CN102216781A - 全部流感嗜血杆菌的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供能够以高灵敏度同时测定全部的流感嗜血杆菌的免疫学测定法。全部流感嗜血杆菌的免疫学测定方法的特征在于，使用流感嗜血杆菌的P4抗原识别抗体或P6抗原识别抗体。
Description
技术领域
本发明涉及特异性地测定所有流感嗜血杆菌的方法、以及用于该方法的测定装置。
背景技术
已知流感嗜血杆菌(HaemoPhilus influenzae)与肺炎球菌同样作为人鼻咽腔的常居菌，并已知对于没有达到常居化的、尤其是婴幼儿、小儿而言是呼吸道感染、中耳炎、髓膜炎、败血症等的病原菌。与其它感染疾病的病原菌同样，对于流感嗜血杆菌而言，多用抗菌药导致的耐药性作为导致症状的难治、重症化的原因而成为问题，治疗开始时的适当的抗菌药选择的重要性正在增加。作为感染疾病治疗的原则，尽可能早期确定病原菌，并选择确切的治疗对预后的改善、医疗成本的削减、防止出现耐药菌很重要，因此需要迅速检测来自流感嗜血杆菌的共同抗原的诊断试剂。
现在，作为流感嗜血杆菌判定方法使用革兰氏染色法、镜检、培养法、利用菌体的酶代谢的显色反应、乳胶凝集法、PCR法等。其中，作为迅速诊断方法有利用乳胶凝集法的流感嗜血杆菌抗原检测试剂盒(Slidex Meningite-Kit 5.bioMerieux公司)，但这是检测b型流感嗜血杆菌的多糖体抗原的方法，不能用于无荚膜型的判定。另外，也有采用PCR法的流感嗜血杆菌基因检测测定法、以菌株共同抗原的P6、P4抗原作为靶的这些基因检测测定法，但采用PCR法的基因诊断测定法由于实施设备受限而目前缺乏普遍性。另外，有关于P6抗原的单克隆抗体的报告，是通过免疫印迹法检测流感嗜血杆菌(非专利文献1)。但是，采用该方法的灵敏度低，不是作为临床检查使用的水平。
流感嗜血杆菌是革兰氏阴性杆菌，根据覆盖菌的荚膜的有无大致分为荚膜型和无荚膜型，进一步按照存在于荚膜的多糖抗原的结构差异导致的血清类型分类，荚膜型存在a～f型，另外，无荚膜型被分类为不能区分类型的型。作为b型荚膜多糖的多核糖基核糖醇磷酸盐被报告是b型特异性抗原，但是在无荚膜型中还没发现作为这样的特异抗原的多糖。另外，作为无荚膜型的蛋白抗原已知作为流感嗜血杆菌的主要抗原的、菌体外膜蛋白质之一的P2蛋白质，由于本抗原多发变异，已知根据菌株而抗原性不同。
非专利文献
非专利文献1：Journal of Clinical Microbiology.(1989)2263-2267
发明内容
如上所述，没有发现流感嗜血杆菌的共同抗原，没有能够同时检测全部流感嗜血杆菌的免疫学的方法。
本发明的课题是解决上述问题，将提供能够以高灵敏度同时检测全部的流感嗜血杆菌的免疫学测定方法、以及利用该方法的测定装置作为课题。
本发明的发明人，为了解决上述课题而进行深入研究的结果，关注了以往被认为流感嗜血杆菌中共同存在并且变异比较少的P4和P6蛋白。该蛋白质相比于其它抗原在流感嗜血杆菌中表达量少，因而认为即使制作了识别抗体也难以高灵敏度地、且全面性地测定全部类型的流感嗜血杆菌。另外，存在很多具有与P4和P6蛋白同源性高的蛋白的细菌，因此认为难以特异性地检测流感嗜血杆菌。但是，与预想相反，本发明的发明人能够制作高选择性地进行识别的抗体。另外，确认了该抗体很难受到具有测定时容易混入的可能性的绿脓杆菌、大肠杆菌等的影响。本发明是基于本成果而完成的发明。
即，本发明提供一种全部流感嗜血杆菌的免疫学测定方法，其特征在于，使用流感嗜血杆菌的P4抗原识别抗体或P6抗原识别抗体。
