharp P.A.(2002)Nat Rev Genet.3：737-47)。此过程在内源核酸酶将较长dsRNA切割成较短(例如21或22核苷酸长度的RNA，称为小干扰RNA或siRNA)时发生。然后较小的RNA片段介导靶标mRNA的降解。用于合成siRNA的试剂盒是可商业获得的，例如从New England Biolabs、Dharmacon或Ambion。因而，在一个实施方案中，“RNAi试剂”是作为siRNA分子的核酸分子。可用于经RNA干扰来使基因表达沉默的核酸分子的其它例子包括小发夹RNA(shRNA)和微RNA(miRNA)。因此，术语“RNAi试剂”也意图包括能够用来通过RNA干扰使基因表达沉默的分子，如shRNA、miRNA等等。 

用于本文中时，术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等等。 

治疗疾病或病症的方法

一方面，本发明涉及治疗疾病或病症的方法。特别地，本发明提供治疗减数分裂驱动蛋白相关疾病或病症的方法。该方法包括向需要该治疗的受试者给予抑制减数分裂驱动蛋白的试剂从而获得疾病或病症的治疗。 

优选地，所述疾病或病症是常染色体疾病或病症。更优选地，所述疾病或病症是中心体疾病或病症。甚至更优选地，所述疾病或病症是细胞增殖性疾病或病症。最优选地，所述疾病或病症是癌症、肿瘤或其它恶性疾病。优选地，所述癌症、肿瘤或其它恶性疾病是其中癌症、肿瘤或恶性疾病细胞包含超数中心体的一种癌症、肿瘤或其它恶性疾病。更优选地，至少50％的癌症、肿瘤或恶性细胞包含超数中心体，甚至更优选地至少75％的癌症、肿瘤或恶性细胞包含超数中心体，甚至更优选地至少90％的癌症、 肿瘤或恶性细胞包含超数中心体。可根据本发明的方法治疗的癌症的非限制性例子包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰癌、脑癌、胃癌、肾癌、肝癌、骨癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和黑色素瘤。 

与超数中心体累积有关的其它疾病或病症包括人乳头瘤病毒(HPV)感染，其包括HPV相关的宫颈瘤变(参见例如，Duensing，S.和Munger，K.(2002)Oncogene 21：6241-6248)。 

优选地，所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族成员。更优选地，所述减数分裂驱动蛋白是HSET。 

抑制减数分裂驱动蛋白(例如HSET)活性并且适合用于受试者的任何试剂可在本发明的治疗方法中使用。在优选实施方案中，所述试剂是RNAi试剂，如siRNA。如在实施例6和8中详细描述的，证明了人类HSET的siRNA抑制剂降低几种不同癌细胞系的存活力。可作为人类HSET的siRNA抑制剂发挥功能的核酸分子的非限制性例子包括SEQ ID NO：1-4中显示的寡核苷酸。可用于抑制减数分裂驱动蛋白(例如HSET)活性的其它试剂包括但不限于反义分子和小分子抑制剂(例如小的有机分子)。此类试剂可使用例如本文详细描述的HSET抑制剂的筛选分析来鉴定。在一个实施方案中，所述试剂抑制驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性。在另一个实施方案中，所述试剂抑制驱动蛋白的微管结合活性。 

本发明的试剂一般以药物组合物给予受试者。给予通过任何适合完成期望的治疗的途径。例如，在一个实施方案中，所述试剂经口给予。在另一个实施方案中，所述试剂经胃肠外给予。 

所述药物组合物一般包括与药学上可接受的载体一起配制的试剂。药物组合物可以以联合治疗给予，即与其它试剂结合。用于本文中时，“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理学上相容的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。优选地，所述载体适合经口、静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊椎或经皮给予(例如，通过注射或输注)。根据给予途径，活性试剂可包有防止该试剂受酸和其他可能灭活该试剂的天然条件的作用的材料。 

所述药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留了母体化合物的期望生物活性并且不产生任何不希望的毒性效应的盐(参见例如，Berge，S.M.等人，(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸的那些盐以及衍生自无毒有机酸的那些盐，所述无机酸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等等，所述有机酸如脂肪族单和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等等。碱加成盐包括衍生自碱土金属的那些盐以及衍生自无毒有机胺的那些盐，所述碱土金属如钠、钾、镁、钙等等，所述有机胺如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等等。 

药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化的羟基茴香醚(BHA)、丁基化的羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、丙基没食子酸酯、α-生育酚等等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等等。 

可用于所述药物组合物中的适当的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等等)及其适当的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。例如，可通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散的情况下通过维持需要的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。 

这些组合物还可含有辅剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌程序，在前，以及通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚山梨酸等等)确保防止微生物的存在。也可能希望的是包括等渗剂(如糖、氯化钠等等)在组合物中。另外，可通过包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)延长可注射药物形式的吸收。 

药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液和用于即时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。使用此类用于药学活性物质的介质和试剂是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与该活性化合物不相容，其 在本公开的药物组合物中的使用可设想的。也可向所述组合物中引入补充的活性化合物。 

治疗组合物一般在制备和储存条件下必然是无菌的和稳定的。所述组合物可配制为溶液、微乳剂、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等等)及其适当混合物的溶剂或分散介质。可通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散的情况下通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，优选包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠于组合物中。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶来延长可注射组合物的吸收。 

可通过以需要的量添加活性化合物到具有一种上面列举的成分或其组合(根据需要)的适当溶剂中，然后进行灭菌微过滤来制备无菌注射溶液。一般而言，分散剂通过添加活性化合物至含有基本分散介质和需要的来自上面列举的成分的其它成分的无菌载体中制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干法)以由预先过滤的活性成分和任何额外的期望成分产生活性成分加上任何额外期望成分的粉末。 

可与载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量将根据受治疗的受试者以及特定给药模式而变化。可与载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量一般为产生治疗效应的组合物的量。一般而言，在百分之百中，这一量的范围为大约百分之0.01至大约百分之九十九的活性成分，优选地为大约百分之0.1至大约百分之70，最优选地是大约百分之1至大约百分之30的活性成分与药学上可接受的载体结合。 

