CN102174636B - 应用gca稳定转染细胞系测定bnp活性 - Google Patents

Abstract

本发明“应用GCA稳定转染细胞系测定BNP活性”，建立了一种新的脑利钠肽(BNP)生物活性测定方法。GCA是BNP的主要受体，它是一种腺苷酸环化酶前体，被BNP激活后，催化GTP产生cGMP，继而发挥生物学效应。野生293细胞GCA表达水平低，对于BNP反应性弱，本方法是转基因构建BNP受体(GCA)超表达的稳定细胞株293GCAC3，通过检测BNP刺激后293GCAC3分泌到细胞上清中的cGMP的含量变化，来对BNP活性进行定量。具体检测步骤为：细胞铺96孔板，培养16-18小时，加入BNP刺激90分钟，吸取细胞上清用竞争ELISA检测cGMP含量。该方法操作简单，反应灵敏，变异性小，对于BNP的质量控制和临床应用具有重要意义。

Description

应用GCA稳定转染细胞系测定BNP活性

技术领域：

本发明涉及生物药物活性检测领域，针对脑利钠肽（BNP）的活性测定建立了更加快速、准确的定量方法。 

背景技术：

BNP目前的活性测定方法为离体动脉条法，通过记录BNP作用下动脉张力的变化来进行测定其活性。这种方法不仅操作繁琐，而且误差比较大。而基于细胞系的体外活性测定方法操作简便，误差较小，正越来越广泛的应用于生物药物的活性检测。因此，我们希望可以建立一种基于细胞系的活性测定方法。考虑到没有合适的细胞系来进行BNP的活性测定，我们首先通过转基因构建BNP受体（GCA）超表达的稳定细胞株，再建立竞争ELISA法来进行活性检测。GCA是BNP的主要受体，它是一种腺苷酸环化酶前体，被BNP激活后，催化GTP产生cGMP,继而发挥生物学效应。本方法的原理是通过检测cGMP的含量变化来对BNP活性进行定量。 

发明内容：

1．发明目的： 

目前，BNP的活性测定方法，误差大，操作繁琐，我们需要建立一种更加快速，简便，准确客观的定量方法，对于该产品的研究开发，质量控制乃至临床应用都具有重要意义。 

2．技术方案： 

本发明首先通过基因转染筛选一种BNP强反应性的稳定细胞系，再建立相应的检测方法来对BNP活性进行定量。其技术流程为：293GCAC3细胞株的建立（GCA稳定表达的单克隆细胞株）→测定方法建立（竞争ELISA）。 