另外本发明还提供一种全部流感嗜血杆菌的免疫学测定装置，其特征在于，含有流感嗜血杆菌的P4抗原识别抗体或P6抗原识别抗体。
根据本发明，通过以所有流感嗜血杆菌为对象的高灵敏度测定方法的确立，使该测定装置的提供成为可能，由此使得在中耳炎等中感染的所有流感嗜血杆菌的检测能够简便、迅速地进行。本发明方法对由流感嗜血杆菌导致的中耳炎的检测特别有用。
附图说明
图1表示ELISA中的、对于抗P4PoAb(a)和抗P6PoAb(b)的免疫原的流感嗜血杆菌共同抗原(P6、P4)的反应性。
图2表示ELISA中的、对于抗P6PoAb的NTHiP6(a)和NTHi破碎菌体(b)的反应性。
图3表示ELISA中的、对于抗P6PoAb的细菌类(表1)的反应性。
图4表示ELISA中的、对于抗P4PoAb的P4rec.(a)和NTHi菌体提取液(b)的反应性。
图5表示ELISA中的、对于抗P4PoAb的细菌类(表1)的反应性。
图6表示免疫层析的一般性结构。
图7表示免疫层析停止时的检测体的展开状态。
图8表示免疫层析中的、对抗P6PoAb的NTHiP6(a)和NTHi破碎抗体的反应性。
具体实施方式
成为本发明的测定法的对象菌是流感嗜血杆菌，流感嗜血杆菌中的作为荚膜型的a～f型、以及无荚膜型全部是测定对象。具体来说，表达P4抗原和P6抗原的菌成为对象。另外，作为流感嗜血杆菌引起的疾病，可以想到婴幼儿和小儿的呼吸道感染、中耳炎、髓膜炎和败血症等，但可以想到这样的疾病的情况下，从患部取样品时，其它菌混入并在测定体系中进行反应的可能性。但是，在本发明测定法中，其特征是，对于将与P6抗原和P4抗原具有同源性的蛋白质作为构成成分的菌，例如副流感嗜血杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等，一概不反应。本来，制备针对抗原的多克隆抗体并用于测定体系时，通常理应针对所有具有同源性抗原的菌发生交叉性，另外，P6和P4抗原的情况也有这样产生与其它菌的交叉性的担心。另外，该抗原均是流感嗜血杆菌中的微量成分，即便是能够制作多克隆抗体，在测定灵敏度方面也不利是大多数人的看法。由于上述原因，还没有报告使用针对该抗原的多克隆抗体的测定体系。但是，本发明的情况是，使用了这些多克隆抗体的测定体系与预想相反，与具有混入上述样品的可能性的副流感嗜血杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等的交叉反应性极低(参照图3)，能够高出预想而以高灵敏度测定所有流感嗜血杆菌。
识别本发明中使用的流感嗜血杆菌的P4抗原或P6抗原的抗体可以通过将P4抗原或P6抗原对动物进行免疫，并取得该动物的抗血清或卵等来制造。
用于免疫的P4抗原或P6抗原可以取自流感嗜血杆菌，也可以通过重组法来制造。其中，从测定灵敏度方面考虑，优选使用从流感嗜血杆菌提取的抗原。在这里作为P4抗原或P6抗原可以是P4蛋白或P6蛋白，也可以是P4抗原或P6抗原的一部分多肽。
另外，在P4抗原和P6抗原中，从对流感嗜血杆菌的特异性和灵敏度方面考虑，优选使用P6抗原。
将关于P6抗原的核苷酸序列以及它所编码的氨基酸序列示于序列号1(登记号M19391)。将关于P4抗原的核苷酸序列以及它所编码的氨基酸序列示于序列号2(登记号M68502)。
对于以下的说明，基于P6抗原进行说明，但P4抗原的情形也可以同样实施。
P6和P4抗原的重组体的制作
基于P6抗原进行说明。P6多核苷酸可以基于序列号1的序列信息通过化学DNA合成法来制造、取得，通过一般的基因工程学方法容易制造、取得〔参照Molecular Cloning 2d Ed，Cold SPring Harbor Lab.Press(1989)；续生化学实验讲座「基因研究法I、II、III」、日本生化学会编(1986)等〕。
