CN102078636A - 含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料，由100体积份混合溶液A，2～8体积份交联剂组成，将质量百分比为2.0～5.0％聚乙烯醇水溶液和质量百分比为0.5～2.0％海藻酸钠水溶液按照质量比(2～5)∶1混合，然后加入质量百分比0～0.1％的苯甲酸钠、5～20μg/g的重组人表皮生长因子及质量百分比2.0％～10％的甘油制得混合溶液A，取2～8体积份硼酸钠溶液和氯化钙溶液混合得到的交联剂滴入到100体积份混合溶液A中静置除泡，得凝胶敷料。本发明敷料具有良好的生物相容性，可在室温条件下成型，制备条件温和简单，能有效保持重组表皮生长因子的活性，且对其具有控释效果。该敷料对糖尿病大鼠伤口具有良好的治疗效果，能够加速伤口的愈合。

Description

含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种含重组人表皮生长因子(rh-EGF)的水凝胶敷料及其制备方法，以及其作为治疗糖尿病足慢性溃疡药物的应用。

背景技术

糖尿病足部慢性溃疡严重影响糖尿病患者的生命安全和生活质量，其发病率高、危害性大、治疗费用昂贵，是糖尿病致残致死的重要原因，也是导致糖尿病病人截肢的主要原因。足溃疡一旦发生，治疗非常困难。研究表明，生长因子水平下降是糖尿病创面愈合延迟的重要原因。由于重组生长因子能加速伤口愈合，因此局部应用外源性生长因子来加速糖尿病足溃疡愈合临床常用的方法之一。然而，由于生长因子半衰期短，直接用于伤口时容易被基质金属蛋白酶(MMPs)降解；喷雾剂型载体易造成生长因子的流失，且缺乏缓释和持续作用功能，使外源性生长因子的局部应用得不到理想的效果。

在传统治疗的基础上，近年一系列经临床观察证实可促进溃疡愈合、避免截肢的新型医用敷料问世，进一步改善了糖尿病足的预防和治疗。

根据不同的伤口类型和溃疡愈合的不同阶段，用于糖尿病足溃疡的敷料类型和功能有所不同。主要包括薄膜(保护创面)、泡沫(保护、填充、吸收)、水凝胶(清创、再水化、保湿)、水胶体(清创、保护)、藻酸盐(止血、吸收)、加药敷料(带抗细菌功能)等。其中水凝胶由高分子材料加工，在聚合物衬垫上加上胶联聚合物而成，既能吸收创面渗液，又能将渗液部分保留在敷料中，使创面产生微湿、微酸和低氧环境，促进组织修复和再上皮化；近年来已被证实对慢性溃疡的愈合疗效显著。

中国专利CN1121876C(授权公告日2003年9月24日)和Yoshii等(RadiationPhysics and Chemistry，1999，55(2)：1331)采用电子束辐射交联的方法制备了聚乙烯醇类复合水凝胶敷料。但辐射过程会导致生物药剂变性失活，使这种方法在制备含生长因子敷料时受到限制。中国专利申请200410051638.4(公开日2005年7月6日)和中国专利申请200510036465.3(公开日2006年2月15日)将碱性成纤维生长因子负载于卡波姆中制备凝胶制剂。但凝胶基质的主要成分为丙烯酸树脂，存在释药迅速、降解困难、生物相容性较差等缺点。因此，开发一种价格便宜、制备工艺简单、生物相容性好的糖尿病足慢性溃疡专用凝胶敷料具有重要意义。目前，国内尚未有关于糖尿病足慢性溃疡专用敷料的专利、文章报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种以海藻酸钠和聚乙烯醇为主要原料，以氯化钙和硼酸钠为交联剂，加入重组人表皮生长因子(rh-EGF)和防腐剂苯甲酸钠制备而成的糖尿病足慢性溃疡专用水凝胶敷料。

本发明的另一目的在于提供上述含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料，由以下体积份数的成分制备得到：

