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CN102105165A - 来自β溶血性链球菌菌株的ORF554的组合物和使用方法 - Google Patents

来自β溶血性链球菌菌株的ORF554的组合物和使用方法 Download PDF

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CN102105165A
CN102105165A CN2009801288691A CN200980128869A CN102105165A CN 102105165 A CN102105165 A CN 102105165A CN 2009801288691 A CN2009801288691 A CN 2009801288691A CN 200980128869 A CN200980128869 A CN 200980128869A CN 102105165 A CN102105165 A CN 102105165A
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CN
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streptococcus
polynucleotide
gar
group
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CN2009801288691A
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E·墨菲
E·布劳恩施泰因
A·S·安德森
I·L·道奇
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Original Assignee
Wyeth LLC
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Abstract

本发明涉及包括C组和G组链球菌的肽基脯氨酰异构酶(PPI)多肽和编码其的多核苷酸的组合物和使用方法。本发明还涉及包括PPI多肽和多核苷酸的免疫原性组合物，以及结合PPI多肽的抗体和抗体片段。此外，本发明涉及使用免疫原性组合物在受试者中诱导针对β溶血性链球菌的免疫应答，以及通过施用治疗抗体或抗体片段赋予被动免疫性的方法。

Description

来自β溶血性链球菌菌株的ORF554的组合物和使用方法
背景 
总的来说，本发明涉及细菌学、传染病和免疫学领域。更具体而言，本发明涉及包括β溶血性链球菌(hemolytic streptococci)多肽的多核苷酸、多肽和免疫原性组合物。
β溶血性链球菌(BHS)物种是负责从浅表感染到更严重病的众多人疾病的重要病原体。它们包括来自血清学A、B、C和G组的物种。A组链球菌属细菌(GAS；化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes))可负责大多数情况的病，并且可以导致非侵入性疾病，例如咽炎、猩红热、脓疱病、蜂窝织炎或丹毒，但某些菌株可以导致更严重的侵入性感染，例如中毒性休克综合征、坏死性筋膜炎和败血病。另外，表面感染的并发症可以导致免疫介导的后遗症。兰斯菲尔德的(Lancefield’s)B组链球菌(GBS；无乳链球菌(Streptococcus agalactiae))是新生儿中的新生儿败血症的主要原因，并且可以引起老年患者中的肺炎。链球菌C和G组最初被公认为动物病原体，但近年来已显示具有关于人疾病的强烈潜力。病一般与A组链球菌中相似地呈现其自身，但仍未显示导致免疫介导的后遗症。C和G组链球菌通常在具有潜在健康问题的患者中呈现，对于老年患者具有重要性并且在几个链球菌物种中分散。
概述
在一个方面，本发明提供了由C组或G组链球菌开放读码框编号554(ORF 554)编码的新型多肽。在一个实施方案中，本发明提供了包括SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的分离多肽，所述序列是得自下述的新型几种不同ORF 554序列的共有序列：停乳链球菌似马亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp.Equisimilis)，即SEQ ID NO：2、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28；星座链球 菌星座亚种(Streptococcus constellatus subsp.Constellatus)，即SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：32；咽颊炎链球菌(Streptococcus anginosus)，即SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：30；或其片段。在某些实施方案中，分离多肽包括如下氨基酸序列或其片段或由如下氨基酸序列或其片段组成，所述氨基酸序列在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30和/或SEQ ID NO：32中显示。在某些实施方案中，分离多肽具有肽基脯氨酰异构酶(PPI)活性。
在另一个方面，本发明提供了包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成的分离多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和/或SEQID NO：32至少90％、95％或99％等同。在某些实施方案中，分离多肽具有肽基脯氨酰异构酶活性。
在另一个方面，本发明提供了编码链球菌ORF 554多肽或其片段的分离多核苷酸。在一个实施方案中，本发明提供了分离多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列或其片段的多肽。在某些实施方案中，分离多核苷酸编码包括如下氨基酸序列或其片段或由如下氨基酸序列或其片段组成的多肽，所述氨基酸序列在SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个中显示。在某些实施方案中，分离多核苷酸包括如下核苷酸序列或其片段或由如下核苷酸序列或其片段组成，所述核苷酸序列在SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中的任何一个或多个中显示。在某些实施方案中，多核苷酸与调节元件可操作地连接。
在另一个方面，本发明提供了编码包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成的多肽(或其片段)的分离多核苷酸，所述氨基酸序列与 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同。在某些实施方案中，分离多肽具有肽基脯氨酰异构酶活性。在其他实施方案中，分离多核苷酸包括如下核苷酸序列或其片段或由如下核苷酸序列或其片段组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同。在某些实施方案中，多核苷酸与调节元件可操作地连接。在某些实施方案中，调节元件包括诱导型启动子和/或组成型启动子。
在另一个方面，本发明提供了包括核苷酸序列的多核苷酸载体，所述核苷酸序列编码包括如下氨基酸序列或其片段或由如下氨基酸序列或其片段组成的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在某些实施方案中，分离多肽具有肽基脯氨酰异构酶活性。载体可以是例如质粒载体、病毒载体等。在其他实施方案中，多核苷酸载体包括核苷酸序列(或其片段)，其与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在某些实施方案中，多核苷酸载体是表达载体，其使得能够产生重组链球菌PPI蛋白质。
在另一个方面，本发明提供了包括分离多核苷酸的离体细胞，所述分离多核苷酸包括如下核苷酸序列或其片段或由如下核苷酸序列或其片段组成，所述核苷酸序列编码由ORF 554编码的C组或G组链球菌PPI。在某些实施方案中，C组或G组链球菌PPI由包括如下氨基酸序列或其片段或由如下氨基酸序列或其片段组成的ORF 554编码，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在某些实施方案中，分离多核苷酸包括如下核苷酸序列或其片段或由如下核苷酸序列或其片段组成，所述核苷酸序列与SEQID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在某些实施方案中，细胞产生C组或G组链球菌PPI或其片段。在某些实施方案中，宿主细胞包括包含分离多核苷酸的多核苷酸载体，所述分离多核苷酸包括与分离多核苷酸可操作地连接的调节序列。在某些实施方案中，宿主细胞包括包含调节元件的多核苷酸载体，所述调节元件可以是组成型或诱导型启动子。在某些实施方案中，宿主细胞包括其为质粒、病毒载体或表达载体的多核苷酸载体。在某些实施方案中，宿主细胞选自细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞。
在另一个方面，本发明提供了在受试者中引起针对C组或G组链球菌PPI多肽的免疫应答中有用的免疫原性组合物。在某些实施方案中，免疫原性组合物包括多肽或其片段或由多肽或其片段组成，所述多肽包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在其他实施方案中，免疫原性组合物包括分离多核苷酸或其片段或由分离多核苷酸或其片段组成，所述分离多核苷酸包括如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在某些实施方案中，多核苷酸进一步包括调节元件，例如调节受试者中的分离多核苷酸表达的诱导型或组成型启动子。
在另一个方面，本发明提供了包括表位结合区或由表位结合区组成的免疫学试剂，所述表位结合区与由C组或G组链球菌ORF 554编码的链球菌PPI结合。在某些实施方案中，免疫学试剂包括抗体或由抗体组成，所述抗体与由ORF 554编码的至少一种链球菌PPI多肽特异性结合。在某些实施方案中，抗体结合包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在某些实施方案中，抗体是嵌合抗体，包括例如人源化抗体。
在另一个方面，本发明提供了用于诱导受试者中针对β溶血性链球菌或β溶血性链球菌感染的免疫应答的方法，其包括给受试者施用包括C组或G组链球菌PPI蛋白质或其片段的免疫原性组合物。在某些实施方案中，PPI蛋白质包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。
在另一个方面，本发明提供了用于诱导受试者中针对β溶血性链球菌或β溶血性链球菌感染的免疫应答的方法，其包括给受试者施用包括多核苷酸的免疫原性组合物，所述多核苷酸编码C组或G组链球菌PPI蛋白质或其片段。在某些实施方案中，PPI蛋白质包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在其他实施方案中，多核苷酸包括如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在某些实施方案中，多核苷酸进一步包括调节元件，例如调节受试者中的分离多核苷酸表达的诱导型或组成型启动子。
在另一个方面，本发明提供了分离C组或G组链球菌PPI多肽或其片段在制备用于预防性治疗受试者中的β溶血性链球菌感染的药物中的用途。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，PPI多肽包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。
在另一个方面，本发明提供了编码分离C组或G组链球菌PPI多肽或其片段的分离多核苷酸在制备用于预防性治疗受试者中的β溶血性链球菌感染的药物中的用途。在某些实施方案中，受试者是人患者。在某些实施方案中，PPI多肽包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在其他实施方案中，多核苷酸包括如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ IDNO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在某些实施方案中，多核苷酸进一步包括调节元件，例如使得分离多核苷酸能够在受试者中表达的诱导型或组成型启动子。
在另一个方面，本发明提供了免疫学试剂在制备用于预防性治疗受试者中的β溶血性链球菌感染的药物中的用途，所述免疫学试剂包括与C组或G组链球菌PPI多肽特异性结合的区域。在某些实施方案中，免 疫学试剂包括抗体或由抗体组成。在某些实施方案中，受试者是人患者。在某些实施方案中，PPI多肽包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在某些实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在某些实施方案中，抗体可以是嵌合抗体，例如人源化抗体或多克隆抗体。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者中的β溶血性链球菌的方法，其包括施用在药学上有效的赋形剂中的治疗有效量的抗体或其片段，所述抗体与C组或G组链球菌PPI多肽的表位特异性结合。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，PPI多肽包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ IDNO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在某些实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在某些实施方案中，抗体可以是嵌合抗体，例如人源化抗体或多克隆抗体。
在另外其他方面，本发明提供了包括下述的试剂盒：(a)分离的C组或G组链球菌PPI多肽，具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同的氨基酸序列；(b)编码C组或G组链球菌PPI多肽(同上)的分离多核苷酸；和/或(c)与C组或G组链球菌PPI多肽(同上)的表位特异性结合的抗体。
序列表简述
SEQ ID NO：1是停乳链球菌似马亚种中的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是由停乳链球菌似马亚种中的ORF 554编码的氨基酸 序列。
SEQ ID NO：3是星座链球菌星座亚种中的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是由星座链球菌星座亚种中的ORF 554编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是咽颊炎链球菌中的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6是由咽颊炎链球菌中的ORF 554编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是链球菌属物种(Streptococcus sp.)菌株N04A27中的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8是由链球菌属物种菌株N04A27中的ORF 554编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是链球菌属物种菌株N04AFT中的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是由链球菌属物种菌株N04AFT中的ORF 554编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的多肽的共有氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是无乳链球菌GBS0827的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：13是由无乳链球菌GBS0827的ORF 554编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14是化脓性链球菌SPY_1390的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：15是由化脓性链球菌SPY_1390的ORF 554编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16是兽疫链球菌(S.zoopedimicus)的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：17是由兽疫链球菌的ORF 554编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18是引物D554 F1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：19是引物D554 F2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20是引物D554 F5的核苷酸序列。