作为化学DNA合成法，可以例示采用亚磷酰胺法的固相合成法。在该合成法中可以利用自动合成仪。
另外，作为一般的基因工程学方法，具体来说，可以通过以下方法来实施：根据能够表达P6多核苷酸的适当的来源，通过常用方法制备cDNA文库，通过利用P6多核苷酸特有的适当的探针、抗体从该文库选择所需克隆〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，78，6613(1981)；Science122，778(1983)等〕。
在这里，作为cDNA的来源，只要是表达P6多核苷酸的微生物就没有特别限制，但具体来说，可以优选使用H.influenzae。
另外，从其中分离总RNA、分离纯化mRNA、取得cDNA及其克隆等均可以根据常用方法实施。另外，从cDNA文库中筛选P6多核苷酸的方法也没有特别的限制，可以根据通常的方法进行。具体来说，例如可以例示对通过cDNA而产生的多肽通过使用了该多肽特异抗体的免疫筛选来选择对应的cDNA克隆的方法，使用了与目标核苷酸序列选择性地结合的探针的噬菌斑杂交，菌落杂交等或它们的组合等。
作为在这里使用的探针，一般可以例示以涉及P6多核苷酸的核苷酸序列的信息为基础而化学合成的DNA等。另外，还可以将以本发明的多核苷酸的碱基序列信息为基础而设定的正义引物和/或反义引物作为筛选用探针来使用。
取得P6多核苷酸时，可以适当地利用采用PCR法〔Science130，1350(1985)〕或其变更方法的DNA或者RNA扩增法。尤其，难以从文库得到全部长度的cDNA的情况下，适合采用RACE法〔Rapid amplification of cDNA ends；实验医学、12(6)，35(1994)〕、特别是5’-RACE法〔M.A.Frohman，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，8，8998(1988)〕等。
采用所述PCR法时使用的引物可以基于P6多核苷酸的序列信息适当设定，这可以根据常用方法来合成。再者，扩增的DNA或者RNA片段的离析纯化可以如上所述根据常用方法进行，例如可以通过凝胶电泳法、杂交法等进行。
利用P6多核苷酸，可以通过采用通常的基因工程学方法，容易地、大量地、稳定地制造该多核苷酸的产物(即，上述多肽)。
表达载体
表达载体只要是含有P6多核苷酸且能够表达该P6多核苷酸的载体就没有特别限制，一般由与宿主细胞的关系适当选择。
作为宿主细胞使用原核生物的细胞的情况下，作为表达载体，可以举出例如在该宿主细胞中能够复制的质粒载体，即，以在该载体中能够表达上述多核苷酸的方式对上述多核苷酸的上游赋予启动子和SD(Shine-Dalgarno)碱基序列的表达质粒。具体来说，可以举出利用了PL启动子、T7启动子和lac启动子的表达质粒。作为其它的优选的细菌表达载体，可以举出利用了tac启动子或trc启动子的质粒pKK233-2和pKK233-3等。但是，不限于这些，可以利用公知的各种菌株及载体。
另外，作为宿主细胞使用脊椎动物细胞的情况下，作为表达载体可以使用具有通常位于所要表达的上述多核苷酸的上游的启动子、RNA的剪接部位、多聚腺苷酸化部位和转录终止序列等的表达载体，所述表达载体可以进一步根据需要具有复制起点。对插入上述多核苷酸有用的真核生物载体广为熟知。例如，作为合适的真核生物载体可以例示pCD和pCMV。另外，除此之外，可以举出根据需要利用了MMTV或SV40后期启动子的pMSG和pSVL。
重组细胞