调整给药方案以提供最优的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可给予单一的丸剂、可经一段时间给予几次分剂量或者可根据治疗情况的紧迫性所指示的按比例降低或增加剂量。尤其有利地是以单元剂量形式配制胃肠外组合物从而方便给予以及获得剂量的均一性。本发明所用的单元剂量形式是指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理离散的单元；各单元含有与需要的药学载体结合的经计算可产生期望治疗效应的预定量的 活性化合物。本公开的单元剂量形式的规格根据以下因素规定并直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征和需获得的特定治疗效应，和(b)配合这种活性化合物用于个体灵敏治疗的领域中的固有限制。 

可改变药物组合物中活性成分的实际剂量水平，从而得到对于特定患者、组合物和给药模式有效获得期望的治疗反应而对该患者是无毒的活性成分的量。选定的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本文公开的特定组合物或其酯、盐、酰胺的活性，给药途径，给药时间，所用特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所用特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料，受治疗患者的年龄、性别、体重、状态、一般健康和以前医疗史及医学领域熟知的类似因素。 

药物组合物可使用本领域已知的多种方式中的一种或多种，通过一种或更多种给药途径给予。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或模式将根据期望的结果而变化。优选的给药途径包括经口、静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其它胃肠外给药途径，例如通过注射或输注。本文使用的短语“胃肠外给予”意思为除肠内和局部给予以外的其它给药模式，通常通过注射，且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内，囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。 

活性化合物可利用阻止化合物快速释放的载体制备，如控释制剂，包括植入物、透皮贴片和微囊递送系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的许多方法是获得专利的或一般为本领域技术人员所知的。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。 

治疗组合物可通过本领域已知的医疗装置给予。例如，治疗组合物可通过无针皮下注射装置给予，所述装置如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。本发明中有用的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号 4,486,194，其公开了用于通过皮肤给予药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流的可植入输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多室隔间的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。这些专利通过引用并入本文。许多其它此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。 

在一些实施方案中，可配制药物组合物以确保合适的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性的化合物。为保证治疗剂穿过BBB(如果需要)，其可配制于例如脂质体中。制造脂质体的方法参见例如美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。该脂质体可包含一个或多个选择性运输至特定细胞或器官中的部分，从而增强靶向药物递送(参见例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，授予Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人，(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人，(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。 

细胞生长或繁殖的抑制

另一方面，本发明涉及抑制细胞生长的方法。例如，本发明提供抑制其中细胞增殖与减数分裂驱动蛋白有关的肿瘤细胞生长的方法，其包括将肿瘤细胞与抑制减数分裂驱动蛋白的试剂接触，从而抑制肿瘤细胞的生长。优选地，该肿瘤细胞包含超数中心体。优选地，所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族的成员，最优选地是HSET。所述试剂可以是，例如RNAi试剂、反义分子或小分子，如上面更详细描述的。在一个实施方案中，所述试剂抑制所述驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性。在另一个实施方案中，所述试剂抑制所述驱动蛋白的微管结合活性。 

所述肿瘤细胞可通过例如与试剂一起培养肿瘤细胞而与所述试剂接触。附加地或替代地，所述肿瘤细胞可通过直接注射所述试剂至含有肿瘤细胞的肿瘤中而与试剂接触。附加地或替代地，所述肿瘤细胞可通过给予所述试剂至携带含有所述肿瘤细胞的肿瘤的受试者而与试剂接触。 

另一方面，本发明提供抑制细胞增殖的方法，其中细胞增殖与减数分裂驱动蛋白有关，所述方法包括将细胞与抑制减数分裂驱动蛋白的试剂接触，从而获得细胞增殖的抑制。优选地，所述细胞含有超数中心体。优选地，所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族的成员，最优选地是HSET。所述试剂可以是，例如RNAi试剂、反义分子或小分子，如上面更详细描述的。在一个实施方案中，所述试剂抑制所述驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性。在另一个实施方案中，所述试剂抑制所述驱动蛋白的微管结合活性。 

所述细胞可通过例如与所述试剂一起培养细胞而与试剂接触。附加地或替代地，所述细胞可通过直接注射该试剂至含有细胞的肿瘤中而与试剂接触。附加地或替代地，所述细胞可通过给予所述试剂至携带该细胞的受试者而与试剂接触。 

筛选方法

另一方面，本发明涉及鉴定抑制减数分裂驱动蛋白(如HSET)活性的化合物的方法。例如，本发明提供鉴定抑制减数分裂驱动蛋白HSET活性的化合物的方法，该方法包括 

提供包含减数分裂驱动蛋白HSET的指示组合物； 

将所述指示组合物与测试化合物接触；以及 

确定所述减数分裂驱动蛋白HSET在该测试化合物存在下的活性，其中，与不存在该测试化合物时所述减数分裂驱动蛋白HSET的活性相比，存在该测试化合物时该减数分裂驱动蛋白HSET活性的降低将该测试化合物鉴定为抑制减数分裂驱动蛋白HSET活性的化合物。 

指示组合物可以是，例如，含有(即表达)HSET的细胞或含有HSET的无细胞组合物。如果指示组合物是含有(即表达)HSET的细胞，其可以是天 然地表达HSET或已被工程化(例如通过标准重组DNA技术)以表达或过表达HSET的细胞。天然表达HSET的细胞包括但不限于癌细胞系MDA-231、MMEDX 4N和N1E-115，以及实施例中描述的其它细胞系。为工程化细胞系以表达人类HSET，人类HSET cDNA(具有Genbank登录号NM_002263所示的序列)可通过标准方法(如PCR扩增)获得、使用标准重组DNA技术插入到表达载体中和转染至宿主细胞中。为获得无细胞组合物中的HSET，HSET可使用本领域已知的方法纯化。例如，DeLuca，J.G.等人，(2001)J.Biol.Chem.276：28014-28021描述了从HeLa细胞纯化人类HSET。本领域已经描述了可用于通过标准的免疫亲和技术纯化HSET的抗HSET抗体。 