混合溶液A：100体积份

交联剂：2～8体积份；

所述混合溶液A，是通过以下方法制备的：10～40℃下，将聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠(SA)配制成水溶液，将质量百分比2.0～5.0％聚乙烯醇水溶液和质量百分比0.5～2.0％海藻酸钠水溶液按照(2～5)∶1混合，搅拌均匀，然后加入质量百分比0～0.1％的苯甲酸钠、5～20μg/g的重组人表皮生长因子(rh-EGF)及质量百分比2.0％～10％的甘油，得到混合溶液A；

所述交联剂由等浓度的硼酸钠水溶液与氯化钙水溶液等体积比混合而成。

所述硼酸钠水溶液与氯化钙水溶液的质量分数为1.0～2.0％。

所述聚乙烯醇(PVA)的重均分子量为12～15万。

所述海藻酸钠1％水溶液粘度为200～500mPa·s。

所述重组人表皮生长因子为市购，购买于CYTOLAB/PEPROTECH ASIA。

上述含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

(1)10～40℃下，将聚乙烯醇、海藻酸钠配制成水溶液，将聚乙烯醇水溶液和海藻酸钠水溶液按照质量比1∶4～4∶1混合，搅拌均匀，然后按照配比加入苯甲酸钠、rh-EGF及甘油，得到混合溶液A；

(2)10～40℃下，在搅拌条件下取2～8体积份的交联剂缓慢滴入到100体积份的混合溶液A中，静置除泡，即得含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料。

所得水凝胶敷料具有剪切变稀的特性，在1.0s^-1剪切速率条件下，不同配比的敷料的剪切粘度范围1.2～10Pa·s(37℃)；弹性模量范围20～50Pa(37℃)；敷料放置室温2周，其模量变化0～6％，粘度变化0～10％。

rh-EGF水凝胶敷料在不同温度(4℃、25℃、37℃)、不同储存时间(1d、7d、14d)下外观、性质、气味、pH值均无明显变化。

上述含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料的应用，所述水凝胶敷料在制备治疗糖尿病足慢性溃疡药物中的应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明以海藻酸钠和聚乙烯醇两种生物相容性良好的高分子材料为主要原料，采用原位交联技术制备得到了一类新型的糖尿病足慢性溃疡专用凝胶敷料，该敷料具有良好的生物相容性。

(2)本发明的水凝胶敷料可在室温条件下成型，制备条件温和，工艺简单。

(3)本发明的水凝胶敷料能有效保持重组表皮生长因子的活性，且对其具有控释效果。

(4)动物实验表明，本发明的水凝胶敷料对糖尿病大鼠伤口具有良好的治疗效果，能够加速伤口的愈合。

附图说明

图1是高剂量组与正常对照组大鼠的心、肝、肾切片比较图，其中，A是高剂量组大鼠心脏切片，B是高剂量组大鼠肝脏切片，C是高剂量组大鼠肾脏切片，D是空白组大鼠心脏切片，E：空白组大鼠肝脏切片，F：空白组大鼠肾脏切片。

图2是完整皮肤组大鼠皮肤刺激反应照片，其中，A是给凝胶前，B是给凝胶后48h，C是给凝胶后72h，D是给凝胶后7d，E是给凝胶后14d。

图3是破损皮肤组大鼠皮肤刺激反应照片，其中，A是给凝胶前，B是给凝胶后48h，C是给凝胶后72h，D是给凝胶后7d，E是给凝胶后14d。

图4是试验组大鼠致敏反应照片，其中A是致敏前，B是致敏后24h，C是致敏后48h，D是致敏后72h。

图5是rh-EGF从敷料中释放后的活性检测图。

图6是不同药物处理对大鼠伤口愈合效果的影响图，其中，A是空白对照组，B是水凝胶基质组，C是rh-EGF水凝胶组，D是rh-EGF水溶液组。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

