CN102099483A

CN102099483A - 生产有机酸的方法和过程

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Publication number: CN102099483A
Application number: CN2008801303697A
Authority: CN
Inventors: S-T·杨
Original assignee: Ohio State University
Current assignee: Ohio State University
Priority date: 2008-06-19
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2011-06-15
Also published as: AU2008358063A2; BRPI0822904A2; AP2011005545A0; JP2011524749A; KR20110042058A; AU2008358063A1; US20110151529A1; CA2728262A1; WO2009154624A1; EP2304042A1

Abstract

提供了用于有机酸生产的发酵方法，并且包括，提供代谢工程化的突变细菌，其使得ack和pta基因中的一个或两个已经被破坏，通过将该突变细菌固定化同时将该突变细菌暴露于可发酵底物使该突变细菌适应以提高它们对酸的耐受性和提高它们的生长速率，并进一步将适应的突变细菌暴露于可发酵底物足够长的时间，以提供高于约50g/L的最终有机酸发酵产物浓度。

Description

生产有机酸的方法和过程

本发明总地涉及生产有机酸的方法，更具体地，涉及通过使用源自代谢和过程工程化的耐酸性厌氧细菌菌株的发酵来生产丁酸、丙酸和醋酸的方法。

对矿物燃料将来的缺乏、成本和环境影响的关注激发了开发廉价的、可再生的作为燃料和化学制品替代来源的生物质的兴趣。因为原油价格上涨，基于生物的化学制品和工业产品成为有吸引力的石油衍生对应物的替代品。使用厌氧微生物的发酵方法提供了有前景的将生物质和农业废物转化成化学制品和燃料的途径。存在大量需要适当处置以避免污染问题的低价值农产品和食品加工副产物/废物。这些生物质废物原料可以用作低价给料，用于生产燃料和化学制品，如有机酸。

因为基于石油原料与日俱增的成本、对石化工业引起的环境污染的公众关注以及消费者对食品、化妆品和药品中基于生物的天然成分的偏好，从可再生来源生产丁酸和氢已经成为基于石油加工方法的吸引力日增的替换方案。丁酸是通过梭菌属物种，如酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、丙酮丁酸梭菌(C.acetobutyricum)、波氏梭菌(C.populeti)和热醋梭菌(C.thermobutyricum)，从糖产生的短链脂肪酸。尽管丁酸目前主要是通过石化途径来生产的，但对通过发酵从天然来源生产丁酸存在着日益增加的兴趣。然而，因为产丁酸细菌是异型发酵的并受到丁酸的强烈抑制，因此用于丁酸生产的常规发酵技术受到反应器生产力低、产物浓度低和产量低的限制。

相似地，常规丙酸发酵方法遇到生产力低、产量低以及终产物浓度低和纯度低的问题，并且对于商业应用是不经济的。丙酸是广泛用于纤维素塑料、除草剂和香料生产中的重要化学制品。丙酸也是重要的霉菌抑制剂。它的铵盐、钙盐、钠盐和钾盐广泛用作食品和饲料防腐剂。目前，大部分商业销售的丙酸是通过石油化学方法生产的。然而，对通过丙酸细菌从糖的发酵生产丙酸存在着越来越大的兴趣。尽管通过各种方法和菌株改良在提高发酵生产力和终产物浓度中存在着一些成功，但怎样进一步提高发酵过程中的丙酸产量和纯度仍然是个挑战。

经济上可行的用于化学制品生产的发酵方法的研发需要不仅具有高生产率而且可以耐受高浓度发酵产物的微生物。改进工业微生物的方法包括经典菌株改良(CSI)的随机方法和代谢工程化的高度理性方法。尽管CSI是很有效的，但其是时间和资源密集性的。为了获得对抑制性发酵产物高耐受性的菌株，通常使用通过在递增抑制剂浓度的培养基中连续培养，并结合通过化学诱变剂或UV照射来诱导突变来连续筛选和选择突变株。然而，常规培养筛选方法是繁重、费时的，且常常没有结果。最近，也已经应用重组DNA技术来改善对抑制性产物的细胞耐受性。这些方法通常更有效，但使用也更复杂并需要遗传水平的详细抑制机理的知识，这对于具有工业发酵关注的大部分微生物而言是不可获得的。

代谢工程化广泛用于设计工程化菌株，以通过代谢量分布的改变来获得较高效率的代谢产物过度产生。迄今为止，大多数代谢工程化工作涉及使用遗传学和生理学得到了充分研究的微生物(例如，大肠杆菌、酵母和杂交瘤细胞)次生代谢产物(如抗生素)、氨基酸(例如，赖氨酸)和异源蛋白质的产生。代谢量分布的化学计量分析给代谢工程化、最佳的培养基配方和给料策略以及生物方法优化提供了指导，然而，这些需要对发酵细胞中的代谢和调控网络的深入了解。尽管理性代谢工程化方法在涉及基因簇内的单个基因或少数几个基因的情况下已经成功，但在涉及复杂或代谢途径很大程度上未知的许多情况下，是无效的。这是因为理性代谢工程化方法通常一次针对一个基因，因此不能预测途径中多个基因间复杂的相互作用。

丙酸细菌是革兰氏阳性、过氧化氢酶阳性、不产生孢子、非运动性、兼性厌氧、棒状的细菌。丙酸细菌属的成员广泛用于维生素B₁₂、四吡咯化合物和丙酸的生产中，已经用于益生菌和干酪工业中。如图1中所示，通过丙酸细菌从二羧酸途径生产丙酸，并且通常伴随醋酸盐和二氧化碳的形成。理论上，通过EMP(Embden-Meyerhof-Parnas)途径进行糖酵解时，1mol葡萄糖只产生4/3mol丙酸盐和2/3mol醋酸盐。当存在明显的细胞生长和生物质形成时，试剂的丙酸盐产量要低得多。即使在10g/L相对低的浓度下，丙酸盐也是发酵的强抑制剂。典型的分批丙酸发酵需要～3天来达到～20g/L丙酸，丙酸产量通常低于0.4g/g葡萄糖。就产量、终产物浓度和生产速率而改善丙酸发酵的尝试导致了新的生物方法和突变菌株的产生，但成功有限。需要发酵方法的显著改进，以使得基于生物的丙酸在经济上与其石油对应物和其他相关化学制品可相互竞争。

酪丁酸梭菌是革兰氏阳性、棒状、产孢子、专性厌氧的细菌，其能够将多种碳水化合物发酵成丁酸和醋酸。在历史上，由原料奶中存在的梭菌孢子(大部分源自青贮饲料)的生长引起的干酪中(后期通风)的丁酸发酵可能导致相当大的产物损耗。另一方面，丁酸在化学、食品和药品工业中具有许多应用。以纯酸的形式来使用，以增强食品风味中类似黄油的特征。这种酸的酯用作添加剂，用于提高水果香味，以及用作芳香化合物，用于香料的生产。

丁酸是由结肠中膳食纤维的细菌发酵产生的短链脂肪酸之一，并已经显示出具有抗癌作用，并可以用作营养药物或甚至用作药物来治愈结直肠癌。图2中显示了从糖生产丁酸的发酵途径。在发酵中还产生了醋酸和氢。几种厌氧细菌可以从多种底物产生丁酸，作为主要的发酵产物。其中，酪丁酸梭菌具有许多优于其他物种的优点，包括细胞生长的培养基简单以及相对高的产物纯度和产量。