该方法的“接触”步骤可包括，例如，与含有(即表达)HSET的细胞一起孵育测试化合物或与含有HSET的无细胞组合物一起孵育测试化合物。 

可使用多种可能的“读出器”中的一种或多种实施“确定减数分裂驱动蛋白HSET的活性”的步骤。例如，在一个实施方案中，HSET的活性通过测量表达HSET的细胞中HSET mRNA的水平而确定，其中如果与在不存在该测试化合物时的水平相比降低了HSET mRNA的表达水平，则该测试化合物是HSET活性的抑制剂。测量HSET mRNA水平的方法是本领域已经确立的，包括但不限于RNA印迹分析和PCR扩增方法。在另一个实施方案中，HSET的活性通过测量表达HSET的细胞中HSET蛋白的水平而确定，其中如果与在不存在该测试化合物时的水平相比降低了HSET蛋白的表达水平，则该测试化合物是HSET活性的抑制剂。测量HSET蛋白水平的方法是本领域已经确立的，包括但不限于蛋白质印迹分析和免疫沉淀法。 

在其它实施方案中，HSET的活性通过测量HSET的一种或多种酶活性或生物活性而确定。例如，已经证明当紫杉醇稳定的微管与纯化的HSET接触时，纯化的HSET已证明产生微管滑动(microtubule gliding)(参见DeLuca，J.G.等人，(2001)J.Biol.Chem.276：28014-28021)。因而，在一个实施方案中，可与测试化合物不存在时HSET介导的微管滑动相比，体外确定测试化合物对HSET介导的微管滑动的效应，从而确定该测试化合物对HSET活性的效应。 

附加地或替代地，可确定测试化合物对HSET三磷酸腺苷酶活性的效应。例如，DeBonis，S.等人，(2004)Mol.Cancer Ther.3：1079-1090描述了用于鉴定有丝分裂驱动蛋白Eg5的抑制剂的微管激活的三磷酸腺苷酶分析法。相似地，这种微管激活的三磷酸腺苷酶分析法可用于纯化的HSET以确定测试化合物对HSET的三磷酸腺苷酶活性的效应。因而，在一个实施方案中，减数分裂驱动蛋白HSET的活性通过测量驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性而确定。 

可在确定测试化合物对HSET活性的效应中用作“读出器”的HSET的其它生物活性包括但不限于微管结合活性和中心体群集活性。因而，在其它实施方案中，减数分裂驱动蛋白HSET的活性通过测量驱动蛋白的微管结合活性或中心体群集活性而确定。 

已经发现在细胞中过表达HSET基因导致生长停滞和细胞死亡。因此，本发明还提供基于细胞的分析以确定测试化合物对HSET诱导的生长停滞和细胞死亡的效应，由此鉴定HSET的调节剂(例如抑制剂)。一般而言，这些分析包括下述步骤：(a)提供包含重组表达载体的指示细胞，该重组表达载体包含可操作地与启动子连接的HSET基因，处于所述HSET基因在所述指示细胞中表达的条件下；(b)将所述指示细胞与测试化合物接触；和(c)确定所述测试化合物对HSET诱导的生长停滞和细胞死亡的效应，其中与该测试化合物不存在时HSET诱导的生长停滞和细胞死亡相比，所述测试化合物存在时HSET诱导的生长停滞和细胞死亡的减弱将该测试化合物鉴定为抑制减数分裂驱动蛋白HSET的活性的化合物。在一个实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。可考虑任何本领域公认的诱导型启动子系统，包括但不限于蜕皮激素诱导系统(参见例如，Wakita等人，2001，Biotechniques 31：414)。测量细胞增殖和细胞存活力的方法是本领域熟知的(参见例如，Wilson，A.P.，Cytotoxicity and Viability Assays in Animal Cell Culture：A Practical Approach，第三版(编辑Masters，J.R.W.)Oxford University Press：oXford 2000，Vol.1.；和Mosmann，T.，Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival：Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays.J.Immunol.Meth.1983，65，55-63.)。 

在优选实施方案中，在本发明的筛选分析中筛选化合物的文库以鉴定文库内表现出抑制HSET活性的能力的化合物。因而，在优选实施方案中，上述指示组合物与测试化合物文库的各成员接触并选择文库内抑制减数分裂驱动蛋白HSET活性的一个或多个测试化合物。 

还有一方面，本发明涉及通过本发明的筛选方法鉴定的分离的化合物。 

选择受试者的方法

另一方面，本发明涉及选择用抑制减数分裂驱动蛋白(如HSET)的试剂进行治疗的受试者的方法。如本文所证明的，HSET活性的抑制选择性地降低含有额外中心体的细胞(如癌细胞)的存活力。因此，携带包含具有额外中心体的细胞的肿瘤的受试者特别有利于用抑制减数分裂驱动蛋白(如HSET)的试剂治疗。因而，另一方面，本发明提供选择患有用抑制减数分裂驱动蛋白的试剂进行治疗的肿瘤的受试者的方法，该方法包括(i)从受试者获得肿瘤细胞样品，以及(ii)确定所述肿瘤细胞样品中的中心体数目，其中所述肿瘤细胞样品中存在超数中心体则选择该受试者以用抑制减数分裂驱动蛋白的试剂进行治疗。确定细胞中中心体数目的方法是本领域熟知的，且可应用于这一受试者选择方法。例如，中心体可使用抗γ微管蛋白抗体和荧光标记的二抗进行荧光染色，然后进行免疫荧光成像来定量每细胞的中心体数目(在实施例中进一步描述)。 

优选地，所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族的成员，更优选地是HSET。优选地，所述肿瘤细胞样品中至少50％的肿瘤细胞含有超数中心体。更优选地，所述肿瘤细胞样品中至少75％的肿瘤细胞含有超数中心体。甚至更优选地，所述肿瘤细胞样品中至少90％的肿瘤细胞含有超数中心体。 

本发明通过下述实施例进一步示例性说明，这些实施例不应解释为进一步的限制。本申请全文中引用的所有参考文献、Genbank条目、专利和公开的专利申请的内容通过引用全文明确地并入本文中。 

实施例1：鉴定用于治疗减数分裂驱动蛋白相关疾病或病症的治疗靶标 

在这一例子中，使用RNAi筛选以全面阐明群集超数中心体需要的分子途径。在表征的8个果蝇细胞系中，近-四倍体S2细胞最适合筛选，因为＞50％的细胞含有在有丝分裂过程中有效地群集至两极的额外中心体。图1图示了基因组范围筛选的方案，其提供了初级和次级筛选过程的细节。 