利用含有P6多核苷酸的表达载体进行转化能够得到重组细胞(转化体)。
作为用于重组细胞的宿主细胞，可以使用原核细胞和真核细胞中的任一种。
作为宿主细胞来使用的原核细胞，可以使用基因重组中经常使用的细菌，可以例示大肠杆菌、链霉菌、枯草菌、链球菌、葡萄球菌等。特别是可以举出大肠杆菌、枯草菌等作为适合的例子。
作为宿主细胞使用的真核细胞，例如可以例示酵母、曲霉菌等真核微生物；果蝇S2、草地贪夜蛾Sf9等昆虫细胞；L细胞、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、C127细胞、BALB/c3T3细胞(包括缺失二氢叶酸还原酶、胸苷激酶等的变异株)、BHK21细胞、HEK293细胞、Bowes黑色素瘤细胞、卵母细胞等动植物细胞等。
另外，将上述表达载体导入宿主细胞的方法没有特别的限制，可以采用一般的各种方法。例如，向宿主细胞导入上述表达载体可以按照Davis等(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，1986)和Sambroo等(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)等的多个标准实验室手册中记载的方法进行，作为其具体的方法，可以举出磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导转染、转介(transvection)、显微注射、阳离子型脂质体介导转染、电穿孔、转导、划痕负载(scrape loading)、弹丸导入(ballistic introduction)、感染等。
使用了重组细胞的P6抗原肽的制造
培养导入了P6多核苷酸的重组细胞，从细胞和/或培养物中回收P6多肽，从而可以制造P6多肽。
培养是使用适合宿主的培养基来进行传代培养或分批培养。培养是将重组细胞内外产生的P6多肽量作为指标，进行到得到适当量的P6多肽即可。
作为用于该培养的培养基，可以根据所采用的宿主细胞而适当地选择利用惯用的各种培养基，培养也可以在适合宿主细胞的生育的条件下实施。
另外，这样得到的P6多肽，根据需要，可以采用利用其物理性质、化学性质等的各种分离操作〔参照「生化学デ一タ一ブツクII」、1175-1259頁、第1版第1刷、1980年6月23日株式会社东京化学同人发行；Biochemistry，25(25)，8274(1986)；Eur.J.Biochem.，163，313(1987)等〕进行分离、纯化。具体来说，可以例示下述与“抗原的提取和离析”一栏中记载的将目标蛋白质离析纯化的方法相同的方法。
P6抗原肽的提取和离析法
以下，对由具有P6多肽产生能力的微生物离析纯化P6肽的方法进行说明。首先，破碎具有P6多肽产生能力的微生物的菌体，得到该微生物的粗提取物。在这里，菌体的破碎可以使用采用弗氏压碎器、细胞研磨器等破碎器的处理；低渗溶液下的超声波处理等通常的菌体破碎处理中使用的方法。另外，可以在得到的粗提取物中添加适当的缓冲液。
针对得到的粗提取物，为了提高其纯化度，进而，可以供给到利用了硫酸铵沉淀、乙醇等的有机溶剂沉淀，或等电点沉淀等纯化处理。接着，通过将粗提取物供给到离子交换色谱法、凝胶过滤色谱、疏水层析、各种亲和层析、反相色谱、羟基磷灰石柱层析等处理，可以得到含有P6多肽的组分。再有，利用这些色谱法的处理可以根据需要而使用开放柱(オ一プンカラム)，或使用HPLC。另外，对这样得到的含有P6多肽的组分的纯度，可以利用电泳、特别是SDS-PAGE直观而简便地推定。另外，P6多肽可以通过氨基酸序列分析法；利用了MALDI-TOF MS、ESI Q-TOF MS或MALDI Q-TOF MS等质量分析装置的质量分析法；肽质量指纹图谱法等来确认。