然而，与其他acidogen一样，丁酸细菌受到其酸产物的强烈抑制。因此，常规的丁酸发酵通常受到反应器生产力低(＜0.5g/L.h)、产物产量低(＜0.4g/g)和终产物浓度低(＜30g/L)的限制，使得产物回收困难和生产不经济。许多研究已经针对了提高细胞密度、反应器生产力和最终的丁酸浓度，但只获得了有限的成功。此外，丁酸不是唯一的发酵产物。还产生了醋酸作为副产物，其不仅降低了丁酸产量，而且使得终产物回收更困难，变得更有挑战性。

丙酸和丁酸发酵中的一个常见问题是醋酸盐的共同产生，这不仅降低了主要发酵产物的产量，而且使得产物纯化变得困难。如果通过代谢工程化将底物碳重新分配，从葡萄糖的丙酸和丁酸产量可以得到很大程度的提高。例如，丙酸发酵途径的化学计量分析表明通过HMP(磷酸己糖)和/或EMP途径分解代谢的葡萄糖百分比对丙酸盐产生、醋酸盐产生和三磷酸腺苷(ATP)产生具有意义深远的影响，并且如果通过HMP途径涉及更多葡萄糖，通常可以产生更多丙酸盐，降低醋酸盐产生。然而，这是以较低的ATP产生为代价的。由于能量因素，细菌自然将不会采用该途径，但如果阻断丙酮酸盐氧化成醋酸盐，可以强迫其进行该途径。

如果HMP途径产生的CO₂可以通过磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶重新引入二羧酸途径中，丙酸盐产量可以得到进一步的提高。相似地，丁酸发酵中的醋酸盐产生在氧化还原平衡和ATP产生中起着关键作用，但可以通过将碳流量重新引向丁酸盐产生途径来降低。因此，灭活醋酸盐形成途径中的基因对于提高这些厌氧发酵中的丙酸盐和丁酸盐产量是一种可行的方法。

发展了整合(integrational)诱变技术来破坏酪丁酸梭菌和产丙酸丙酸杆菌(P.acidipropionici)中的醋酸激酶(ack)和磷酸转乙酰酶(pta)基因。参见，Y.Zhu，X.Liu和S.T.Yang，Construction and Characterization of pta Gene Deleted Mutant of Clostridium tyrobutyricum for Butyric Acid Fermentation(用于丁酸发酵的酪丁酸梭菌的pta基因缺失突变株的构建和表征)，Biotechnol.Bioeng.，90：154-166(2005)；X.Liu，Y.Zhu和S.T.Yang，Construction and Characterization of ack Deleted Mutant of Clostridium tyrobutyricum for Enhanced Butyric Acid and Hydrogen Production (用于提高的丁酸和氢产生的酪丁酸梭菌的ack缺失突变株的构建和表征)，Biotechnol.Prog.，22(5)：1265-1275(2006)；和S.Suwannakham，Y.Huang和S.T.Yang，Construction and Characterization of ackKnock-out Mutants of Propionibacterium acidipropionici for Enhanced Propionic Acid Fermentation(用于提高的丙酸发酵的产丙酸丙酸杆菌的ack敲除突变株的构建和表征)，Biotechnol.Bioeng.，94(2)：383-395(2006)。将含有ack或pta基因片段和抗生素抗性盒的非复制性整合质粒构建体引入细胞中，并且作为质粒整合至染色体上的同源性片段中的结果，发生了ack或pta的灭活。

因此，与其野生型相比，如在对应的突变株中所预期的那样，最终的丁酸盐和丙酸盐浓度和生产力提高，而细胞生长速率明显降低。终产物浓度仍然低于约50g/L，并且低于经济的商业规模回收和纯化的极限。突变细菌降低的细胞生长速率也将限制它们在常规发酵方法中的应用。基因敲除提高了细胞对代表性突变株的丁酸盐和丙酸盐的耐受性，但没有消除醋酸盐产生。

有机酸发酵中的一个主要限制是由产物抑制引起的低终产物浓度(细菌的低酸耐受性)。怎样提高细胞对毒性副产物的耐受性成为了许多发酵方法中的主要问题。然而，与常规丙酸和丁酸发酵(以及许多其他羧酸发酵)相关的一些问题，包括酸耐受性低，可以通过细胞固定化得到部分解决。在Yang，美国专利No.5,563,069中，研发了用于几种有机酸发酵的纤维-床固定化-细胞反应器(FBB)，其提供了提高的生产力、产量和产物浓度。

使用FBB导致终产物浓度比常规游离细胞发酵方法中的终产物浓度高2至3倍，不仅因为FBB中较高的细胞密度，而且通过培养物的适应以对发酵产物更耐受。这种通过纤维床生物反应器中同时的适应和突变的过程工程化方法给获得适于从生物质工业化生产有机酸并具有高酸耐受性和发酵能力的突变株提供了一条途径。FBB也使得使用慢生长或非生长性固定化细胞以高发酵速率和高产量来生产丙酸盐和丁酸盐成为可能。参见，Y.Zhu和S.T.Yang，Enhancing Butyric Acid Production with Mutants of Clostridium tyrobutyricum Obtained from Metabolic Engineering and Adaptation in a Fibrous-Bed Bioreactor (在纤维床生物反应器中使用获自代谢工程化和适应的酪丁酸梭菌突变株来提高丁酸生产)，在B.C.Saha(编辑)，“FermentationBiotechnology(发酵生物技术)”中，ACS Symposium Series No.862，American Chemical Society(2003)，pp.52-66Y；Zhu，Z.Wu和S.T.Yang，Butyric Acid Production from Acid Hydrolysate of Corn Fiberby Clostridium tyrobutyricum in a Fibrous Bed Bioreactor(在纤维床生物反应器中通过酪丁酸梭菌从玉米纤维的酸水解产物生产丁酸)，Process Biochemistry，38：657-666(2002)；Y.Zhu和S.T.Yang，Adaptation of Clostridium tyrobutyricum for Enhanced Toleranceto Butyric Acid in a Fibrous-Bed Bioreactor(在纤维床生物反应器中用于提高的丁酸耐受性的酪丁酸梭菌的适应)，Biotechnol.Progress，19：365-372(2003)，和S.Suwannakham和S.-T.Yang.Enhanced Propionic Acid Fermentation by Propionibacteriumacidipropionici Mutant Obtained by Adaptation in a Fibrous-BedBioreactor(在纤维床生物反应器中使用通过适应获得的产丙酸丙酸杆菌突变株提高的丙酸发酵)，Biotechnol.Bioeng.，91：325-337.(2005)。然而，再一次地，终产物浓度仍然低于约50g/L，并且低于经济的商业规模回收和纯化的极限。

因此，对生产有机酸的方法，并且更特别地，对使用厌氧细菌通过发酵以在允许经济的商业规模的有机酸产物回收和纯化的生长速率、产量和产物浓度下生产丁酸、丙酸和醋酸的方法，仍然存在着需求。

本发明的实施方案通过提供生产有机酸的方法，更具体地，通过提供使用厌氧细菌通过发酵以在允许经济的商业规模的有机酸产物回收和纯化的生长速率、产量和产物浓度下生产丁酸、丙酸和醋酸的方法，来满足这种需求。

根据一个实施方案，提供了有机酸生产的发酵方法，并且包括提供代谢上工程化的突变细菌，其使得ack和pta基因中的一个或两个已经被破坏，通过使该突变细菌固定化同时将该突变细菌暴露于可发酵底物使该突变细菌适应以提高它们对酸的抵抗力和提高它们的生长速率，并进一步将适应的突变细菌暴露于可发酵底物足够长的时间，以提供高于约50g/L的最终有机酸发酵产物浓度。

