CN102266570A - miRNA-484的新用途及含有miRNA-484的药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种miRNA-484的新用途及含有miRNA-484的药物组合物及其用途。所述miRNA-484在制备用于预防或治疗心脏疾病药物中的用途，所述药物组合物，该药物组合物由有效剂量的miRNA-484药学上可接受的载体、病毒或辅料组成。miRNA-484通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用，miRNA-484对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种内源性的非编码小RNAs的新用途，尤其涉及一种miRNA-484在预防或治疗心脏疾病中的用途，属于生物制药技术领域。
背景技术
心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。在我国，随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据国家卫生部2004年底公布的最新统计结果表明，我国18岁及以上居民高血压患病率为18.8％，估计全国患病人数1.6亿多，由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术、方法用于心脏病的诊断、防治。
miRNA是新近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子，许多研究表明miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。单一的miRNA可以同时作用于多个靶基因的mRNA的表达，这样药物作用于一个miRNA可以调节多个参与心脏发病基因的表达，影响多个信号通路，从整体上达到治疗疾病的目的。由于miRNA在心脏病理状态下表达水平不同，因此可以通过检测miRNA的表达水平来预测诊断疾病。
细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程。它是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。在许多心肌损伤或心脏病理状态下，如心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大、心力衰竭等，心肌细胞会发生凋亡。由于成熟的心肌细胞不能分裂增殖，心肌细胞过度凋亡必然会使心肌细胞数目减少，这一点可能是一些心脏疾病发病的机理。目前研究发现许多miRNA通过调控凋亡相关靶蛋白的表达参与细胞凋亡的发生，这些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。寻找心脏中特异表达的、参与心肌细胞凋亡的miRNA，阐明其作用机理，对于开发以miRNA为策略的心脏疾病的诊断、治疗具有及其重要的意义和应用前景。
发明内容
因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种miRNA-484及含有miRNA-484的药物组合物在制备用于预防或治疗心脏疾病药物中的用途。
一方面，本发明提供一种miRNA-484在制备用于预防或治疗心脏疾病药物中的用途。
优选地，所述miRNA-484的核苷酸序列如下述SEQ ID NO：1的序列所示：
5′-UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU-3′。
优选地，所述心脏疾病包括心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚或心肌纤维化。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物由有效剂量的miRNA-484药学上可接受的载体、病毒或辅料组成。
优选地，所述载体为壳聚糖、胆固醇、脂质体或纳米颗粒。
又一方面，本发明一种药物组合物在制备用于预防或治疗心脏疾病药物中的用途。
优选地，所述心脏疾病包括心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚或心肌纤维化。
本发明通过实验发现miRNA-484在心脏中高表达，在心肌缺血损伤及缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-484表达显著下调。通过构建miRNA-484过表达腺病毒或miRNA-484转基因小鼠加强miRNA-484的表达可以抑制心肌细胞凋亡及心肌缺血损伤，心肌梗死面积减少。
心肌缺血再灌注损伤后，过表达miRNA-484可以减轻缺血再灌注损伤所致的凋亡，减小心肌梗死面积，过表达miRNA-484还能改善缺血再灌注损伤所致的心功能的损伤。而抑制内源性的miRNA-484可加重缺血再灌注损伤。
以上实验说明miRNA-484通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用，miRNA-484对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。而给予miRNA-484反义核苷酸抑制miRNA-484的表达则可以诱导心肌细胞凋亡，心肌缺血损伤会更加严重。