SEQ ID NO：21是引物D554 R1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22是引物D554 R4的核苷酸序列。
SEQ ID NO：23是引物ATCC12394 554 F的核苷酸序列。
SEQ ID NO：24是引物ATCC12394 554 R的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25是停乳链球菌似马亚种中的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：26是由停乳链球菌似马亚种中的ORF 554编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27是停乳链球菌似马亚种中的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：28是由停乳链球菌似马亚种中的ORF 554编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29是咽颊炎链球菌中的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：30是由咽颊炎链球菌中的ORF 554编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：31是星座链球菌星座亚种中的ORF 554的核苷酸序列。
SEQ ID NO：32是由星座链球菌星座亚种中的ORF 554编码的氨基酸序列。
详述
本发明描述了得自C组或G组链球菌物种的多肽和多核苷酸，其与化脓性链球菌开放读码框554(ORF 554)对应。关于ORF 554的DNA和氨基酸序列在公开的国际专利申请号WO 02/083859中提供。这些ORF 554多肽与化脓性链球菌肽基脯氨酰异构酶(PPI)蛋白质相似。这些多核苷酸和多肽可以在免疫原性组合物中使用，以诱导受试者中针对β溶血性链球菌或β溶血性链球菌感染的免疫应答。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸片段”在本文中可互换使用。这些术语包含由磷酸二酯键连接的核苷酸。“多核苷酸”可以是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物，其是单链或双链的，任选包含合成、非天然或改变的核苷酸碱基。以DNA聚合物形式的多核苷酸可以包括cDNA、基因组DNA、合成DNA的一个或多个区段，或其混合物。核苷酸碱基在本文中由单字母编码指示：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、 胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。
“蛋白质”或“多肽”是在编码多肽的多核苷酸中以由编码序列决定的特定次序排列的氨基酸链。
术语“分离的”意指通过“人工”由天然状态改变的。如果组合物或物质在自然界中存在，为了使它被视为“分离的”，那么它必须已改变或从其原始环境中取出，或两者。例如，活动物中天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料分开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如该术语在本文中采用的。分离多核苷酸或分离多肽可以从其中它们天然存在的宿主细胞中纯化。本发明涉及领域的技术人员已知的常规核酸纯化方法可以用于获得分离多核苷酸。
C组或G组链球菌ORF 554多核苷酸
本文描述的C组或G组链球菌ORF 554多核苷酸可以使用标准克隆和筛选技术获得。这些多核苷酸可以例如得自基因组DNA、衍生自mRNA的cDNA文库、基因组DNA文库，或可以使用众所周知和商购可得技术合成，例如通过PCR从cDNA文库中或经由RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)。
术语“重组体”意指例如通过2个或更多个其他分开的多核苷酸区段的人为组合制备的多核苷酸，例如通过化学合成或通过使用基因工程技术处理分离多核苷酸。“重组DNA构建体”包括与至少一种调节元件可操作地连接的本发明的分离多核苷酸中的任何。
在一个方面，本发明提供了编码C组或G组链球菌脯氨酰肽基异构酶(PPI)蛋白质的分离多核苷酸或其片段。
在一个实施方案中，分离多核苷酸编码包括SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO：11的氨基酸序列是在比对得自C组或G组物种停乳链球菌似马亚种ORF 554的概念翻译的多肽序列后获得的共有序列，所述多肽序列由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10表示。
在一个实施方案中，本发明提供了分离多核苷酸，其编码包括SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30或SEQ ID NO：32中的任何一种或多种多肽，或其片段。示例性核苷酸序列在SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中显示。在另一个实施方案中，本发明提供了由于遗传密码的简并性与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中所示的多核苷酸序列不同的多核苷酸。这些多核苷酸编码相同ORF 554多肽。
使用本领域众所周知的方法，可以容易地鉴定C组或G组链球菌ORF 554多核苷酸的直向同源物和等位基因变体。ORF 554多核苷酸的等位基因变体和直向同源物可以包括核苷酸序列，其一般与SEQ IDNO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中所示核苷酸序列中的任何一个或多个或其片段至少约90-95％或更多等同。ORF 554多核苷酸的等位基因变体和直向同源物可以编码包括如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个中所示的氨基酸序列至少90％等同。此类多核苷酸可以容易地鉴定为能够在严格条件下与如下多核苷酸中的任何一个或多个或其片段杂交，所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和/或SEQ IDNO：31中所示的核苷酸序列。
此外，ORF 554多核苷酸的等位基因变体和直向同源物可以仅包括C组或G组链球菌ORF 554多核苷酸编码区的片段，例如SEQ IDNO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和/或SEQ ID NO：31中所示多核苷酸的片段，或这些核苷酸序列的片段。在特定实施方案中， 此类片段编码免疫原性片段。
本领域技术人员充分了解许多水平的序列同一性在鉴定相关多核苷酸和多肽序列中有用。序列比对和同一性百分比计算可以使用LASERGENETM生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)的MEGALIGNTM程序执行。使用Clustal比对方法(Higgins和Sharp，Gene，73(1)：237-44，1988)可以执行序列的多重比对，用缺省参数例如GAP PENALTY＝10和GAP LENGTH PENALTY＝10。使用Clustal方法用于配对比对的缺省参数可以是例如KTUPLE 1、GAPPENALTY＝3、WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。
本发明的ORF 554多核苷酸可以用于产生重组多肽用于包括在免疫原性组合物和其他用途中。对于重组多肽的产生，多核苷酸可以包括关于成熟多肽的编码序列、其自身、或与其他编码序列可操作地连接的关于成熟多肽的编码序列，例如编码前导或分泌序列的那些，蛋白质前序列、原序列或前原序列，或其他融合肽部分。例如，促进融合多肽纯化的标记序列可以与编码序列连接(参见Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：821-824，1989)。多核苷酸还可以包含非编码5′和3′序列，例如转录、非翻译序列、剪接和多腺苷酸化信号。
在特定实施方案中，本文提供的多核苷酸序列信息允许制备相对短DNA(或RNA)寡核苷酸序列，其具有与本文公开的所选择多核苷酸的核苷酸序列特异性杂交的能力。如本文使用的，术语“寡核苷酸”定义为包括2个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，通常超过三(3)个，并且一般超过十(10)个且直到一百(100)个或更多(尽管优选20-30个)。确切大小将依赖于许多因素，这依次依赖于寡核苷酸的最后功能或用途。因此，在某些实施方案中，合适长度的核酸探针基于所选择的核苷酸序列进行制备，例如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中所示的序列。此类核酸探针与编码C组或G组链球菌PPI多肽的多核苷酸特异性杂交的能力给予它们在各种实施方案中的特别效用。在某些实施方案中，探针可以在用于检测给定 样品中互补序列的存在的各种测定法中使用。
在某些实施方案中，寡核苷酸可以用作引物。这些引物可以以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。使用本文描述的多核苷酸设计此类引物的序列，用于检测、扩增或突变ORF 554多核苷酸的限定区段，所述ORF 554多核苷酸编码C组或G组链球菌PPI多肽，使用聚合酶链反应(PCR)技术。
在特定实施方案中，有利的是采用与用于检测杂交物形成的合适标记组合的本文描述的多核苷酸。广泛多样的合适标记是本领域已知的，包括放射性、酶促或其他配体，例如抗生物素蛋白/生物素，其能够给出可检测信号。
与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18直到SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31之一或其片段中包含的核苷酸序列等同或充分等同的多核苷酸可以用作关于cDNA和基因组DNA的杂交探针，或用作关于核酸扩增(PCR)反应的引物，以分离编码本文所述多肽的全长cDNA和基因组克隆，且分离其他基因(包括编码来自除停乳链球菌外的物种的同系物和直向同源物的基因)的cDNA和基因组克隆，其与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ IDNO：31中所示的多核苷酸序列或其片段具有高序列相似性。一般地，这些多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的那种至少约90％等同-至少约99％等同。探针或引物一般将包括至少15个核苷酸、至少30个核苷酸或至少50个核苷酸。
存在本领域技术人员可获得且众所周知的几种方法，以获得全长cDNA或延长短cDNA，例如基于cDNA末端快速扩增(RACE)方法的那些。参见Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，8998-9002，1988。例如由MARATHONTM技术(Clontech Laboratories Inc.)例示的该技术的近期修饰已显著简化关于更长cDNA的研究。在 MARATHONTM技术中，已由从选择组织中提取的mRNA和在每个末端上连接的“衔接子”序列制备cDNA。随后使用基因特异性和衔接子特异性寡核苷酸引物的组合执行核酸扩增(PCR)，以扩增cDNA的“缺失”5′末端。随后使用“套式”引物重复PCR反应，即设计为在扩增产物内退火的引物(一般地在衔接子序列中更远的3′退火的衔接子特异性引物，和在已知基因序列中更远的5′退火的基因特异性引物)。随后可以通过DNA测序分析这种反应的产物，并且通过使产物与现有cDNA直接连接构建全长cDNA，以获得全序列，或通过执行分开的全长PCR使用新序列信息用于设计5′引物。
C组或G组链球菌PPI多肽
在一个方面，本发明提供了分离的C组或G组链球菌肽基脯氨酰异构酶(PPI)多肽(由ORF 554编码)，其尤其可以用作免疫原和用于免疫原性组合物中。PPI多肽可以是重组多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了包括SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的分离多肽。SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列是在比对关于停乳链球菌似马亚种ORF 554获得的多核苷酸序列后获得的共有序列，并且在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQID NO：10中显示。
在一个实施方案中，多肽包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同的氨基酸序列；所述多肽的功能和非功能天然存在的变体或生物学等价物；所述多肽的重组产生的变体或生物学等价物；所述多肽的直向同源物和/或等位基因变体；和所述多肽的片段。
C组或G组链球菌PPI多肽的生物学等价物或变体包括功能和非功能多肽。功能生物学等价物或变体包括多肽的天然存在的氨基酸序列变体，其维持在受试者中引发免疫学或抗原应答的能力。功能变体一般包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个的一个或多个氨基酸的保守置换；或多肽的非关键区中的非关键残基的置换、缺失或插入。
在某些实施方案中，可以在PPI多肽的结构中进行修饰和改变，并且仍获得与未改变的C组或G组链球菌PPI多肽具有相同抗原性的PPI多肽。例如，特定氨基酸可以置换序列中的其他氨基酸，而抗原性没有可测量的损失。因为这是限定多肽的生物学功能活性的多肽的交互能力和性质，所以可以在多肽序列中进行特定氨基酸序列置换，并且仍获得具有相似性质的多肽。
在制备此类修饰和改变中，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在对多肽赋予交互生物功能中的重要性是本领域一般理解的(Kyte和Doolittle，J Mol Biol，157：第105-132页，1982)。本领域已知特定氨基酸可以置换具有相似亲水指数或得分的其他氨基酸，并且仍产生具有相似生物活性的多肽。每个氨基酸已基于其疏水性和电荷特征指定亲水指数。这些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸盐(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域一般公认氨基酸残基的相对亲水特征决定所得到的多肽的二级和三级结构，这进而限定多肽与其他分子的相互作用，所述其他分子例如酶、底物、受体、抗体、抗原等。本领域已知氨基酸可以由具有相似亲水指数的另一种氨基酸置换且仍获得功能上等价的多肽。在某些实施方案中，修饰或改变的PPI多肽包括一个或多个置换氨基酸，其亲水指数在每个原始氨基酸的+/-2内。在其他实施方案中，每个置换氨基酸的亲水指数在其原始氨基酸的+/-1内。在另外其他的实施方案中，每个置换氨基酸的亲水指数在其原始氨基酸的+/-0.5内。
相似氨基酸的置换也可以基于亲水性进行制备，特别是当由此制备 的生物学功能等价多肽或肽预期用于在免疫学实施方案中使用时。美国专利号4,554,101教导了如由其相邻氨基酸的亲水性控制的多肽的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关。
如该术语在本文中使用的，“变体”是分别与参考多核苷酸或多肽不同的多核苷酸或多肽，但保留某些基本性质。多核苷酸的一般变体在核苷酸序列中与参考多核苷酸不同。变体的核苷酸序列中的改变可能改变或不改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸改变可能产生如下所述由参考序列编码的多肽中的氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短。多肽的一般变体在氨基酸序列中与参考多肽不同。一般地，差异是有限的，从而使得参考多肽和变体多肽的序列是总体相似的，并且在许多区域中是等同的。变体多肽及其参考多肽在氨基酸序列中可以相差以任何组合的一个或多个置换、添加和缺失。置换或插入的氨基酸残基可以是或不是由遗传编码所编码的那种。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或可以是未知天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术或通过直接合成进行制备。