在一个实施方案中，突变细菌包括酪丁酸梭菌PAK-Em，并且有机酸发酵产物包括丁酸和氢。可发酵底物包括糖或其他碳底物。在优选的形式中，糖选自葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖及其混合物。碳底物可以选自如乳酸盐和甘油这样的来源。

在另一个实施方案中，突变细菌包括酪丁酸梭菌HydEm，并且有机酸发酵产物包括丁酸和氢。可发酵底物包括糖。

在另一个实施方案中，突变细菌包括酪丁酸梭菌PPTA-Em，并且有机酸发酵产物包括丁酸和氢。可发酵底物包括糖。

在再一个实施方案中，突变细菌包括产丙酸丙酸杆菌ACK-Tet，并且有机酸发酵产物包括丙酸。可发酵底物包括糖。或者，可发酵底物包括甘油。

在再一个实施方案中，突变细菌包括产丙酸丙酸杆菌TAT-ACK-Tet，并且有机酸发酵产物包括丙酸。可发酵底物包括糖。或者，可发酵底物包括甘油。

通过使用代谢和过程工程化技术的结合，已经研发了酸耐受性细菌菌株用于发酵过程，以在之前使用其他方法不可获得的生长速率、产物产量和终产物浓度下来生产有机酸。终产物浓度超过有机酸产物的经济回收和纯化需要的极限，这些有机酸产物包括丙酸和丁酸。在优选的实施方案中，获得高于80g/L的终产物浓度，使得可以从发酵液中经济地回收和纯化。

这种代谢和过程功能化的结合明显地提高了细菌菌株的酸耐受性，这是只使用固定化野生型细菌菌株或通过单独的遗传工程化不可能获得的。只有使用技术的组合才可以在纤维床生物反应器中的刺激环境中在方法上诱导细菌菌株，以使其对发酵的有机酸产物变得非常耐受。基于本领域之前的知识，这样的结果是不可预测的。

根据本发明的实施方案，将细菌细胞固定于纤维基质中的纤维床生物反应器(FBB)可以用于有机酸的生产，包括醋酸、丙酸和丁酸。使用固定于反应器的纤维基质中的高细胞密度，与常规无细胞发酵方法相比，将提高生产力、终产物浓度和产物产量。将代谢工程化菌株固定于纤维床反应器中给细胞提供了快速适应的环境，并提供了富集的对抑制性发酵产物具有高耐受性的培养物。这导致了终产物浓度增加，超过了可以经济回收和纯化发酵液中的有机酸的极限水平。

在优选的实施方案中，利用代谢工程化来至少部分地破坏细菌中的醋酸盐形成途径，以进一步提高分别通过酪丁酸梭菌和产丙酸丙酸杆菌的丁酸和丙酸生产。将细菌基因组上的醋酸激酶(ack)和/或磷酸转乙酰酶(pta)基因部分灭活(即，破坏)，以降低细菌的醋酸盐产生。突变分别导致酪丁酸梭菌的丁酸生产提高和产丙酸丙酸杆菌的丙酸生产提高。

通过将工程化细胞固定化并使其在纤维床反应器中适应来提高和恢复细胞生长速率和提高发酵性能来解决由于机械工程化细菌菌株降低的醋酸盐和能量产生引起的生产速率降低。通过固定于纤维床生物反应器中来同时进行细菌菌株的适应和突变提供了获得适于以工业规模从糖和生物质生产有机酸(包括丁酸和丙酸)的突变菌株。代谢工程化突变细菌菌株在纤维床反应器中的按序适应提供了经济而有效的从生物质生产有机酸的方法。从以下的详述、附图和所附的权利要求，本发明实施方案的这些和其他特征和优点将变得清楚。

图1(现有技术)描绘了通过产丙酸丙酸杆菌发酵丙酸的二羧酸途径。

图2(现有技术)描绘了通过酪丁酸梭菌发酵丁酸的代谢途径。

图3是相对生长速率(％)与丁酸盐浓度的图表，显示了丁酸对酪丁酸梭菌野生型、突变株PAK-Em和突变株PPTA-Em的细胞生长的抑制作用。在此使用了在零丁酸盐浓度下的相对比生长速率为100％，用于野生型和突变株之间更容易的比较。

图4是酪丁酸梭菌突变株PAK-Em的固定化细胞在纤维床反应器中在37℃和pH6.3下发酵的浓度(g/L)与时间(小时)的图表，发酵使用葡萄糖作为底物。

图5是酪丁酸梭菌突变株PAK-Em的游离细胞在37℃和pH6.0下发酵的浓度(g/L)与时间(小时)的图表，发酵使用含有葡萄糖和果糖的葡萄汁作为底物。

图6是使用固定于纤维床反应器中的产丙酸丙酸杆菌ACK-Tet细胞的长期葡萄糖丙酸发酵的浓度(g/L)与时间(小时)的图表，发酵在pH6.5，32℃下进行。

图7是在pH6.5，32℃下，无细胞培养物中各种产丙酸丙酸杆菌菌株的相对比生长速率与丙酸浓度(g/L)的图表。

图8是使用固定于FBB中的产丙酸丙酸杆菌ACK-Tet细胞的长期甘油丙酸发酵的浓度(g/L)与发酵时间(小时)的图表，发酵在pH7.0，32℃下进行。

丁酸发酵

许多丁酸细菌，包括酪丁酸梭菌，从乳酸盐和碳水化合物底物(包括源自淀粉和木质纤维材料的葡萄糖和木糖)产生丁酸盐、醋酸盐、H₂和CO₂作为主要发酵产物。为了改进丁酸生产的发酵方法，将代谢工程化和过程工程化技术按序结合应用于研发具有高酸耐受性以及从葡萄糖和木糖产生更高含量的丁酸和氢的能力的突变细菌菌株。

酪丁酸梭菌的代谢工程化

如图1中所示，用于酪丁酸梭菌和丙酮丁酸梭菌的丁酸盐和醋酸盐产生的代谢途径已经得到了彻底的研究。通常，通过EMP(Embden-Meyerhof-Parnas)途径将葡萄糖催化成丙酮酸盐，并通过HMP(磷酸己糖)途径将木糖催化成丙酮酸盐。丙酮酸盐随后氧化成乙酰-CoA和二氧化碳，伴随铁氧化还原蛋白(Fd)还原成FdH₂，其随后通过氢化酶氧化成Fd，产生氢并将NAD⁺转化成NADH。乙酰-CoA是从通过磷酸转丁酰酶(PTB)和丁酸激酶(BK)催化的丁酸盐-形成分支分出通过磷酸转乙酰酶(PTA)和醋酸激酶(AK)催化的醋酸盐-形成分支的节点处的关键代谢中间产物。理想的是减少发酵中的醋酸盐产生，使得丁酸盐的产生得到相应地提高。通过灭活细菌醋酸盐形成途径中的基因使这成为可能。