3．有益效果： 

该检测方法的建立有利于脑利钠肽产品的研究开发，质量控制和临床应用，具有较高的应用价值。 

通过与现有的离体动脉条法比较，有如下优点： 

(1)从伦理学角度，不需要动物实验； 

(2)操作简便，不需要进行组织分离等操作； 

(3)周期短，可以在48小时内完成全部实验； 

(4)结果较客观可靠，准确度高，变异小。 

附图说明：

图1-1293瞬时转染NPR1/GCA前后的BNP反应性比较 

Sample1：转染NPR1/GCA前的293细胞 

Sample2：转染NPR1/GCA后的293细胞 

图1-2293GCA多克隆稳定细胞株的BNP反应性 

图1-3-1四个293GCA单克隆细胞株与多克隆细胞株的BNP反应性比较 

Sample1：293GCA多克隆细胞株； 

Sample2：293GCA Clone 1 

Sample3：293GCA Clone 2 

Sample4：293GCA Clone 3 

Sample4：293GCA Clone 4 

图1-3-2western blot检测293GCAC3的GCA表达情况 

A:GCA抗体    B：DDK抗体 

图2-1不同稀释度HRP-cGMP（50ul细胞上清+50ulHRP-cGMP）的实验结果 

Sample2:1:10000 

Sample3:1:5000 

Sample4:1:1000 

Sample5:1:500 

图2-2cGMP一抗分别以1：5000和1：2500包被酶标板的实验结果比较 

Sample1:cGMP一抗1:2500包被 

Sample2:cGMP一抗1:5000包被 

图2-3不同细胞密度的实验结果比较 

Sample1:0.9×10⁴个细胞/孔 

Sample2:1.8×10⁴个细胞/孔 

Sample3:2.7×10⁴个细胞/孔 

图2-4不同体积的细胞上清与50ulHRP-cGMP(1:1000稀释)的实验结果 

Sample1:细胞上清50ul    Sample2:细胞上清40ul 

Sample3:细胞上清30ul    Sample4:细胞上清20ul 

图3NPR1/GCA载体图谱 

SgfI和MluI两个酶切位点间插入NPR1/GCA cDNA序列。 

具体实施方式：

1．材料与方法： 

1.1研究对象：B型脑利钠肽（BNP） 

1.2NPR1/GCA质粒：基因ID为NM_000906，购买于傲锐东源基因有限公司，载体图谱见图3。 

HEK293细胞：中国食品与药品研究检定院细胞室保存。 

BNP参考品：中国食品与药品研究检定院重组技术产品室制备。 

1.3试剂： 

生长培养基：DMEM（GIBCO，#11995）+10%胎牛血清（GIBCO，#10099）+1%双抗（GIBCO，#15240） 

平板培养基：DMEM（GIBCO，#11995） 

脂质体2000：invitrogen，#11668 

G418：CalBiochem，#345810 

G418选择培养基：生长培养基+200ug/ml G418 

BNP稀释液：PBS+0.2%BSA(Merck Calbiochem，#12659)+1mM IBMX(sigma，I5879，临用前加入) 

cGMP检测试剂盒：cell signaling，#4360S 

cGMP一抗：Abcam，ab836 

一抗包被液：碳酸钠0.32g，碳酸氢钠0.586g，定容至200ml，PH9.6 

HRP-cGMP：Genscript，M01058 

HRP-cGMP稀释液：PBS+0.01%BSA 

洗液：PBS+1%Tween-20 

TMD：Amresco，J644 

TMD终止液：2M硫酸 

NPR1/GCA抗体：Santa cruz，sc-137041 

DDK抗体：OriGene，TA50011 

1.4仪器： 

酶标仪，Molecular Devices 

1.5数据分析软件： 

SoftMax Pro软件，四参数方程 

1.6实验流程： 

1.6.1293GCA稳定细胞系构建 

1.6.1.1瞬时转染及检测： 

（1）提前16-24h，6孔板铺293细胞，使转染时密度达90%左右； 

（2）脂质体2000常规转染NPR1/GCA质粒； 

（3）转染后48h，消化计数，平板培养基重悬，调整细胞浓度至1×10⁵/ML，180ul/孔接种至96孔板内，同时将未转染的HEK293以同样的细胞密度接种至96孔板内，共同培养16-18h；（4）取1支BNP参考品，用1ml BNP稀释液溶解后，预稀释5倍，再进行4×倍比稀释，20ul/孔加入细胞培养板中； 

（5）作用90分钟后，取细胞上清50ul按照cGMP检测试剂盒说明书中的步骤检测cGMP含量变化，结果见图1-1。 

1.6.1.2稳定转染及多克隆细胞检测 

（1）转染步骤同瞬时转染； 

（2）转染后48h，更换G418选择培养基，筛选3周左右，每3-4天更换一次G418选择培养基； 

（3）待克隆长出后，挑出6个单克隆分别培养，剩余细胞传代，按1.6.1.1种检测方法进行检测，结果见图1-2。 

1.6.1.3单克隆细胞培养及检测 

（1）6个单克隆细胞株培养2周左右，其中4个成为稳定克隆。 

（2）对4个单克隆细胞株的BNP反应性进行检测，结果见图1-3-1； 

（3）经比较3号克隆的反应性较好，分别用GCA抗体和标签（DDK）抗体对其进行western blot检测，结果见图1-3-2。 

1.6.2BNP活性测定方法建立： 

1.6.2.1比较使用不同稀释度HRP-cGMP的实验结果（见图2-1）。 

以cGMP一抗1：5000包被酶标板，取细胞上清50ul与HRP-cGMP工作液50ul，HRP-cGMP工作液共设置4个不同的稀释度，分别为1：10000，1：5000，1：1000，1：500。 

初步确定为：在HRP-cGMP1：1000稀释度下，结果较好； 

1.6.2.2比较cGMP一抗以1：5000和1：2500包被酶标板的实验结果（见图2-2）。 

使用HRP-cGMP1：1000稀释度，取细胞上清50ul与HRP-cGMP工作液50ul，分别以cGMP一抗1：5000和1：2500包被酶标板。 

初步确定为：cGMP一抗以1：2500包被酶标板，结果较好； 

1.6.2.3比较不同细胞密度的实验结果（见图2-3）。 

以cGMP一抗1：2500包被酶标板,使用HRP-cGMP1：1000稀释度，分别铺细胞0.9×10⁴个细胞/孔，1.8×10⁴个细胞/孔，2.7×10⁴个细胞/孔。 

初步确定为：铺细胞1.8×10⁴个细胞/孔，结果较好； 

1.6.2.4根据多次试验，初步确定标准检测方法步骤如下： 

（1）第一天，取对数生长期的293GCAC3细胞，消化离心，用DMEM重悬后，计数，调整细胞浓度至1×10⁵/ml，180ul/孔，接种至96孔板内，培养16-18h； 

