CN102199545A - 一株辛格粒毛盘菌及其液态发酵制备胞内黑色素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辛格粒毛盘菌及由其液态发酵制备胞内黑色素的方法，特征是将保藏编号为CCTCC No：M 2011054的辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株活化后摇瓶培养得到的种子液按发酵培养基体积的4～8％接种于发酵培养基进行液态发酵，发酵液抽滤得到的菌丝体经干燥后，采用碱性溶液浸提，再用盐酸进行沉淀，即得到胞内黑色素。与采用基础发酵培养基相比，采用本发明的改良培养基配方干菌丝体产量由5.956g/L提高到8.420g/L，黑色素得率由7.835％提高到12.05％，发酵周期由10天缩短至8天。
Description
技术领域
本发明属于由微生物发酵制备黑色素技术领域，具体涉及一株辛格粒毛盘菌菌株及采用改良培养基液态发酵提高胞内黑色素产量的方法。
背景技术
黑色素是分布较广泛的天然色素之一，按照意大利化学家Nicolaus(Melanins In：Chemistry of Nature Products[M].Paris：Hermann，1968：68-91)的观点，黑色素通常以三种形式存在：真黑色素(eumelanins)，主要是呈黑色或褐色的含氮色素，不含硫原子，由酪氨酸、二羟基苯丙氨酸(多巴)、多巴胺、酪胺等氧化聚合而成；棕黑色素(phaeomelanins)，颜色较真黑色素浅，含氮和硫原子，常呈棕色、红色甚至黄色，是由酪氨酸经上述同样路径合成而来，其中有半胱氨酸的参与；异黑色素(allomelanins)，常呈黑色或棕色，主要存在于植物中，是在多酚氧化酶(polyphenol oxidase)存在下通过多酚的氧化聚合形成的。近年来人们已经发现一些合成色素对人体有不同程度的毒性，甚至有的有致癌作用；因此，天然色素越来越受到人们的青睐。目前天然黑色素主要从动植物材料中提取，例如芝麻黑色素、香蕉皮黑色素以及乌骨鸡黑色素等；天然黑色素还可以利用微生物合成。微生物所产黑色素可分为胞内黑色素和胞外黑色素，胞内黑色素多存在于真菌的菌丝、分生孢子壁之中，胞外黑色素则是在细胞壁外最终完成合成的黑色素。
辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)，隶属于盘菌纲(Discomycetes)柔膜菌目(Helotiales)晶杯菌科(Hyaloscyphaceae)粒毛盘菌属(Lachnum)。目前大多数学者对粒毛盘菌的研究主要集中在对其分类上，而对其代谢产物的研究较少。《中国抗生素杂志》(Journal Antibiot，1995，48(2)：158-161；1996，49(5)：447-452)报道过从粒毛盘菌深层发酵产物中发现具有杀线虫及抗微生物作用的生物活性物质。目前仅见本发明人研究课题组在中国《食品科学》(2007，28(10)：329-322)以及《菌物学报》(2009，28(3)：393-398)公开报道过对巴西粒毛盘菌产黑色素的研究，以及在《食品科学》(2009，30(17)：185-189)公开报道过对粒毛盘菌产黑色素的研究。
中国专利申请号200910145058公开了本发明人的《一种粒毛盘菌及由其液态发酵制备黑色素的方法》，是利用一株保藏编号为CCTCC No：M 209193的粒毛盘菌制备胞外黑色素；而利用一株保藏编号为CCTCC No：M 2011054的辛格粒毛盘菌制备胞内黑色素，之前还从未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种产胞内黑色素的辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)，并采用改良培养基对其液态发酵提高胞内黑色素产量的方法。
本发明的辛格粒毛盘菌，该生物材料的样品保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院(邮政编码430072)，保藏日期为2011年3月2日；保藏编号为CCTCC No：M 2011054，分类命名为辛格粒毛盘菌(Lachnumsingerianum)。
本发明由辛格粒毛盘菌液态发酵制备胞内黑色素的方法，其特征在于：将保藏编号为CCTCC No：M 2011054的辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株活化后，采用马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)摇瓶培养得到种子液，将种子液接种于发酵培养基进行液态发酵，再将发酵液抽滤得到的菌丝体经干燥后，采用碱性溶液浸提后，用盐酸进行沉淀，即获得胞内黑色素。
所述辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株的活化为：将马铃薯葡萄糖培养基(PDA)斜面保藏的辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株接种于PDA平板上，在23～26℃恒温培养3～5天，得到活化菌落；
所述摇瓶培养为：沿上述辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株的活化菌落边缘接种菌龄一致的菌块于马铃薯葡萄糖液体发酵培养基中，在23～28℃、以160～200r/min摇床培养3～5天后，得到种子液；
所述液态发酵为：将上述种子液按发酵培养基体积的4～8％接种于发酵培养基，在23～28℃、以160～200r/min转速培养7～10天。