已经从几种微生物(包括大肠杆菌、嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)和丙酮丁酸梭菌)克隆了编码AK的ack基因和编码PTA的pta基因，并进行了测序和表征。如下通过PCR扩增获得酪丁酸梭菌中ack和pta基因的部分DNA序列：基于已知的来自大肠杆菌、丙酮丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌的克隆ack和pta基因序列以及酪丁酸梭菌的密码子使用偏好来设计用于PCR的引物。用于ack基因的PCR引物序列为5’-GAT AC(A/T)GC(A/T)TT(C/T)CA(C/T)CA(A/G)AC-3’和5’-(G/C)(A/T)(A/G)TT(C/T)TC(A/T)CC(A/T)AT(A/T)CC(A/T)CC-3’。用于pta基因的引物序列为5’-GA(A/G)(C/T)T(A/T/G)AG(A/G)AA(A/G)CA(T/C)AA(A/G)GG(A/T)ATG AC-3’和5’-(A/T)GCCTG(A/T)(G/A)C(A/T)GC(A/T/C)GT(A/T)AT(A/T)GC-3’。使用酪丁酸梭菌基因组DNA作为模板和设计的寡核苷酸作为引物，在DNA机中进行了扩增，以获得分别具有预期560bp和730bp大小的ack和pta的DNA片段，然后使用TA克隆克隆至PCR载体pCR2.1中，并测序来证实它们的同一性。

然后构建携带部分pta或ack基因的非复制性质粒，用于整合诱变来形成pta或ack敲除突变株。从分别含有ack和pta部分基因的质粒pCR-AK(4.5kb)和pCR-PTA(4.65kb)除去1.5kb Sph I片段，并将载体重新连接来形成pCR-AK1和pCR-PTA1。从pDG 647除去含有1.6kb HindIII片段的Em^r盒，然后连接Hind III消化的pCR-AK1和pCR-PTA1。将所得到的质粒，pAK-Em(4.6kb)和pPTA-Em(4.75kb)，用作基因灭活的整合质粒。

通过电穿孔将质粒DNA(pAK-Em或pPTA-Em)引入酪丁酸梭菌中，通过在含有Em作为选择压力的琼脂平板上培养来选择突变细胞，这些细胞具有整合至其染色体中的非复制性质粒。在厌氧室中使用Bio-Rad基因脉冲装置进行整合质粒至酪丁酸梭菌中的转化。如下制备酪丁酸梭菌的全能细胞：过夜生长后，将5ml后对数生长期培养物用于接种40ml补充了40mM DL-苏氨酸的CGM。使细胞生长4小时以达到～0.8OD₆₀₀，然后收集，洗涤两次并悬浮于冰冷电穿孔缓冲液中(SMP；270mM蔗糖，7mM磷酸钠，pH7.4，1mM MgCl₂)。将0.4cm电穿孔试管中的0.5ml细胞悬浮液在冰上冷却5分钟，将10～15μg质粒DNA(pAK-Em或pPTA-Em)加入悬浮液中并彻底混合。应用脉冲后(2.5kV，600Ω，25μF)，将细胞转移至5ml CGM中，并在涂布于含有40μg/ml Em的RCM之前在37℃下培养3小时。

获得分别具有灭活ack和pta的两个突变株PAK-Em和PPTA-Em，并且研究了这些突变对酶活性和发酵动力学的影响。收集酪丁酸梭菌野生型、PAK-Em和PPTA-Em的指数期培养物，并且测试细胞提取物的产醋酸和产丁酸酶(AK、PTA、BK、PTB)。PAK-Em呈现出比野生型低54％的AK活性和高大约130％的PTA活性。但在PAK-Em和野生型中，产丁酸酶的活性大致相同。与野生型相比，PPTA-Em只具有20～40％的AK和PTA活性，135％的BK活性和相似的PTB活性。

在5L搅拌罐发酵器中，在含有葡萄糖(30g/L)和40μg/ml红霉素(Em)的梭菌生长培养基中，分别进行了酪丁酸梭菌野生型、PAK-Em和PPTA-Em游离细胞的分批和加料-分批发酵，以研究ack/pta敲除突变对发酵动力学的作用。通过最初时用氮喷射培养基来达到厌氧。用6NHCl将培养基pH调节至～6.0，接着接种～100ml在血清瓶中制备的细胞悬浮液。在37℃，150rpm下进行实验，并通过加入NH₄OH或NaOH来控制pH6.0。在发酵液中的糖水平接近零时，通过脉冲加入浓缩的底物溶液来运行加料-分批模式。持续进料，直至由于产物抑制引起的发酵停止产生丁酸盐。将Micro-oxymax气体分析系统连接发酵器，以自动测量气体(H₂和CO₂)产生。通过光密度(OD)测量分析了发酵液样品的细胞密度，并通过使用高性能液相色谱分析了葡萄糖和酸产物浓度。将结果用于估算比生长速率(μ)和产物产量，并在下表中，对野生型和两个突变株进行了比较。

表1.在pH6.0，37℃下使用酪丁酸羧酸野生型和突变株的游离细胞的葡萄糖加料-分批发酵的动力学。

如表1中所看到的，两个突变株的生长都比野生型慢，但产生更多的丁酸来达到～43g/L的高终浓度，这比野生型发酵获得的高～50％。然而，灭活pta或ack基因没有明显降低发酵中的醋酸盐产生，表明也导致醋酸形成的其他酶(或途径)的存在。无论如何，两个突变株都显示出高于醋酸盐产生的较高特异性的丁酸盐产生，如发酵产物中提高的丁酸盐比醋酸盐比例所示的。提高的丁酸盐比醋酸盐比例表明ack和pta缺失将更多的碳流量转移至丁酸盐产生，导致较高的丁酸盐生产力和产量。ack缺失的突变株PAK-Em将野生型中34％的丁酸盐产量提高至47％。出乎意料地，PAK-Em突变株比野生型从葡萄糖产生了多50％的氢(0.024g/g)。pta缺失的突变株PPTA-Em也具有较高的丁酸盐产量，但氢产量略低于野生型。

尽管与野生型相比，相应的酶活性降低了超过50％，但通过使用整合质粒灭活ack或pta基因没有消除或明显减少醋酸盐形成。可能是其他酶(如丁酸产生酶PTB和BK)引起了发酵过程中突变株酪丁酸梭菌的一些醋酸盐形成。与野生型相比，两个突变株的比生长速率都降低了约32％，表明由于每摩尔代谢的底物降低的ATP产生，通过醋酸盐产生途径减少的碳流量给细胞强加了代谢负担。通过丁酸盐形成途径增加的碳流量，其产生了较低的ATP/摩尔碳底物，缓解了该问题，但不能弥补受损醋酸盐途径中损耗的所有ATP。因此，突变株生长比野生型慢得多。降低的细胞生长速率限制了这些突变株在用于丁酸生产的工业发酵中的应用。

两个突变株显示出对丁酸盐抑制更高的耐受性，如通过较高终丁酸盐浓度所示的，其比野生型高～50％。增强的丁酸盐耐受性也有助于发酵中较高的丁酸盐生产力。发现酪丁酸梭菌中的PTA比PTB受到丁酸更强烈的抑制。可能是破坏丁酸盐敏感性PTA和醋酸盐形成途径使得突变株对丁酸盐抑制不太敏感，因为突变株主要使用丁酸盐形成途径来产生生物合成和维持穿过细胞膜的功能性pH梯度所需的ATP。尽管使用突变株的发酵中的终丁酸浓度可以达到～43g/L，但在该浓度水平下，用于产物回收和纯化的能量成本仍然高。通常，需要至少50g/L或更高的产物浓度，以使得有机酸发酵在经济上能与石油化学合成方法相竞争。