筛选了靶向～99％的果蝇基因组(～14,000个基因)的23,172个dsRNA，以鉴定其敲除导致S2细胞中的多极纺锤体(中心体去群集)的基因。S2细胞暴露于dsRNA 4天，并在RNAi处理最后9小时的过程中通过蛋白质组抑制剂MG 132处理富集有丝分裂象。细胞进行DNA、微管(MT)和中心体染色，然后使用高通量自动显微镜用20X物镜获得图像。 

更具体地，S2细胞以1x10⁴细胞/孔的密度接种于384孔板的无血清Schneider培养基中，该384孔板预先铺有0.25μg dsRNA(dsRNAs可从Drosophila RNAi Screening Center，DRSC，http://flyrnai.org获得)。细胞与dsRNA一起在室温下(RT)于无血清培养基中孵育40分钟，然后加入含血清培养基并孵育3.5天以耗尽蛋白质。为阻断中期-后期转变，25μM MG 132(一种蛋白质组抑制剂)在RNAi处理结束时(3.5天RNAi处理的细胞)加入并孵育另外9小时(总计大约4天RNAi孵育)。为协助有丝分裂细胞的粘附，RNAi处理的细胞进行重悬浮，转移至预先涂覆有伴刀豆球蛋白A(Con-A，0.25mg/ml)的新384孔板，然后该板以1,000rpm旋转1分钟。细胞在于PBS(pH 7.2)中的4％多聚甲醛(PFA)中固定，用PBS-Triton 0.01％(PBST)渗透，与PBST中的0.5％SDS一起孵育，并于4℃保持于PBST中直至进行免疫染色。 

对于初级筛选，固定的细胞分别用FITC-抗-α微管蛋白(DM1A，1∶300，Sigma)和小鼠抗-γ微管蛋白(GTU88，1∶500)抗体进行MT和中心体染色。Alexa Fluor 568或594驴抗小鼠IgG用作二抗(1∶1000)。细胞用于PBST中的Hoechst 33342(1∶5000，Invitrogen)进行DNA染色并于4℃储存于同样的溶液中。 

对于初级筛选，细胞使用20X空气物镜用自动显微镜成像，自动显微 镜为ImageXpress Micro(Molecular Devices，ICCB，倒置全自动落射荧光显微镜，激光自动对焦，配有Photometries CoolSNAP ES数字CCD像机，MetaXpress用于分析)或Discovery-1(Mol ecular Devices，DRSC，自动滤波器和分色轮以及六物镜转动架，高速激光自动对焦，且在多孔板中每次测定可测量多达八个荧光团)。在FITC上(MT)进行自动对焦，并对于三通道(Hoechst、Cy3和FITC)从单个焦平面获得图像。 

次级筛选在96孔板(对于5x10⁴细胞/孔使用1μg dsRNA/孔)中进行，并遵循几乎与初级筛选相同的方法。RNAi结束时，细胞转移至96孔玻璃底平板(Whatman)中进行高分辨率成像。另外用抗兔磷酸-组蛋白H3和Alexa Fluor 660驴抗兔IgG进行细胞染色以鉴定有丝分裂细胞。为保证对所有中心体的成像，通过Zeiss Axiovert显微镜和Slidebrook软件(Intelligent Imaging Inovations，Denver，CO)使用40X空气ELWD物镜(Zeiss)以1μm步长获得3D图像。对所有701个RHAi状态手动调节Z堆栈(stacks)的高度(起点和终点)。 

通过目视检查～96,000张图像，对各种RNAi状态的多极纺锤体百分数进行评分。筛选结果总结于下表1中。 

表1：S2细胞中RNAi筛选结果的总结 

	数目
		筛选总数	23,172dsRNAs
未测定(#纺锤体＜10)	148
		在初级筛选中评分为选中基因	701基因
从初级筛选中测试的选中基因	292基因
		次级筛选后的总选中基因	133(46％)基因
具有哺乳动物同源物的选中基因	82(62％)基因

使用95％的置信区间，初级筛选鉴定了701个与多极纺锤体表型相关的候选者。基于下述内容选定292个基因作为进行进一步研究的初始同期组群：表型强度、易于鉴定的哺乳动物同源物的存在和很少或没有预测的脱靶(off-target)效应。另外，以前确定为果蝇细胞中胞质分裂所需要的大部分基 因被消除(Echard，A.等人，(2004)Curr Biol 14：1685-1693；Eggert，U.S.等人，(2004)PLoS Biol 2：e379)，因为纺锤体多极性可能是胞质分裂故障的次级效应(Goshima，G.等人，(2007)Science 316：417-421)。选定用于次级筛选的292个基因中，133个基因确认在中心体群集中具有真正的作用。在验证的基因中，鉴定的62％的基因(133个基因中的83个)具有哺乳动物同源物，而33％的基因(44个)没有已知的功能。中心体群集可以以不同效率发生。下列种类的缺陷被区分：带有散布于纺锤体周围的多个中心体的双极纺锤体、小的多星体纺锤体和大的多极纺锤体。

该筛选鉴定了涉及多种细胞过程的基因，表明在控制超数中心体组织的机制中未知的复杂性，包括大量促进纺锤体微管成束的基因，例如朝向负端的驱动蛋白Ncd(人类HSET)。筛选也鉴定出未预料过程中的基因。SAC、肌动蛋白、细胞极性和细胞粘附所需基因的发现提出了抑制多极有丝分裂的新机制。下面给出阐明限定抑制多极有丝分裂的三种相互重叠机制的实验：利用SAC的定时机制、依赖MT调节因子的内在极群集机制及需要肌动蛋白和细胞粘附的新机制。 

实施例2：纺锤体装配检验点(SAC)阻止多极有丝分裂 

中心体群集需要SAC部件Mad2、BubR1(人类Bub1)和CENP-Meta(人类CENP-E)。图2表明中心体群集需要Mad2。经EGFP、Mad2单独的RNAi处理和EGFP或Mad2再加上7小时MG 132处理在S2细胞中对中心体群集缺陷进行评分。图2的图显示三个独立实验的平均数(均值±Sd， ^*p＜0.05；^***p＜0.001，Student′s t检验)。 