(1)40℃下，取聚乙烯醇(PVA)(广东汕头市西陇化工厂，分子量12～15万)配制成5.0％的水溶液，取海藻酸钠(浙江省温州市东升化工试剂厂，中粘度)配制成2.0％的水溶液，然后将聚乙烯醇和海藻酸钠水溶液按4∶1(质量比)混合配成89.95g的聚乙烯醇/海藻酸钠混合溶液，搅拌均匀，然后加入苯甲酸钠(SB)0.05g、1mg rh-EGF(购买于CYTOLAB/PEPROTECH ASIA)，甘油10g，混合溶解，得到混合溶液A；

(2)40℃下，将硼酸钠和氯化钙分别配制成1％的溶液，按体积比1∶1混合而得交联剂，取4.0mL交联剂缓慢滴入到100mL混合溶液A中，搅拌均匀，静置除泡，即得含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料。

所得敷料具有剪切变稀的特性，在1.0s^-1剪切速率条件下，敷料的剪切粘度为的剪切粘度5.6Pa·s(37℃)；弹性模量38Pa(37℃)；敷料放置室温2周，其弹性模量变化4.2±0.3％，粘度变化6.5±0.5％。

采用美国TA Instrument公司生产的ARES/RFS型高级流变扩展系统测定水凝胶敷料基质的稳态流变参数(表观粘度、剪切速率和剪切应力)和动态流变参数(弹性模量、粘性模量等)。选用圆筒型模具进行测试，圆筒外径为34.0mm，内径为32.0mm，圆筒高度为33.0mm。

加入rh-EGF后，水凝胶在不同温度(4℃、25℃、37℃)、不同储存时间(1d、7d、14d)下外观、性质、气味、pH值均无明显变化。

实施例2

含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

(1)10℃下，取聚乙烯醇(PVA)(广东汕头市西陇化工厂，分子量12～15万)配制成2.0％的水溶液，取海藻酸钠(浙江省温州市东升化工试剂厂，中粘度)配制成0.5％的水溶液，然后将聚乙烯醇和海藻酸钠水溶液按5∶1(质量比)混合配成89.95g的聚乙烯醇/海藻酸钠混合溶液，搅拌均匀，然后加入苯甲酸钠0.03g、1mg rh-EGF(购买于CYTOLAB/PEPROTECH ASIA)，甘油2.0g，混合溶解，得到混合溶液A；

(2)10℃下，将硼酸钠和氯化钙分别配制成2％的溶液，按体积比1∶1混合而得交联剂，取2.0mL交联剂缓慢滴入到100mL混合溶液A中，搅拌均匀，静置除泡，即得含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料。

所得敷料具有剪切变稀的特性，在1.0s^-1剪切速率条件下，敷料的剪切粘度为2.4Pa·s(37℃)；弹性模量30Pa(37℃)；敷料放置室温2周，其弹性模量变化2.8±0.4％，粘度变化3.8±0.7％。

加入rh-EGF后，水凝胶在不同温度(4℃、25℃、37℃)、不同储存时间(1d、7d、14d)下外观、性质、气味、pH值均无明显变化。

实施例3

含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

(1)25℃下，取聚乙烯醇(PVA)配制成3.0％的水溶液，取海藻酸钠配制成1.0％的水溶液，然后将聚乙烯醇和海藻酸钠水溶液按2∶1(质量比)混合配成89.95g的聚乙烯醇/海藻酸钠混合溶液，搅拌均匀，然后加入苯甲酸钠0.04g、1mgrh-EGF(购买于CYTOLAB/PEPROTECH ASIA)，甘油8.0g，混合溶解，得到混合溶液A；

(2)25℃下，将硼酸钠和氯化钙分别配制成1.5％的溶液，按体积比1∶1混合而得交联剂，取8.0mL交联剂缓慢滴入到100mL混合溶液A中，搅拌均匀，静置除泡，即得含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料。

所得敷料具有剪切变稀的特性，在1.0s^-1剪切速率条件下，不同配比的敷料的剪切粘度6.8Pa·s(37℃)；弹性模量43Pa(37℃)；敷料放置室温2周，其弹性模量变化2.9±0.5％，粘度变化4.3±0.4％。