重组系统
对于多肽的重组生产，宿主细胞可以进行遗传改造，以掺入包括本发明的ORF 554多核苷酸的表达系统。多核苷酸可以例如通过许多标准实验手册中描述的方法引入宿主细胞内，例如Davis等人，BASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)和Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989.)这些方法包括例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转应(transvection)、显微注射、超声、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、刮擦装载、弹道引入(ballistic introduction)和感染。
合适宿主细胞的代表性例子包括细菌细胞(例如，链球菌属、葡萄球菌属(staphylococci)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属物种(Streptomycesspp.)和枯草芽孢杆菌细胞)、酵母细胞(例如，毕赤酵母属(Pichia) 和酿酒酵母属(Saccharomyces))、哺乳动物细胞(例如CHO细胞)和昆虫细胞(例如，Sf9和Sf21)。
重组产生的多肽可以通过众所周知的方法从重组细胞培养中回收且纯化，所述方法包括高效液相色谱法、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法和凝集素色谱法。
众多载体系统中的任何一种或多种可以用于在异源细胞系统中表达且产生C组或G组链球菌PPI多肽。此类载体系统尤其包括染色体、附加体和病毒衍生系统，例如衍生自下述的载体：细菌质粒、减毒细菌例如沙门氏菌属(Salmonella)(美国专利号4,837,151)，噬菌体，转座子，酵母附加体，插入元件，酵母染色体元件，病毒例如痘苗和其他痘病毒、辛德毕斯、腺病毒、杆状病毒、乳多空病毒例如SV40、禽痘病毒、假性狂犬病病毒和逆转录病毒、甲病毒例如委内瑞拉马脑炎病毒(美国专利号5,643,576)、非节段负链RNA病毒例如水疱性口炎病毒(美国专利号6,168,943)，和衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒。表达系统应包括调节以及引起表达的控制区，例如启动子和其他调节元件(例如多腺苷酸化信号)。一般地，可以使用适合于维持、繁殖或表达多核苷酸以在宿主中产生多肽的任何系统或载体。合适核苷酸序列可以通过众所周知和常规技术中的任何而插入表达系统内，例如Sambrook等人，MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL(同上)中所示的那些。
在一个实施方案中，本发明提供了包括C组或G组链球菌ORF 554多核苷酸的表达载体，所述C组或G组链球菌ORF 554多核苷酸编码C组或G组链球菌PPI多肽。表达载体包括ORF 554多核苷酸，其编码包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。备选地，表达载体包括多核苷酸，所述多核苷酸包括如下核 苷酸序列或由如下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中的任何一个或多个至少90％、95％或99％等同，或100％等同。在其他实施方案中，本发明的表达载体包括与增强子-启动子可操作地连接的多核苷酸。在另外其他的实施方案中，表达载体包括与原核启动子可操作地连接的多核苷酸。备选地，表达载体包括与其为真核启动子的增强子-启动子可操作地连接的多核苷酸。表达载体进一步包括多腺苷酸化信号，其位于羧基末端氨基酸的3′且在编码多肽的转录单位内。
如本文使用的，术语“调节元件”指控制核酸序列表达的某些方面的遗传元件。例如，启动子是促进可操作地连接的编码区转录起始的调节元件。其他调节元件是增强子、沉默子、剪接信号、多腺苷酸化信号、终止信号、RNA输出元件、内部核糖体进入位点等等。
如本文使用的，启动子是转录开始的点(即，转录起始位点)前面(上游)一般约100个核苷酸对内的DNA分子区域。那个区域一般包含几个类型的DNA序列元件，其位于不同基因中的相似相对位置中。如本文使用的，术语“启动子”包括本领域被称为上游启动子区的那种，启动子区或泛发真核RNA聚合酶II转录单位的启动子。
另一个类型的不连续转录调节序列元件是增强子。增强子提供关于特定编码区(例如，基因)的时间、位置和表达水平的特异性。增强子的主要功能是增加细胞中编码序列的转录水平，所述细胞包含与那个增强子结合的一种或多种转录因子。不像启动子，增强子可以在位于转录起始位点可变距离时起作用，只要启动子存在。
如本文使用的，短语“增强子-启动子”意指包含增强子和启动子元件的组合单位。增强子-启动子与编码至少一种基因产物的编码序列可操作地连接。如本文使用的，短语“可操作地连接”意指增强子-启动子以这样的方式与编码序列连接，使得那种编码序列的转录通过那个增强子-启动子控制且调节。用于使增强子-启动子与编码序列可操作地连接的方法是本领域众所周知的。如本领域同样众所周知的，相对于其转录受控制的 编码序列的精确定向和定位尤其依赖于增强子-启动子的特定性质。因此，TATA盒最小启动子一般定位在转录起始位点上游约25到约30个碱基对处，并且上游启动子元件一般定位在转录起始位点上游约100到约200个碱基对处。相比之下，增强子可以位于起始位点下游且可以在距离那个位点相当大距离处。
在本文描述的载体构建体中使用的增强子-启动子可以是驱动在待转染细胞中表达的任何增强子-启动子。通过采用具有众所周知性质的增强子-启动子，基因产物表达的水平和模式可以得到最佳化。例如，常用启动子可以衍生自多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于用于原核和真核细胞的其他合适的表达系统，参见通过引用合并入本文的Sambrook等人，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989的第16和17章。
在另一个实施方案中，表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中的表达(例如，组织特异性调节元件用于表达核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适组织特异性启动子的非限制性例子包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等人，Genes Dev，1：第268-277页，1987)，淋巴样特异性启动子(Calame和Eaton，Adv Immunol，43：第235-275页，1988)，T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore，EMBO J，8：第729-733页，1989)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等人，Cell，33：第729-740页，1983)，(Queen和Baltimore，Cell，33：第741-748页，1983)，神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle，PNAS，86：第5473-5477页，1989)，胰腺特异性启动子(Edlund等人，Science，230：第912-916页，1985)，和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和国际申请EP 264,166)。在另一个实施方案中，调节元件包括发育调节的启动子，例如鼠类hox启动子(Kessel和Gruss，Science，249：第374-379页，1990)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman，Genes Dev，3：第537-546，1989页)。
载体DNA可以经由常规转化、感染或转染技术引入原核或真核细胞 内。如本文使用的，术语“转化”和“转染”意指用于将外源核酸引入宿主细胞内的各种领域公认技术，其包括例如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、超声和电穿孔方法。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook，等人(″Molecular Cloning：ALaboratory Manual″第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)和其他实验室手册中找到。
多肽在原核生物中的产生最通常在大肠杆菌中进行，用包含指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体。组成型启动子包括例如λPL、spc核糖体和β-内酰胺酶。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lac、tac和麦芽糖结合蛋白。融合载体将许多氨基酸加入其中所编码的蛋白质，通常加入重组蛋白质的氨基末端。此类融合载体一般发挥3个用途：增加重组蛋白质的表达；增加重组蛋白质的溶解性；和通过充当亲和纯化中的配体帮助重组蛋白质的纯化。通常，在融合表达载体中，蛋白酶解性切割位点在融合部分和重组蛋白质的连接处引入，以使得能够在融合蛋白纯化后从融合部分中分离重组蛋白质。此类酶及其同种识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。本发明还提供了载体(例如，表达载体、测序载体、克隆载体)，其包括本发明的至少一种多核苷酸，用本发明的载体遗传改造的宿主细胞，和通过重组技术产生本发明的多肽。无细胞翻译系统也用于产生此类蛋白质，使用衍生自本发明的DNA构建体的RNA。
C组或G组链球菌PPI抗体
本发明的多肽包括包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列、其片段和类似物的那些，或表达所述序列、片段和类似物的细胞，其也可以用作免疫原，以产生与本发明的多肽特异性结合的抗体。在一个方面，本发明提供了(a)与C组或G组链球菌PPI多肽特异性结合的抗体，(b)此类抗体检测细胞、细胞或组织提取物或生物流体中链球菌PPI多肽的存在或测量其数量或浓度的用途，和(c)此类抗体用于治 疗受试者中的β溶血性链球菌感染的用途。
本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和抗独特型抗体。多克隆抗体是衍生自用抗原免疫接种的动物血清的抗体分子的异质群体。单克隆抗体是与特异性抗原结合的抗体的基本上同质群体。一般而言，抗体可以例如使用常规杂交瘤技术(Kohler和Milstein(1975)Nature，256：495-499)、重组DNA方法(美国专利号4,816,567)、或使用抗体文库的噬菌体展示(Clackson等人(1991)Nature，352：624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.，222：581-597)。对于另外的抗体生产技术，参见Antibodies：A Laboratory Manual，编辑Harlow和Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。本发明并不限于任何特定来源、生产方法、或抗体的其他特别特征。
可以使用产生或分离与C组或G组链球菌PPI多肽表位特异性结合的抗体的其他合适方法。在某些实施方案中，重组抗体选自肽或蛋白质展示文库，例如噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA和cDNA展示文库(EP368,684；PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755；PCT/GB92/002240；PCT/GB92/00883；PCT/GB93/00605；PCT/GB94/01422；PCT/GB94/02662；PCT/GB97/01835；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；PCT/US94/1234；WO92/18619；WO96/07754；EP614,989；WO95/16027；WO88/06630；WO90/3809；美国专利号4,704,692；PCT/US91/02989；WO89/06283；EP371,998；EP550,400；EP229,046；和PCT/US91/07149.)在其他实施方案中，重组抗体选自随机产生的肽或蛋白质文库(美国专利号5,723,323；5,763,192；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862；WO 86/05803；和EP 590,689.)在另外其他实施方案中，重组抗体在能够产生人抗体储库的转基因动物中产生(Nguyen等人，Microbiol.Immunol.41：901-907，1997；Sandhu等人，Crit.Rev.Biotechnol.16：95-118，1996；和Eren等人，Immunol.93：154-161，1998.)用于产生重组抗体的其他技术包括例如(a)单细胞抗体生产技术例如选择淋巴细胞抗体方法(″SLAM″)(美国专利号5,627,052)，(b)凝胶微滴和流式细胞术方法(Powell等人，Biotechnol.8：333-337，1990)， 和(c)B细胞选择(Steenbakkers等人，Molec.Biol.Reports 19：125-134，1994)。这些相同方法也可以用于改善抗C组或G组链球菌PPI抗体与其特异性结合靶的亲和力和/或亲合力。
完整抗体是免疫球蛋白(Ig)，并且它们一般是由2条轻链(各～25kDa)和2条重链(各～50kDa)组成的四聚糖基化蛋白质。轻链分类成2个同种型(λ和κ)，并且重链分类为5个同种型(A、D、E、G和M)。某些重链同种型进一步分成同种型亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
不同抗体的结构域和三维结构是本领域已知的(Harlow和Lane，同上)。简言之，轻链由恒定结构域(CL)和N末端可变结构域(VL)组成。重链由3或4个恒定结构域(CH)、铰链区和N末端可变结构域(VH)组成。与VH结构域相邻的CH指定为CH1。VH和VL结构域包含称为构架(FR)区的4个保守序列区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其形成关于称为互补决定区(CDR)的3个高变序列区域的支架。CDR(CDR1、CDR2和CDR3)包含特异性识别且结合抗原的大多数抗体氨基酸。重链CDR指示为H1、H2和H3，而轻链CDR指示为L1、L2和L3。
Fab片段(抗原结合片段)由通过恒定区之间的二硫键共价连接的VH-CH1和VL-CL结构域组成。Fv片段较小，并且由非共价连接的VH和VL结构域组成。为了克服非共价结构域分离的趋势，可以构建单链Fv片段(scFv)。scFv包含弹性多肽，其使(a)VH的C末端与VL的N末端连接，或(b)VL的C末端与VH的N末端连接。15聚体(Gly4Ser)3肽可以用作接头，但其他接头也是本领域已知的。
通过使用编码可变区的多个种系基因和各种体细胞事件产生抗体多样性。体细胞事件包括可变基因区段和多样性(D)和连接(J)基因区段的重组，以制备完全VH区和可变，以及可变和连接基因区段的重组，以制备完全VL区。CDR3(H3)是抗体序列内分子多样性的最大来源。H3例如可以短至2个氨基酸残基或大于26。最小的抗原结合片段是Fv，其由VH和VL结构域组成。
本发明的抗C组或G组链球菌PPI抗体可以任选包括抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以在其C末端与轻链恒定结构域如Cκ或Cλ附着。类似地，VH结构域或其部分可以与重链如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM以及任何同种型亚类的全部或部分附着。抗体同种型例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4由CH2和CH3结构域决定。同种型可以通过改变这些结构域转换而不影响抗原结合。恒定区是本领域已知的(参见例如，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，No.91-3242，National Institutes of Health Publications，Bethesda，Md.，1991.)
