CN102268399A - 一种通过同源重组敲除nagE的高产氨基葡萄糖工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产氨基葡萄糖基因工程菌及其应用，是将氨基葡萄糖合成酶的基因(glmS)和氨基葡萄糖乙酰化酶基因(gna1)导入大肠杆菌E.coli K-12，并敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸转运系统编码基因nagE，得到的基因工程菌E.coli-glmS-gna1-ΔnagE，该菌株用于发酵生产氨基葡萄糖，具有发酵时间短，生产强度高，生产成本低，对环境污染小，无过敏反应等优点，生产得到的氨基葡萄糖可以广泛用于医药、食品等领域。

Description

一种通过同源重组敲除nagE的高产氨基葡萄糖工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种产氨基葡萄糖基因工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

氨基葡萄糖(Glucosamine，2-amino-2-deoxy-D-glucose)是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物。几乎存在与所有有机体中，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物以及动物体，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分。氨基葡萄糖能特异性地作用于关节软骨，恢复软骨细胞正常的代谢功能，能刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的蛋白多糖，抑制损伤软骨的酶，延缓骨性关节炎的病理过程和疾病的进展，改善关节活动，缓解疼痛。因此，临床上多用于治疗骨关节炎。此外，氨基葡萄糖还具有肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用；刺激婴儿肠道中双歧杆菌的增生；在医药上作为抗菌消炎药物，用于治疗风湿性关节炎和胃溃疡疾病。在食品中，是婴儿配方乳中添加的一种重要微量糖类成分，还是合成VB6和核黄素中间体的起始原料，此外也可用于化妆品和饲料添加剂中。

甲壳素水解法是我国目前生产氨基葡萄糖的主要方法，甲壳素水解法转化效率低，产生大量酸性废水，因而产品成本高、污染严重。目前，国内外对生物法生产氨基葡萄糖的报道较少，发酵产量也较低，尚未达到工业化生产的要求。

在发酵过程中当碳源葡萄糖浓度较低时，氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖可以被细胞当作碳源利用。氨基葡萄糖依靠甘露糖磷酸转移系统(mannose PTS，II^Man，由manXYZ操纵子编码)和葡萄糖磷酸转移系统(glucose PTS，II^Glc，由pstG基因编码)对其进行磷酸化后从胞外向胞内转运，而N-乙酰氨基葡萄糖在从胞外向胞内转运时，依靠II^Man和乙酰氨基葡萄糖磷酸转移系统(GlcNAc PTS，II^NAG，由基因nagE编码)对其进行磷酸化后进行转运。因此，要想在胞外积累高浓度的氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖，就必须对其转运途径进行阻断，减弱氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖从胞外到胞内的转运。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高产氨基葡萄糖基因工程菌，所述重组菌为是克隆E.coli BL21(DE3)基因组中氨基葡萄糖合成酶glmS基因和酿酒酵母S.cerevisiae S288C基因组中氨基葡萄糖乙酰化酶gna1基因，同时敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸转运系统nagE基因和甘露糖磷酸转移系统manX基因构建而成的重组大肠杆菌。

所述氨基葡萄糖合成酶的基因来源于GenBank No.CP001509.3基因组中glmS片断，氨基葡萄糖乙酰化酶gna1基因来源于GenBank NC_001138，大肠杆菌为E.coli K-12(ATCC25947)。

将氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS和氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因gna1连接到载体pET-28a(+)上。

本发明还提供了一种构建高产氨基葡萄糖基因工程菌的方法，用限制性内切酶Sac I和Hind Ⅲ对glmS基因片断和pET-28a(+)进行酶切，并通过连接反应将glmS基因片断插入质粒pET-28a(+)的Sac I和Hind Ⅲ位点之间；用限制性内切酶Not I和Xho I对gna1基因片断和pET-28a(+)进行酶切，并通过连接反应将gna1基因片断插入质粒pET-28a(+)的Not I和Xho I位点之间得到重组质粒pET-28a(+)-glmS-gna1。敲除E.coli ATCC 25947基因组中nagE基因片段，得到nagE基因失活的菌株E.coli-ΔnagE，再将携带有glmS和gna1基因片段的质粒pET-28a(+)-glmS-gna1转化大肠杆菌E.coli-ΔnagE中得到重组菌E.coli-glmS-gna1-ΔnagE。

所述重组菌培养环境条件：

培养时间为12h，温度37℃，摇床转速200rpm，待OD₆₀₀达到0.6时，按照10％浓度加入乳糖(使发酵液中终浓度为5g/L)诱导glmS和gna1基因的表达。

所述重组菌培养基组成为：

种子培养基：蛋白胨12g，酵母膏24g，甘油4ml，按照50μg/ml加入卡那霉素，pH自然；

发酵培养基：蛋白胨12g，酵母膏24g，葡萄糖10g，按照50μg/ml加入卡那霉素，pH自然。

本发明采用基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖，具有发酵时间短，生产强度高，生产成本低，对环境污染小，无过敏反应等优点。生产得到的氨基葡萄糖可以广泛用于医药、食品等领域。

具体实施方式

1.重组质粒pET-28a(+)-glmS-gna1的构建

用于扩增glmS基因的引物：

上游：5’-CGA GCT CAT GTG TGG AAT TGT TGG C-3’(下划线序列表示限制性内切酶识别位点Sac I)

下游：5’-CCC AAG CTT TTA CTC AAC CGT AAC CGA-3’(下划线序列表示限制性酶切位点Hind Ⅲ)。

氨基葡萄糖合成酶基因glmS是利用E.coli BL21(DE3)基因组(GenBank No.CP001509.3)作为模版进行PCR得到的。用限制性内切酶Sac I和Hind Ⅲ对glmS基因片断和pET-28a(+)进行酶切，并通过连接反应将glmS基因片断插入质粒pET-28a(+)的Sac I和Hind Ⅲ位点之间，得到重组质粒pET-28a(+)-glmS。