抗体的取得
关于用于测定的P6抗原肽或P6抗原肽识别抗体的取得，可以根据常用方法来取得。优选使用多克隆抗体。
制作多克隆抗体时，可以通过以下方法取得：通常将上述目标抗原与弗氏完全佐剂进行混合而制备乳化物，用该乳化物对兔子、羊、豚鼠、鸡之类的恒温动物进行多次免疫，根据常用方法由得到的抗血清取得多克隆抗体。另外，鸡的情况下，将上述免疫抗原进行多次免疫，使得该鸡产下的鸡蛋中产生IgY，从而可以由该鸡蛋的蛋黄根据常用方法取得IgY。
测定体系的构建
本发明流感嗜血杆菌的测定方法优选使用识别P6抗原或P4抗原的多克隆抗体。被检试样可以是流感嗜血杆菌或该菌的提取物。其中特别优选使用识别P6抗原的多克隆抗体。
作为利用了本免疫学方法的测定装置，可以举出ELISA和免疫层析测定装置作为代表例。作为其它的例子，可以举出放射免疫测定法(RIA)等利用了针对测定对象物的抗体的方法作为合适的例子。
ELISA测定方法
例如，夹心法的情况下，通常对96孔板将一次抗体(抗P6多克隆抗体或抗P4多克隆抗体)在板上固相化，添加来自生物体的试样(血液、血清、血浆、或其它体液成分特别是耳漏等中耳浸出液、咽拭子液、尿)、或根据需要用适当的缓冲液稀释的试样，通过与抗体接触一定时间来结合。此后，用适当的缓冲液进行清洗后，与标记2次抗体(标记抗P6抗体或标记P4抗体)进行反应。例如，如果标记体是生物素，则通过与亲和素(或链霉亲和素)标记过氧化物酶反应，并与适当的反应底物(例如TBM)作用而显色。一定时间后，通过用规定波长测定，进行比色定量，在此时所述规定波长为450nm。亲和素标记抗体可以考虑过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和酪氨酸酶标记等。作为底物，只要是市售且一般使用的底物，就没有特别限制。
作为标记抗体，可以举出生物素标记抗体、与此相对的亲和素或链霉亲和素、或2次抗体中的过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和酪氨酸酶标记等。作为底物，只要是市售且一般使用的底物，就没有特别限制。
免疫层析测定装置
免疫层析的结构可以如图6所示根据一般方法进行。简单来说，包括以下部分：在塑料底衬上的一侧末端粘贴的样品上样部分(样品垫)、接着将胶体金标记抗P6PoAb干燥保持的部分(金垫)、硝化纤维素部分、和吸收过量的样品的部分(吸收垫)。样品垫和吸收垫优选玻璃纤维滤纸、纤维素制、或棉花制、以及它们的混合体的滤纸，硝化纤维素优选孔径为1.0～20μm(优选为5.0～10.0μm)。另外，以溶液状态使用胶体金标记抗P6PoAb时不需要金垫。
在硝化纤维素上的检测线上以0.1～10mg/ml浓度(优选为0.2～5mg/mL)的浓度涂布上述P6PoAb。对照线上以0.1～10mg/mL的浓度涂布具有抗兔IgG活性的山羊、小鼠的IgG等。干燥后，用蛋白质、高分子等进行封闭。封闭操作可以使用BSA、酪蛋白、明胶等蛋白质，聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)等高分子。另一方面，作为胶体金，优选20～150nm大小(优选为30～100nm)，抗体的标记可以考虑吸附或介由其它的蛋白质等形成的共价键。进而，还可以考虑代替胶体金使用着色Latex粒子、其它的贵金属胶体。胶体金的封闭与硝化纤维素同样，可以使用BSA、酪蛋白、明胶等蛋白，PVA、PVP、PEG等高分子。将这样组装的试纸条装入塑料盒内使用即可。
诊断试剂盒