术语“抗体”也意欲包括完整分子以及片段例如Fab，其能够结合抗原。Fab片段缺乏完整抗体的Fc片段，从循环中更快速清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(Wahl等人，1983，J.Nucl.Med.24：316-325)。应当理解在本发明中有用的抗体的Fab和其他片段可以用于检测且定量C组或G组链球菌PPI多肽，根据用于完整抗体分子的方法。
嵌合抗体是分子，其不同部分衍生自不同动物种类，例如具有衍生自鼠类单克隆抗体的可变区(VH、VL)和人免疫球蛋白恒定区(CH1-CH2-CH3、CL)的那些。嵌合抗体和用于其生产的方法是本领域已知的(Cabilly等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3273-3277；Morrison等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Boulianne等人，1984，Nature 312：643-646；Cabilly等人，欧洲专利申请125023(1984年11月14日公开)；Taniguchi等人，欧洲专利申请171496(1985年2月19日公开)；Morrison等人，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Neuberger等人，PCT申请WO 86/01533(1986年3月13日公开)；Kudo等人，欧洲专利申请184187(1986年6月11日公开)；Morrison等人，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Sahagan等人，1986，J.Immunol.137：1066-1074；Robinson等人，PCT/US86/02269(1987年5月7日公开)；Liu等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Sun等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84：214-218；Better等人，1988，Science 240：1041-1043)。这些参考文献在此通过引用合并。
抗体以各种方式使用，例如用于证实蛋白质表达或证实蛋白质在哪里表达。标记的抗体(例如，用于FACS的荧光标记)可以与完整细菌一起温育，并且在细菌表面上标记的存在证实例如蛋白质的定位。
免疫原性组合物
本发明提供了包括C组或G组链球菌PPI多肽中的一种或多种的免疫原性组合物。在某些实施方案中，免疫原性组合物包括一种或多种PPI多肽和一种或多种生理学可接受的载体，所述PPI多肽包括与SEQ IDNO：2、4、6、8和10至少90％、95％、99％或100％等同的氨基酸残基序列。
在其他实施方案中，本发明的免疫原性组合物包括编码C组或G组链球菌PPI多肽的多核苷酸，和一种或多种生理学可接受的载体。在某些实施方案中，免疫原性组合物包括具有与SEQ ID NO：1、3、5、7和/或9中的一个或多个至少90％、95％、99％或100％等同的核苷酸序列的多核苷酸。
如本文使用的，术语“免疫原性组合物”指以可施用方式的生物制剂的任何类型，其能够刺激用免疫原性组合物接种的受试者中的免疫应答。免疫应答可以包括抗体的诱导和/或T细胞应答的诱导。当提及免疫原性组合物使用时，术语“保护”在本文中指与所讨论的疾病或病状相关症状中的任何的改善(部分或完全)。因此，通过呈现的免疫原性组合物保护受试者不受链球菌属物种例如停乳链球菌(包括停乳和似马亚种)感染一般导致细菌生长和/或与链球菌感染相关的临床症状中的一种或多种消除，包括关节炎、心内膜炎、脑膜炎、多浆膜炎、支气管肺炎、脑膜炎、永久性听力丧失和败血病性休克。
本文公开的方法可以包括诱导针对一种或多种病原体的免疫应答，所述病原体包括链球菌属物种(例如，停乳链球菌、停乳链球菌似马亚种、停乳链球菌停乳亚种、化脓性链球菌、无乳链球菌、咽颊炎链球菌、星座链球菌、似马链球菌(S.equisimilis)和中间链球菌(S.intermedius)。) 例如，该方法可以包括诱导针对一种或多种链球菌病原体例如停乳链球菌似马亚种的多克隆抗体产生。在某些实施方案中，该方法包括给受试者施用组合物，所述组合物包括分离的C组或G组链球菌ORF 554多核苷酸或PPI多肽。
多种测试用于评估本发明的多肽的体外免疫原性。例如，通过一起温育链球菌属物种细胞、包含针对所讨论多肽的特异性抗体的热灭活血清、和外源补体来源的混合物，进行体外调理素测定法。调理吞噬作用在新鲜分离的多形核细胞(PMN′s)和抗体/补体/链球菌属物种细胞混合物的温育过程中进行。用抗体和补体包被的细菌细胞在调理吞噬作用后被杀死。通过铺平板测定法混合物测定逃离调理吞噬作用的存活细菌的菌落形成单位(cfu)。滴度报告为给出≥50％细菌杀死的最高稀释度的倒数，如通过与测定法对照比较测定的。在测试的最低血清稀释度(1∶8)下显示小于50％杀死的样品报告为具有调理吞噬作用抗体(OPA)滴度为4。上述方法是Gray′s方法的修饰(Gray，Conjugate VaccinesSupplement，第694-697页，1990)。
对于每种个别血清包括包含测试血清加上细菌细胞和热灭活补体的测试血清对照。这种对照用于评估抗生素或其他血清组分的存在是否能够直接杀死细菌菌株(即，在不存在补体或PMN′s的情况下)。具有已知调理素滴度的人血清用作阳性人血清对照。关于每种未知血清的调理素抗体滴度计算为，与不含血清的对照比较给出50％cfu减少的血清起始稀释度的倒数。
全细胞ELISA测定法也可以用于评估多肽抗原的体外免疫原性和表面暴露，其中目的细菌菌株包被在平板例如96孔板上，并且来自经免疫的动物的测试血清与细菌细胞反应。如果对于测试多肽抗原特异的任何抗体与多肽抗原的表面暴露表位反应，那么它可以通过本领域技术人员已知的标准方法检测。
显示所需体外活性的任何多肽随后可以在体内动物攻击模型中测试。在某些实施方案中，免疫原性组合物通过本领域技术人员已知的免疫接种方法和途径(例如，鼻内、肠胃外、肌肉内、经口、经直肠、阴 道、经皮、腹膜内、静脉内、皮下等)用于动物(例如，小鼠)的免疫。在用特定停乳链球菌免疫原性组合物免疫动物后，用停乳链球菌或其他链球菌属物种攻击动物，并且就针对停乳链球菌或其他链球菌属物种感染的抗性进行测定。
将C组或G组链球菌PPI/ORF 554多肽和多核苷酸掺入适合于施用于受试者的免疫原性组合物。此类组合物一般包括核酸分子或蛋白质，连同药学上可接受的载体。如本文使用的，短语“药学上可接受的载体”意欲包括与药学施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、赋形剂等。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则此类介质可以在本发明的组合物中使用。补充性活性化合物也可以掺入组合物内。
本发明的任何免疫原性组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外(例如，肌肉内、静脉内、真皮内、皮下、腹膜内)、经粘膜(例如，经口、直肠、鼻内、阴道、呼吸)和经皮(局部)。用于肠胃外、真皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括下述组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调整张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠调整pH。肠胃外制备物可以封闭在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射用途的药学组合物包括水溶液或分散系和用于临时制备无菌注射液或分散系的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应流动至容易注射性存在的程度。它在制造和贮存条件下必须是稳定的，并且必须针对微生物例如细菌和真菌的污染作用进行保存。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇、 聚乙二醇等)及其合适混合物。合适流动性可以例如通过下述得到维持，通过使用包衣例如卵磷脂，在分散系的情况下通过维持所需粒子大小，和通过使用表面活性剂。微生物作用的预防可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸等。在许多情况下，等渗剂包括在组合物中，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇和/或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来达到，所述试剂例如单硬脂酸铝和明胶。
无菌注射液可以通过将活性化合物(例如，C组或G组链球菌PPI多肽、ORF 554多核苷酸或针对其的抗体)以所需量与上文列出成分之一或组合一起掺入合适溶剂中，需要时，随后为过滤灭菌。一般地，通过将活性化合物掺入无菌媒介物内制备分散系，所述无菌媒介物包含基本分散介质和来自上述列举那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这产生来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何另外所需成分的粉剂。
经口组合物一般包括惰性稀释剂或食用载体。它们可以封闭在明胶胶囊中或压缩成片剂。为了经口治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂一起掺入，并且以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。经口组合物也可以使用流体载体进行制备而用作漱口水，其中流体载体中的化合物经口应用且发出瑟瑟声，并且吐出或吞咽。可以包括药学上相容的结合剂和/或佐剂材料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以包含下述成分中的任何，或相似性质的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙调味料。
为了通过吸入施用，化合物以气溶胶喷雾的形式从加压容器或分配器或喷雾器中递送，所述分配器包含合适推进剂，例如气体例如二氧化碳。全身施用还可以通过经粘液或经皮方式。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用对于待穿透屏障合适的穿透剂。此类穿透剂是本领域一般已知的，并且包括例如，对于经粘膜施用、洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸 衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻腔喷雾或栓剂完成。对于经皮施用，如本领域一般已知的将活性化合物配制成软膏、药膏、凝胶剂或乳膏。
化合物还可以以栓剂(例如用常规栓剂基质，例如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠的形式制备用于直肠递送。
在一个实施方案中，活性化合物用保护化合物不受从体内快速消除的载体进行制备，例如控制释放制剂，包括埋植剂和微胶囊递送系统。
生物可降解、生物相容性聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸可以用作载体。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。材料还可以从Alza Corporationand Nova Pharmaceuticals，Inc商购获得。脂质体悬浮液(包括靶向具有针对病毒抗原的单克隆抗体的受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如如通过引用合并入本文的美国专利号4,522,811中所述。
有利的是配制以单位剂型形式的经口或肠胃外组合物用于易于施用和剂量的均匀性。如本文使用的，单位剂型形式指适合作为单元剂量用于待治疗受试者的物理上不连续单位；每个单位包含与所需药学载体结合经计算产生所需疗效的预定数量的活性化合物。关于本发明的单位剂型形式的规格由下述指示且直接依赖于下述：活性化合物的独特特征和待达到的特定疗效，和配药法中固有的局限性例如用于治疗个体的活性化合物。
通过使本发明的多肽中的一种或多种与一种或多种已知链球菌多糖或多糖-蛋白质缀合物相组合提供组合免疫原性组合物。
多糖-蛋白质缀合物的蛋白质组分被称为“载体蛋白质”。术语“载体蛋白质”作为组包括无毒、非反应且以足够量和纯度可获得的那些蛋白质。载体蛋白质可顺应标准缀合操作。例如，CRM197可以用作载体蛋白质。CRM197，(Wyeth，Sanford，N.C.)是从白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株C7(β197)中分离的白喉毒素的无毒变体(类毒素)，所述白喉杆菌在基于酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培养基中生长。CRM197通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换色谱法进行纯化。其他白喉类 毒素也适合于用作载体蛋白质。