加入rh-EGF后，水凝胶在不同温度(4℃、25℃、37℃)、不同储存时间(1d、7d、14d)下外观、性质、气味、pH值均无明显变化。

实施例4

含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

(1)10℃下，取聚乙烯醇(PVA)(广东汕头市西陇化工厂，分子量12～15万)配制成2.0％的水溶液，取海藻酸钠(浙江省温州市东升化工试剂厂，中粘度)配制成0.5％的水溶液，然后将聚乙烯醇和海藻酸钠水溶液按5∶1(质量比)混合配成97.9g的聚乙烯醇/海藻酸钠混合溶液，搅拌均匀，然后加入苯甲酸钠0.1g、0.5mg rh-EGF(购买于CYTOLAB/PEPROTECH ASIA)，甘油2.0g，混合溶解，得到混合溶液A；

(2)10℃下，将硼酸钠和氯化钙分别配制成2％的溶液，按体积比1∶1混合而得交联剂，取2.0mL交联剂缓慢滴入到100mL混合溶液A中，搅拌均匀，静置除泡，即得含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料。

所得敷料具有剪切变稀的特性，在1.0s^-1剪切速率条件下，敷料的剪切粘度为2.4Pa·s(37℃)；弹性模量30Pa(37℃)；敷料放置室温2周，其弹性模量变化2.8±0.4％，粘度变化3.8±0.7％。

加入rh-EGF后，水凝胶在不同温度(4℃、25℃、37℃)、不同储存时间(1d、7d、14d)下外观、性质、气味、pH值均无明显变化。

实施例5

含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

(1)25℃下，取聚乙烯醇(PVA)配制成3.0％的水溶液，取海藻酸钠配制成1.0％的水溶液，然后将聚乙烯醇和海藻酸钠水溶液按2∶1(质量比)混合配成92g的聚乙烯醇/海藻酸钠混合溶液，搅拌均匀，然后加入2mg rh-EGF(购买于CYTOLAB/PEPROTECH ASIA)，甘油8.0g，混合溶解，得到混合溶液A；

(2)25℃下，将硼酸钠和氯化钙分别配制成1.5％的溶液，按体积比1∶1混合而得交联剂，取8.0mL交联剂缓慢滴入到100mL混合溶液A中，搅拌均匀，静置除泡，即得含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料。

所得敷料具有剪切变稀的特性，在1.0s^-1剪切速率条件下，不同配比的敷料的剪切粘度6.8Pa·s(37℃)；弹性模量43Pa(37℃)；敷料放置室温2周，其弹性模量变化2.9±0.5％，粘度变化4.3±0.4％。

加入rh-EGF后，水凝胶在不同温度(4℃、25℃、37℃)、不同储存时间(1d、7d、14d)下外观、性质、气味、pH值均无明显变化。

实施例6安全性试验

试验方法：选成年、健康、皮肤无损伤的体重为200～300g的大鼠(中山大学北校区动物实验中心提供，下同)20只，雌雄各半，雌性应未产和无孕。根据预试验及结构上相关化合物的资料预计本发明的水凝胶敷料不会产生毒性，故将20只大鼠分成2组，每组10只，雌雄各半。第1组为高剂量组，给实施例1制得的水凝胶敷料。第2组为空白对照组，不给与任何药物。给药前24小时用机械法将大鼠背部脱毛，脱毛范围约20cm²。脱毛24小时后取实施例1制得的水凝胶敷料按5g/kg剂量均匀涂与高剂量组大鼠背部脱毛区，然后用纱布及玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布及绷带加以固定。对照组不涂抹，作为空白对照。24小时后用温水或无刺激溶剂去除残留受试物，每日观察，连续7～14天。给药后要注意动物全身中毒表现和死亡情况，包括动物体重、皮肤、毛发、眼睛和粘膜的变化。呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等变化。若遇有死亡动物则需进行尸检和肉眼观察，当有肉眼可见病变时，则需进行病理检查。试验结束后，将全部大鼠处死取心、肝、肾组织进行病理检查。