图2中显示的结果表明SAC在中心体群集过程中的作用。这一需要甚至在没有经过MG 132处理的细胞中更加明显，表明筛选中使用的MG 132短期处理部分地掩盖了SAC基因RNAi对纺锤体多极性的效应。考虑到表明SAC不被多极纺锤体或多个中心体激活的以前在PtK1细胞中的工作(Sluder，G.等人，(1997)J Cell Sci 110(Pt A)；421-429)，这一发现有些令人吃惊。 

延时(time-lapse)成像支持SAC在阻止多极有丝分裂中的作用。在中心 粒和MT用GFP-SAS-6和mCherry α-微管蛋白标记的S2细胞中，中心体数目的增加与形成双极纺锤体需要的时间延长(2.7倍)之间明显相关。测量了NEBD和后期开始之间的间隔(用GFP-Cid、果蝇CENP-A显示)，比较带有2个或＞2个中心体的细胞。相对于带有两个中心体的细胞，带有多个中心体的细胞表现出明显的后期开始的延迟(1.8倍)。此外，后期开始的延迟被Mad2 RNAi消除，这些细胞以去群集的中心体和错误排列的着丝粒进入后期。进一步表明SAC激活，多极前后期纺锤体相对于双极中期纺锤体在BubR1焦点数目上有强烈的增加。最后，SAC阻止多极有丝分裂的需要可部分地被用MG 132处理施加的人工中期延迟而抑制。这表明SAC不监测多极有丝分裂本身，而是SAC激活(很可能由于异常着丝粒附着或张力触发)为组织多中心体的补偿机制提供了足够的时间。 

实施例3：纺锤体内在极群集力阻止多极有丝分裂 

以前在S2细胞中的工作已经证明MT马达和MAP在纺锤体极集中上的重要作用(Goshima，G.等人，(2005)J Cell Biol 171：229-240；Morales-Mulia，S.和Scholey，J.M.(2005)Mol Biol Cell 16：3176-3186)。实施例1中描述的筛选将Ncd(驱动蛋白-14家族成员)鉴定为初级筛选中的最强选中基因。Ncd是在纺锤体极处使MT成束的朝向负端马达(Karabay，A.和Walker，R.A.(1999)Biochemistry 38：1838-1849)。通过GFP-SAS-6标记，证明群集多个中心体需要Ncd。果蝇动力蛋白未在筛选中鉴定出来。已预料到这一点，因为在S2细胞中动力蛋白的丧失并不显著诱导多极有丝分裂，尽管它的确损害中心体附着并收紧纺锤体极的集中(Goshima，G.等人，(2005)J Cell Biol 171：229-240)。进一步对筛选的验证确认了MAP Asp在极集中上的作用(Morales-Mulia，S.和Scholey，J.M.(2005)Mol Biol Cell 16：3176-3186；Wakefield，J.G.等人，(2001)J Cell Biol 153：637-648)。 

另外，该筛选鉴定了几种影响纺锤体MT的内聚的其它因素。鉴定了中心体群集中Bj1/RCC1(RanGEF)的需要，这与其在哺乳动物细胞中阻止多极有丝分裂的作用(Chen，T.等人，(2007)Nat Cell Biol 9：596-603)是一致的。也鉴定了ADP-核糖基化因子端锚聚合酶(Tankyrase)和CG15925(推测 的人类PARP-16同源物)的作用(Schreiber，V.等人，(2006)Nat Rev Mol Cell Biol 7：517-528)。端锚聚合酶的ADP-核糖基化被认为通过提供可锚定MT马达和其它纺锤体蛋白的静止基质而有助于纺锤体的双极性(Chang，P.等人，(2005)Nat Cell Biol 7：1133-1139.)。以前尚未描述PARP-16在有丝分裂中的作用。 

实施例4：肌动蛋白依赖的力调节纺锤体多极性 

除了很可能影响使纺锤体MT的成束和组织的基因外，出乎意料地，还鉴定出参与肌动蛋白细胞骨架(如形成素(formin)Form3/INF2)的组织和调节的基因(Chhabra，E.S.和Higgs，H.N.(2006)J Biol Chem  281：26754-26767)。这些基因的敲除间接地通过触发胞质分裂故障不诱导多极有丝分裂。使用破坏肌动蛋白细胞骨架的小分子进行简短(2小时)的处理的实验类似地诱导了多极有丝分裂。 

更具体地，细胞用拉春库林(40μM LatA)、细胞松弛素D(20μM)处理2小时，并确定中心体群集缺陷的百分比。这些结果显示于图3中，其证明S2细胞中中心体群集需要肌动蛋白细胞骨架。该图显示三次独立实验的平均数(平均值±SD，^*p＜0.05；^**p＜0.005，Student′s t检验)。 

此外，S2细胞的活细胞成像揭示了对于多中心体的最初群集，肌动蛋白确实是需要的。相对于对照(14.7±6.4分钟)，在13/15的LatA处理的细胞中中心体群集有1.5倍的延迟(22.1±12.3分钟)。剩余的2/15的细胞完全不能群集额外的中心体。LatA处理诱导的细胞周期延迟很可能是由于SAC的激活，如在LatA处理的细胞中通过用BubR1显著标记着丝粒所证实的。 

然后，确定中心体群集是否需要皮质收缩(cortical contraction)。细胞暴露于可溶性四价凝集素伴刀豆球蛋白A(Con-A)2小时，其交联质膜并因此整体上阻断皮质收缩(Canman，J.C.和Bement，W.M.(1997)J Cell Sci 110(Pt 16)：1907-1917)。确定了Con-A处理后中心体群集缺陷的百分比。结果也显示于图3中，其证明Con-A处理诱导中心体群集缺陷。 

此外，据发现增强基于肌球蛋白的收缩性可抑制纺锤体多极性。低浓度花萼海绵诱癌素A(calyculin A，CA)抑制肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP) 并促进肌球蛋白II激活而不改变其分布(Gupton，S.M.和Waterman-Storer，CM.(2006)Cell 125：1361-1374)。用CA处理的野生型S2细胞的中心体群集缺陷有中度降低(15％至9％)。此外，CA处理部分地挽救了被Ncd RNAi诱导的中心体群集缺陷。因而，在带有额外中心体的细胞中，肌动蛋白和基于肌动蛋白的收缩性影响有丝分裂是否为双极或多极的。 