其他合适的载体蛋白质包括灭活的细菌毒素例如破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素(如例如WO/2004/083251中所述)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。还可以使用细菌外膜蛋白质例如外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白质、肺松解术、肺炎球菌表面蛋白质A(PspA)、肺炎球菌粘附素蛋白质(PsaA)、或流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)蛋白质D。其他蛋白质例如卵白蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素(PPD)的纯化蛋白质衍生物也可以用作载体蛋白质。
包括多核苷酸的免疫原性组合物通过多种载体和表达系统递送给接受者。此类系统尤其包括染色体、附加体和病毒衍生系统，例如衍生自下述的载体：细菌质粒、减毒细菌例如沙门氏菌属(美国专利号4,837,151)，噬菌体，转座子，酵母附加体，插入元件，酵母染色体元件，病毒例如痘苗和其他痘病毒、腺病毒、杆状病毒、乳多空病毒例如SV40、禽痘病毒、假性狂犬病病毒和逆转录病毒、甲病毒例如委内瑞拉马脑炎病毒(美国专利号5,643,576)、辛德毕斯病毒和塞姆利基森林病毒、非节段负链RNA病毒例如水疱性口炎病毒(美国专利号6,168,943)，和衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒。表达系统应包括调节以及引起表达的控制区，例如启动子和其他调节元件(例如多腺苷酸化信号)。一般地，可以使用适合于维持、繁殖或表达多核苷酸以在宿主中产生多肽的任何系统或载体。合适的核苷酸序列可以通过多种众所周知和常规技术中的任何插入表达系统内，例如Sambrook等人，″Molecular Cloning：A LaboratoryManual″第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989中所示的那些。
本发明的免疫原性组合物一般在单位剂量制剂中肠胃外施用，需要时，所述单位剂量制剂包含标准、众所周知的无毒生理学上可接受的载体、佐剂和媒介物。
药学上可接受的媒介物应理解为指定进入药学或免疫原性组合物内的化合物或化合物组合，其不引起副作用并且使得可以例如促进活性化合物施用，增加其在体内的寿命和/或其功效，增加其在溶液中的溶解性或备选地增强其保存。这些药学上可接受的媒介物是众所周知的，并且根据选择的活性化合物的性质和施用方式通过本领域技术人员修改。
根据已知技术配制可注射制剂例如无菌可注射水性或油性悬浮液，其中使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂。无菌可注射制备物还可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射液或悬浮液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。
在可以采用的可接受媒介物和溶剂中有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发性油照惯例用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单或二酯。此外，脂肪酸例如油酸在注射剂制备中有用。
载体包括用磷酸盐、乳酸盐、Tris等缓冲的中性盐水溶液。当施用病毒载体时，充分纯化载体以致使其基本上不含不希望有的污染物，例如缺陷干涉腺病毒颗粒或内毒素和其他热原，从而使得它在接受载体构建体的个体中不引起任何不利反应。在某些实施方案中，纯化载体的方法涉及使用浮力密度梯度，例如氯化铯梯度离心。
载体还可以是脂质体。关于使用脂质体作为递送媒介物的方法是本领域众所周知的(参见例如，由Schwendener RA，Adv.Exp.Med.Biol.620：117-128，2007的综述)。
本发明的免疫原性组合物还包括与控制基因表达的调节序列可操作地连接的本发明多核苷酸序列。将目的多核苷酸序列改造到表达载体例如质粒内，在促进DNA表达的调节元件的控制下，所述调节元件即启动子和/或增强子元件。在某些实施方案中，使用人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子(美国专利号5,168,062)。启动子可以是细胞特异性的，并且允许多核苷酸仅在预定细胞中的大量转录。
本发明的多核苷酸作为“裸露”DNA直接引入宿主内(美国专利号5,580,859)或与促进剂一起在组合物中配制，所述促进剂例如布比卡因 和其他局部麻醉剂(美国专利号5,593,972)和阳离子聚胺(美国专利号6,127,170。)
在这个多核苷酸免疫接种操作中，本发明的多肽在体内在瞬时基础上表达；不将遗传材料插入或整合到宿主的染色体内。这个操作区别于其中目的是将目的遗传材料插入或整合到染色体内的基因疗法。测定法用于证实通过免疫施用的多核苷酸不引起宿主中的转化表型(例如，美国专利号6,168,918)。
在特定实施方案中，如本文描述的免疫原性组合物还包括一种或多种佐剂。佐剂是当连同免疫原或抗原一起施用时增强免疫应答的物质。许多细胞因子或淋巴因子已显示具有免疫调节活性，并且因此用作佐剂，包括但不限于白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参见例如，美国专利号5,723,127)、13、14、15、16、17和18(及其突变形式)；干扰素-α、β和γ；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(参见例如，美国专利号5,078,996和ATCC登记号39900)；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；以及肿瘤坏死因子α和β。对于本文描述的免疫原性组合物有用的另外其他佐剂包括趋化因子，包括但不限于MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES；粘附分子例如选择素，例如L-选择素、P-选择素和E-选择素；粘蛋白样分子，例如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1；整联蛋白家族成员例如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95；免疫球蛋白超家族成员例如PECAM，ICAMs例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3，CD2和LFA-3；共刺激分子例如CD40和CD40L；生长因子包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管内皮生长因子；受体分子包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6；和半胱天冬酶(ICE)。
用于增强免疫应答的合适佐剂进一步包括但不限于MPLTM(3-O-去乙酰化单磷酰脂质A，Corixa，Hamilton，MT)，其在美国专利号4,912,094中描述。还适合于用作佐剂的是合成的脂质A类似物或氨基烷 基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)、或其衍生物或类似物，其可从Corixa(Hamilton，MT)获得，并且在美国专利号6,113,918中描述。一种此类AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也称为529(先前称为RC529)。这种529佐剂配制为水形式(AF)或稳定乳状液(SE)。
另外其他佐剂包括胞壁酰肽，例如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基膦酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳化液，例如使用微射流机(microfluidizer)例如Model 110Y微射流机(Microfluidics，Newton，MA))配制成亚微米颗粒的MF59(美国专利号6,299,884)(包含5％角鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(任选包含多种量的MTP-PE)，和SAF(包含10％角鲨烯、0.4％Tween 80、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳状液或涡旋以产生较大粒子大小的乳状液)；不完全弗氏佐剂(IFA)；铝盐(铝)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝；Amphigen；阿夫立定；L121/角鲨烯；D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷；普朗尼克多羟基化合物；杀死的博德特氏菌(Bordetella)；皂苷，例如在美国专利号5,057,540中描述的StimulonTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，在美国专利号5,254,339中描述的ISCOMATRIX(CSL Limited，Parkville，Australia)，和免疫刺激复合物(ISCOMS)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；细菌脂多糖；合成的多核苷酸例如包含CpG基序的寡核苷酸(例如，美国专利号6,207,646)；在欧洲专利号1,296,713和1,326,634中描述的IC-31(Intercell AG，Vienna，Austria)；百日咳毒素(PT)或其突变体、霍乱毒素或其突变体(例如，美国专利号7,285,281、7,332,174、7,361,355和7,384,640)；或大肠杆菌不耐热毒素(LT)或其突变体，特别是LT-K63、LT-R72(例如，美国专利号6,149,919、7,115,730和7,291,588)。
治疗性抗体和抗原结合多肽
本发明尤其针对链球菌感染的治疗，通过在受试者中产生有利治疗应答的条件下，给受试者施用治疗免疫学试剂，例如识别在链球菌PPI内的特异性表位的人源化单克隆抗体。“免疫学试剂”包括例如抗体、人源化抗体、抗体片段、包括抗原结合元件或CDR的肽等。“有利治疗应答”包括例如吞噬作用的诱导或β溶血性链球菌的调理作用。本发明还涉及所公开的免疫学试剂在制备用于治疗或预防β溶血性链球菌感染的药物中的用途。
在一个方面，本发明提供了预防或治疗与患者中的β溶血性链球菌感染相关的疾病的方法。本发明的某些方法必需给患者施用有效剂量的抗体，所述抗体与链球菌PPI表位特异性结合。此类方法对于预防或治疗受试者中的β溶血性链球菌疾病特别有用。“受试者”包括任何脊椎动物，例如伴侣动物、农场动物、哺乳动物和人患者。示例性方法包括施用有效剂量的与链球菌PPI结合的抗体或抗原结合肽。某些实施方案包括施用有效剂量的包括抗原识别位点或CDR的抗体或其他肽，其与链球菌PPI内的表位特异性结合，例如包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10和11中的任何一个或多个的氨基酸序列的PPI。
在另外一个方面，本发明的特征在于施用抗体或其他抗原结合肽，其与受试者中的链球菌PPI结合，并且诱导针对β溶血性链球菌的清除应答。例如，此类清除应答可以通过Fc受体介导的吞噬作用实现。
本发明的治疗性免疫学试剂一般基本上纯化的，不含不希望有的污染物。这意味着免疫学试剂一般至少约50％w/w(重量/重量)纯度，以及基本上不含干扰蛋白质和污染物。在某些实施方案中，免疫学试剂是至少约80％w/w纯度。在其他实施方案中，免疫学试剂是至少约90或约95％w/w纯度。然而，使用常规蛋白质纯化技术，可以获得至少99％w/w纯度的均质肽。
该方法可以对无症状受试者和目前显示疾病症状的受试者使用。在此类方法中使用的抗体可以是人、人源化、嵌合或非人抗体、或其片段(例如，抗原结合片段、包括表位结合区的肽或CDR)，并且可以是单克隆或多克隆的，如本文描述的。
在另一个方面，本发明的特征在于施用抗体与药学载体作为药学组合物。备选地，抗体可以通过施用编码至少一条抗体链的多核苷酸施用于受试者。表达多核苷酸以在患者中产生抗体链。任选地，多核苷酸编码抗体的重链和轻链。表达多核苷酸以在患者中产生重链和轻链。在示例性实施方案中，就患者血液中施用抗体的水平监控患者。
顺应治疗的受试者包括处于疾病危险中但未显示症状的个体，以及目前显示症状的患者。因此，呈现的免疫原性组合物和治疗性抗体可以预防地施用于一般群体。在无症状受试者中，治疗可以在任何年龄时开始。治疗可以通过测定随着时间过去的抗体水平进行监控。如果免疫应答或抗体水平下降，那么指示加强剂量。
在预防性应用中，将免疫原性组合物或药物施用于对β溶血性链球菌感染敏感或另外处于β溶血性链球菌感染危险中的受试者，其量足以消除或减少危险、减轻严重性、或延迟疾病开始，包括与感染相关的疾病的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病发展过程中呈现的中间病理学表型。在治疗性应用中，将组合物或药物施用于怀疑或已患有此类疾病的患者，其量足以治愈或至少部分阻止疾病的症状(生物化学、组织学和/或行为)，包括其并发症和在疾病发展中的中间病理学表型。