通过测定被检试样中的P4抗原量或者P6抗原量，可以测定中耳炎患者等是否有流感嗜血杆菌感染。即，可以提供ELISA试剂盒或包括用于免疫层析法的各种试剂的试剂盒组合物。特别是，在试剂盒中包括针对P4抗原或者P6抗原的抗体。试剂盒中另外还包括BSA等白蛋白、2次抗体、酶的底物(作为标记而使用酶的情况)等。例如，如果标记抗体是生物素标记抗体，则该测定试剂盒中可以包括作为2次抗体的过氧化物酶标记亲和素。另外，可以提供包含对该过氧化物酶的底物等的全部流感嗜血杆菌诊断试剂盒。
根据本发明方法，可以特异性地检测各种感染疾病中的流感嗜血杆菌。因此，通过本发明方法判断为阳性的感染疾病的病原菌可以判定为流感嗜血杆菌。作为本发明的对象疾病，可以举出婴幼儿和小儿中的呼吸道感染疾病、中耳炎、败血症，但在中耳炎中几乎没有副流感嗜血杆菌的感染(International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology 2003)67，43-51)。因此，本发明方法对中耳炎中的全部流感嗜血杆菌的测定特别有用。
实施例
以下表示本发明的实施例，但不应限定于此。
1.抗P6或P4抗体的制作
将P6或P4各蛋白质从菌体中直接提取或制作大肠杆菌重组体，通过对兔子进行免疫而得到多克隆抗体。接着利用得到的抗体构建ELISA系并进行评价。进而，转化为免疫层析系并研究迅速诊断的可能性。
1-1.抗原制作
1-1-1.P6抗原的制备
P6抗原是采用从流感嗜血杆菌中的直接提取和制作大肠杆菌重组体这2种方法来实施。
从菌体中的提取
按照Kodama等的方法(Infection and Immunity，68，2294-2300(2000))，从菌体中提取P6抗原。即，将无荚膜型流感嗜血杆菌(NTHi(ATCC No.9333))在添加有杆菌肽的巧克力琼脂培养基(BD公司)上培养，通过刮法、离心法回收沉淀物。将沉淀悬于1％SDS/0.1M Tris/0.5M NaCl/0.1％2-巯基乙醇(pH8.0)的缓冲液中，超声波破碎后，在37℃加热30分钟。离心得到的沉淀物用添加有10ug/mL RNase A(SIGMA公司)的上述缓冲液悬浮，超声波破碎，再次在37℃加热30分钟。接着离心而得到沉淀物后，用没有添加RNase A的缓冲液悬浮，重复进行2次超声波破碎、加热这一系列的操作。将离心后的沉淀物悬于0.01M Tris/0.15M NaCl(pH7.4)的缓冲液中，超声波破碎后，在65℃加热30分钟。将离心得到的上清通过离心型超滤进行浓缩，将其作为抗原使用。
大肠杆菌重组体的制作
将流感嗜血杆菌b型(Hib)(ATCC No.10211)的菌体用于模板来进行直接PCR，扩增了缺少信号序列的P6基因(成熟型)。正向引物使用5′-GCGGGATCCTGTAGTTCCTCTAACAACGATGCT-3′(序列号3)，反向引物使用5′-GCGGAGCTCGTACGCTAACACTGCACGACGGTT-3′(序列号4)，并将GeneAmPTM PCR System 9700(PE APPlied Biosystems公司)中使用TaKaRa rTaq(TaKaRa公司)而得到的扩增片段插入到亚克隆用载体pCRTM 2.1(Invitrogen公司)中。确认扩增的P6基因(成熟型)的序列后，接着将利用BamHI、XhoI位点来切出的片段插入表达载体pET21a(MERCK公司)中，制作了重组体P6表达用质粒(P6-pET21a)。转导至大肠杆菌BL21后，在1mM IPTG、37℃、3小时的条件下进行重组体P6抗原的表达诱导。