用一抗包被液按1：2500稀释cGMP一抗，100ul/孔加入酶标板，4度包被过夜； 

（2）第二天，用BNP稀释液对BNP参考品进行倍比稀释（预稀释20倍，4×倍比稀释），20ul/孔加入细胞板中，放入培养箱内孵育1.5h； 

（3）倒掉酶标板中的包被液，用洗液200ul/孔，清洗3次； 

配制HRP-cGMP工作液：用HRP-cGMP稀释液按1：1000稀释HRP-cGMP； 

取细胞上清和HRP-cGMP工作液各50ul同时加入包被好的酶标板中，室温摇晃3h； 

（4）倒掉酶标板中的液体，用洗液200ul/孔，清洗4次； 

（5）加入TMD100ul/孔，反应约10min;加入终止液100ul/孔； 

（6）酶标仪450nm波长测定，数据分析。 

1.6.2.5 

使用上述标准检测方法，对BNP参考品进行标定3次，每次3支，结果见图2-4-1，2-4-2，2-4-3。 

2．结果与讨论 

2.1瞬时转染质粒NPR1/GCA，并检测转染前后293细胞对BNP的反应性。使用的是cGMP检测试剂盒，检测不同浓度的BNP作用后，细胞所分泌的cGMP含量变化，结果发现转染后的细胞对BNP有良好的反应性，细胞上清中的cGMP含量与BNP作用浓度的关系符合四参数方程，且线性较好，而转染前的293细胞细胞上清中的cGMP含量较低，且与BNP作用浓度基本无关（见图1-1）。 

2.2293细胞转染质粒NPR1/GCA后，经G418筛选获得稳定细胞株，对BNP反应良好（见图1-2）。但是信噪比明显比瞬时转染的细胞低。分析其原因，认为稳定细胞株的基础cGMP含量就较高，由于使用的竞争ELISA，导致低浓度BNP作用时，HRP-Cgmp结合量减少，即上限降低。 

2.3挑选6个单克隆分别培养，有四个长成稳定细胞株，检测其对BNP反应性，结果见图1-3-1。1号和2号基本无反应性，3号较4号反应性较强。于是选择3号克隆293GCAC3作为建系细胞株。Western blot方法检测了其外源GCA的表达（见图1-3-2），无论用GCA抗体还是标签抗体，293GCAC3均显著高于293细胞。 

2.4检测方法的确定 

2.4.1首先根据cGMP一抗说明书的推荐剂量，以1：5000包被酶标板，来确定HRP-cGMP工作液的最佳稀释度。从实验结果看出：1：10000和1：5000信噪比很低，而1：1000和1：500结果明显好些，但是考虑到成本问题，初步确定为使用1：1000的稀释度； 

2.4.2由于实验结果值总体偏低，考虑提高cGMP一抗的包被浓度，经过比较1：5000和1：2500包被酶标板的结果，发现以1：2500包被酶标板，实验结果值均有所升高； 

2.4.3通过比较不同细胞密度的检测结果，均具有比较好的线性关系，但是1.8×10⁴个细胞/孔信噪比较好，且之前的实验都是按照此密度铺细胞，因此初步确定仍用此密度：1.8×10⁴个细胞/孔。 

2.4.4通过条件选择和优化，初步确定了标准检测方案：cGMP一抗包被浓度为1：2500，HRP-cGMP工作液为1：1000稀释，细胞铺板密度为1.8×10⁴个细胞/孔。 

2.4.5使用标准检测方法，对BNP参考品进行标定3次，每次3支，ED₅₀值见下表（结果见图 2-4-1，2-4-2，2-4-3）： 

表中结果表明，该BNP参考品的ED₅₀值板内精密度分别为7.228％，6.681％和9.266％，板间最大精密度为17.94％，板间ED₅₀均值精密度为10.52％，均小于20％，说明该方法比较稳定，适用于作为常规方法来检测BNP活性。 

Claims (1)

1.一种应用转基因细胞株来检测脑利钠肽(BNP)生物活性的非诊断目的的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)根据BNP及其受体的作用机制，构建BNP反应性转基因细胞株：选用HEK293细胞，转染NPR1/GCA质粒，基因ID为NM_000906，购买于傲锐东源基因有限公司，通过加压筛选，获得BNP受体GCA超表达的稳定细胞株，并用于BNP活性检测；

(2)通过检测BNP刺激下cGMP含量变化对BNP活性进行定量：(i)铺细胞板时要用无血清的DMEM；(ii)BNP稀释液为PBS+0.2％BSA，临用前加入1mM IBMX；(iii)检测的是BNP作用90分钟cGMP的含量变化；

(3)通过建立竞争ELISA法来检测cGMP含量：(i)cGMP一抗的包被浓度为1∶2500稀释；(ii)HRP-cGMP工作液的稀释度为1∶1000，稀释液为PBS+0.01％BSA；

(4)利用SoftMax Pro软件四参数方程对BNP活性进行定量分析。

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