试验结果：根据图1高剂量组与正常对照组大鼠的心、肝、肾切片比较图，可知高剂量组及对照组心、肝、肾病理检查均未见异常，说明所制备的敷料具有良好的生物安全性。

实施例7大鼠皮肤刺激试验

试验方法：选成年、健康、皮肤无损伤的体重为200～300g的大鼠(来源同上)30只，雌雄各半，雌性应未产和无孕。将30只大鼠分成完整皮肤组、破损皮肤组和对照组，每组各10只，雌雄各半。试验前24小时将其背部脊柱两侧用机械法脱毛，脱毛范围约20cm²。破损皮肤组的小鼠，用消毒的注射针头将其脱毛区的皮肤划破，以有渗血为度。

脱毛24小时后取实施例1制得的水凝胶敷料按5g/kg剂量均匀于两个试验组大鼠背部脱毛区，然后用纱布及保鲜膜覆盖，再用无刺激性胶布及绷带加以固定。对照组不涂抹，作为空白对照。24小时后用温水或无刺激溶剂去除残留受试物，即刻观察。然后于1h、24h、48h、72h后再次观察给药部位刺激反应情况。每日观察，连续7～14天。

每只大鼠观察结果按表1进行刺激反应评分，计算出平均分值再按表2进行刺激强度评价。

表1皮肤刺激反应评分

反应平均值＝红斑形成总分+水肿形成总分/合计动物数

表2皮肤刺激强度评价

试验结果(见表3、图2、图3)：

表3完整皮肤组和破损皮肤组大鼠皮肤刺激反应评分平均值

实施例8大鼠皮肤致敏试验

选成年、健康、皮肤无损伤的体重为200～300g的大鼠(来源同上)20只，雌雄各半，雌性应未产和无孕。将大鼠按体重随机分成2组，每组10只，雌雄各半。第一组为试验组，给实施例1制得的水凝胶敷料，第二组为空白对照组，不给与任何药物。

①致敏接触：于试验前24小时将试验组大鼠背部两侧用机械法脱毛，脱毛范围约3cm×3cm。取实施例1制得的水凝胶敷料0.1g涂在动物背部右侧脱毛区，用纱布及保鲜膜覆盖，再用无刺激性胶布固定，持续6小时。第七天和第十四天，以同样方法重复一次。

②激发接触：于末次给水凝胶敷料致敏后14天，将受试物0.1g涂于试验组大鼠背部左侧脱毛区，6h后去掉受试物，即刻观察，然后于24h、48h、72h再次观察皮肤过敏反应情况。按表3评分，判断受试物对皮肤过敏反应性质。为反应受试物的致敏强度，可按表4的分类判断其致敏率。可按表4的分类判断其致敏率。

表4皮肤过敏反应程度的评分标准

表5皮肤致敏性评价标注

试验结果(见表6、图4)：

表6试验组大鼠皮肤致敏反应平均值

实施例9rh-EGF在水凝胶敷料中的释放模式及稳定性观察

1、按照每克实施例1制得的水凝胶敷料加入10μg rh-EGF的比例制备水凝胶敷料。

2、采用倒置方法将5g rh-EGF水凝胶敷料放入含100ml PBS液烧杯中，分别于5min、10min、20min、30min、1hr，1.5hr、2hr，4hr，6hr，8hr，10hr，12hr，24hr在同一位置取样0.5ml，每次取样后补充同量同温PBS。

3、采用双抗体夹心ABC-ELISA法进行浓度检测(试剂盒来源：上海森雄科技实业有限公司)：

(1)建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液(指在上述实验中，凝胶敷料在介质中的释放产物(取一定量的释放液，然后稀释))100μl，第一孔加已知浓度的rh-EGF 100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100μl弃去，使之体积为100μl。第八孔为空白对照。