纤维床生物反应器中的培养物适应和发酵

在实验室规模的纤维床生物反应器(FBB)中培养细胞，该反应器是由玻璃柱制得的，并用螺旋创伤棉毛巾包裹。反应器具有480ml工作体积，并通过再循环环连接5L搅拌罐发酵器，并在充分混合的条件下使用pH和温度控制来运行。通过最初时用N₂喷射发酵器中的培养基，然后在整个发酵运行过程中将发酵器顶部空间维持在5psig N₂下来维持厌氧。将含有2L培养基的反应器维持在37℃下，在150rpm下搅拌，并通过添加NH₄OH或NaOH将pH控制在6.0。为了启动发酵，将血清瓶中～100ml的细胞悬浮液接种发酵器并使其生长3天直至细胞浓度达到～4.0的光密度(OD)。然后通过将发酵液以～25ml/分钟的泵动速率通过纤维床循环，使细胞附着并固定于纤维基质上，来进行细胞固定化。在连续循环约36～48小时后，大部分细胞得到固定并且鉴定培养基中的细胞密度没有变化。然后将培养基循环速率提高至～100ml/分钟，并以重复的分批模式来运行反应器，以将纤维床中的细胞密度提高至稳定的高水平(＞50g/L)。为了使培养物适应以耐受较高的丁酸盐浓度，然后无论何时发酵液中的糖水平接近零时，通过脉冲添加浓缩的底物溶液以加料-分批模式来运作反应器。持续加料直至由于产物抑制引起的发酵停止产生丁酸盐。分析样品的细胞、底物和产物浓度。在加料-分批实验结束时，通过从纤维基质上洗脱来收集FBB中的固定化细胞并在4℃下存储。

进行加料-分批发酵，以使细菌培养物适应更高的丁酸盐浓度，并评价发酵中可以产生的最大丁酸浓度。在该研究中使用了酪丁酸梭菌ATCC 25755(野生型)。还进行了使用游离细胞的对照实验，用于比较目的。表2比较了分别通过游离细胞和固定化细胞，在pH6.0下，从葡萄糖和木糖产生丁酸的发酵动力学。与游离细胞发酵相比，FBB中的固定化细胞发酵不仅较快，而且以高得多的终浓度来产生更多丁酸盐。游离细胞发酵中产生的最高丁酸浓度仅为～19g/L，而在固定化细胞发酵中丁酸达到了～40g/L的浓度。固定化细胞发酵中，来自葡萄糖和木糖的丁酸盐产量也比无细胞发酵中的那些高得多。然而，在固定化细胞发酵中也产生了更多的醋酸盐。醋酸和丁酸的共同产生使得从发酵液中分离和纯化丁酸变得复杂。因此，理想的是降低FBB中固定化细胞发酵的醋酸盐产生。降低醋酸盐产生不仅有助于下游加工，而且可以提高来自糖的丁酸盐产生和产量。

表2.在pH6.0，37℃下，通过酪丁酸梭菌ATCC 25755野生型游离细胞和固定化细胞的葡萄糖和木糖发酵的动力学。

¹固定化细胞发酵的生产力是基于400mL容积的纤维床生物反应器，而不是反应器系统中总共2L的液体培养基体积。

已知丁酸抑制细胞生长。与原始培养物相比，来自FBB的适应培养物的比生长速率高得多，并且对丁酸盐浓度提高不太敏感，表明对丁酸盐更高的耐受性。当丁酸盐浓度从零提高至30g/L时，适应细胞保持了其超过50％的生长能力，而原始培养物在丁酸盐浓度超过20g/L时失去了生长能力。可以通过以下非竞争性产物抑制模型来描述丁酸盐对细胞生长的影响：

μ = \frac{μ_{\max} K_{P}}{K_{P} + P}

或

\frac{1}{μ} = \frac{1}{μ_{\max}} + \frac{1}{μ_{\max} K_{P}} P

其中μ是比生长速率(h^-1)，μ_max是最大生长速率，K_P是抑制率常数(g/L)，而P是产物(丁酸)浓度(g/L)。可以从1/μ相对于P的线性图中确定动力学常数μ_max和K_P。与原始培养物相比，适应培养物不仅具有较高的μ_max(0.298h^-1相对于0.127h^-1)，而且还具有高得多的K_P值(53.89g/L相对于1.87g/L)。K_P值的29倍提高清楚地表明了来自FBB的适应培养物对丁酸盐抑制没有原始野生型那样敏感。在使用不同微生物(包括用于醋酸盐生产的蚁酸醋酸梭菌(C.formicoaceticum)和用于丙酸生产的产丙酸丙酸杆菌)的其他研究中，也观察到了在FBB中适应的培养物对产物抑制提高的生长耐受性。

来自FBB的适应培养物在生理上不同于用于接种生物反应器的原始培养物。通过在纤维床生物反应器(FBB)中的固定，在短期内实现了成功地适应和选定可以从葡萄糖和木糖产生高浓度丁酸盐的酪丁酸梭菌的酸耐受性菌株。该突变株在高丁酸盐浓度(＞30g/L)下生长良好，并且与用于接种生物反应器的野生型菌株相比，具有更高的发酵能力。对细胞生长、酸形成酶和ATP酶活性的丁酸盐抑制的动力学分析表明了来自FBB的适应细胞在生理上不同于原始的野生型。与野生型相比，适应培养物的最大比生长速率提高了2.3倍，对丁酸盐抑制的生长耐受性提高了29倍(基于K_P值)。丁酸形成途径中的关键酶，磷酸转丁酰酶(PTB)和丁酸激酶(BK)，在突变株中活性也更大，PTB活性高175％，而BK活性高146％。此外，突变株的ATP酶对丁酸抑制的敏感性较低，如通过抑制率常数提高4倍所示，并且对酶抑制剂N，N’-二环己基碳二亚胺(DCCD)的抵抗力更高。ATP酶对丁酸盐抑制较低的敏感性可能有助于提高的对丁酸盐抑制的生长耐受性，这也可能归因于膜磷脂中较高百分比的饱和脂肪酸(突变株中的74％相对于野生型中的69％)。该研究表明了FBB中的细胞固定化给对抑制性发酵产物具有较高耐受性的突变株的进行中适应和选择提供了有效的方法。

然而，使用酪丁酸野生型的FBB发酵中产生的最终丁酸浓度仍然低于50g/L，这通常是发酵生产的有机酸的经济回收和纯化需要的极限水平。因此，进行了下一系列的实验，这一系列的实验目标在于研发可以用于经济地生产浓度高于50g/L的丁酸盐并具有高产物产量和生产力的极端酸耐受性突变株。

使用固定于纤维床生物反应器中的PPTA-Em和PAK-Em突变株进行了丁酸发酵。如在表3和4中可以看到的，从葡萄糖和木糖的丁酸产生明显高于游离细胞发酵的，并且这些加料-分批发酵中的最终丁酸浓度达到了～50g/L，丁酸盐产量也提高至～0.45g/g。FBB发酵中改善的发酵性能也优于使用野生型获得的，产生了～40g/L的最终丁酸盐浓度和～0.42g/g的丁酸盐产量(参见表2)。固定化PPTA-Em细胞相对于低的比生长速率可能是由于FBB环境中高细胞密度的生长抑制引起的。

表3.在37℃，pH6.0下，通过酪丁酸梭菌PPTA-Em游离细胞和固定化细胞的葡萄糖和木糖发酵的动力学。

表4.在37℃，pH6.0下，通过酪丁酸梭菌PAK-Em游离细胞和固定化细胞的葡萄糖和木糖发酵的动力学。

除了提高的丁酸产生外，在使用ack-缺失的酪丁酸梭菌突变株PAK-Em的所有发酵中还观察到更多的氢产生，这显示出与野生型和PPTA-Em相比高得多的氢产生。不知道为什么该突变株也可以产生更多的氢，氢是有价值的生物燃料。进一步研究了在各种pH值下，使用PAK-Em发酵从各种糖源同时产生丁酸和氢的潜能，并且将结果概括于表5中。