还确定了是否肌动蛋白和内部纺锤体力协同地发挥作用以阻止多极有丝分裂。的确，在Ncd或Bj1/RCC1耗竭的细胞中，LatA处理导致纺锤体多极性的组合增加。为进一步评价这一观点，使用延时转盘显微镜(spinning disc microscopy)确定Ncd耗竭的S2细胞中中心体运动的轨迹。与对照细胞相反，Ncd耗竭细胞中的中心体表现出运动度的显著增加；运动的速度和幅度都有增加。此外，中心体运动的主体偏离纺锤体而朝向细胞皮质。通过将细胞短暂暴露于LatA，Ncd耗竭细胞中的中心体运动度严重降低，证明这些皮质拉力需要肌动蛋白。因而，皮质力与内部纺锤体成束力协同以组织多个中心体。 

这些结果也提供了对调节纺锤体多极性的皮质力发生器的性质的理解。据发现MT+tip CLIP-190和肌球蛋白Myo10A对于中心体群集是重要的。果蝇Myo10A是可通过独特的MyTH4-FERM结构域结合MT的人类Myo15同源物。已知纺锤体定位需要Myo 10(哺乳动物的含MyTH4-FERM肌球蛋白的成员)(Sousa，A.D.和Cheney，R.E.(2005)Trends Cell Biol  15：533-539；Toyoshima，F.和Nishida，E.(2007)EMBO J 26：1487-1498；Weber，K.L.等人，(2004)Nature 431：325-329)。Myo10A(但不是另外的果蝇含MyTH4-FERM的肌球蛋白Myo7)的RNAi诱导中心体群集缺陷的2倍增加而无胞质分裂故障(Eggert，U.S.等人，(2004)PLoS Biol 2，e379)。此外，如果细胞同时用LatA处理，Myo10A的敲除对纺锤体多极性并无附加的效应。最后，Myo 10A耗竭细胞的中心体追踪揭示了与LatA处理相似的对中心体运动的效应；在耗竭Myo 10的细胞中，与Ncd耗竭的细胞中显示的广泛皮质定向运动相反，仅检测到随机的或极大降低的中心体运动。总之，数据证明多个中心体联合地通过纺锤体内部力和通过至少部分地作用于星体MT的肌动蛋白依赖性皮质力组织。 

实施例5：细胞形状、细胞极性和粘附 

对纺锤体多极性的效应 

筛选鉴定了涉及中心体群集的细胞粘附所需的基因：Turtle、Echinoid、Cad96Ca、CG33171和Fit1。果蝇含FERM结构域的蛋白Fit1看起来在调节高等真核生物中的细胞基质粘附中具有高度保守的功能(Rogalski，T.M.等人，(2000)J Cell Biol 150：253-264；Tu，Y.等人，(2003)Cell 113：37-47)。哺乳动物Fit1同源物(Mig-2/人类PLEKHC1)定位于粘着斑(FA)，且对于整合素介导的细胞粘附和通过连接整合素至肌动蛋白骨架的细胞形状的调节是重要的(Tu，Y.等人，(2003)Cell 113：37-47)。未表征的CG33171蛋白与哺乳动物Co118 A具有同源性，后者以前涉及细胞基质粘附的调节(Dixelius，J.等人，(2002)Cancer Res 62：1944-1947；Wickstrom，S.A.等人.，(2004)J Biol Chem 279：20178-20185)。含Turtle和Echinoid的III型纤连蛋白结构域涉及细胞-细胞粘附(Bodily，K.D.等人，(2001)J Neurosci 21：3113-3125；Wei，S.Y.等人，(2005)Dev Cell 8：493-504)。另外，鉴定了后/侧极性基因PAR-1(PAR-1/MARK/KIN 1家族成员)及顶极性基因Crumbs和Cometto，它们对星体MT功能、非对称细胞分裂和上皮极性是重要的(Bulgheresi，S.等人，(2001)J Cell Sci 114：3655-3662；Munro，E.M.(2006)Curr Opin Cell Biol  18：86-94；Tepass，U.等人，(2001)Annu Rev Genet 35：747-784)。因为需要维持正常的间期细胞形状和粘附，以前已经鉴定了许多这些基因。的确，当与CG33171、Fit1、Crumbs、Cornetto或PAR-1蛋白的耗竭结合时，LatA处理或Myo10耗竭没有显示纺锤体多极性的增强，从而证明这些基因通过肌动蛋白骨架影响中心体群集。 

实施例6：阻止多极有丝分裂的机制的保守 

然后确定是否哺乳动物癌细胞利用如在S2细胞中观察到的相似的机制以群集多个中心体。这是为了建立筛选与人类癌症的关联性，并且是由于能够直接表征粘附和细胞形状对多极有丝分裂的效应的利用哺乳动物癌细胞的技术。尽管其效率存在一些变异性，但在哺乳动物细胞中常常观 察到额外中心体的群集。 

为确定瞬时肌动蛋白破坏在哺乳动物细胞中的效应，用DMSO、LatA(5μM)或二氢细胞松弛素B(DCB)(10μM)处理细胞系MCF-7、MDA-231、MMEDX 4N和N1E-115 2小时。MCF-7细胞系含有2个中心体而其它细胞系含有多于2个中心体。结果显示于图4中。该图显示三次独立实验的平均数(平均值±SD，^*p＜0.05；^**p＜0.005；^***p＜0.001，Student ′s t检验)。如图4所示，瞬时的肌动蛋白破坏导致含有多个中心体的细胞系中多极纺锤体频率的显著增加，但对于带有正常中心体数目的细胞则没有多极纺锤体频率的显著增加。这些多极纺锤体由额外中心体的去群集产生，而并不是由于中心粒的分裂/断裂。据推测肌动蛋白通过对星体MT的力影响中心体的定位。与这一观点一致，低剂量的诺考达唑(nocodazole)处理选择性分拆星体MT(Thery，M.等人，(2005)Nat Cell Biol 7：947-953)在带有额外中心体的细胞中特异性地增加了多极纺锤体的频率。 