足以完成治疗性或预防性处理的量定义为治疗或预防有效剂量。在预防性和治疗性方案中，免疫学试剂通常以几个剂量施用，直至已实现足够的免疫应答。术语“免疫应答”或“免疫学应答”包括接受受试者中针对抗原的体液(抗体介导的)和/或细胞(通过抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)应答的发展。此类应答可以是主动应答，即通过施用免疫原(同上)所诱导的，或被动应答，即通过施用免疫球蛋白或抗体或预处理的T细胞所诱导的。一般地，监控免疫应答，并且如果免疫应答开始减弱，那么给予反复剂量。
本发明的组合物用于治疗β溶血性链球菌感染的有效剂量依赖于许多不同因素而改变，所述不同因素包括施用方式、靶位点、患者的生理学状况、患者是人还是其他动物、施用的其他药物、和处理是预防性的 还是治疗性的。通常，受试者是人，但也可以治疗非人哺乳动物包括转基因动物。治疗剂量可能需要逐步增加，以最佳化安全和功效。
对于使用抗体的被动免疫接种，剂量范围为约0.0001-100mg/kg，并且更通常为0.01-5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)宿主体重。例如，剂量可以是约1mg/kg体重或约10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。在上述范围中间的剂量也意欲在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周、每月、每2个月、每3个月或根据通过经验分析决定的任何其他时间表施用此类剂量。示例性治疗必需经过例如至少6个月的延长时期施用多次剂量。另外的示例性治疗方案必需每2周施用一次，或每月一次或每3-6个月一次。示例性剂量时间表包括在连续天时的1-10mg/kg或15mg/kg，在隔天时的30mg/kg或每周60mg/kg。在某些方法中，同时施用具有不同结合特异性的2种或更多种单克隆抗体，在所述情况下每种抗体施用的剂量包括在所示范围内。
抗体通常以多次机会施用。单个剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中针对链球菌PPI的抗体血液水平指示的。在某些方法中，调整剂量以达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在某些方法中，是25-300μg/ml。备选地，抗体可以作为持续释放制剂施用，在所述情况下需要较不频繁的施用。剂量和频率依赖于抗体在患者中的半衰期而改变。一般而言，人源化抗体显示最长的半衰期，随后为嵌合抗体和非人抗体。
施用剂量和频率可以依赖于处理是预防性的还是治疗性的而改变。在预防性应用中，将包含呈现的抗体或其混合物的组合物施用于不处于疾病状态中的患者，以增强患者的抵抗力。此类量定义为“预防有效剂量”。在这种用途中，精确量再次依赖于患者的健康状况和全身免疫性，但一般范围为0.1-25mg/剂量，特别是0.5-2.5mg/剂量。相对低剂量以相对不频繁的间隔经过长时间段施用。
在治疗性应用中，有时需要以相对短间隔的相对高剂量(例如，约 1-200mg抗体/剂量，其中更通常使用5-25mg的剂量)，直至疾病进展减少或终止，并且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。其后，患者可以施用预防性方案。
关于编码抗体的核酸的剂量范围为约10ng-1g、100ng-100mg、1μg-10mg、或30-300μg DNA/患者。关于传染性病毒载体的剂量从10到100或更多病毒粒子/剂量不等。
治疗性免疫学试剂可以通过肠胃外、局部、静脉内、经口、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌肉内方法施用用于预防性和/或治疗性处理。免疫学试剂的最一般施用途径是静脉内输注或皮下施用，尽管其他途径也是同样有效的。下一个最常见的途径是肌肉内注射。这种类型的注射最一般在臂或腿肌肉中执行。在某些方法中，免疫学试剂直接注射到其中已积累沉积物的特定组织内，例如颅内注射。肌肉内注射或静脉内输注优选用于抗体施用。在某些方法中，抗体作为持续释放组合物或装置施用，例如microinfusor装置(例如，MedipadTM装置；参见Meehan等人，Journal of Controlled Release，46：107-119，1997.)
如上所述，通过施用编码抗体及其组分链的核酸用于被动免疫接种，可以在体内(或离体)形成针对β溶血性链球菌感染的免疫应答。此类核酸可以是DNA或RNA。编码免疫学试剂的核酸区段一般与调节元件例如启动子和增强子连接，所述调节元件允许在患者的预期靶细胞中表达DNA区段。对于在血细胞中的表达，如对于诱导免疫应答希望的，来自轻链或重链免疫球蛋白基因的启动子和增强子元件或CMV主要立即早期启动子和增强子适合于指导表达。连接的调节元件和编码序列通常克隆到载体内。对于双链抗体的施用，2条链可以克隆到相同或分开载体中。
许多病毒载体系统是可获得的，包括逆转录病毒系统(参见例如，Lawrie和Tumin，Cur.Opin.Genet.Develop.3：102109(1993))；腺病毒载体(参见例如，Bett等人，J.Virol.67：5911(1993))；腺伴随病毒载体(参见例如，Zhou等人，J.Exp.Med.179：1867(1994))，来自痘家族包括痘苗病毒和禽痘病毒的病毒载体，来自甲病毒属的病毒 载体例如衍生自辛德毕斯和塞姆利基森林病毒的那些(参见例如，Dubensky等人，J.Virol.70：508(1996))，委内瑞拉马脑炎病毒(参见Johnston等人，美国专利号5,643,576)和弹状病毒，例如水疱性口炎病毒(参见Rose，美国专利号6,168,943)和乳头状瘤病毒(Ohe等人，Human Gene Therapy 6：325(1995)；Woo等人，WO 94/12629和Xiao& Brandsma，Nucleic Acids.Res.24，2630 2622(1996))。
编码抗体或包括CDR的抗体片段的DNA，或包含其的载体，可以包装到脂质体内。合适脂质和相关类似物由Eppstein等人，美国专利号5,208,036，Felgner等人，美国专利号5,264,618，Rose，美国专利号5,279,833,和Epand等人，美国专利号5,283,185描述。载体和编码免疫原的DNA也可以与微粒载体吸附或结合，所述微粒载体的例子包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚丙交酯和聚(丙交酯共乙交酯)，参见例如，McGee等人，J.Micro Encap.14(2)：197-210(1997)。
多核苷酸载体或裸露多核苷酸(例如，DNA)可以通过施用于个体患者在体内递送，一般通过全身施用(例如，静脉内、腹膜内、鼻、胃、真皮内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部应用(参见例如，Anderson等人，美国专利号5,399,346)。术语“裸露多核苷酸”指不连同转染促进剂一起施用的多核苷酸。裸露多核苷酸有时在质粒载体中克隆。质粒载体可以进一步包括转染促进剂例如布比卡因(Weiner等人，美国专利号5,593,972)。DNA还可以使用基因枪以施用。参见Xiao & Brandsma，同上。编码抗体(或包括CDR的片段)的DNA沉淀到微型金属珠的表面上。微弹轰击(microprojectiles)用冲击波或膨胀氦气加速，并且穿透组织到几个细胞层的深度。例如，由Agricetus，Inc.Middleton Wis.制造的ACCELTM Gene Delivery Device，即DNA枪，适合于用于本发明的实践中。备选地，简单地通过用化学或机械刺激将DNA点在皮肤上，裸露DNA可以经过皮肤进入血流内(参见Howell等人，WO 95/05853)。
在另一个实施方案中，编码免疫学试剂的载体可以离体递送给细胞，例如来自个体患者外植的细胞(例如，淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活组织检查)或万能供体造血干细胞，随后为细胞再植入患者内，通常在 选择已掺入载体的细胞后。
本发明的免疫学试剂可以任选与其他试剂组合施用，所述其他试剂至少在治疗β溶血性链球菌疾病中部分有效。本发明的免疫学试剂还可以与其他试剂组合施用，所述其他试剂增强治疗性免疫学试剂进入靶细胞或组织，例如脂质体等。共施用此类试剂可以降低达到所需效应需要的治疗性免疫学试剂(例如，治疗性抗体或抗体链)的剂量。
本发明的免疫学试剂通常作为包含活性治疗性试剂即和多种其他药学上可接受的组分的药学组合物施用。参见Remington′s Pharmaceutical Science(第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1980))。优选形式依赖于预期施用方式和治疗性应用。依赖于所需制剂，组合物还可以包括药学上可接受的、无毒载体或稀释剂，其定义为通常用于配制药学组合物用于动物或人施用的媒介物。这样选择稀释剂以便不影响组合的生物学活性。此类稀释剂的例子是蒸馏水、生理学磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克氏溶液。此外，药学组合物或制剂还可以包括其他载体，佐剂，或无毒、非治疗性、非免疫原性的稳定剂等。
药学组合物还可以包括大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖例如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如胶乳官能化的sepharoseTM、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集物(例如油小滴或脂质体)。另外，这些载体可以充当免疫刺激剂(即，佐剂)。
对于肠胃外施用，本发明的免疫学试剂可以作为物质在具有药学载体的药学上可接受的稀释剂中的溶液或悬浮液的可注射剂量施用，所述药学载体可以是无菌液体例如水油、盐水、甘油或乙醇。另外，辅助物质例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等可以存在于组合物中。药学组合物的其他组分是具有石油、动物、蔬菜或合成起源的那些，例如花生油、大豆油和矿物油。一般而言，二醇例如丙二醇或聚乙二醇是优选液体载体，特别是对于可注射溶液。抗体可以以积存注射或埋植剂制备物的形式施用，其可以以这样的方式配制，以便允许活性成分的 持续释放。示例性组合物包括在水性缓冲液中配制的5mg/mL的单克隆抗体，所述水性缓冲液由50mM L-组氨酸、150mM NaCl组成，用HCl调整至pH6.0。
一般地，组合物制备为注射剂，作为液体溶液或悬浮液；还可以制备适合于在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。制备物还可以在脂质体或微小粒子例如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中乳化或封装，用于增强佐剂效应，如上所述(参见Langer，Science 249：1527(1990)和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28：97(1997))。本发明的免疫学试剂可以以积存注射或埋植剂制备物的形式施用，其可以以这样的方式施用，以便允许活性成分的持续或脉冲式释放。
适合于其他施用方式的另外制剂包括经口、鼻内和肺制剂、栓剂和经皮应用。对于栓剂，粘合剂和载体包括例如聚乙二醇或甘油三酯；此类栓剂可以由包含在0.5％-10％优选1％-2％范围中的活性成分的混合物形成。经口制剂包括赋形剂，例如药学级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂的形式，并且包含10％-95％活性成分，优选25％-70％。
可替代地，经皮递送可以使用皮肤贴剂或使用transferosomes来实现(Paul等人，Eur.J.Immunol.25：3521(1995)；Cevc等人，Biochem.Biophys.Acta 1368：20115(1998))。
本发明还提供了监控患有β溶血性链球菌感染或对β溶血性链球菌感染敏感的患者中的治疗的方法，即用于监控施用于患者的治疗过程。该方法可以用于监控对无症状患者的治疗性处理和对无症状患者的预防性处理。特别地，该方法对于监控被动免疫有用(例如，测量施用抗体的水平)。
某些方法必需测定例如在施用免疫学试剂的剂量之前患者中的抗体水平或谱的基线值，并且使之与关于治疗后的谱或水平的值比较。水平或谱的值中的显著增加(即，大于相同样品的反复测量中的实验误差的一般边缘，表示为距离此类测量平均值1个标准差)显示阳性治疗结果 (即，免疫学试剂的施用已实现所需应答)。如果关于免疫应答的值未显著改变或降低，那么指示阴性治疗结果。如果治疗是被动免疫疗法，那么抗体水平预期随着时间过去降低，具有特征半衰期。
用于分析的组织样品一般是来自患者的血液、血浆、血清、粘液流体或脑脊髓液。样品例如就针对链球菌PPI的抗体水平或滴度进行分析。检测对链球菌PPI特异的抗体的ELISA方法在实施例部分描述。在某些方法中，使用清除测定法测定施用抗体的水平或滴度，例如在体外吞噬作用测定法中(参见例如，Jansen等人，Clin.Diagn.Lab.Immunol.，8(2)：245-250，2001.)