通过离心集菌后，用BugBusterTM Protein Extraction Reagent(MERCK公司)进行溶菌，通过离心操作回收可溶性组分。使结合有组氨酸标签的重组体P6抗原与用平衡用缓冲液(100mM磷酸盐，300mM NaCl，50mM咪唑，PH7.8)平衡后的Ni柱(HisTraPTM HP；GE Healthcare公司)结合，依次用平衡用缓冲液、清洗用缓冲液(100mM磷酸盐，300mM NaCl，50mM咪唑，PH6)清洗后，以洗脱用缓冲液(100mM磷酸盐，300mM Na Cl，200mM咪唑，PH6)进行洗脱。纯化后的重组体P6抗原用D-PBS(-)在4℃进行1夜的透析后通过离心型超滤进行浓缩。
1-1-2.P4抗原的制备
P4抗原只制作大肠杆菌重组体。制作程序等与重组体P6抗原几乎相同，首先，将无荚膜型流感嗜血杆菌(NTHi)(ATCC No.9333)的菌体用于模板来进行直接PCR，从而扩增缺少信号序列的P4基因(成熟型)。正向引物使用5′-GCGGGATCCTGTGGTTCACACCAAATGAAATC-3′(序列号5)，反向引物使用5′-GCGCTCGAGTTTACCATCCCAAGCTTGTACTG-3′(序列号6)，并对GeneAmPTM PCR System 9700中使用TaKaRa ExTaq(TaKaRa公司)而得到的扩增片段进行利用BamHI、XhoI的限制性内切酶处理后，利用这两位点插入到表达载体pET21a中，制作了重组体P4表达用质粒(P4m-pET21a)。转导至大肠杆菌BL21后，在1mM IPTG、37℃、3小时的条件下进行重组体P4抗原的表达诱导。通过离心集菌后，用BugBusterTM Protein Extraction Reagent进行溶菌，通过离心操作回收可溶性组分。使结合有组氨酸标签的重组体P4抗原与用平衡用缓冲液平衡后的Ni柱结合，依次用平衡用缓冲液、清洗用缓冲液清洗后，以洗脱用缓冲液进行洗脱。纯化后的重组体P4抗原用D-PBS(-)在4℃进行1夜的透析后通过离心型超滤进行浓缩。
1-2.抗体制作
在兔子的皮下，将得到的各免疫原与弗氏等佐剂一起进行免疫。免疫量使用100μg/body，以隔周方式进行5～6次左右的免疫。每种抗原免疫2个体，将得到的全血离心分离后，以抗血清的形式冻结保存。解冻适量的抗血清后，进行使用了Protein A的亲和纯化、通过凝胶过滤进行纯化，将得到的抗体作为多克隆抗体(PoAb)来使用。
1-3.PoAb的反应性
通过上述方法制作的各PoAb的效价根据以下的ELISA法进行评价。首先，将作为免疫原的重组体P4抗原、重组体P6抗原和提取P6抗原以1μg/mL的浓度分别在ELISA板上固相化后，用牛血清白蛋白(BSA)等进行封闭。分别以1μg/mL的浓度使由2个体纯化而得的抗P4PoAb与重组体P4抗原固相板反应，另外使由2种P6抗原得到的共计4种抗P6PoAb与重组体P6抗原和提取P6抗原固相板反应。清洗后，与标记了辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔IgG抗体(ZYMED公司)反应，用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)显色。另外，作为对照抗原使用BSA固相板。进而，为了确认对得到的各PoAb的菌体的反应性，使用将NTHi(ATCC No.9333)的破碎菌体以1μg/mL固相化的板同样进行ELISA，所述破碎菌体是将NTHi用表面活性剂或超声波等进行破碎而得到的。结果，如图1的a、b所示，抗P4、抗P6PoAb均是不仅对免疫原而且对破碎菌体也具有反应性，因此，推测可以构建流感嗜血杆菌抗原检测夹心ELISA。