所述发酵培养基可采用现有的基础发酵培养基，其配方按质量百分比为：马铃薯汁20％、葡萄糖2％、pH自然，蒸馏水1000ml；或，可特别采用本发明提出的改良发酵培养基进行液态发酵，该改良发酵培养基的配方质量百分比为：马铃薯汁15～25％、葡萄糖1～3％、蛋白胨0.5～1.5％、K2HPO40.03～0.1％、MgSO4·7H2O 0.01～0.1％、蒸馏水1000ml，pH 7.0～9.0。
所述碱性溶液可选自氢氧化钠、氢氧化钾或氨水溶液。
本发明提出的改良发酵培养基配方，在现有基础发酵培养基的基础上添加了作为氮源的蛋白胨、作为生长因子的MgSO4·7H2O以及用来调节发酵培养基pH值的K2HPO4；采用本发明的改良发酵培养基配方与采用基础发酵培养基相比，黑色素干菌丝体产量由5.956g/L提高到8.420g/L，黑色素得率由7.835％提高到12.05％，发酵周期由10天缩短至8天。
具体实施方式
实施例1：
本发明的保藏编号为CCTCC No：M 2011054的辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株，其子实体采自安徽黄山，采用组织分离法对其进行分离纯化：取新鲜的粒毛盘菌子实体，先用75％酒精浸泡10～30s后再用0.1％升汞溶液浸泡5～8min，然后用无菌水清洗2～3次后，将子实体切割成2～4块，接种于PDA培养基，23～25℃恒温培养，待菌丝生长后，沿菌落边缘取菌龄及形态一致的菌块进行纯化培养，重复4～5次，获得辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株的纯培养物；
(1)辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株的液态发酵
将上述保藏编号为CCTCC No：M 2011054的辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株的纯培养物接种于马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)平板上活化，25℃恒温培养4天后，用直径6mm的打孔器沿菌落边缘取一块菌龄一致的菌块接种于装有50ml马铃薯葡萄糖液体培基(PDB)的250ml三角瓶中，在25℃、以180r/min的转速，摇床培养4天后，得到辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)种子液；将该辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)种子液按发酵培养基体积的6％接种于5L自动控制发酵罐，装液量为3.5L，通气量为2L/min，在25℃、以180r/min，在基础发酵培养基以及改良发酵培养基中分别培养10天以及8天后，抽滤，收集菌丝体，60℃烘干，分别得到干菌丝体5.956g/L和8.420g/L。
所述马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，其配方质量百分比为：马铃薯汁20％、葡萄糖2％、琼脂2％、蒸馏水1000ml，pH自然；所述马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)，其配方质量百分比为：马铃薯汁20％、葡萄糖2％、蒸馏水1000ml，pH自然；所述发酵培养基配方，可选用现有的基础发酵培养基，其配方质量百分比为：马铃薯汁20％、葡萄糖2％、蒸馏水1000ml，pH自然；或选用本发明提出的改良发酵培养基，其配方质量百分比为：马铃薯汁20％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、K2HPO40.05％、MgSO4·7H2O 0.05％、蒸馏水1000ml，pH 8.0。
(2)胞内黑色素的提取
分别取上述采用不同发酵培养基所得到的干菌丝体20g，按干菌丝体的质量(g)与浓度为0.4mol/L的氢氧化钠溶液(ml)比为1∶200混匀，80℃水浴浸提2小时，抽滤，得浸提液；用1mol/L盐酸溶液调节上述浸提液pH值为2，静置12小时，得到黑色素悬浮液；然后将上述黑色素悬浮置于高速冷冻离心机中，以5000r/min的转速、在4℃离心10min，弃上清液，将所得到的沉淀经去离子水洗涤至pH值为7后采用真空冷冻干燥，从采用基础发酵培养基以及改良发酵培养基所得到的干菌丝体中分别得到胞内黑色素1.567g和2.410g。
实施例2：
保藏编号为CCTCC No：M 2011054的辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株纯培养物的获得方法同实施例1；
(1)辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株的液态发酵
将上述保藏编号为CCTCC No：M 2011054的辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株的纯培养物接种于马铃薯葡萄糖培养基平板上活化，26℃恒温培养3天后，用直径6mm的打孔器沿菌落边缘取一块菌龄一致的菌块接种于装有50ml马铃薯葡萄糖液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在28℃、以160r/min摇床培养3天后，得到辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株的种子液。将该种子液按发酵培养基体积的4％接种于5L自动控制发酵罐，发酵培养基装液量为3L，通气量为2L/min，在28℃、以160r/min的转速培养7天后，抽滤，收集菌丝体，60℃烘干，得到干菌丝体6.960g/L。所述发酵培养基配方，其配方质量百分比为：马铃薯汁15％、葡萄糖3％、蛋白胨0.5％、K2HPO40.03％、MgSO4·7H2O 0.1％、蒸馏水1000ml，pH 7.0。