具体的，本发明发现miRNA-484(5′-UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU-3′)通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用。心肌细胞缺氧或心肌缺血损伤过程miRNA-484表达显著下调，miRNA-484的下调可能诱导了心肌细胞凋亡的发生。miRNA-484在缺血再灌注动物模型的心肌组织中表达下调，过表达miRNA-484的心脏特异性转基因小鼠，可以抵抗心肌缺血再灌注损伤，心肌梗死面积减少，心功能显著改善。将miRNA-484与适当的载体结合形成药物，导入心脏或体内，对许多心脏疾病将具有预防及治疗作用。通过构建能够过表达miRNA-484的腺病毒从冠状动脉注射入小鼠心脏，发现心肌缺血损伤程度明显被抑制，在动物模型证明了miRNA-484对缺血性心脏病的治疗作用。可以考虑将miRNA-484与壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等包装形成药物分子，通过口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射的方式，用于防治心脏疾病、改善心脏功能、阻止心肌纤维化及心肌重构的发生。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为心肌缺血损伤及低氧诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-484表达水平的变化的试验结果示意图，图中A为原代心肌细胞缺氧处理miRNA-484表达水平的试验结果示意图；B为小鼠心肌缺血miRNA-484表达水平的试验结果示意图；
图2为miRNA-484抑制心肌细胞凋亡的实验结果示意图，图中A为原代心肌细胞感染miRNA-484腺病毒miRNA-484过量表达对细胞凋亡的作用实验结果示意图；图中B为原代心肌细胞感染miRNA-484腺病毒miRNA-484过量表达对细胞色素C的释放作用实验结果示意图；
图3为miRNA-484过表达抑制心肌缺血损伤实验结果示意图，图中A为小鼠经注射冠动脉miRNA-484病毒后，其心脏的左心室面积(LV)所占的百分比和危险区总面积(AAR)所占的百分比实验结果示意图；图中B为小鼠经注射冠动脉miRNA-484模拟物病毒后对缺血再灌注手术(I/R)的影响作用的实验结果示意图；
图4为小鼠心肌注射miRNA-484模拟物在心脏中表达的效率的实验结果示意图，图中B为miRNA-484模拟物注射小鼠心肌后的实验结果示意图，图中A为生理盐水注射小鼠心肌后的实验结果示意图；
图5为小鼠静脉注射miRNA-484后再进行心肌缺血再灌注后24小时与野生型小鼠再灌24小时后的心功能状况比较，图中A为miRNA-484过量表达对小鼠的左室舒张末内径(LVIDd)的作用实验结果示意图；图中B为miRNA-484过量表达对左室收缩末内径(LVIDs)的作用实验结果示意图；图中C为miRNA-484过量表达对短轴截短率(FS)的作用实验结果示意图。
图6为小鼠静脉注射miRNA-484抑制剂抑制内源性miRNA-484及抑制剂阴性对照后缺血再灌注所致的比较实验结果示意图，图中A为心肌细胞凋亡的比较实验结果示意图，图中B为心肌梗死面积的比较实验结果示意图；
图7为荧光标记FAM标记miRNA-484抑制剂后，注射小鼠后检测心脏的miRNA-484抑制剂注射效率实验结果示意图，图中B为miRNA-484抑制剂射小鼠心肌后的实验结果示意图，图中A为生理盐水注射小鼠心肌后的实验结果示意图；
图8为小鼠静脉注射miRNA-484抑制剂抑制内源性miRNA-484后缺血再灌注后24小时与对照组相比的心功能状况实验结果示意图，图中A为抑制内源性miRNA-484对左室收缩末内径(LVIDs)的作用实验结果示意图，B为抑制内源性miRNA-484对左室收缩末内径(LVIDs)的作用实验结果示意图，图中C为抑制内源性miRNA-484对对短轴截短率(FS)的作用实验结果示意图。
具体实施方式
以下实验小鼠除特殊说明，均购自北京医科大学，品系均为C57/BL6。
实验例1心肌缺血及心肌细胞缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中
miRNA-484表达情况检测
对于心肌细胞凋亡实验模型，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞(大鼠乳鼠购自北京医科大学，大鼠品系为Wistar大鼠，大鼠乳鼠原代心肌细胞的制备可参见以下文献：W.-Q.Tan，etal，Foxo3aInhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J BiolChem.2008October 31；283(44)：29730-29739)，低氧培养箱(氧浓度低于1％)培养不同时间，提取RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-484的表达水平。如图1A所示，miRNA-484表达水平在低氧处理10min～180min内显著下调。