如所预期的，从葡萄糖生产丁酸受到pH的显著影响；在pH5.0下，丁酸生产为50.1g/L，在pH7.0下，为61.5g/L，并且在pH5.0下，只有14.8g/L。pH5.0下的低丁酸产生是由低pH值下更强的丁酸抑制引起的。pH7.0下的丁酸浓度高于pH6.0的也在预期之内，因为在较高的pH下，更多的丁酸以解离的形式存在，这对细胞生长的抑制较少。令人惊讶地，将发酵pH从6.0略升至6.3时，达到了80.2g/L这一非常高的丁酸浓度(参见图4)。正常地，不会预料到随着这么小的pH变化会有这种巨大的改善。然而，pH和较高的丁酸盐浓度没有明显影响产物产量，在所研究的所有pH值下，丁酸为约0.44±0.02g/g，醋酸为约0.07±0.01g/g。随着pH递增，氢产生似乎略有提高，氢产量从pH5.0下的0.022g/g至pH7.0下的0.027g/g。所观察到的较高pH值下较低的CO₂产生归因于在较高pH值下，CO₂在培养基中的溶解度较高。

表5.在37℃和各种pH值下，在FBB中通过依赖于葡萄糖生长的酪丁酸梭菌突变株PAK-Em的固定化细胞发酵的动力学数据。

然而，在使用木糖作为底物的FBB发酵中，pH对各种代谢产物的产生具有明显的作用。在pH5.0下，PAK-Em突变株只产生丁酸，而野生型产生了大量的醋酸盐(0.43g/g木糖)和乳酸盐(0.61g/g木糖)，以及少量的丁酸盐(0.05g/g木糖)。该结果表明了PAK-Em将是良好的丁酸盐生产者，即使是在5.0的低pH值下，而野生型则不是，因为存在明显的由低pH引起的远离丁酸盐产生的代谢途径转移。

表6.在37℃和pH5.0下，通过酪丁酸梭菌野生型和PAK-Em的葡萄糖和木糖的固定化细胞发酵。

na：数据不可获得

如之前所讨论的，使用ack或pta基因敲除的突变的一个负面影响是明显降低的细胞生长速率，这是由于由受损的醋酸盐形成途径引起的降低的每摩尔底物的ATP产生引起的。然而，在FBB中培养PAK-Em突变株延长的时间段后，从FBB分离出的一个适应突变株(HydEm)显示出与野生型相当的比生长速率，而且仍然可以产生比野生型及其亲本株PAK-Em更多的丁酸盐和氢(参见表7)。获得该HydEm突变株的程序如下。通过六次加料-分批发酵的适应后，收集FBB中的PAK-Em细胞。在高压下从纤维基质洗脱适应细胞，然后涂布于琼脂平板上，以分离具有较高生长速率的菌落。选择了一个适应突变株HydEm，并且在pH6.0和37℃下使用葡萄糖作为底物的游离细胞发酵中来表征。如在表7中可看到的，该突变株的比生长速率(0.21h^-1)比亲本株PAK-Em的(0.14h^-1)快得多，并且与野生型的相似。HydEm的游离细胞发酵中的细胞密度(OD₆₀₀＝11.5)比PAK-Em(OD₆₀₀＝4.4)和野生型(OD₆₀₀＝7.1)的高得多。HydEm的生物质产量(0.14g/g)也比野生型(0.10g/g)和PAK-Em(0.064g/g)的高。此外，该突变株的氢产生也明显提高，具有高得多的氢产量(0.04g/g相对于0.24g/g)和较高的H₂/CO₂比(2.69相对于1.44)。该结果从现有的知识是不可预测的，并且表明提高的氢产生和细胞生长可以结合在一起。

表7.在37℃，pH6.0下，通过酪丁酸梭菌野生型、PAK-Em和适应突变株HydeEm的游离细胞的葡萄糖发酵的动力学。

PAK-Em中ack基因的破坏降低了通过PAT-AK途径的碳流量，并因此迫使细胞增加氢产生，以补偿一些损耗的能量产量和平衡氧化还原电势。因此，ack-缺失突变株必须产生更多的氢，以维持良好的生长速率，所观察到的FBB适应突变株HydEm更高的生长速率和氢产生很好地证实了这一点。由于相对快的生长速率以及高产物产量和酸耐受性，该HydEm突变株具有最大的从生物质产生丁酸盐和氢的潜能。显然，使用代谢工程化和环境适应的酪丁酸梭菌突变株的发酵具有优于野生型和源自只进行了遗传工程化或环境适应而没有适当的两者按序组合的突变株的优势。这些实验清楚地显示出目标基因的理性代谢工程化可以产生一定的正面结果，但由于发酵中涉及的不清楚和复杂的途径，通常也导致不可预料的结果。

总而言之，从整合诱变获得分别编码醋酸激酶和磷酸转乙酰酶的ack和pta基因灭活的酪丁酸梭菌突变株PAK-Em和PPTA-Em，并可以用于FBB发酵中，以从糖(包括葡萄糖和木糖)生产高浓度和高产量的丁酸和氢。PAK-Em突变株是较好的一个菌株，具有较高的氢产生，并且该菌株的适应突变株(HydEm)在游离细胞发酵条件下显示出良好的生长速率。在pH6.3下，使用PAK-Em的FBB发酵获得了迄今为止对于丁酸发酵所报道的最高丁酸浓度。之前的最好结果为：从蔗糖，62.8g/L，从木糖，57.9g/L，从葡萄糖，50.1g/L。来自发酵的较高丁酸浓度明显降低了产物回收和纯化成本，这通常占据超过50％的总生产成本。

尽管所有之前的发酵实验使用了纯葡萄糖或木糖作为底物，但使用所公开的发酵方法，食物加工废料和木质纤维水解产物中存在的糖也可以容易地转化成丁酸和氢。例如，来自葡萄酒制造的废葡萄汁中存在的糖(葡萄糖和果糖)可以用作发酵底物，并且在pH6.0和37℃下的游离细胞发酵从这些糖产生了～40g/L丁酸，具有高产量的丁酸(0.42g/g)和氢(～0.024g/g)(参见图5)。

丙酸发酵

使用固定于纤维床生物反应器(FBB)中的细胞进行了丙酸发酵，该生物反应器通过再循环环连接5-L发酵器，并在充分混合的条件下，使用pH和温度控制来运行。通过将螺旋创伤棉毛巾包装至玻璃柱生物反应器中来构建FBB，并具有～690mL的工作容积。将～100mL细胞悬浮液(OD₆₀₀～2.0)接种于发酵器中后，使细胞生长3-4天，以达到～3.5的光密度(OD₆₀₀)。然后将发酵液以～30mL/分钟的流速通过FBB循环，以使细胞粘附并固定于纤维基质中。将该过程持续60-72h，直至大部分细胞固定于FBB中。然后将培养基循环速率提高至～80mL/分钟，并且以重复的分批模式来进行发酵，以在纤维床中获得高细胞密度。然后进行使用脉冲添加浓缩葡萄糖溶液的加料-分批发酵，来研究发酵动力学和评价可获得的最大丙酸浓度。在加料-分批发酵结束时，通过在无菌过滤水中涡旋基质，从纤维基质中取出在FBB中的适应细胞(突变株)。