在被动免疫接种后的抗体谱一般显示抗体浓度中的立即峰，随后为指数式衰减。如果没有进一步剂量，那么衰减在数天至数月的时期内接近处理前水平，依赖于施用抗体的半衰期。
在某些方法中，在施用前进行患者中针对链球菌PPI的抗体的基线测量，其后不久进行第二次测量，以测定峰抗体水平，并且以间隔进行一次或多次进一步测量，以监控抗体水平的衰减。当抗体水平已下降至基线或小于基线的峰预定百分率(例如，50％、25％或10％)时，使用抗体的进一步剂量的施用。在某些方法中，峰或后续测量的小于本底的水平与先前测定的参考水平比较，以构成在其他患者中有利的预防性或治疗性处理方案。如果测量的抗体水平显著小于参考水平(例如，在获益于处理的患者群体中小于参考值的平均值减1个标准差)，那么指示抗体的另外剂量的施用。
另外的方法包括随着治疗过程监控常规由研究者或医生依赖以诊断或监控链球菌感染或相关疾病的任何领域公认的示例性症状。例如，可以监控蜂窝织炎、丹毒、小脓疱疹、坏死性筋膜炎、咽喉痛、红喉(redthroat)、恶寒、发热、头痛、恶心、呕吐、心跳加快、不适、扁桃体肿大、淋巴结肿大和/或皮疹。
根据说明书内引用的参考文献的教导，最充分理解说明书，所有参考文献在此通过引用整体合并。在说明书内的实施方案提供了本发明实施方案的举例说明，并且不应解释为限制本发明的范围。技术人员应认 识到许多其他实施方案由本发明包含，并且预期说明书和实施例仅被视为示例性的，而本发明的真实范围和精神由下述权利要求指出。
实施例1：停乳链球菌ORF 554的克隆
关于A组的十二(12)个基因组序列和关于B组链球菌属物种的多个基因组序列是可公开获得的。开放读码框(ORF)编号554(ORF 554)的DNA和蛋白质序列已在这些链球菌属基因组的许多中得到鉴定；参见例如，公开的国际专利申请号WO 02/083859。然而，存在关于C组或G组基因组有限的序列信息。本文公开的是这个ORF 554在其他G组和C组链球菌菌株中的序列。
包含ORF 554的已知链球菌属序列在AlignX(载体NTI)中比对，并且同源性区域用于简并引物构建(参见Wessner，Science，286(5554)：1495-1496，1999；Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992；和Rhee等人，Applied andEnvironmental Microbiology，71(2)：817-825，2005.)寡核苷酸引物设计为具有最低限度简并性，同时维持高解链温度和低自身二聚化潜力。用于分离、扩增和鉴定新型C组或G组链球菌ORF 554多核苷酸的寡核苷酸引物核苷酸序列在SEQ ID NO：18-26中显示。
使用对链球菌属C分离物ATCC12394(停乳链球菌似马亚种)制备的基因组DNA制剂执行起始PCR研究。获得关于ORF 554的5-最初和3-最初末端的部分基因序列。随后基于这些序列设计正向和反向引物(分别为SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24)，并且随后用于通过PCR产生来自不同G和C菌株的约700-900bp ORF554序列。
在本公开内容前未限定来自这些菌株的ORF554的基因组或蛋白质序列。关于来自分离物ATCC12394的ORF 554获得的核苷酸序列在SEQ ID NO：1中描述，并且它的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中描述。
ORF554在五(5)种分离物中发现：得自ATCC的ATCC12394、ATCC35666和ATCC27823，和作为临床前筛选的部分获得的2种兰斯菲尔德G组分离物N04A27和N04AFT[研究号6122K1-9000，Cross Sectional Serology Study，Australia，F.Laudat，MD，Paris]。它们分别的核苷酸序列在SEQ ID NO：1、3、5、7、9、25、27、29和31中描述。它们分别的氨基酸序列在SEQ ID NO：2、4、6、8、10、26、28、30和32中描述。制备在SEQ ID NO：2、4、6、8和10之间的共有氨基酸序列，并且作为SEQ ID NO：11呈现。
在新型C组或G组链球菌PPI和ORF 554序列与已知A组和B组链球菌PPI和ORF 554序列之间的蛋白质和核酸序列的比对和ClustalW分析(Chenna等人，Nuc.Acids Res.，31，3497-3500(2003))提供了在表1中概括的百分率。
表1：同一性百分比
A：氨基酸同一性
  GAS   GBS   SEQ ID NO：10
 GAS   100   56   76
 GBS   100   57
 SEQ ID NO：10   100
B：核苷酸同一性
  GAS   GBS   SEQ ID NO：9
  GAS   100   52   76
  GBS   100   53
  SEQ ID NO：9   100
实施例2：针对C/G组葡萄球菌属PPI表位的抗体
抗体与细菌的结合，称为调理作用的过程，可以导致细菌通过吞噬细胞的摄取和杀死。此类抗体无论衍生自大量人或动物来源，还是人或鼠类或嵌合单克隆来源，并且单独还是组合使用，都可以在其中BHS可能存在于血流中的预防性或治疗性背景中使用，例如新生儿败血症或在手术或脓肿渗漏后的败血症。
在小鼠中产生针对由ORF 554编码的重组C组或G组葡萄球菌肽基脯氨酰异构酶多肽的抗体。在筛选这些抗β溶血性链球菌抗血清和针对多种β溶血性链球菌(BHS)菌株的单克隆抗体的过程中，应注意到某些抗血清和抗体针对许多BHS菌株是交叉反应的，包括化脓性链球菌 (A组链球菌)、无乳链球菌(B组链球菌)、以及C组和G组链球菌(这包括链球菌属物种咽颊炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、停乳链球菌似马亚种和停乳链球菌停乳亚种)成员(表2。)通过荧光激活细胞分选(FACS)执行抗体的筛选。简言之，热杀死的链球菌与小鼠抗C组和G组链球菌PPI抗体一起在冰上温育45分钟，随后为2次洗涤。链球菌随后与山羊抗小鼠Alexa-488抗体(Molecular Probes，Eugene，OR)一起在冰上温育30分钟，随后为2次洗涤。因此处理的细胞在FACS机器上运行(例如参见DeMaster等人，Infect.Immun.，70(1)：350-359，2002.)这种交叉反应性也意味着C组或G组ORF554或由其编码的多肽可以用于免疫原性组合物中，以诱导有效保护不受由A组或B组链球菌以及由C组或G组链球菌感染的免疫应答。
表2描述了抗血清和抗体针对由ORF 554编码的C组或G组链球菌PPI的交叉反应性。根据表2，符号“+”意指抗体与抗原反应超过本底至少3倍；符号“+/-”意指抗体与抗原反应在超过本底2倍和3倍之间；并且符号“-”意指抗体信号的检测在本底下或低于本底。
表2：抗体交叉反应性
  菌株   物种  针对αPPI的反应性
  GAR 1165   化脓性链球菌   +
  GAR 1199   化脓性链球菌   +
  GAR 1251   化脓性链球菌   +
  GAR 1278   化脓性链球菌   +
  GAR 1362   化脓性链球菌   +
  GAR 1439   化脓性链球菌   +
  GAR 1530   化脓性链球菌   +
  GAR 1566   化脓性链球菌   +
  GAR 1672   化脓性链球菌   +
  GAR 1839   化脓性链球菌   +
  GAR 1923   化脓性链球菌   +
  GAR 2107   化脓性链球菌   +
  GAR 2330   化脓性链球菌   +
  GAR 2646   化脓性链球菌   +
  GAR 2650   化脓性链球菌   +
  GAR 2869   化脓性链球菌   +
  GAR 3104   化脓性链球菌   +
  GAR 3549   化脓性链球菌   +
  GAR 3784   化脓性链球菌   +
  GAR 4029   化脓性链球菌   +
  GAR 4030   化脓性链球菌   +
  GAR 4230   化脓性链球菌   +
  GAR 4773   化脓性链球菌   +
  GAR 4983   化脓性链球菌   +
  GAR 4987   化脓性链球菌   +
  GAR 5861   化脓性链球菌   +
  GAR 5991   化脓性链球菌   +
  GAR 6084   化脓性链球菌   +
  GAR 7055   化脓性链球菌   +
  GS20   化脓性链球菌   +
  GS21   化脓性链球菌   +
  GS22   化脓性链球菌   +
  GS23   化脓性链球菌   +
  GS24   化脓性链球菌   +
  GS25   化脓性链球菌   +
  GS26   化脓性链球菌   +
  GS27   化脓性链球菌   +
  GS28   化脓性链球菌   +
  GS29   化脓性链球菌   +
  GS30   化脓性链球菌   +
  GS31   化脓性链球菌   +/-
  GS32   化脓性链球菌   +
  GS33   化脓性链球菌   +
  GS34   化脓性链球菌   +
  GS35   化脓性链球菌   +
  GS36   化脓性链球菌   +/-
  GS37   化脓性链球菌   +
  GS38   化脓性链球菌   +
  GS39   化脓性链球菌   +
  GS40   化脓性链球菌   +
  GS41   化脓性链球菌   +
  GS42   化脓性链球菌   +
  GS43   化脓性链球菌   +
  GS44   化脓性链球菌   +
 GS45   化脓性链球菌   +
 GS46   化脓性链球菌   +
 GS47   化脓性链球菌   +
 GS 48   化脓性链球菌   +
 GS 49   化脓性链球菌   +
 GS 50   化脓性链球菌   +
 GS 51   化脓性链球菌   +
 GS 52   化脓性链球菌   +
 GS 53   化脓性链球菌   +
 GS 54   化脓性链球菌   +/-
 GS 55   化脓性链球菌   +
 GS 56   化脓性链球菌   +
 GS 57   化脓性链球菌   +
 GS 58   化脓性链球菌   +
 GS 59   化脓性链球菌   +
 GS 60   化脓性链球菌   +
 GS 61   化脓性链球菌   +
 GS 62   化脓性链球菌   +
 GS 63   化脓性链球菌   +
 GS 64   化脓性链球菌   +
 GS 65   化脓性链球菌   +
 GS 66   化脓性链球菌   +
 GAR 1   无乳链球菌   +
 GAR 1012   无乳链球菌   +/-
 GAR 1023   无乳链球菌   -
 GAR 1049   无乳链球菌   -
 GAR 10895   无乳链球菌   -
 GAR 1192   无乳链球菌   +/-
 GAR 127   无乳链球菌   -
 GAR 12790   无乳链球菌   -
 GAR 1305   无乳链球菌   -
 GAR 131   无乳链球菌   -
 GAR 1355   无乳链球菌   -
 GAR 1446   无乳链球菌   -
 GAR 1494   无乳链球菌   -
 GAR 154   无乳链球菌   +
 GAR 176   无乳链球菌   -
 GAR 18   无乳链球菌   +
  GAR 1844   无乳链球菌   -
  GAR 1931   无乳链球菌   -
  GAR 2369   无乳链球菌   -
  GAR 252   无乳链球菌   -
  GAR 2533   无乳链球菌   -
  GAR 2682   无乳链球菌   +
  GAR 2717   无乳链球菌   -
  GAR 2723   无乳链球菌   -