(2)加样：待测品孔每孔各加入样品稀释液和分别于5min、10min、20min、30min、1hr，1.5hr、2hr，4hr，6hr，8hr，10hr，12hr，24hr取得的样品各50μl。

(3)将反应板充分混匀后在37℃下放置120分钟。

(4)洗板：用洗涤液(质量分数0.05％Tween20-PBS)将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

(5)每孔加第一抗体工作液(生物素化的抗人EGF抗体)50μl，将反应板在37℃下放置60分钟。

(6)洗板：同前。

(7)每孔加酶标抗体工作液(辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 100μl。

(8)将反应板在37℃下放置60分钟。

(9)洗板：同前。

(10)每孔加入底物工作液(辣根过氧化物酶底物OPD)100μl，置37℃暗处反应5-10分钟。

(11)每孔加入1滴中止液(2mol/L硫酸)混匀。

(12)在492nm处测吸光值。

4、计算累计释放率。累计释放率＝实际测得的浓度/理论上完全释放的浓度*100％

5、分别于rh-EGF水凝胶制成后1d、7d、14d进行检测，并在试验期间观察rh-EGF水凝胶在不同温度(4℃、25℃、37℃)、不同储存时间(1d、7d、14d)下外观、性状、气味、pH值变化，评估rh-EGF水凝胶的稳定性。

6、重复实验2次。

试验结果(见表7)：

表7rh-EGF水凝胶储存不同时间后24小时累计释放率(％)

2.rh-EGF水凝胶在不同温度(4℃、25℃、37℃)、不同储存时间(1d、7d、14d)下外观、性质、气味、pH值均无明显变化。

实施例10rh-EGF在水凝胶敷料中释放后的活性检测

试验方法：

1.分别取上述实施例7中1d、7d、14d各13个时间点，释放液0.4ml加入3.6ml含10％(体积分数)小牛血清的DMEM培养基(Sigma-AldrichCompany)中(含rh-EGF 1～10ng/ml)，用0.22μm滤器过滤备用。

2.Balb/c3T3细胞(来源于中国科学院细胞库)经传代后接种于96孔板。

3.取上述备用释放液(即分别于5min、10min、20min、30min、1hr，1.5hr、2hr，4hr，6hr，8hr，10hr，12hr，24hr取得的释放液)各200μl加入已接种Balb/c3T3细胞的96孔板中，同时设阳性对照组(培养基中含rh-EGF标准品1～64ng/ml，分别为1ng/ml、4ng/ml、16ng/ml、64ng/ml，每个浓度设3孔)阴性对照组(培养基中不含rh-EGF)各12孔。于37℃5％CO₂环境下培养48小时。

4.MTT法于492nm波长处检测活性：细胞培养48小时后，加入MTT(5g/L)20μl，继续培养4小时，去除上清，加入DMSO 150μl，于492nm波长处检测吸光度。

试验结果见图5，图5为rh-EGF在实施例1敷料中释放后的活性检测结果，实验组(储存1d、7d、14d后的rh-EGF水凝胶的释放液分别为1天组、7天组、14天组)、阳性对照组、阴性对照组的平均活性(吸光度)分别为0.90±0.10、0.86±0.10、0.80±0.14、0.87±0.15、0.55±0.10。实验组和阳性对照组促BALB/c3T3增殖的活性均高于阴性对照组(p＜0.05)。说明敷料基质能够有效保持rh-EGF的活性。

实施例11含rh-EGF敷料对糖尿病大鼠伤口治疗效果试验

试验方法：

取56只250～300克清洁级SD大鼠(购自广州中医药大学实验动物中心)，适应性饲养1周后，连续3d腹腔内注射35mg/kg STZ诱导糖尿病。注射3d后尾静脉采血检测随机血糖水平，若大鼠随机血糖水平≥16.7mmol/L，视为糖尿病模型建立成功。