研究了在游离细胞悬浮液培养物和固定于纤维床生物反应器(FBB)中的产丙酸丙酸杆菌ATCC 4875的葡萄糖加料-分批发酵。后者产生了高得多的丙酸浓度(～72g/L相对于～52g/L)，表明了在FBB中适应的细胞提高了对丙酸抑制的耐受性。与游离细胞发酵相比较，从葡萄糖FBB培养物产生了多20％-59％的丙酸盐(0.40-0.65g/g相对于0.41g/g)，少17％的醋酸盐(0.10g/g相对于0.12g/g)和少50％的琥珀酸盐(0.09g/g相对于0.18g/g)。FBB中较高的丙酸盐产生归因于两个关键酶草酰乙酸转羧酶和丙酰CoA：琥珀酰CoA转移酶的突变，这两种酶导致从丙酮酸盐产生丙酸。两者在突变株中都显示出高于野生型的比活性和低于野生型的对丙酸抑制的敏感性。相反，将PEP直接转化成草酰乙酸盐并导致从葡萄糖产生琥珀酸盐的PEP羧化酶的活性通常是突变株的低于野生型的。然而，对于醋酸盐形成途径中的磷酸转乙酰酶和醋酸激酶，突变株和野生型之间不存在明显的差异。此外，突变株的形态具有明显的改变。长度增加了三倍，直径降低了～24％，突变株细胞具有高～10％的比表面积，这应当使得突变株在通过细胞膜转运底物和代谢产物时更有效。突变株中发现的略低的膜结合ATP酶活性也表明了突变株可能具有更有效的质子泵，使其更好地耐受丙酸。此外，突变株具有更多的长链饱和脂肪酸(C17:0)和较少的不饱和脂肪酸(C18:1)，两者都降低了膜流动性，并因此也可能引起提高的丙酸盐耐受性。因此，通过产丙酸丙酸杆菌从葡萄糖增强的丙酸生产归因于反应器中维持的高活细胞密度和通过FBB中的细胞固定化适应获得的有利突变。

产丙酸丙酸杆菌从葡萄糖产生丙酸，醋酸、琥珀酸和CO₂为副产物。通过基因破坏和整合诱变的编码醋酸激酶(AK)的ack基因的灭活用作降低丙酸发酵中醋酸盐形成的方法。使用基于PCR的方法，使用简并引物，克隆了产丙酸丙酸杆菌中～750bp的部分ack基因，并测序。推算出的氨基酸序列与来自枯草芽孢杆菌的AK的氨基酸序列具有88％的相似性和76％的同一性。如下，使用插入的四环素抗性盒和含有四环素抗性基因盒的非复制性整合质粒，将部分ack基因用于构建线性DNA片段。

通过将四环素抗性(Tet^r)盒插入获自产丙酸丙酸杆菌的部分ack序列的中间来构建ack基因被破坏的线性DNA片段。首先将750-bp ack片段克隆至pNo TA/T7(克隆载体，2.7kb)中，以获得pACK(3.5kb)。然后将Tet^r盒插入XmaIII位点，其粘性端与NotI的互补，NotI是用于从pBEST309中释放出Tet^r盒的位点。通过连接Tet^r盒和含有部分ack片段的XmaIII切割的pACK质粒来获得pACK-Tet(5.4kb)。Tet^r盒的插入在插入盒的每个末端形成了400-bp和350-bp ack片段。没有常用的限制酶可以用于从pACK-Tet释放完整的ACK-Tet序列，其具有两个位于完整ACK-Tet序列末端的EcoRI位点和一个位于完整序列内部的EcoRI位点。因此，进行了使用EcoRI的部分消化来敲除内部EcoRI位点，通过从内部限制位点除去一些DNA碱基对并重新连接DNA片段来进行这。这种改变发生在接近Tet^r盒末端的位置，并且没有显示出对基因功能有任何的不利影响。然后用EcoRI消化所得到的质粒pLAT4-dE13(5.4kb)，以释放具有～2.7kb大小的线性ACK-Tet DNA片段。然后将线性ACK-Tet用于转化产丙酸丙酸杆菌，以获得双-交叉突变株。

如下进行了含有部分ack基因和Tet^r盒的非复制性整合质粒pTAT的构建。通过750-bpack片段的BamHI消化获得了～500bp的部分ack基因(从碱基257至碱基749)，其在碱基257处具有一个BamHI限制位点，在接近750-bp片段的末端有另一个位点。为了形成用于连接

2.1-

(Invitrogen)的具有A’-悬垂物的平截端，首先通过Klenow用dNTP填补500-bp部分ack片段的两个末端，以形成平截端，然后通过虾碱性磷酸酶(GIBCO/BRL)去磷酸，以除去5’-端的磷酸基团，最后通过TaqDNA聚合酶(Amersham Biosciences)添加dATP，以在两个平截端形成A’-悬垂物。然后将改变的部分ack片段克隆至2.1-

(3.9kb)中，以获得pTOPOACK1(4.4kb)。将从通过用XbaI和ApaI消化的pDG1515获得的2.1-kb Tet^r盒连接XbaI-ApaI消化的pTOPOACK1。然后将所得到的整合质粒pTAT(6.5kb)用于转化产丙酸丙酸杆菌。

通过电穿孔将这些DNA构建体引入产丙酸丙酸杆菌后，获得了两个突变株，ACK-Tet和TAT-ACK-Tet。Southern杂交证实了突变株ACK-Tet中的ack基因受到插入的四环素抗性基因的破坏。与野生型相比较，ACK-Tet和TAT-ACK-Tet突变株中AK的活性分别降低了26％和43％。这些突变株的比生长速率降低了～25％，降至0.10h^-1(野生型为0.13h^-1)，可能是由于降低的醋酸盐和ATP产生引起的。两个突变株从葡萄糖都产生了少～14％的醋酸盐。尽管单独的ack破坏没有完全消除醋酸盐产生，但丙酸盐产量提高了～13％。

对代谢途径进行的遗传操纵影响了产丙酸丙酸杆菌中丙酸和醋酸的产生。与未工程化的菌株相比，具有部分灭活的ack基因(该基因与醋酸盐形成途径相关)的突变株(ACK-Tet和TAT-ACK-Tet)在分批发酵中生长较慢，但从糖产生更多的丙酸和较少的醋酸。因此，尝试在FBB系统中使ACK-Tet突变株适应，以获得更高终浓度的丙酸和极端丙酸耐受性的突变株。如图6中所示的，在生物反应器中使用逐渐提高的丙酸盐浓度的6-个月连续发酵后，发酵液中最终的丙酸浓度达到了104g/L，这比之前在FBB中使用野生型菌株获得的最高浓度(～72g/L)高43％。该发酵中高得多的丙酸产生是在FBB中适应的突变株对丙酸耐受性提高的结果，该突变株对丙酸的耐受性提高了超过10倍(参见图7和表8)。

图7比较了野生型、从FBB适应的野生型、ACK-Tet和从FBB适应的ACK-Tet在各种初始丙酸浓度(0-20g/L)下的比生长速率。如在该图中可看到的，随着提高至20g/L，在丙酸的存在下，比生长速率快速降低，产生了强烈的丙酸抑制细胞的结果。然而，适应的ACK-Tet对丙酸抑制的敏感性低得多。在20g/L丙酸下，适应的ACK-Tet保留了约75％的其在0g/L丙酸下的比生长速率。相反，在相同的条件下，野生型丧失了多于80％的其生长速率。未适应的ACK-Tet和FBB适应的野生型菌株比未适应的野生型都具有较好的丙酸耐受性。然而，该提高没有使用适应的ACK-Tet菌株获得的那样明显。