果蝇和哺乳动物细胞之间的类似性扩展至中心体群集的遗传需要。为进一步检验这一点，用哺乳动物HSET(Ncd同源物)和Myo10基因进行siRNA实验如下。从Dharmacon购买针对人类HSET、人类Myo10和小鼠Myo10的四种不同siRNA寡核苷酸混合库(ON-TARGETplus和SMART库)。针对小鼠HSET的siRNA购自Ambion。非特异性杂混siRNA用作对照(Ambion)。siRNA的寡核苷酸序列记载于下表2中： 

表2：siRNA寡核苷酸序列 

根据制造商的说明，以50nM终浓度的siRNA用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)转染细胞。转染后3天(除非另有说明)分析/收获细胞。图5和6显示在MDA-231和MCF-7细胞中siRNA三天后HSET(图5)或Myo10(图6)耗竭的蛋白质印迹的结果。图7的柱状图显示在MCF-7或MDA-231细胞中经HSET或Myo10的siRNA处理后带有多极纺锤体的细胞的百分比。图7中显示的结果证明Ncd同源物HSET(驱动蛋白-14成员)和Myo10的siRNA增加了多极性的频率，尤其是在携带多个中心体的细胞(即MDA-231细胞)中。如在S2细胞中，Myo10诱导的多极性不是胞质分裂故障的结果。 

最后，通过用HSET或Myo10的siRNA处理并结合肌动蛋白破坏剂LatA，确定皮质肌动蛋白骨架是否影响与内纺锤体极群集力平行的中心体组织。如图8所示，肌动蛋白和HSET两者的破坏具有组合效应，从而相对于单个处理增加了多极纺锤体的频率。当Myo10 siRNA与LatA处理结合时，没有观察到此类效应。因而，在哺乳动物癌细胞和果蝇S2细胞中 相似的重叠机制阻止多极有丝分裂。 

实施例7：间期细胞形状、粘附和多极有丝分裂 

尽管细胞在有丝分裂中变圆，它们通过保留连接至强细胞基质粘附位点的含肌动蛋白的收缩纤维(RF)保持其间期形状的记忆(Mitchison，T.J.(1992)Cell Motil Cytoskeleton 22：135-151；Thery，M.和Bornens，M.(2006)Curr Opin Cell Biol 18：648-657)。已知间期粘附模式和含肌动蛋白RF的分布强烈影响有丝分裂过程中纺锤体的定向(Thery，M.等人，(2007)Nature  447：493-496；Thery，M.等人，(2005)Nat Cell Biol 7：947-953)。筛选中阻止有丝分裂需要细胞基质粘附基因和肌动蛋白调节因子两者的发现表明了一种具有吸引力的假说：这些基因产物可以通过影响收缩纤维(RF)的分布和/或组成并因此影响皮质力发生器而协同地作用以组织额外中心体。 

一些证据支持这一假说。首先，活细胞成像用来将间期细胞形状与有丝分裂过程中的细胞分裂模式相关联。在间期采取细长或极化的形状的MDA-231(含有额外中心体的乳腺癌细胞)几乎一致地发生双极分裂。相比之下，在间期采取圆形形状的MDA-231细胞具有增加频率的多极分裂。其次，在四倍体BSC-1细胞中(它们的粗大RF易于通过DIC成像显示)，注意到RF的定位与细胞是否发生双极(RF的双极分布)或多极分裂(RF的等向分布)之间具有强的相关性。再次，RF积聚特异性蛋白质，如ERM蛋白埃兹蛋白(ezrin)，其参与皮质异质性从而参与星体MT上的局部力发生。通过src激酶抑制剂PP2破坏这一皮质异质性(Thery，M.等人，(2005)Nat Cell Biol 7：947-953)也在MDA-231中诱导多极纺锤体，但在MCF-7细胞中则没有。第四，为评价细胞基质粘附对有丝分裂效率的作用，将细胞平铺在不同浓度的纤连蛋白(FN)上以改变细胞-基质粘附的强度。抑制粘着斑(FA)周转的FN浓度(30μg/ml)在MDA-231细胞中增加了多极纺锤体的频率，但在MCF-7细胞中则没有。此外，这一效应可被CA逆转，其通过增加皮质收缩性促进FA周转(Gupton，S.L.和Waterman-Storer，CM.(2006)Cell 125：1361-1374)。 

为直接测试细胞粘附模式和RF定位在中心体群集中的作用，使用FN 的微接触印刷(micro-contact printing)操控细胞粘附模式(Thery，M.等人，(2005)Nat Cell Biol 7：947-953)。与对照相比，平铺成Y-形或O-形微模式的MDA-231细胞具有显著增加(3-4倍)的多极纺锤体。相比之下，平铺细胞成H-形微模式相对于对照细胞抑制多极纺锤体的频率(2％，对照的一半)。因而，O和Y排列的粘附接触使细胞偏向多极有丝分裂，而双极排列的粘附接触(H-形)促进双极有丝分裂。这些结果证明间期细胞粘附模式并因此细胞形状可对有丝分裂的精确度具有显著影响——尤其是在含有额外中心体的癌细胞中。 

实施例8：中心体群集的破坏可选择性杀死癌细胞 

原则上，由于大部分体细胞在有丝分裂过程中具有两个中心体，破坏中心体群集可能对含有多个中心体的癌细胞的存活力具有选择性效应。作为评价这一可能治疗策略的第一步，确定了不同癌细胞系对敲除HSET的敏感性。 

由于对正常细胞中的细胞分裂不是必需的，并且驱动蛋白易受小分子抑制影响，HSET是特别令人感兴趣的治疗靶标(Mayer，T.U.等人(1999)Science 286：971-974；Mountain，V等人，(1999)J Cell Biol 147：351-366)。通过siRNA耗竭HSET导致在含有多个中心体的人类癌细胞中多极纺锤体的增加(参见图7，在上述实施例6中进一步描述)。为确定中心体去群集的结果，使用DIC显微镜在含有额外中心体的多个细胞系中监测细胞分裂。人类HSET的耗竭(由三次独立的siRNA确认)在N1E-115细胞(其中几乎100％的细胞含有额外中心体)(Spiegelman，B.M.等人，(1979)Cell  16：253-263)中诱导了多极后期的急剧增加(88％)。用MDA-231细胞(其中约50％的细胞含有额外中心体)(HSET耗竭后24％)和用带有额外中心体的四倍体BJ和NIH-3T3细胞获得了相似的结果。相比之下，HSET敲除在多种二倍体对照细胞中的细胞分裂没有影响。 