本实验以假手术处理的大鼠乳鼠原代心肌细胞作为对照组，采用结扎大鼠冠状动脉建立心肌缺血模型，缺血不同时间取心脏缺血区及非缺血区心肌组织，提取总RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-484的表达水平。如图1B所示，结果显示缺血10min～60min心肌缺血组织较非缺血组织及非缺血模型组miRNA-484表达水平显著下降。
实验例2miRNA-484抑制心肌细胞凋亡的实验
miRNA-484腺病毒的构建采用Ambion公司的pSilencer Adeno1.0-CMV系统。按照公司说明书构建相应载体及腺病毒，具体方法如下：提取大鼠心脏的基因组，以其为模板，PCR扩增miRNA-484及其上下游两端各将近200个bp的序列(PCR体系50μL，PCR条件如下：95℃3min一个循环；95℃30s，56℃30s，72℃1min共28个循环；最后72℃延伸5min)，将该扩增片段用spe I和xho I进行双酶切，再将腺病毒载体pSilencer Adeno CMV1.0穿梭载体(pSilencer Adeno CMV1.0shuttle vector载体)(购自Ambion公司)进行双酶切后与酶切后的片段进行连接，即将片段克隆入腺病毒载体中。Pac I酶切线性化该载体及腺病毒骨架(Adenovirus LacZ Backbone)，共转染HEK-293细胞(人胚肾细胞，购自上海研生生化试剂有限公司)，包装腺病毒，扩增收集病毒，测定病毒滴度。
本实验中使用原代培养的心肌细胞为模型。感染上述的miRNA-484腺病毒过表达miRNA-484，突变的miRNA-484腺病毒作为对照(即miRNA-对照)，病毒感染24小时后，在低氧培养箱中培养处理细胞3小时，诱导细胞凋亡。台盼兰染色方法检测心肌细胞凋亡情况，结果见图2A。同时又检测了细胞色素C的释放用来证明凋亡的发生(图2B)，其中线粒体部分以COX IV为阳性对照，细胞质部分以微管蛋白为阳性对照。结果显示过表达miRNA-484可以显著抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。
实验例3miRNA-484过表达抑制心肌缺血损伤实验验证
小鼠经冠状动脉注射miRNA-484模拟物可显著抑制心肌缺血再灌注损伤。以C57/BL6小鼠为实验对象，按照如下方法注射miRNA-484模拟物(miRNA-484mimic)及miRNA-484模拟物阴性对照(miRNA-484mimicNC)，并以假手术处理小鼠为作为对照组，以C57/BL6小鼠为野生型。小鼠称重并麻醉，仰卧位固定，剪毛并用碘酒消毒手术区。颈部正中切开气管并插管，连动物呼吸机进行正压通气，在胸骨左缘处及心脏搏动处纵行切开皮肤约3cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏。稀释2×1011pfu(感染系数)腺病毒于PBS中，终体积为200μL，26号导管从心尖进入动脉根部，注射病毒时同时夹闭主动脉及肺动脉，持续夹闭20秒。监测5min，待心脏恢复窦律后，清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。等小鼠清醒后，脱离呼吸机，放回笼中。心电图监测整个手术过程。
注射病毒3天后进行心脏缺血再灌注手术，具体操作如下：小鼠麻醉后，背位固定于实验用木板上，并进行心电图监测。颈部正中切开气管并插管，连动物人工呼吸机，于第四肋间开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏、血管。在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2mm处进针，进针深度0.5mm；以6/0带针缝合线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针；待心电图恢复稳定10min后，予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)。以ST段弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5h以上作为结扎成功的标志。缺血45min之后，松开结扎线开始再灌注。以ST段下降为标志。清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。再灌注24h用伊文氏蓝双染测定心肌梗死面积。结果显示：注射miRNA-484mimic的小鼠I/R组心肌梗死面积比野生小鼠I/R组明显降低，有统计学差异(p＜0.01)，见图3A。
心梗面积按如下方法计算：左心室面积(left ventricle，LV)为蓝色、红色和白色面积之和；危险区总面积(area at risk，AAR)为红色和白色面积之和；梗死区面积(infarct area，INF)为白色面积。危险区面积(AAR/LV，％)＝(危险区总面积/左心室面积)×100％，心梗面积(INF/AAR，％)＝(梗死区面积/危险区总面积)×100％。同时又检测了注射miRNA-484mimic对I/R的凋亡的影响，用细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL法)检测(图3B)，结果表明注射了miRNA-484mimic的组份与I/R组份相比凋亡率明显的减小，即miRNA-484对心肌具有保护作用。