表8.产丙酸丙酸杆菌野生型、ACK-Tet及其FBB适应菌株的非竞争性抑制平衡中抑制速率常数和最大比生长速率的比较。

与野生型和ACK-Tet相比，适应的ACK-Tet菌株只具有略高的μ_max(0.25相对于0.22h^-1)。然而，与亲本菌株相比，该适应突变株的抑制速率常数K_P高出超过12倍(59.5相对于4.9g/L)。显然，FBB中适应的ACK-Tet获取了高得多的对丙酸的耐受性。ACK-Tet比野生型只具有略高的K_P值(4.9相对于3.8g/L)；然而，适应的ACK-Tet具有比适应的野生型高得多的K_P值(59.5相对于8.9g/L)。不仅来自产丙酸丙酸杆菌染色体的ack基因的敲除影响了醋酸盐产生并降低了对丙酸的敏感性，还给予了突变株更好的适应力，以获取之前从未见过的极端高丙酸耐受性。该发现完全出乎任何一个人的预料。在分离自FBB的适应突变株细胞中存在明显的变化。FBB-适应的ACK-Tet突变株的蛋白质表达水平、H⁺-ATP酶活性和形态全部明显不同于亲本ACK-Tet株的那些。适应的突变株获得了较细和拉长的杆状，并具有较高的H⁺-ATP酶表达水平，这在维持pH或穿过细胞膜的H⁺梯度中起着关键作用。

总而言之，使用固定于纤维床生物反应器中的ACK-Tet突变株的丙酸发酵获得了～0.56g/g葡萄糖的最大理论丙酸产量，并且达到了之前从未获得过的～104g/L的最高丙酸浓度。在FBB中适应后的ACK-Tet突变株特别适于从糖(包括葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖)和其他碳源(包括乳酸盐和甘油)进行丙酸的工业化生产。如图8中所示，使用甘油作为碳源，用于在纤维床生物反应器中通过代谢工程化产丙酸丙酸杆菌(ACK-Tet)的丙酸生产，产生了0.71g/g甘油的高丙酸产量，这比来自葡萄糖的高得多。此外，在甘油发酵中的醋酸产生只有0.03g/g甘油，比来自葡萄糖的低很多(0.1g/g葡萄糖)。因此，从甘油发酵可以产生高纯度的丙酸，丙酸与醋酸的比为20(相对于来自葡萄糖发酵的～5)。从甘油发酵获得的最高丙酸浓度为～106g/L或之前在文献中报道的使用甘油作为底物的最大浓度(～42g/L)的2.5倍。

Claims

1.用于生产有机酸的发酵方法，其包括，提供代谢工程化的突变梭菌或丙酸细菌，其使得ack和pta基因中的一个或两个已经被破坏，通过将该突变细菌固定化同时将该突变细菌暴露于可发酵底物使该突变细菌适应以提高它们对酸的耐受性和提高它们的生长速率，并进一步将适应的突变细菌暴露于可发酵底物足够长的时间，以提供高于约50g/L的最终有机酸发酵产物浓度。

2.如权利要求1中所要求的方法，其中所述突变细菌包括酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)PAK-Em，而所述有机酸发酵产物包括丁酸和氢。

3.如权利要求2中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

4.如权利要求3中所要求的方法，其中所述糖选自葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖及其混合物。

5.如权利要求1中所要求的方法，其中所述突变细菌包括酪丁酸梭菌PPTA-Em，而所述有机酸发酵产物包括丁酸和氢。

6.如权利要求5中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

7.如权利要求6中所要求的方法，其中所述糖选自葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖及其混合物。

8.如权利要求1中所要求的方法，其中所述突变细菌包括酪丁酸梭菌HydEm，而所述有机酸发酵产物包括丁酸和氢。

9.如权利要求8中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

10.如权利要求9中所要求的方法，其中所述糖选自葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖及其混合物。

11.如权利要求1中所要求的方法，其中所述突变细菌包括产丙酸丙酸杆菌(P.acidipropionici)ACK-Tet，而所述有机酸发酵产物包括丙酸。

12.如权利要求11中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

13.如权利要求11中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括选自乳酸盐和甘油的碳源。

14.如权利要求1中所要求的方法，其中所述突变细菌包括产丙酸丙酸杆菌TAT-ACK-Tet，而所述有机酸发酵产物包括丙酸。

15.如权利要求14中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

16.如权利要求14中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括选自乳酸盐和甘油的碳源。

17.用于生产有机酸的发酵方法，其包括，提供代谢工程化的选自酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、丙酮丁酸梭菌(C.acetobutyricum)、波氏梭菌(C.populeti)、热醋梭菌(C.thermobutyricum)和产丙酸丙酸杆菌(P.acidipropionici)的突变细菌，该细菌使得ack和pta基因中的一个或两个已经被破坏，通过将该突变细菌在纤维床反应器中固定化同时将该突变细菌暴露于可发酵底物使该突变细菌适应以提高它们对酸的耐受性和提高它们的生长速率，并进一步将适应的突变细菌暴露于可发酵底物足够长的时间，以提供高于约50g/L的最终有机酸发酵产物浓度。

18.如权利要求17中所要求的方法，其中所述突变细菌包括酪丁酸梭菌PAK-Em，而所述有机酸发酵产物包括丁酸和氢。

19.如权利要求18中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

20.如权利要求17中所要求的方法，其中所述突变细菌包括酪丁酸梭菌HydEm，而所述有机酸发酵产物包括丁酸和氢。

21.如权利要求20中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

22.如权利要求17中所要求的方法，其中所述突变细菌包括酪丁酸梭菌PPTA-Em，而所述有机酸发酵产物包括丁酸和氢。

23.如权利要求22中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

24.如权利要求17中所要求的方法，其中所述突变细菌包括产丙酸丙酸杆菌ACK-Tet，而所述有机酸发酵产物包括丙酸。

25.如权利要求24中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

26.如权利要求24中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括甘油。

27.如权利要求17中所要求的方法，其中所述突变细菌包括产丙酸丙酸杆菌TAT-ACK-Tet，而所述有机酸发酵产物包括丙酸。

28.如权利要求27中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

29.如权利要求27中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括甘油。

30.用于生产丁酸的发酵方法，其包括，提供代谢工程化的酪丁酸梭菌PAK-Em、酪丁酸梭菌HydEm或酪丁酸梭菌PPTA-Em突变细菌，其使得ack和pta基因中的一个或两个已经通过同源重组而被破坏，通过将该突变细菌在纤维床反应器中固定化同时将该突变细菌暴露于可发酵底物使该突变细菌适应以提高它们对酸的耐受性和提高它们的生长速率，并进一步将适应的突变细菌暴露于可发酵底物足够长的时间，以提供高于约50g/L的最终丁酸发酵产物浓度。

31.如权利要求30中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

32.用于生产丙酸的发酵方法，其包括提供代谢工程化的产丙酸丙酸杆菌ACK-Tet或产丙酸丙酸杆菌TAT-ACK-Tet突变细菌，其使得ack和pta基因中的一个或两个已经通过同源重组而被破坏，通过将该突变细菌在纤维床反应器中固定化同时将该突变细菌暴露于可发酵底物使该突变细菌适应以提高它们对酸的耐受性和提高它们的生长速率，并进一步将适应的突变细菌暴露于可发酵底物足够长的时间，以提供高于约50g/L的最终丙酸发酵产物浓度。

33.如权利要求32中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。

34.如权利要求32中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括甘油。