选取建模成功的糖尿病大鼠继续喂养，喂养期间自由进食、饮水，每周监测体重和血糖，根据血糖水平皮下注射低精蛋白胰岛素(NPH)1～2U/d，血糖维持在16.7mmol/L～28mmol/L。

糖尿病大鼠成模6周后，戊巴比妥30mg/kg腹腔注射麻醉，背部剪毛，75％酒精消毒，以边长为1.3cm的消毒模板作为标志用手术刀在鼠背部正中距离颅骨后1cm处形成一个1.3cm×1.3cm的正方形伤口，切除范围深达筋膜，伤口形成后每只大鼠单笼饲养。

实验动物按创面处理因素的不同分4大组，(见表8)。空白对照组：不予处理；水凝胶基质组：每天外用水凝胶基质(“水凝胶基质”是指实施例1制得的水凝胶敷料不包含rh-EGF)0.5g/每个创面；rh-EGF水凝胶组：每天外用实施例1制得的rh-EGF水凝胶0.5g/每个创面(含rh-EGF 5μg)；rh-EGF水溶液组：每天外用rh-EGF水溶液0.5ml/每个创面(含rh-EGF 5μg)。

表8成模雄性SD糖尿病大鼠28只分组

分别在伤口形成后(一边用药治疗一边测量伤口大小)0d、3d、5d、7d、10d、14d用数码相机对伤口进行拍摄(A610，Canon)，同时放置一个有刻度直尺并标明大鼠的号码。伤口面积用Image J(1.36b版本)进行计算。

每次测量重复2次，取其平均数。

试验结果如图6所示，比较伤口愈合率发现，4组愈合率的差别具有统计学意义(p＜0.05)。含rh-EGF水凝胶组在各个时间点愈合率均最高。伤口形成后第3、5d水凝胶处理组(B、C)愈合率高于空白对照组(p＜0.05)；第10d水凝胶处理组(B、C)优于非水凝胶处理组(A、D)(p＜0.05)；第14d三个治疗组均优于空白对照组(p＜0.05)。含有rh-EGF的敷料能够快速有效地促进糖尿病大鼠的伤口愈合(见表9)。

表9不同时间4组愈合率(

％)

注：*与A组比较，p＜0.05；△与D组比较，p＜0.05。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料，其特征在于：由以下体积份数的成分制备得到：

混合溶液A：100体积份

交联剂：2～8体积份；

所述混合溶液A，是通过以下方法制备的：10～40℃下，将质量百分比2.0～5.0％聚乙烯醇水溶液和质量百分比0.5～2.0％海藻酸钠水溶液按照质量比(2～5)∶1混合，搅拌均匀，然后加入质量百分比0～0.1％的苯甲酸钠、5～20μg/g的重组人表皮生长因子及质量百分比2.0～10％的甘油，得到混合溶液A。

2.根据权利要求1所述含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料，其特征在于：所述交联剂由等浓度的硼酸钠水溶液与氯化钙水溶液等体积比混合而成；

所述硼酸钠水溶液与氯化钙水溶液的质量分数为1.0～2.0％。

3.根据权利要求1所述含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料，其特征在于：所述聚乙烯醇的重均分子量为12～15万。

4.根据权利要求1所述含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料，其特征在于：所述海藻酸钠1％水溶液的粘度为200～500mPa·s。

5.权利要求1所述含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)10～40℃下，将聚乙烯醇、海藻酸钠配制成水溶液，将质量百分比2.0～5.0％聚乙烯醇水溶液和质量百分比0.5～2.0％海藻酸钠水溶液按照质量比(2～5)∶1混合，搅拌均匀，然后按照配比加入苯甲酸钠、rh-EGF及甘油，得到混合溶液A；

(2)10～40℃下，在搅拌条件下取2～8体积份的交联剂缓慢滴入到100体积份的混合溶液A中，静置除泡，即得含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料。

6.权利要求1所述含重组人表皮生长因子的水凝胶敷料在制备治疗糖尿病足慢性溃疡药物中的应用。

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