图9图示了6天HSET siRNA后N1E-115细胞的细胞存活力的丧失和集落形成的抑制。图9显示了转染后六天三次独立实验的对照和HSET耗竭(-HSET)细胞的相对细胞数目(左图)，和四个不同区域中两次独立实验的 平均集落数(右图；面积＝10mm²)。显著地，通过siRNA处理从N1E-115细胞中清除HSET 6天降低了90％以上的细胞存活力，并且许多存活的细胞显示出衰老(senescent)。 

图10图示了各种癌细胞系中与带有额外中心体的细胞的份数成比例的HSET RNAi诱导的细胞死亡。柱状图显示了siRNA转染后六天后对照和HSET耗竭(-HSET)细胞中的相对细胞数。具有多于2个中心体的细胞的百分数显示于图中下方。该图显示三次独立实验的平均数。所有图形表示平均值±SD(^**p＜0.005，^***p＜0.001，Student′s t检验)。因而，HSET耗竭在各种癌细胞系中诱导与含有额外中心体的细胞的份数大致成比例的细胞死亡。相比之下，主要具有两个中心体的细胞的存活力在不存在HSET时仅仅轻微降低。因而，中心体去群集可选择性地在带有超数中心体的细胞中诱导细胞死亡。 

Claims (42)

1.治疗减数分裂驱动蛋白相关疾病或病症的方法，其包括向需要该治疗的受试者给予抑制减数分裂驱动蛋白的试剂，从而获得对疾病或病症的治疗。

2.权利要求1的方法，其中所述疾病或病症是常染色体疾病或病症。

3.权利要求1的方法，其中所述疾病或病症是中心体疾病或病症。

4.权利要求1的方法，其中所述疾病或病症是细胞增殖性疾病或病症。

5.权利要求1的方法，其中所述疾病或病症是癌症。

6.权利要求1的方法，其中所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族成员。

7.权利要求6的方法，其中所述减数分裂驱动蛋白是HSET。

8.权利要求1的方法，其中所述试剂是小分子。

9.权利要求1的方法，其中所述试剂是RNAi试剂。

10.权利要求1的方法，其中所述试剂抑制所述驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性。

11.权利要求1的方法，其中所述试剂抑制所述驱动蛋白的微管结合活性。

12.权利要求1的方法，其中所述试剂经口给予。

13.权利要求1的方法，其中所述试剂经胃肠外给予。

14.抑制肿瘤细胞生长的方法，其中细胞增殖与减数分裂驱动蛋白有关，所述方法包括将肿瘤细胞与抑制减数分裂驱动蛋白的试剂接触，从而抑制该肿瘤细胞的生长。

15.权利要求14的方法，其中所述肿瘤细胞包含超数中心体。

16.权利要求14的方法，其中所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族成员。

17.权利要求16的方法，其中所述减数分裂驱动蛋白是HSET。

18.权利要求14的方法，其中所述试剂是小分子。

19.权利要求14的方法，其中所述试剂是RNAi试剂。

20.权利要求14的方法，其中所述试剂抑制所述驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性。

21.权利要求14的方法，其中所述试剂抑制所述驱动蛋白的微管结合活性。

22.权利要求14的方法，其中所述接触包括直接注射该试剂至肿瘤中。

23.抑制细胞增殖的方法，其中细胞增殖与减数分裂驱动蛋白有关，所述方法包括将细胞与抑制减数分裂驱动蛋白的试剂接触，从而获得对细胞增殖的抑制。

24.权利要求23的方法，其中所述细胞包含超数中心体。

25.权利要求23的方法，其中所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族成员。

26.权利要求25的方法，其中所述减数分裂驱动蛋白是HSET。

27.权利要求23的方法，其中所述试剂是小分子。

28.权利要求23的方法，其中所述试剂是RNAi试剂。

29.权利要求23的方法，其中所述试剂抑制所述驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性。

30.权利要求23的方法，其中所述试剂抑制所述驱动蛋白的微管结合活性。

31.鉴定抑制减数分裂驱动蛋白HSET活性的化合物的方法，所述方法包括

提供包含所述减数分裂驱动蛋白HSET的指示组合物；

将所述指示组合物与测试化合物接触；以及

确定所述减数分裂驱动蛋白HSET在该测试化合物存在下的活性，其中，根据与不存在该测试化合物时所述减数分裂驱动蛋白HSET的活性相比，存在该测试化合物时所述减数分裂驱动蛋白HSET活性的降低，将该测试化合物鉴定为抑制减数分裂驱动蛋白HSET活性的化合物。

32.权利要求31的方法，其中所述指示组合物与测试化合物文库中的各个成员接触并且选择所述文库内一种或多种抑制减数分裂驱动蛋白HSET活性的测试化合物。

33.权利要求31的方法，其中所述减数分裂驱动蛋白HSET的活性通过测量该驱动蛋白的三磷酸腺苷酶活性而确定。

34.权利要求31的方法，其中所述减数分裂驱动蛋白HSET的活性通过测量该驱动蛋白的微管结合活性而确定。

35.权利要求31的方法，其中所述减数分裂驱动蛋白HSET的活性通过测量HSET mRNA或蛋白质的表达而确定。

36.通过权利要求31的方法鉴定的分离的化合物。

37.选择患有用抑制减数分裂驱动蛋白的试剂进行治疗的肿瘤的受试者的方法，所述方法包括(i)从该受试者获得肿瘤细胞样品，以及(ii)确定所述肿瘤细胞样品中的中心体数目，其中所述肿瘤细胞样品中存在超数中心体则选择该受试者以用抑制减数分裂驱动蛋白的试剂进行治疗。

38.权利要求37的方法，其中所述减数分裂驱动蛋白是驱动蛋白-14家族成员。

39.权利要求38的方法，其中所述减数分裂驱动蛋白是HSET。

40.权利要求37的方法，其中所述肿瘤细胞样品中至少50％的肿瘤细胞包含超数中心体。

41.权利要求37的方法，其中所述肿瘤细胞样品中至少75％的肿瘤细胞包含超数中心体。

42.权利要求37的方法，其中所述肿瘤细胞样品中至少90％的肿瘤细胞包含超数中心体。

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