  GAR 2724   无乳链球菌   -
  GAR 2842   无乳链球菌   +/-
  GAR 287   无乳链球菌   -
  GAR 3003   无乳链球菌   -
  GAR 3751   无乳链球菌   -
  GAR 381   无乳链球菌   -
  GAR 3830   无乳链球菌   -
  GAR 4131   无乳链球菌   +/-
  GAR 4293   无乳链球菌   -
  GAR 4398   无乳链球菌   -
  GAR 462   无乳链球菌   -
  GAR 4837   无乳链球菌   +/-
  GAR 54   无乳链球菌   -
  GAR 562   无乳链球菌   +
  GAR 6016   无乳链球菌   +
  GAR 614   无乳链球菌   +
  GAR 63   无乳链球菌   +
  GAR 6332   无乳链球菌   +/-
  GAR 6387   无乳链球菌   +
  GAR 6505   无乳链球菌   +/-
  GAR 67   无乳链球菌   -
  GAR 864   无乳链球菌   +/-
  GAR 967   无乳链球菌   -
  GS19   GGS   +/-
  GS27   GGS   +/-
  ATCC 33397   咽颊炎链球菌   +/-
  ATCC 33397   咽颊炎链球菌   -
  GAR 10823   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 1272   咽颊炎链球菌   -
  GAR 1370   咽颊炎链球菌   -
  GAR 1425   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 1592   咽颊炎链球菌   -
  GAR 1595   咽颊炎链球菌   -
  GAR 2044   咽颊炎链球菌   -
  GAR 2523   咽颊炎链球菌   -
  GAR 2565   咽颊炎链球菌   -
  GAR 2697   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 2822   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 3091   咽颊炎链球菌   -
  GAR 3560   咽颊炎链球菌   +
  GAR 3576   咽颊炎链球菌   -
  GAR 3858   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 3938   咽颊炎链球菌   -
  GAR 4133   咽颊炎链球菌   -
  GAR 4158   咽颊炎链球菌   +
  GAR 4234   咽颊炎链球菌   -
  GAR 4426   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 4680   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 4834   咽颊炎链球菌   -
  GAR 4896   咽颊炎链球菌   +
  GAR 5093   咽颊炎链球菌   -
  GAR 5094   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 5675   咽颊炎链球菌   -
  GAR 5776   咽颊炎链球菌   +
  GAR 5831   咽颊炎链球菌   -
  GAR 6187   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 6590   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 7000   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 7023   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 7190   咽颊炎链球菌   -
  GAR 7214   咽颊炎链球菌   +
  GAR 7468   咽颊炎链球菌   -
  GAR 7818   咽颊炎链球菌   +
  GAR 8620   咽颊炎链球菌   +
  GAR 8693   咽颊炎链球菌   +/-
  GAR 8722   咽颊炎链球菌   -
  GAR 8736   咽颊炎链球菌   -
  GAR 8954   咽颊炎链球菌   +/-
  ATCC 27823   星座链球菌   +/-
  GAR 1235   星座链球菌   -
  GAR 1384   星座链球菌   +
  GAR 1811   星座链球菌   +
  GAR 2421   星座链球菌   +/-
  GAR 3145   星座链球菌   -
  GAR 3355   星座链球菌   -
  GAR 4048   星座链球菌   +/-
  GAR 4083   星座链球菌   +/-
  GAR 4861   星座链球菌   +
  GAR 4870   星座链球菌   +/-
  GAR 5757   星座链球菌   -
  GAR 6129   星座链球菌   +
  GAR 6147   星座链球菌   -
  GAR 6258   星座链球菌   +/-
  GAR 7224   星座链球菌   +
  GAR 7369   星座链球菌   +
  ATCC 12394   停乳链球菌   +
  ATCC 12394   停乳链球菌   +
  ATCC 40378   停乳链球菌   -
  ATCC 40378   停乳链球菌   -
  GAR 3868   停乳链球菌   +/-
  GAR 4272   停乳链球菌   +
  ATCC 35666   停乳链球菌似马亚种   +
  BAA-338   停乳链球菌似马亚种   -
  GAR 3015   似马链球菌   +
  ATCC 27335   中间链球菌   +
  ATCC 27335   中间链球菌   +
  GAR 2407   中间链球菌   +/-
  GS28   unk   +
  GS67   GGS/GCS   +
  GS68   GGS/GCS   +/-
  GS69   GGS/GCS   +/-
  GS70   GGS/GCS   +/-
  GS71   GGS/GCS   +
  GS72   GGS/GCS   +
  GS73   GGS/GCS   +/-
  GS74   GGS/GCS   -
  GS75   GGS/GCS   +/-
  GS77   GGS/GCS   +
  GS78   GGS/GCS   +/-
  GS79   GGS/GCS   +/-
  GS80   GGS/GCS   -
  GS81   GGS/GCS   -
  GS82   GGS/GCS   +/-
  GS83   GGS/GCS   +
  GS84   GGS/GCS   -
  GS85   GGS/GCS   +/-
  GS86   GGS/GCS   +/-
  GS88   GGS/GCS   +
  GS89   GGS/GCS   +/-
  GS90   GGS/GCS   -
  GS91   GGS/GCS   +/-
  GS92   GGS/GCS   +
  GS93   GGS/GCS   +
  GS94   GGS/GCS   +
Figure IDA0000045094700000011
Figure IDA0000045094700000021
Figure IDA0000045094700000041
Figure IDA0000045094700000051
Figure IDA0000045094700000061
Figure IDA0000045094700000071
Figure IDA0000045094700000081
Figure IDA0000045094700000101
Figure IDA0000045094700000111
Figure IDA0000045094700000121
Figure IDA0000045094700000131
Figure IDA0000045094700000141
Figure IDA0000045094700000161
Figure IDA0000045094700000181
Figure IDA0000045094700000191
Figure IDA0000045094700000211
Figure IDA0000045094700000221
Figure IDA0000045094700000231

Claims (19)

1.包括如下氨基酸序列的分离多肽，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQID NO：32中的任何一个或多个至少90％等同。
2.权利要求1的分离多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32中任何一个的氨基酸序列。
3.分离多核苷酸，其编码权利要求1或权利要求2的分离多肽中的任何一个。
4.权利要求3的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸包括与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中的任何一个或多个至少90％等同的核苷酸序列。
5.权利要求3或权利要求4的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中的任何一个的核苷酸序列。
6.权利要求3-5中任一项的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸与调节元件可操作地连接。
7.多核苷酸载体，其包括权利要求3-6中任一项的分离多核苷酸。
8.权利要求7的多核苷酸载体，其中所述多核苷酸载体是质粒、病毒载体和表达载体中的任何一种或多种。
9.细胞，其包括权利要求3-6中任一项的分离多核苷酸，或权利要求7和8中任一项的多核苷酸载体，其中所述细胞是离体的。
10.权利要求9的细胞，其中所述细胞选自细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
11.免疫原性组合物，其包括权利要求1或权利要求2的分离多肽。
12.免疫原性组合物，其包括权利要求3-6中任一项的分离多核苷酸，或权利要求7和8中任一项的多核苷酸载体。
13.用于诱导患者中针对β溶血性链球菌细菌或β溶血性链球菌感染的免疫应答的方法，其包括给所述患者施用权利要求11或权利要求12的免疫原性组合物。
14.权利要求13的方法，其中所述β溶血性链球菌细菌或β溶血性链球菌感染来自A组、B组、C组或G组。
15.权利要求1或权利要求2的分离多肽在制备在预防性治疗患者中的β溶血性链球菌感染中有用的药物中的用途。
16.权利要求3-6中任一项的分离多核苷酸或权利要求7和8中任一项的多核苷酸载体在制备在预防性治疗患者中的β溶血性链球菌感染中有用的药物中的用途。
17.试剂盒，其包括权利要求1或权利要求2的分离多肽。
18.试剂盒，其包括权利要求3-6中任一项的分离多核苷酸或权利要求7和8中任一项的多核苷酸载体。
19.产生分离多肽的方法，其包括用包含编码权利要求1或权利要求2的分离多肽的分离多核苷酸的质粒转化、转染或感染细胞，并且在允许所述多肽通过所述细胞表达的条件下培养所述细胞，并且从所述细胞中纯化所述多肽。
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