2.P6或P4抗原检测用ELISA的构建及性能评价(ELISA实施例)
2-1.P6抗原检测用夹心ELISA
将抗P6PoAb(抗NTHi P6PoAb No.2)以5μg/mL的浓度分别在ELISA板上进行固相化后，用BSA等进行封闭。使适当阶段稀释的免疫原或破碎菌体对本抗体固相板进行反应。清洗后，使与固相的抗P6PoAb相同的PoAb的生物素标记体分别反应，再次清洗后，使HRP标记的链霉亲和素反应，用TMB进行显色。将用量依赖曲线的一个例子示于图2的a、b，可以检测30pg/mL以上的P6抗原，另外，在NTHi(ATCC No.8149)的破碎菌体中可进行103～107CFU/mL的检测。
2-2.P6抗原检测用夹心ELISA的交叉反应性
通过上述夹心ELISA评价对表1所示的各种细菌类的交叉反应性的结果示于图3，如期地检测到了荚膜型、无荚膜型二者的全部流感嗜血杆菌株。
表1
2-3.P4抗原检测用夹心ELISA
测定顺序等与上述P6抗原检测用夹心ELISA相同，但将抗P4PoAb(抗P4rec.PoAb No.2)以5μg/mL的浓度分别在ELISA板上固相化后，用BSA等进行封闭。使适当阶段稀释的免疫原或破碎菌体对本抗体固相板进行反应。清洗后，使与固相的抗P4PoAb相同的PoAb的生物素标记体分别反应，再次清洗后，使HRP标记的链霉亲和素反应，用TMB进行显色。将用量依赖曲线的一个例子示于图4的a、b，可以检测100pg/mL以上的P4抗原，另外，在NTHi的破碎菌体中可进行103～107CFU/mL的检测。
2-4.P4抗原检测用夹心ELISA的交叉反应性
将通过夹心ELISA评价对表1所示的各种细菌类的交叉反应性的结果示于图5，按照目标检测到了荚膜型、无荚膜型二者的全部流感嗜血杆菌株。
由以上的结果可以推测，由于组成了对于任意抗P6PoAb、抗P4PoAb能够主要检测流感嗜血杆菌抗原的夹心ELISA的测定体系，所以能够构建利用免疫层析的测定体系。
3.P6抗原检测用免疫层析的构建及性能评价
3-2.使用了抗P6PoAb的夹心免疫层析的性能
将通过上述操作而制作的胶体金标记抗P6PoAb用含有表面活性剂的磷酸缓冲液等稀释后与提取P6抗原混合，并采用图7的右侧所示的方法在抗体固相试纸条进行展开。用上述缓冲液清洗后，利用密度计解析出现的各检测线的信号强度并将其数值化。结果，如图8的a、b所示，免疫原中能够在此次测定最小浓度1ng/mL以上的检测线的信号强度。另外，NTHi的破碎菌体中在3×104CFU/mL以上能够检测菌体浓度依赖性的检测线的信号强度。从这些结果，可以构建采用抗P6PoAb检测流感嗜血杆菌抗原的免疫层析测定体系。
Claims (6)
1.一种全部流感嗜血杆菌的免疫学测定方法，其特征在于，使用流感嗜血杆菌的P4抗原识别抗体或P6抗原识别抗体。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，抗体是多克隆抗体。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其中，测定体系是ELISA或免疫层析。
4.一种全部流感嗜血杆菌的免疫学测定装置，其特征在于，含有流感嗜血杆菌的P4抗原识别抗体或P6抗原识别抗体。
5.根据权利要求4所述的测定装置，其中，抗体是多克隆抗体。
6.根据权利要求4或5所述的测定装置，其中，测定体系是ELISA或免疫层析。
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