实验例4荧光标记FAM标记miRNA-484模拟物后，注射小鼠后检
测心脏的miRNA-484模拟物注射效率
对小鼠注射带有FAM荧光基团标记的miRNA-484模拟物(miRNA-484mimic)(购自上海吉玛)后，取小鼠的心脏，固定后用冰冻切片切成5μm后，注射上述FAM荧光基团标记的miRNA-484模拟物，用荧光染料DAPI(4，6-联脒-2-苯基吲哚)染细胞核后在荧光显微镜下检测拍照(图4B)，图中FAM-模拟物即为FAM荧光基团标记的miRNA-484模拟物，再用生理盐水作为对照组按上述相同的方法处理小鼠的心脏(图4A)；从图片可看出注射了荧光标记FAM的miRNA-484模拟物后在心脏中可看到明显的荧光信号，说明通过这种注射方法注入miRNA-484模拟物是可信的，可用于后续的实验研究。
实验例5miRNA-484过表达显著抑制心肌缺血再灌注引起的心功
能的损伤
对实验小鼠分别进行假手术处理作为对照组，缺血再灌注手术处理作为为缺血再灌组，注射miRNA-484模拟物后进行缺血再灌注手术处理(作为miRNA-484模拟物)及注射miRNA-484模拟物阴性对照后再进行缺血再灌注手术处理(作为miRNA-484模拟物阴性对照)。以购自上海吉玛公司的一段无关序列为阴性对照序列，其不抑制现有已知的任何基因的表达，为了证明我们目标的小RNA即miRNA-484的有效性，在购买miRNA-484模拟物的时候公司都会配送一个目标小RNA的阴性对照以此来证明我们目标小RNA的有效性。对实验小鼠各组别进行超声心动的心功能检测，检测指标包括(图5A)左室舒张末内径(LVIDd)、(图5B)左室收缩末内径(LVIDs)、和(图5C)短轴截短率(FS)，结果表明miRNA-484模拟物的注射可以改善缺血再灌手术造成的心功能的损伤。
实验例6抑制内源性miRNA-484可加重缺血再灌注所致的心肌细
胞凋亡、心肌梗死面积
小鼠尾静脉30mg/kg注射miRNA-484抑制剂及阴性对照(功能同实施例6中相同的无序序列)，以假手术处理小鼠作为对照组。三天后进行缺血再灌注手术，再灌注3h监测心肌细胞凋亡，再灌注24小时用伊文氏蓝双染测定心肌梗死面积。与阴性对照注射组相比，miRNA-484抑制剂I/R组心肌细胞凋亡率明显增高(图6A)，心肌梗死面积显著增高(图6B)，说明抑制内源性miRNA-484可加重缺血再灌注所致的心肌细胞凋亡、心肌梗死面积。
实验例7荧光标记FAM标记miRNA-484抑制剂后，注射小鼠后
检测心脏的miRNA-484抑制剂注射效率
对小鼠注射带有FAM荧光基团标记的miRNA-484抑制剂(miRNA-484antagomir)后，将小鼠心脏固定后用冰冻切片切成5μm后，用荧光染料DAPI(4，6-联脒-2-苯基吲哚)染细胞核后在荧光显微镜下检测拍照(图7B)，再用生理盐水作为对照组按上述相同的方法处理小鼠的心脏(图7A)。图中FAM-抑制剂即为FAM荧光基团标记的miRNA-484抑制剂；从图片可看出注射了荧光标记FAM的miRNA-484抑制剂后在心脏中可看到明显的荧光信号，说明通过这种注射方法注入miRNA-484抑制剂是可信的，可用于后续的实验研究。
实验例8抑制内源性miRNA-484可加重缺血再灌注所致心功能失
调
对实验小鼠各组别注射miRNA-484的抑制剂抑制内源性的miRNA-484后进行超声心动的功能检测，检测指标包括检测指标包括左室舒张末内径(LVIDd)、)左室收缩末内径(LVIDs)、和短轴截短率(FS)，图中的结果表明注射了miRNA-484抑制剂后增加了缺血再灌注引起的心功能的损伤，也间接说明了miRNA-484对心脏的保护作用。
Claims (7)
1.miRNA-484在制备用于预防或治疗心脏疾病药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA-484的核苷酸序列如下述SEQ ID NO：1的序列所示：
5′-UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU-3′。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述心脏疾病包括心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚或心肌纤维化。
4.一种药物组合物，该药物组合物由有效剂量的miRNA-484药学上可接受的载体、病毒或辅料组成。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为壳聚糖、胆固醇、脂质体或纳米颗粒。
6.根据权利要求4或5所述的药物组合物在制备用于预防或治疗心脏疾病药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的药物组合物的用途，其特征在于，所述心脏疾病包括心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚或心肌纤维化。
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