用于扩增gna1基因的引物：

上游：5’-AAGGAGATAAGAATGCGGCCGCATGAGCTTAC-3’(下划线序列表示限制性内切酶识别位点Not I)

下游：5’-CCGCTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3’(下划线序列表示限制性酶切位点Xho I)。

氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1是利用酿酒酵母S.cerevisiae S288C基因组(GenBankNC_001138)作为模版进行PCR得到的。用限制性内切酶Not I和Xho I对gna1基因片断和pET-28a(+)-glmS进行酶切，并通过连接反应将gna1基因片断插入质粒pET-28a(+)-glmS的Not I和Xho I位点之间，得到重组质粒pET-28a(+)-glmS-gna1。

2.nagE基因的敲除

根据E.coli JW0665-1(该菌购自麻省理工学院，其nagE基因已经被kan插入失活)基因组序列设计：

上游引物：5’-TACGAGAAGCCAGAGAAGACGC-3’

下游引物5’-GGTGTTCAGCAAATTTAATACGG-3’

该菌株信息详见：http://cgsc.biology.yale.edu/Mutation.php？ID＝101996

扩增该菌nagE基因座及上下游约800bp片段，将该片段转化含有质粒pKD46的E.coliK-12，利用Red同源重组技术敲除E.coli K-12基因组nagE基因片段，再转化质粒pCP20，去除kan片段后得到nagE基因失活菌株E.coli-ΔnagE。

将重组质粒pET-28a(+)-glmS-gna1转化E.coli-ΔnagE，得到重组大肠杆菌E.coli-glmS-gna1-ΔnagE。

4.发酵：用LB斜面培养基培养大肠杆菌E.coli-glmS-gnal-ΔnagE，培养12h后用接种环取1环接入装有20mL种子培养基的250mL的三角瓶中进行种子培养。种子培养基为：种子培养基：蛋白胨12g，酵母膏24g，甘油4ml，按照50μg/ml加入卡那霉素，pH自然。培养时间为12h，温度37℃，摇床转速200rpm。

再以5％的接种量接入装有100ml发酵培养基的500ml的三角瓶中进行发酵培养。发酵培养基：蛋白胨12g，酵母膏24g，葡萄糖10g，同时按照50μg/ml加入卡那霉素，pH自然。培养时间为12h，温度37℃，摇床转速200rpm，待OD₆₀₀达到0.6时，按照10％浓度加入乳糖诱导glmS和gna1基因的表达。发酵结束后发酵液中氨基葡萄糖浓度可以达到70g/L。

5.氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的检测方法；

氨基葡萄糖标准曲线绘制：准确称取氨基葡萄糖0.0100g，加入20.0ml蒸馏水，配制成0.5000g/l的氨基葡萄糖溶液，然后分别稀释成浓度为0.2500g/l，0.1250g/l，0.0625g/l，0.0313g/l的溶液。分别取相应浓度氨基葡萄糖溶液0.5mL于玻璃塞试管中，加入乙酰丙酮试剂1.0ml，90℃水浴处理1h，冷却至室温，慢慢加入96％(v/v)乙醇10.0mL(勿搅动)，然后加入DMAB试剂1.0mL，混合均匀。因反应体系由碱性变为酸性，需注意有大量二氧化碳气体产生。混合后室温放置1h稳定，530nm比色，以试样浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。

氨基葡萄糖的检测：取发酵液5.0ml加入5mL离心管中，8000rpm离心8min，取0.5mL于玻璃塞试管中，加入乙酰丙酮试剂1.0ml，90℃水浴处理1h，冷却至室温，慢慢加入96％(v/v)乙醇10.0mL(勿搅动)，然后加入对二甲胺基苯甲醛(DMAB)试剂1.0mL，混合均匀，混合后室温放置1h稳定，530nm比色，根据标准曲线计算GlcN产量。

乙酰氨基葡萄糖的检测：用HPLC检测，安捷伦1200，RID检测器，C18柱，内径4.6mm，柱长250mm，流速0.7ml/min，柱温30℃，流动相：70％乙腈。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种氨基葡萄糖基因工程菌，是克隆E.coli BL21(DE3)基因组中氨基葡萄糖合成酶glmS基因和酿酒酵母S.cerevisiae S288C基因组中氨基葡萄糖乙酰化酶gna1基因，同时敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸转运系统nagE基因构建而成的重组大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖合成酶的基因来源于GenBankNo.CP001509.3基因组中glmS片断，氨基葡萄糖乙酰化酶gna1基因来源于GenBank NC_001138。

3.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，将氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS和氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因gna1连接到载体pET-28a(+)上。

4.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，大肠杆菌为E.coli ATCC 25947。

5.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

1)用限制性内切酶Sac I和Hind Ⅲ对glmS基因片断和pET-28a(+)进行酶切，并通过连接反应将glmS基因片断插入质粒pET-28a(+)的Sac I和Hind Ⅲ位点之间；

2)用限制性内切酶Not I和Xho I对gna1基因片断和pET-28a(+)进行酶切，并通过连接反应将gna1基因片断插入质粒pET-28a(+)的Not I和Xho I位点之间得到重组质粒pET-28a(+)-glmS-gnal；

3)通过Red同源重组技术敲除重组菌E.coli ATCC 25947基因组中nagE基因片段，得到nagE基因失活的菌株E.coli-ΔnagE；

4)将质粒pET-28a(+)-glmS-gna1转化E.coli-ΔnagE，得到基因工程菌E.coli-glms-gna1-ΔnagE。