(2)胞内黑色素的提取
取上述干菌丝体20g，按干菌丝体的质量(g)与浓度为0.4mol/L的氢氧化钠溶液(ml)比为1∶200混匀，80℃水浴浸提2小时，抽滤，得浸提液；用1mol/L盐酸溶液调节上述浸提液pH值为2，静置12小时，得到黑色素悬浮液；然后将上述黑色素悬浮置于高速冷冻离心机中，以5000r/min的转速、在4℃离心10min，弃上清液，将所得到的沉淀经去离子水洗涤至pH值为7后采用真空冷冻干燥，得到胞内黑色素2.374g。
实施例3：
保藏编号为CCTCC No：M 2011054的辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株纯培养物的获得方法同实施例1；
(1)辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株的液态发酵
将上述保藏编号为CCTCC No：M 2011054的辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株的纯培养物接种于马铃薯葡萄糖培养基平板上活化，25℃恒温培养5天，用直径6mm的打孔器沿菌落边缘取一块菌龄一致的菌块接种于装有60ml马铃薯葡萄糖液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在23℃、以200r/min的转速，摇床培养5天后，得到辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株的种子液。将该种子液按发酵培养基体积8％接种于5L自动控制发酵罐，发酵培养基装液量为3.5L，通气量为2L/min，在23℃、以200r/min的转速，培养10天后，抽滤，收集菌丝体，60℃烘干，得到干菌丝体6.690g/L。所述发酵培养基配方，其配方质量百分比为：马铃薯汁25％、葡萄糖1％、蛋白胨1.5％、K2HPO40.1％、MgSO4·7H2O 0.01％、蒸馏水1000ml，pH 9.0。
(2)胞内黑色素的提取
取上述干菌丝体20g，按干菌丝体的质量(g)与浓度为0.4mol/L的氢氧化钠溶液(ml)比为1∶200混匀，80℃水浴浸提2小时，抽滤，得浸提液；用1mol/L盐酸溶液调节上述浸提液pH值为2，静置12小时，得到黑色素悬浮液；然后将上述黑色素悬浮置于高速冷冻离心机中，以5000r/min的转速、在4℃离心10min，弃上清液，将所得到的沉淀经去离子水洗涤至pH值为7后采用真空冷冻干燥，得到胞内黑色素2.038g。由以上本发明实施例的结果与现有技术相比较可以看到：采用本发明的改良培养基配方干菌丝体产量由5.956g/L提高到8.420g/L，胞内黑色素黑色素得率由7.835％提高到12.05％，发酵周期由10天缩短至8天。
Claims (5)
1.一种辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株，其特征在于所述菌株的保藏编号为CCTCC No：M 2011054。
2.一种由辛格粒毛盘菌液态发酵制备胞内黑色素的方法，其特征在于：先将保藏编号为CCTCC No：M 2011054的辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)菌株活化后，采用马铃薯葡萄糖液体培养基摇瓶培养得到种子液，将种子液接种于发酵培养基进行液态发酵，再将发酵液抽滤得到的菌丝体经干燥后，采用碱性溶液浸提后，用盐酸进行沉淀，即获得胞内黑色素；
所述菌株活化为：将马铃薯葡萄糖培养基斜面保藏的辛格粒毛盘菌(Lachnumsingerianum)菌株接种于马铃薯葡萄糖培养基平板上，在23～26℃恒温培养3～5天，得到活化菌株；
所述摇瓶培养为：沿活化菌落边缘接种菌龄一致的菌块于马铃薯葡萄糖液体发酵培养基中，在23～28℃、以160～200r/min摇床培养3～5天后，得到辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)种子液；
所述液态发酵方法为：将辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)种子液按发酵培养基体积的4～8％接种于发酵培养基，在23～28℃、以160～200r/min转速培养7～10天。
3.如权利要求2所述由辛格粒毛盘菌液态发酵制备胞内黑色素的方法，特征在于所述发酵培养基采用基础发酵培养基，其配方按质量百分比为：马铃薯汁20％、葡萄糖2％、蒸馏水1000ml。
4.如权利要求2所述由辛格粒毛盘菌液态发酵制备胞内黑色素的方法，特征在于所述发酵培养基采用改良发酵培养基，其配方质量百分比为：马铃薯汁15～25％、葡萄糖1～3％、蛋白胨0.5～1.5％、K2HPO40.03～0.1％、MgSO4·7H2O 0.01～0.1％、蒸馏水1000ml，pH 7.0～9.0。
5.如权利要求2所述由辛格粒毛盘菌液态发酵制备胞内黑色素的方法，特征在于所述碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾或氨水溶液。
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